GFP imaging: methodology and application to investigate ...

11
GFP imaging: methodology and application to investigate cellular compartmentation in plants Maureen R. Hanson 1 and Rainer H. Ko È hler Department of Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Biotechnology Building, Ithaca, NY 14853, USA Received 31 March 2000; Accepted 19 September 2000 Abstract The cloning of the jellyfish gfp green fluorescent protein) gene and its alteration for expression in subcellular locations in transformed plant cells have resulted in new views of intracellular organization and dynamics. Fusions of GFP with entire proteins of known or unknown function have shown where the proteins are located and whether the proteins move from one compartment to another. GFP and variants with different spectral properties have been deliberately targeted to separate compartments to determine their size, shape, mobility, and dynamic changes during development or environmental response. Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET) between GFP variants can discern proteinu protein interactions. GFP has been used as a sensor to detect changes or differences in calcium, pH, voltage, metal, and enzyme activity. Photobleaching and photoactivation of GFP as well as fluorescence correlation spectroscopy can measure rates of diffu- sion and movement of GFP within or between compartments. This review covers past applications of these methods as well as promising developments in GFP imaging for understanding the functional organization of plant cells. Key words: Green fluorescent protein, microscopy, organelle, localization, photobleaching, plastid tubule, confocal microscopy. Introduction Expression of genes encoding green ¯uorescent protein GFP) within cells has engendered experiments that could not be imagined ten years ago. Among the many applications are ones which permit new inquiries into the organization of cellular activities. This review will speci®cally focus on the GFP expression and imag- ing methods that have and will continue to produce advances in understanding compartmentation within plant cells. Details of the use of particular ¯uorescence, confocal laser-scanning, or multiphoton microscopes to visualize GFP-derived ¯uorescent proteins will not be covered, but can be found in many cited references. Research that has exploited GFP imaging to gain new insights will be brie¯y described in order to illustrate the experiments that are feasible. At the present time, GFP imaging has revealed more about animal and fungal cells than about plant cells, partly because of early problems with the use of the jelly®sh GFP gene in plants. The original animal gene contains sequences that are recognized erroneously as an intron in plants, leading to poor expression levels Haseloff et al., 1997; Rouwendal et al., 1997). The production and distribution of modi®ed, thermostable, brightly ¯uorescent GFPs suitable for expression in plant cells Reichel et al., 1996; Chiu et al., 1996; Pang et al., 1996; Davis and Vierstra, 1998; Haseloff et al., 1997; Haseloff, 1999) has stimulated many experiments with plant systems. Additional genes suitable for use in vascular plants have become available with the recoding of GFP for expression in mammals and other organisms Chiu et al., 1996; Muldoon et al., 1997; Fuhrmann et al., 1999), as the codon alterations often have fortuitously destroyed the cryptic splice site sequence. Thus some, though not all, of the new GFP variants with altered spectral properties may be functional in plants without further alterations. The many different variants of GFP are discussed in a number of reviews and papers Cubitt et al., 1995; Cormack et al., 1996; Leffel et al., 1997; Patterson et al., 1997; Misteli and Spector, 1997; 1 To whom correspondence should be addressed. Fax: q1 607 255 6249. E-mail: [email protected] Journal of Experimental Botany, Vol. 52, No. 356, Compartmentation Special Issue, pp. 529±539, April 2001 ß Society for Experimental Biology 2001

Transcript of GFP imaging: methodology and application to investigate ...

��� ������� ��� � � �� ��� ��������� � � ���������

������� � ����������� � �� ������

����� �� ���� �� ��� ����� �� � � ���

���������� ��� ���� ����� ��� ������ �� ������ ����������� ���� ����� ������������� �� �� �� !"� �#$

�������� �� ��� ���� �������� �� ��������� ���

��������

� �� ���� ! �� "���!��� ��� #��� !�� ������� ���$ �� ��� ��� ������� � ! � %����� � ������������ � ���� �� �� �����! ��� ����� ���� ��������� �� �& ��&� ! ������������ �����'��� ���� ��������� ���� �� ! ��� &��� ���� �� ���� ! (� &� � ��(� &� !����� � ��� �� &� &���� �� ���� �� � ���� ��� &���� �� �� ����� � !� � � � �������� � �� ���� ��� ����������� &��� ��!!��� ������� �� ����� ��� ����������� ������ � ������ � ��������� � ������ ���� ��') ����) � ������) ��� ������������� ������ ��� ���� � ���� ��������� ��� ��� ����� �� ���� *���� ����!�#��* $ ��&� ��� �������� ��� ������ �� ������ ��� �������� ��� ��� ��� �� ��� �� � ��� �� ���� ������ � ��!!���� �� �������) ��)� ����) ����) ��� �'�� ��������� �� � ����������� �� � �������� � ! ��� �� &�� �� !�� ������ ������ � ����� �� �� ��� ����� ���� ! ��!!�+�� � ��� � ���� ! ��� &����� � ��&�� ���������� ��� ���& � ��� ���� ��������� �� ! ��� ��� �� �� &�� �� �� ������ ��� ������� ��� ������� ! � ������������ �� !����� ��� �����'��� � ! ����� �����

��� ������ ����� � !�������� �������" ����������" ��#�� �"

�� �$����" ������ �����#" � ���� �!�! �" ������

����������%

,��� ����� �

��������� � ���� ��� �� ���� ��������� ����������� ����� ����� ��� ��� ��� ���������� �������� �� �� ������ �� ����� ���� ���� ��� ���

����������� ��� ��� ����� ������ �� �������� ������ ����� ���� � �������� ����!������ "��� ��!��� ���������#����� ���� � ��� ��� ��������� � ����$�� ����� � ���� ��!� � ���� ������ �� ��� ���� !���� � � ����� �� �������������� ��������� ������ %������ � ��� ��� � ���������� ����������&������ �����$�����& �� ���������� ����������� ��!������ � ���$ ���!� ��������� ������� ���� �� ����!��� & ��� �� �� �� � ��� ���� ���������'������� ���� ��� �������� ��� ������ �� ��� ��������� ���� �� ������ ������� � �� �� �� ���������� ������������� ���� ��� ��������

�� ��� ������ ����& ��� ������ ��� ��!���� ��������� ����� � ���� ����� ��� ����� ���� �����&������ ������� � ����� �������� ���� ��� ��� � ���(����#�� ��� ��� � ������ "�� ������� ����� ��������� �������� ���� ��� ������ � ���������� ��� ���� � �����& ��� �� �� ���� ��������� ��!����)����� �� ���& *++,- '���� �� �� ���& *++,�� "����� ����� � ���������� � �� �#� & ������������&�������� ��������� ���� �������� �� ��������� ����� ����� �'������ �� ���& *++.- /��� �� ���& *++.- ����� ���& *++.- %�!�� � 0�������& *++1- )����� �� ���&*++,- )�����& *+++� ��� ��������� ��� �������������� ���� �������� � ������ ���� �������� �� ��� �!������� ����� ��!� ������ �!������� ���� ��� ���� ��� ��� �� ��������� � ������� � ����� ���������/��� �� ���& *++.- 2�� �� �� ���& *++,- ������ �� ���&*+++�& �� ��� �� � ���������� ��� ��!� ����������� ������� ��� ������� ������ ���� �������� "��� ����&������ �� ���& � ��� �� ��� !������ ���� ������ �������� ���������� ��� �� ������� � ����� ������������� ����������� "�� ��� ����� !������ ���� ��� ������� � � ����� � ��!���� � �������/����� �� ���& *++3- /�����4 �� ���& *++.- 5��� �� ���&*++,- �������� �� ���& *++,- 2������ � 6������& *++,-

� &� ���� �������������� ���! � �� ��������% '(� �� )�* ++ ) ,�% -.�� � ���+/����� %��!

%����� &'���������� ������ (�) !*� �) "!+��������������� #�� ��� ������ ��) !*,-!",� $���� *..�

� ������� ��� -(�������� 0�� �#� ���

)����� � 6�������& *++1- )�����& *+++� � ���� �� �� ��!��� ����� 7�!���������& ��� �������� � �����$����������� ��� !����� ���� ����������� ��������� ��!������ � �������� ������ ���� ����������� �����

8� � ��� ���� � !������ � ��� �� � �������������� �� ��� ���4 � � ���������� �� � ��������������� �/���#� �� ���& *++9�� ��� �� �� �������� ����� ����� ������� � ��������� ������� ���������� ��������� ����� �� ���� ����� � ��������:������ � ��� �������������� � ��� ���� ���� �� �������� � ��� ��� ��� ��4� �� �� ����� �����& ������������ ��� ���������� ���!� �� �� � ���� ���������������� �� ���� ��� �� ����� ���� ��������

-�������� � ! �� ������������ � ���� � !�� ����

"� � ����� ��� ��� ���� ���� �� �������������� � & �� �� �������� �� 4�� ����� � ���� � ���������� ������� ��� ������ � �����#� ���� ����� ������������ ����� � �!������� � � �� �����������!�������� �� ������ ;���� � ���������� � ��� �������� �� �������� �������� �� � ����� �� ����$�������� �������������� � ����������� /�������������!�� ���� � ���������� �������& ��� � ������ ��� ���!�� � �������� ��������& � ��������� �����$������ � � ������ �������� �� ��������� ������������������ � ����� � 4�� �������� ����� � �������� � ��� � ��������� �� � ���������� ������� ��������� � �� ����������& ��� ��� ��� ��� �� �������� � � ������& ������ �������� ������� ������ ���� � ���������� ��!� ��� �� ���������� �������� �� �������� � ��������� �������� ���� ����� ����������� ��� � ���� ����� ������������ ������� ���4��� �����������& ��� � ������ �������� ������ ��� �� ��� ���!������ �4�� �������& ����!��� ������� �����$���� ������ ��������& ��� �� �� ��� $��� ����� ��� ����� ��� ����������� �������������� ���� �4�� � ��� �� ������� �

��� ������ � ������������ ������� ��� %7�������� ���� �� ������ �������� ����� � ��� ��������� �� �������!�� �����������& ���� ���� ���������!� ��� �����!� �� �� ������� �� ���� ��� ��������� �6���� �� ���& *++1�� /��� ���������� � ����#����� � � ������ �� !���#����� � ������������������� �� ��� ���������� ���������& � ����� ���� ����� �� ����� ������� � � ������ � ������� ������� �� �� ����$������� � ���������� ����� ���� �� �� �������� �� �� �� ������ � ���� ��4�� ������� ��� �������� ������ � ���������!������� ���� �� �������� ����� � ������& � ���� ������������ �� ���������� �������& ���� �� ����� ������� �����

��� �� �� �������� ��!� ��� ��� �� ������ ���3� �� <� � � ��� �� �� ����� � � %7� �������� �������& ��� �� �� ��� ����� � 7$������� ��/$������� ����� � ���� 6��� �������� ���� ��!���� ���������� ��� ������ �������� �����& ������ ��� ��� ���� ����� �� ������� ������� ���$ ����� � ������ �������� ����� ��� ��� � !��������� ��� ����� ���� ����� �� �� ������ � �������� ���������� ���� �� �������� & ����� �� ��� ��������� ��� ���������� �������� �� ������� ���������������������& ������� � ��� ����� ���� ��� ������ ���� %7� ����������� � ��� !���������� � ������ ��� ���!��� � ��� ��������� ��� ��� �������� ������& ������� � ������� ������ ������������� ��������� �� ���� �������� ��� ������� � ����� ������!� ��� ������� �� %7� ����4�� 7�!���������& ������� ��� � ���������� � ������� ������ ��4�� ���� �!������� ����& ���������� ����� �!����� ��� ���� ���� ����� � ������ ����������� 8�� ��� �����&����� ��� � ������������ ����� ��������� � �������� � ����� ����� � ��!�� �����& ������� �� �� � ����������������� �������� �� ������� ������ �������� �������������� ��� ���� !������ ���������& ���� ����& ������$�����& ���������& ������& � � �������� �����������'� ���� �� ������� �� ����� ��������� �������� ��� ����� �!� ���� �� ���& *++1- 6���� �� ���& *+++��

:������ � ��� ����� �� �& ��� �� ���� ������ �����&�� ���� ��� �� ��� �� ����� ��������� �� �� �� � ���� ��������� � ������ � ����& ����� � ���������� �������4 �� ���& *++,�& �- =�>���� �� ���& *++,�-)����� � 6�������& *++1- ���� *��� ����� � ��!�������� ��� �������� ������� � ��� ���������� � ��������� ���& ��� �� �� ��� �������� ���� ��� ��� ������� �� �� �� � ������$������ � ������� ������� �������� ������ ����� ������ � �� ��� ��������� ��� ������������ /'?@& � ���� ����� ��������������=����� �� ���& *+++� � ��� ���� ��� �� ����& ����� �� �� � �� ������� ���� ���� �������� ��� ��� !�������� �6���� �� �� ���& *++1�� ����� ���� ���� � �����!���� ��!���� ������ ��!���� ������ ���!�� �� � ������ ������� ������ �5� ������ � :�����& *+++��

����� � ����� ������� � ������� �������� �����!���� ����� �������������� � ������ �& �������$ ���& �� �������� ������� ���� ������������ ����������������� ����!��� �A�� �� ���& *++,� � � 7�%�$ ��� �� ���������� ��� ������� ����!� �� ���& *++1����� ���� �� �� ������ � ������� ���� ����� ����� ���������� �� �����$���� '7� �������������!���� ���� �� ��� ������� ����$������ � � �������� ��� ��������� �� ��� ����������� �)� �4� �� ���&*+++�� "���� ������$��� � '7� ���������� ����������� ���� ��� ���� �� �� ������ $������ � �� ����� ������!� �������� ������ �� ��� �=������ �� ���&*+++�� "�� ���������� ����� ���������������� ��� �

+�� /���� ��� 01 ����

�� ����� ����� �%7� ����� ���� ������ ������� ����� �����������B�������& �����������& � ������� ���B���� � ������ ���� � ��� ����������� �7�(� �� ���& *++1�� ��� ����� ���� !���#� ���� ��� ��� ��� � ��� ���������� �� �� �� ��$���� ���& ������� �� ����� ����������� �!��������2����� �� ���& *++1� � �6"1@& � �������� �����������"�4������ �� ���& *+++�& ��� ������� �� � ��������������� "�� ������� � ��� ����� � ������������������� ������ ���� � ������� ��� � �� �4���%7�� ��� �� �� ��� �!������� � � ����� ����� C2��� "���D � ����� �� �� %7� ������� ��� ��� �� ���& ����� ��������� ��� � !������ ���������������������� ��� ������� & � ��� �������� %7�������� ��� ��� ���� �� '"$�/' �:�(��� � �� ��� & *+++��

��� ����� ��� ���� �� ��� �� ������� �������� ������ ��!�� ��� �� ������� �� ������ �������� ���� ���� �� ��� ������ � � �!�������� ��������

�� �!��������� ���� ��� �������� ���� ��� ���������� ��� �� ���� � ���:& ������� � �������������� ����� � �������������� �=������ �� ���&*+++- ?�������� �� ���& *+++�� E�� ���� ����� ������ �����& ���� � ���: ���� ���������� �� ���������� "������� ���� ��$�� �����& ����� �� ��������������������� �������� �� �� �����& ��� �� ���� ��� �� �����$� ��� ��!���� � ���: ��� �� ������ ��� ������ �=������ �� ���& *+++�� 6��������& �� �������� ���& ��� ��!���� � ������� �AF� ���������������� /�'�@ ��� ���� ���� �� �� � �� ������������������ ��� ����� ��!� ���� ��� ��� �� ��� � ������� ������ ������ ������� � ����� �)���� �� ���& *+++�� ���#�4�� � ������ ������� ������ �������F���� �� ���& *+++��

����� ���� ��� �� �� ���������� � ������� ����� � �������� ��� ������������ ������� � � �������:������ ���� � ��� �� � � ��� ��� ��� ��������� � ��� ����!���& ��� �� ������� ������� ��

���� �� "������� ������� ��� ����� ������� ������������� ����������� � ��� ������� �� ����� ����������� ����� �� /562�"�� ������ ������ ������ ��4� ���� ��� ������� $���� � ��� ����� � ������ ���(���� ��� � ����� ���� �� � ����� � ��� /��������������� ������ � ��� � � �������� �G�3 ��& **�� �:� 7������ ������ � ��� ������ ������� �/� 2������ ������ ������ � ��� � � �������� ������������� �%� �' ������ � ��� � � �������� �G�* ��& @G�� 6���� ���� ��� *G ��� '� ����������� �������������� !������ ��� � ��� �� ������ ���� ��� ���������� !������ ��� � ��� ���� ����� ���� �������� �� � :��$'� 2'/.GG ������������� ��� �� �������� ������& ������� ��� ��� �� � ���� '�: ������ � � ��� ��������� � ����� �� � ����� ������ ��� �������� � ��� � ��� ���� ��������- �:� 756��� 609G �') =�>���� � 2' )���& ��������� ��������- �/� ������� ���� ������ ������� ��� ����� ����� �=�>���� �� ���& *++,�& �& ��-�%� �' ������� �����& 7$������� ������� ��� ���������� !������� �������� � /$������� )%�5 �)����� �� ���& *++,��

�23 ������� �� ������������� +��

�� � ������� ���� )���!��& ���� �!� ��� ������ �������� ��!��� � ��������� � ������ �������� �� �� ����$����� �� ��� ����� ��� �������& )����� �� ��� �� �� �#���� �� ����� ������ ��������� �������� �������� ����� ��� ��� ��� ���������� � ��� �' �)������� ���& *++,�� ;���� �� �� ���� ������� � ��� ������$��� � ����� ����� ������� � ����� ���� � ������������& ��������� ����� ��!� ����������� ������ �)�� �� �� ���& *++,- 5�� �� ���& *+++�� �������$����& �� ������ �������� ����& � ������ �����& ������������� ���� � ��� ��� $���� ������ ���� ���� ����� ����������� ��������� "�� ������� � ��� ���� �������� �� �� ������ ������ ���� ��� � �� � ������������� � ��� ������� ������� 2��� �������� ���$���� ���� �#������ ���������� ��� ��� �������� ���� ��� ��� ��� � ������� ���� �������� �� �������������� � ��� � �����& ��� �������� �� ��������������� ���� ��� ��������� ��� �����!� �=����� �� ���&*++<�� /�!������& � ���� � ��� ������ � ������$����� ����� � ��� ������� ������& ��� � ������ �$��� ����� ���� ������ ����!� ������ �� �� ����������������� � ��� ������ � ��� �� ��� �� �� ���4������ � ������ ���� �

������ �������� ������� �� ���� ��� ���� ���� ��� ������� � ������� ���� ��� ����� ������ ��������� �� �� �� ���������� � ��� ��� � �����������& �� ���� ������ �� � ���������� �� ����������7�����!� ������� � ���� ���� ��� ������ ������� � �������������& ��� ��� ���� �!� ��� �������� ���� �����!���������� ��!� �������� �#������� � ��������������� ��������� ������ ���� ������ �������� ��������������� ������ �� �� � ����$������� ������� ������ ��� ��� ���� �� ���� �� �� � /$����������& ������� ������ ��� ��!�� � ��� �����������;�� � �� ���& *+++�� ����� � ��� ����� ������� ���� �������$�� �� ������ �� ��� ��� ���� �� ������������� �� �� � ���4 � ���������� � ��� ����� ������ � � ���� ���������� �� ���& @GGG��

. �������� �������� &��� ���

�� ���� �� �������� ����� ���������� ������� ��������� & ��� ����� ���� ������ �������� �� ������������ �� �� ��� �� ��������� �������� � �������$��� ����������� �=�>����& *++1�� "�� �������� � �������������� ��� �� �� ��� � �� �� ���� ��������������� ����� �� �����& �� �& �����& ��������& ������������� ����� ���������& � �����!���� � ����������� ���� �!������� �� �!�������� ��������5����� ���� � ��� ��� ������ !������ ���� � �������� ���� � ��� ���� ���� �� ��� �� ��� ���!�������������� ����� *& @��

6�!���� �!���������� ��!� ����������� ������� ������� ��� � ��� ����������� /������!� �� ��� ��!� �����

� �������� ��� �������� � ��������� � � �����$�������� ��� ��E6� ���� ���� ������ � 756 ��� �� �� ��� ��� �������� ����� ������� ������� ����� �� ��� ��� � ������ ����� � ��!���� ������� ���� ����� �/������!� �� ���& *+++�� F������� ��� �� � ���� ������ �� ���� ���� �E6 ������ ������� � ������ � ��� ������ �������4 �� ���& *++,�& �- !� ������ ���& *++1�� "�� ������ ������ ���� ����� �756� ���609G ������� �� ��� ������ ��� ����� � ������������� ���� ���� ��������� ����� ����� *:� ��� � �����$���� ����� � ���� ������� ��� ���� ������ ������� ��� ��������� �') =�>���� � 2' )���& ����$����� ��������� � ������ ����������� ���� ��!� ���������� � ���� ����� ��� ��� !������ �%� 6����������� ���& *++1�& ����������� �2�� �� ���& *+++�& ������:��!�4 �� ���& *++1- ���� �� ���& *+++�& ������� ����=�>���� �� ���& *++,�- ?���� �� ���& *+++- 5��� � 5��!��& @GGG- ���� */& @%�& ������ � �=�>���� �� ���& *++,�& �-)� �4� �� ���& *+++- H�� �� ���& *+++- "������� �� ���& *+++-=�>���� � )���& @GGG- ���� @�& <�& �����4������=��� �� ���& *+++- E� � �� ���& *+++- )��� ��� �� ���&@GGG�& ������ ������� �:����� �� ���& @GGG�& ���� �����6���� �� ���& *+++� � �' �)����� � 6�������& *++1-���� *%& @/��

"�� � ����� � ���� � ��� �������� ���������� ������� �� � ��� ����B���� �� ������ �� ���� ���� �� �� ������� �� ������ ��������� �� ��� ����� �����$������ ����� � ��� ����� "�� � ����� � ����� ������������������ �� ���������� !������ � �� �� ������ ��!����&����!��& � �������� ����������� ����������� ������ ����� �� �� ����� � ��!���� ���� ���� ����� �����#� �������� ���� � ������� ��� ����� �� ��������� � ���� ����������� ��� �������& �����#� �����$��� � ������� ��� �� �� !���#� ���� ������� ����$�����#� ��������� ��� �=�>���� �� ���& *++,��& � ��$������ ���� � ��� ���� ��� �� ����� � ��������$����� ����������� �� !���� ����������� ������ �����

������ ���� � ������������ C����������D ���� ������ ������� ���� ��� �� ���� !����� "�� ��!���� ���������� !������ ������� ������ ������ � ��� ������ �� ������ ��� ���!� � ��� �� ������� ��� !�������������� � ���������� �8���4� �� ���& *++,�������������& ��� �� �� ��� �� ����� !���� �������&���� �� ��� ��!���� ������ ����� �� ���& *++.� �������!� ��� ���������� � ��� !����$��� � ������ �������������� ����� ��� ����� ������� �������� � ���� ������� �� �� � ��!���� ����� ������ �F���� �� ���& *++1-5� ������ � :�����& *+++��

;���� ���� ����������� ����������� ���� �� ������� �� ���� ���� ��� �������� ��� ��� ��� ������ � �������� ��� ������ �� ��� ����� �������& � �����$���!� �������� �� �������� ���� ������ � � � �� �������&����� � ����� ������ ������ �� �� �������� �6!�� � 2�����& *++<�� � ��� �� �� ����� ������� ��� ��� ������� �� ������ ������������ �� ��������

+� /���� ��� 01 ����

������ ��� �25 '�� & 6 ;����& /� 6����& 2')���& ��������� �������- 6� ���! �� ���& *+++� �� ������������ %7� ����4� ����� �� ���& *+++�& �������� ��������� ����� ������� �������� ��������� ������ ������ <�� =�� � 2����� ��!� ��� � ��� �� ������� �� � ��������� ��������� ���������� ���4�� �� ����������� %7� ����������� !����� � ��!�������� �������� ����� ���� ��������� ������ ��=�� � 2�����& *+++�� ��� �� ���� �� �������� ��������� ��� ����� ������������ ������� �������������� ��� �)����� �� ���& *++1� �� �����������������(����� �=������� �� ���& *+++��

F � ���� �� ������� ������� � ������������ ����� ���� �����& �������� � ����������� ���� ������� �� ������� ���� ����� ������� �� ��������� ������� �����4� ��� �������& �������� ���� ��������� ���$������� �' ���� �� ��� �� �����!� ������� ��� �' ����� �� ������ ���� ������� ������ !����

���� �� "������� ������� ����� ��������$������� ����� ������� ��� ������� �� ����� ����������� � ����� �� /562� ��� /������������� ��� ������ � � ��� ������ �& �:� � ��� ������� � ������& �/� ��� �' �� � �%� ������� ���� "�� ������ ��� ���(������ � ������ ��4����� ��� ������� $����� 7������ � ������ ���(���� � ������ ������ ������ ��� ��� 9*�* ��& �:� ..& @ ��& �/� @,& * ��& �%� 3G& @ ��� 6�������� ��� *G ��� "������� ��� �� ��� ��� ����� � � ����� ��� ����������� ��� ������ ������� �=�>���� �� ���&*++,��- ����� ������ ������������ �� � ���� *�

���� �� "������ ������ � � ���������� ������� ������ �������� ���� � ��� �� �� ����� � �� ��� ������ � ������ ��� �������$��� ��������� '� ����������� �������������� � ��� ����� �� ������� � ���� *� 6���� ��� �� *G ��� 6�������� ����� ����������������� �25 '�� & 6 ;����& /� 6����& 2' )���& ��������� ���������

�23 ������� �� ������������� +��

�'������ � :�����& *++1� �� ������ ������ !�����/������ �� ���& @GGG�� ��� �������� � ������ � ����� �� ������������ !������� �� ��������� � ����������������$ �#���� �����& � ����� ������� ������ ���� �#���� �� �����!� �� ����� �����������

8� ���� ���������� � ���������� �������� ���������� �� �� ������ �������� � ���� ������� �� ������� ����������� �� ��������� ����� ��������� ����������� ��� ��������� ���� ���$������� ����� ���� ���������� ��� ���� ����� �� ��� ������ ������������ ���& *+++�� F� ��� ������ �������� �� ��� ��� ����$������ �� � ���4�� �� ������� ���$������� ���������� ����������� ���� ��� �� ������ �������� �� ������� ������ �����

��� ����� �������� ! ������� � ���������

� ����� � ����������� � ��������� ��������� ���������$�������� � ����� ��������� �� ��������������!���� � "���& *++@�� ��������� � ��������������������� �� ���� ����� �#�����& �� ������� ������ � ������ ������ ����������� ���� �!������� �� �!�������� ������� ��� �� ����$#��� �� �#���� ������ 8����!����� � ������ ��������� � ��!���� � ����������� �� �� �� ��� �������� ���� ���� ��������� ������ ����� �������� �� ���������� ��� �� �������

� �� ���� ����������� � ���������� ��� ����$���� ������������� �� ��!������� ������ ��� ������������ � �������& ������� !������ ���� � � ���$������� ��������� ���� ���� ��� ������������� �� �� "� ���& �������������� � ��������� ���� ��� ��� ��������� �������� �� !������ � �� $��������� ������������� ��������� ���� ���$������� ������� ���& �����&�� �' �=�>���� �� ���& *++,�& �- )����� � 6�������&*++1- ���� *��

8�� � �� ������� ��!� ������� ������� ����� �������� � ����� ���� ��� !������& ��� �������������������� � ���� ����� ��� ��4��� �� ������� ���� ��� ��� ��� �� ������ /�� � ������ ���������������� ���� ��� � ��������� ��!������ ���� ���������� � ����� ����������� �� !������ ���� ��������� ���������� ����� �� ���� �)����� � 6�������& *++1& )�����& *+++�� )��������� � ������� ����� �������� ����������& ������� ���� ���������� � ������& ��!� ��� ������� � ��� �������� �� ����� �������� ���������� �2�� �� ���& *+++�� F����� �����& ���� ������� ��� � ����� �'� ��� �����& *++.�& �� ���� ������� ��� � �' ����� �� ���&*++.� ���� �� !������ � & � �������� � ������������� ���� ���� ������� �� ������ �!��� ���� ���� �!���� ��������� �� ���& *+++��

��������& ��!���� ��������� �������� ������ ����!������� �� ����� ����������� ����� �� ������� ���

�� ���� ����� ���������� ��� ���$������� ������������)�����& *+++�� ������ ����� �!������� ��� �� ������ � ����� ��������� ������� � ��������� ������� !������� ������������ �� �� � ���� �� ����� ��������� ������ �2����� � 5��������& *++,�& � ����� �� ���������� �� ������ �������� ��� ��� ����� ���� "���� ��$����� C����������D � ��!� ��� ���$���4 ���� � �������� ������� ���� �� � � & ��4������ �� �� !�������� �� ���� ������ ����� � ��� ������������ � ��$�����& � ����� � ����� �� � �� � ������$��� ���!���!� ����# �� ���& *++1�& ��� ���� �!�������# ���������� � ���� ����� � ��������� ���� ����

������� �����!���� � ����������� � ����������������� � ���� ���� ��������� ��������� � ������ ������ !������� ����������� ������� ������ ������������5F2� ��� ����������� ��� ����� � �� �������� �������������� ������� ��� !������ ������� ����� ������$���� �������� ���� �� ���������� �������4�4 �� ���&*+++�� �5F2 �� ���� �� ��� � ��������� �����'�" �����#����� �� ����� ��� ��� !����� ������������������ ����� �;������ � :�������& *+++��

��� ! � �������� ! �������� &������ ���������

/��� ���������� ��� ��!���� ���� ����������� ������ ���� ����� � ���������� � ���������� � ����������� ������ ��!� ���� ��� �!������� �� �������� ���� � ����� ������ � ������ ��������������� ����� ����������� �� ����� ��� !������ �������!� � �� ���� �� �!������ � ������� ��� ��$���� � ����� ������������ 2� �#� ���� ��!���� ������� � ���� �� ���!� �� � ������� � �)&������� !������& ���������& ������ �� �������� ���!������ ���� ������ �)$ ��� �� ��������� � ��������� ������� ���� ��� ��� � �) � ��� �������&������& � ������� ���� ������ � )�5� ����� ���� �� ������� ������� ����������� � ��� ���� �������� ����������� �5����� �� ���& *++1�� 2���������� !������ ������ ��� �������� � ����� ����� �� ����� ��� ���� � !������$������!� =� ����� �6����� � F����& *++,�� "� �����!� �������� ����!���& � ���� ������$��� ��� !����� �:��� � � ��� !����� ���� ��4� �� � �������� ���� � � ����� ������& � �������$���� '������ ����� "����� ��'�"� ���� �����&���� :�� �� ��� � ��� �� ��������& ����� ������������!��� ������� & ��������� ��� ��� � ������������ �)��� � "���& *++.�� 2���� ��� ���� �������� �� �����$�� �� ��� !������& � ������������ � ��� ������� � ���������� ����� �� ����$����� � ������ �� ������������ �'����� �� ���& @GGG��� �� ���� �'�" �������� � � �������� ��� ��$����� � �����$�� �� ���� �:��� �� ���& *+++��6��������& ����� ��������� ��� ������� �C��������D�

+�, /���� ��� 01 ����

��!� ��� �� � �� ����� ������������ �������� F ����������& ������� � /�@� ���������� ������� ������ ������ ������ � ��� ��������� ������ � � ������ ��������� ������ �2�����4� �� ���& *+++�� 8����� ��� ������& ��� ��� ��� � ��� �������� ������ ������� � ����� �� ���� "��� ��!� ��� �������� �� ������ ������� ������ � ���������� ���� ���������� �� ���& *+++�� � ������ ������ ���� � ������� ��4��� ������ �!�������& ���� ��� ����!��� ������!���� ��� !������ ���� �������� �� �� ����������� ��������� ��� �������� & ������� � ���� ������ ����� �:��� �� ���& *+++��

�'�" �� ���� ���������� �� ����� � �� �����!� ������������� � ��� ������� ����� �� ���������� ���� ����� ��!���� � � ������ ��� �� ������������ ������ ���!��� �� �����4 � )���& *+++�� "��������� � ��� ��� �� ��� ��� ������� � ���� �������& ������������ � ��� ������� � �������� ������� ��� ���� ��������� ��� ��� �����!� �� ���$�'�"�2���(� �� ���& *++1��

F������� ����� ������ ���������� � ����$���� ����� ��� ��!�� ���� �� �� ���� �� ���������������������� � ��� !������� ���������� ������������� �� ��� � ���� ����� ����� ��� ���� ���� &� � �������� ������� � �� ������ ���� �� ����������� �� �� ������� � 2��� ��� !������ � ��� ��!���� ������� �� ���� ������������� �� ���� ����������� �� !���� ��������������� �� � ������ ���� ����� ��5����� � ����� ���� ����� �� � �����& ����!��& ���� ��� �� ����������� ��� ��� ��������� ����� � �����"�� ��!���� � ��� ��� ��� ���� ���� ����� �������� ����� � ��� ���� �� ��� �� �����!� & � ��� ����� ����������� '���!��� ���� ������������� ��'������� ��!� � �������� � ��� ����� ���#���� � � � ������ � ��� ������ � ��� ��� ���� �� �������;���� � 6��� ��& *+++- 6�������� �� ���& *++,�� ������� �������� �� ��� ���������!����& � ����� ���� � ����� ����� �� ��!� � ����� � ���� �����& ��������� ���� ���� ��� ��������� �� ���� �� & � ��� ����� ��!���� � ��� �� $������� ��������� �� �����!� ������� �� ���& *++,�� "���� ��������� ��!� ��� ��� ��������� ��� ����� � ��� � ��� ���� ������������ ����� ������� ��� ������4�� �� ���& *++1�� ����� � ����� ����� ���� ������� �� ���& *+++�& � �������� ����� �� ���������� �� ���� ������ �& ����$��� ���& � ������ '������& ��� ����� ��� ��������!� �� ��� ��� � ���������� ���������& �������!�� � ���� �#� ������������ !����� �� ������������������� � ��� ����� ���#���� �:��� �� ���& *+++��

:��� �'�� � � ������ ��������& �����������5��� � ������������� ��5F�� �� ��!��� ������� ��������� ������ ��� ����������� �� ��� �'�� � �5F� ��!� ��� ����� !������� �� ��� ��� � �������'���#�4�� � ����� ����� �/��� �� ���& *++.- A��� �� ���&*+++�� F �����& ��� #��� ���������� � �'�� �

�5F� ��� �� ������ ������� ������ � ���� ������������� ��������� ������� ����� ������� �����������C���������D� �����!� ��� ��� ��� ������� �� ��������� ������ �=�>���� �� ���& *++,��� � ����� ���� ���� ��� ��� � �� � ��� ������ ������ � ����� 9��&������ ���� � ���������� �������� ��� � ��� ���� ���� ������ � 6�� ���� � �����& ��� ���������� � ������� ���� ������ �� ������� � ���� � ��� �����$ ���� ������ �� ������� � F � �5F� ���������& ������ �� ������ ��� ������ ������ � ��� ���� ���� ������� ��& �� ���� ��������� ������ ������� ��� ��� ������ �� ������������ ����� 9:�� "�� ���� ������������ � ���� � ���������� � ���� ������ �& � ���������� ��������� ��� ����� ������ ���� �=�>���� �� ���&*++,��� 2��� �������& �5F� ��� ��� � ������$������� ����� �� ������� ��� ����� � ������� � ������ � ������� �������� ���� ��� ������ � ��!� ������� ��������� ��� ������� ���� �� ������ �� ��� ���� �������������� @��� ������������� � ������ �� ��� ��� ��������� ������� � ���� � ���������� ��� � ��� ���� �$��� ������ � � � �� ������� ���� �� ��� ������� ���� ������ �� "�� ������� � ��� ���������� ����� ������� � ����� ���� ������ � � ������ ����& ������ ��� ����4�� ��������� � � �����4 ����� @��&���� � ��� ������ � ����� ��� ������ ������� ���� � ��������� ��� ��������� �=�>���� � )���& @GGG��"��� ������ �������� ���� ������ ������ ���� � �������������� �����4& ����� �'� ������������� �� ����� ����� � �' ������� � ���� � ���������� �!����� ����� �' ����� � ����� ���� ���� ������ ������ �� � ����� ������ ���� ���� ������� ��� �' �A����� ���& *+++��

� ��������!� �� �'�� �� ��� ���������!���� ���������� ����� ���#����� � ��� ����� �� �����$������ /��������� 6����������� ��/6�� F ���� ����� &

���� �� %������ � ������������� ���������� ������� � ������ �������� ������$��� � & �����������$������� ��� �=����� �� ���&*++,��� ��� �'�� ������ ��� �� ����� ��� ����� ������ �� ���� ���������� ������ �� F ��� �� ������ �2�& ��� ��� ������� ������ ���� ���������� ����� ��� �������� ������ ���� ���� ������$����� F ��� �� ��������� �6�& ��� ������� ������ ���� ����� �$��������� � ��� �������� ������ ���� ����� ����������� �:��5F� ������ ��� �� ����� � �������� ������� ��� F ��� �� �������2�& ���� ������ � ���� ���� ���������� �� ��� ��� ���� ���!���������� ��� ��������� F ��� �� ��������� �6�& ���� ������ � ���� ���������������& ��� ��� ���� ���� ����� � ��� ������ ���� ��������������� ����������� ������� � ����� ���� ��� �� �������

�23 ������� �� ������������� +�+

���������� � � ����� ����� � ��������� ��!�� �� ��� � � !��� ����� !����� �� ����� � & ����������� ���� � ����� ���� ���� �� �� �����!� �"������& *++*- I� �� ���& *++.- 6������� �� ���& *+++�&��� "��� �������� ���� �� ������ �� ������� ������� � ����� � ������$������� ��� �� ���� �=�>������ ���& @GGG��

. ������ ��

=���� �� � ��� ��������� ����� ����� ������������ �������������� �� ��!� ������� ��� ���� �� ����������������� �� ���������� ��������� �� �������� ����$������ ���$���� ����� � ���� �� ���������� �� ����$�� ���� ����� ��� ����� � �������������� � ��� ����� ���� �� �����!� � ���� �����$����� ��������(����& ��� ��� � ��� �������� � ������� ������� ���� ����� � ��!���� ������� ���� �� ��� ������� ���%7� �������� "�� ���������� � ����� ������� �� ��� ���#� �� ��� ���� ����� �� F��������� � ���������� �� �� ����� �� �����'�" ����� �� 2�!�$��� � ������� ����� ��� ���� � ���� �� �� ����� �/��������� �������� ���� ��� ���� ��������� �������� ��� �� �& ����� � ����� � ����� ������������ ��� ����� � ��!���� ���!������ �4�� �������� ���������� ���������� � ��������� ���� ����������������� ��� ������ �� �� ��� �� ���������� ���� � ��� � ����� ����������& �) � !������& �� �� ����� ����!��� � ���������� � ������'��& �5F� � �/6 �� ��!��� ��� �������� ����������������� ����������� � ����� � ��!�$��� � ��������� ����� �� ������ ������������ ���� ���� ��� ���� ������� � ���� ���� �������� �������� ��� ������� ����� ���� � ��� ���� �����

/���������� �������

6����������� 2������� �� �!������� �� HI: 8����

��(� &�������

'������� �� ��� ������� ������� ���� ��� �������� �� �������� :��������� ������� � ��� %�������� � ������%� ��G@$1+�'*9G<G� � ��� 7������ 6����� ��� �����2/:$+1G1*G*�� ;� ���4 6��� ;���� � 2����� '�� �����!� �� ����� ��������� ����� � ������������ ������������� $��� � ����

�!����

�� �� ���� ��� ��� ��� ����� �� ����� � � !�"��" ����#�"��$�" �%� *+++� /������ ������� � ������ ������������������ ������� ������ � ���������� ���� ��������� ����� ����� ��� ,@,J,<9�

&��"$ �� '�#��"��� (� ����� � � *+++� /������� �������$��� � �������� ������� ����� ���� ��������� ��������

����������� �� � � !������� ����"# �� ��������& �� ���**@9*J**@9.�

&�)�"�� �� ��*��* �� *+++� 2��� ����K � ���� ����� ������ ����� ���� �� ������ ������� �� �#� ����������������� ������ ����� � ���� ������� ���� 9@G,J9@**�

&��#��++ �� ,����-� �� ����$�)� � ��-� �� @GGG�5����� ���� � ��'��9 � ��'8�. � ��������� ������� ����� ������� � ���������� �������� ��'���%**��� ���� ������ ����� �������� ����� ��� 3*3J3<G�

&��.��� �� /��"�� �� ���0� �"�* �� ��"0�� &� &�00�"�$�� �!���� �� *++1� 6���4� � ����4�K ��� ���� ����� ������������#�� � � ������' �����4� ��� ����� ����� ���99*J99,�

&"��� 1&� 2� 1�� '��+� 2� 2�33 22� *+++� 2���������� ��������� ����� � ������� �� ���������� ������$���� ������������� ����!���� ���������� ����� ���@1<,J@19+�

��"�00� �1� �0��.�" �� ,�� ���0 �� 2���� �� ,�� ��--��&� @GGG� /����� ������ !���� ������ � ���� � �����!������������ � � �������� ��������� ��� �� ������������� � �� ��� �� � �� ���� ������� �������������� � ������ ��� .33.J.3.<�

���4� �� �� � 1����"#��� � 2�"$ 22� �"����" (�� *++9����� ��������� ������ �� � ���4�� �� ��� ����������������� ��� 1G@J1G3�

���� 2�� 5��� � '��� 2� !�"��� �� ��3�6���� !� ����� ��*++.� ������� ��� �� � !���� �������� � ������ ������������ �� <@3J<<G�

��60��.� 1� ��#�� �� �3"��0� (2� *+++� ���� ��������������� ������� �� ��� ������& � �������� ������������� �� ��� ��� � ���� �������� ������ � ����� �.93J.39�

��� 5&� �-�0� ��� �#���6 5� ��"����� �� 1$�$�� ��������#�007�#���"0* �� *++.� %������� �������� � ������������ � �������� � ��!�� ������ ������� ��� ,+,J1G*�

��"-�#� &�� ,�$�.�� �!� ����� �� *++.� ��/6$������ � ������ � ��� ���� ��������� ������ ������ ���� ���<<J<1�

��3�00 &� !��- �� $�-� ��� &�6$ 1� "��� �� ����� � �*++3� E ����� ��& �����!�� � ���� ���� ����������������� ������ �� ���������� �������� ��� 991J933�

(�.�� ��� ,��"�0"� �(� *++1� 6������ ���!���!�� � ������������� ������ ����� �� ��� � ���������� � ������������ �������� ����� �� 3@*J3@1�

(� �����3������ 7�� ��"�� 5� ��"#7��"0�� �� 5������ �7��*++1� 6����#� ����������� � ��� � � �$��� �� !����������������� !�� � /$������� �������� �$�� ���� �������������� ��� ����� ����� ��� 99+J93,�

1��3�"� �� ������#�007�#���"0* �� �"���6 ��� *+++� %���$������ ������ ���� ��� !������� ������ �� ���� ������� 3@J3.�

1���0* �&� ��"�00� � � 2�+ �71� �0�#� �� ���3�" �� *++,����������!���� ���� ���� ��������� ������ �� � ������������ �� 1G+J1*@�

1���0* �&� ��"�00� � � 2�+ �71� �0�#� �&� ���3�" �� *+++������� �������� � ��� ��������� � �� ���� �� ���� ���*+,J@G<�

1�� &�� ��$��00 !�� !������ �� &��#� ��� *++.� ���� !������!���� ������ ������ ����� ���� � ���$����������� ���� ��� ,3J,+�

1�� (� (�"�3�"��" (� �-�"$ ,� �0"����" �� ��6� �� ���� ���0�������" !� *+++� "�� 7$������� ,, ���� ��� � ���������� !$�������������������������� F ��� ��#���� ������� � �������� ������ � ��� ����� ��������� � !������������ �"���� ������ ���� ������ ��� *.+J*,<�

+�) /���� ��� 01 ����

���-���" &�� %��-����" � �#�"��$�" (� 2�33�" !������� �� @GGG� ���� ��������� ������ ������ �� ��������� �� ������ ������ ���� � �� ���� �� ����� ����� ����������� ��� 9G.1J9G,.�

���"-��� �� /�"0� 2� !���-��� �� *+++� � �������� ����� �� �� ��� ���� ��������� ������ ����� �� � !���������������� � � ��"#��"���� ���� ������� ��� ����� �������� <3<J<.*�

�3"��0� (2� !�"*��3�"� �� �$�"��� ��� *+++� �������������� ������� � ������� ��������� � ������ ����K���� ��������� ������� ������ �� ��!����� ���@+.J<*3�

�.�* �� ��#�� /� &��-�0� 1� &"��� �� �$� �� !�$��� ��*++1� 2������ ���� ������ ���� � � 7�%�$ ��� ������������ ��� ������� ���� ��� �� ���� ��� ������������� ������ �� � ���4��� ���������� � ��� "������������� ��������# �� ��� ,1*<J,1*1�

"�6 ��� !�33�"$ ��� ����6 ��� 8�)0���� &� *+++� �����!���� ������ ������������� "����� ���������� ���**9.�

"�3���� ��� ���"��� 1� ��-3�"0 �� ��� �7�� +������� !�$�-���7���� �� ��""���0�� ��� �3"��0� (2�*++,�� ����$��������� ������ ����� �� �#�������������� ���� � ������ ������ ���� ������� ��� ���������� ��� 3,<J31.�

"�3���� ��� ��-3�"0 �� �3"��0� (2� *++,��/��������� ���� � ��� ������� ������ ����������� ���� ����� ��� ����� � �������� ������ ��� ����� �������� .13J.+.�

"�+4� &� $�-� ��� ����� � � *++1� 6����#� ��!������������ � ��������� ������ ��������� ��� � ��!� ������������� ��� @.+J@,@�

!����� (� ����" �� 5������ � ��"�� �� *+++� 7������������ � ������� � ����K ��I�8* �� ��� ������ ���������� ������$���� ������ ������ ������ � ���������� � ���������� ����� ����� ��� .+3J,G3�

!���*��� � � ��� (��3�" �1� 1--��� �,&� *++,� ������������� ������ �����!���� !������K ��� ����� � ��������������� ������� ������� � �������!� ��� !������$���� ���� ������� � *<*<J*<*+�

!����++ �� *+++� ��� !������ �� ������������� ������ ���!�� ������ FK =�� 6& 6����!� =& � �� ������ �� ����%����& 0��� 31� ��� ���� �����& *<+J*3*�

!����++ �� ���-�"��� ��� *++1� "�� ���� � ��� � ������ FK/���#� 2& =�� 6& � �� ����� &�������� ������' ����������#�����������# ��� ������& ;����& *+*J@@G�

!����++ �� ���-�"��� ��� �"����" (�� !�$�� �� *++,� '���!��� � ������� ���� � ����������� ������ ���� � ������������� ������ ��� ������� �� ���4 ������������������ ����� ��������� ���������� � ��� "������������� � ��������# �� ��� @*@@J@*@,�

!���*��� �� 8�$� �� ��-���� �� @GGG� "���$������������!����� � ����������� ������ ���������� �������� ��!�� ���� ��������� � ������ �������� ����������B ����� �!� ��� �� ��� ����� � �������� ������������ ��2���*� �������� ����� ��� ���� �������� ��� @99J@3G�

!�$0�� &� ���9��" �� ���$0 �� ��#�0�" 1� &�"��" �� 2���� �*+++� ���� ��������� ������ �� � ���4�� �� �!���������������� � ��������� '7� ����������� � ������ ������� ����� ��� ����� ����� ��� 33,J3.*�

!��- �� ����� �� *++.� �������� ���� ��������� �������� �����!� ���������& ����� ��!������� � ����������������� ����� ������� ������� ����� �� **,1J**1@�

!�33�"$ ��� ����6 ��� ���� ��� "�6 ��� *++1� "��������������� � ���� ��������� ������ � !������ ������ �����

������� ��������(������ ������ ���� ��� ����� �������� .@,J.<@�

%-�� � �"��"��0 1� ����" 5� *+++� /���$��$���� � ���$ ������ ���#�4�� � ��� ���� ��������� ������ � ��������� � ���������� ���� �� � ��� ������ ��� ��4�������� ��� ����� ���� ��� <G+J<@@�

%0�6� � 2�� �� ����0� �� &�� �� 5���� ��� (��� &�*++1� %�!��������� ��������� � ������������ ���������#�4�� ������� ������ ������ � ������� ��� ��� ����������� �������� ��� <,<J<13�

���� %�� 5��- &!� ��- ��� *+++� 6���������� �������� ����� ��������� ������ �� ������ � � �������� ���� ��������!� �� � ����$��!�� ��������� ������� �������� ���������� 93<J9.*�

����-�"� �� ��)���"� �� ���� �� ��0���"� �� 5���-�"� ����#��*��� 5� 5���0��� � �����*��� �� ������ �� ���������!� *+++� ������ �� '7� ���������� ����� ������ ������������ ����� ���� �������� ��& 1<@J19@�

���� ��� ����� �� *+++� ���������� ��������� ������������4�� �� ����4�� ������ ����������� � ������ ������"����� ���������� ��� +*GJ+*3�

��-�"� �� ����$� �� �6�*��� �� ���� �� ���-�-�0� ��5���-�"� �� *++<� "�� ���������� � � ��������� �� ��� ����$������ � ����� ������ ������� ���� �* �"���� ���� ��#���� �� ��� �������� � �$�������� ��� ��E6���� ������� ��� � �������& ���� � ����� ������ ����� ������������ �� <93J<33�

��"#��" �� 2�-�" �� 5�#� �� �����" � �#��+�" 1� !�"0�" ��*+++� 7������ ������ � ��� ������� �AF� ���������������� /�'�@ �� �������� �� ����������� �������������������� � ���� ����� ���� @G*J@**�

�����" /� ��"#��" �� !�"0�" �� &�0�#����" � *+++� 7������������ ���� � ��� ���������� ���� ����� �������� ������$������ @� ��� ����� ����� ��� @1+J@+.�

��:��" �!� ��� �� '��+� 2�� 2�33 22� !����� ��� *++,��������� � ������ ��������� ������� �������� ������������ ���� ������ �� ������� ���� @G<+J@G9@�

��:��" �!� '��+� 2�� 2�33 22� !����� ��� *++,�� "������ ��������� ������ �� � ���4�� �� !������ � ����������� ��� �� ����� ��� ����� ����� ��� .*<J.@*�

��:��" �!� !����� �� 2�$-�� �� *++,�� �������� � �����������K ������ ������������ ����� �� ���������� � ����� �������� ������ �� ���� ����� �� <+@�

��:��" �!� *++1� ��� �� �� ���� ������ � ��������������������� � ���� ������ ������ �� ����� ������� � <*,J<@G�

��:��" �!� !����� ��� @GGG� /����������$������� � !����$��� ����� ��� ������$�����#� � �!����������� �������� ������ � ���� ������� ��� 1*J1+�

��:��" �!� �#���� �� 2�33 22� !����� ��� @GGG� ����!��������� ������� ������ �������K !������� �����#� ������������ ���������� ������������� ����� � ����������� ��� <+@*J<+<G�

���3��#� �� !�33�"$ ��� "�6 ��� .�� &� �1� *+++� "��������� ������� ���������� ������ ������(����� ���4������� ��������� � ���4�������� "����� ������������� +G.J+G+�

���0 &� ������+�" �� ���� 57!� *+++� � ���$����� �������� ������ ������ ���� ���� #������ �� ���� � !������ �� ��� ���� �����4����� � ������ ����� ��������� ����� ����� ��� <+@J9G*�

��*�"���0* � � &��#�6 �5� *+++� 0���� ��!���� ������� �������� �� ������������ � ������������ ���#�4�� � ��������� ����� ���� ��� 3<3J391�

��++� ��� ��3�� �� �0���"0 �5� *++,� ����������� ����� ��������� ������ � ������ ��������(��� �� +*@J+*.�

�23 ������� �� ������������� +�*

��� !�� ��� ��� ���� ��� ���� �!� �� 5�� *+++� F� ������������� ������ ����� �� ��� ��!�� �����L ���������� ������������� )������� ���������� ���� ,*@J,*,�

����� �� �#��++�"6 ��� ��6����� � ��";���" � � ����� � �

*++1� 2��������� � ���������& ������� ���� � ������) � ����� ��!�� ����� ���� ���� ��������� ������������������ � ��� "������ ������� � ��������# ����� .1G<J.1G1�

����� (�� ���.�" ��� @GGG� 2������ ���$������� ������������� ��� ������������ � ������� ���� �����& �� �� ��!���� ����� ��!�� ���� ����� ����� ��*���������� ����� ��� 1.3J1,*�

����)�� 5� ���$�" �� &�""6 � �"$�� 2� !��- �� !�"-��

&� *++1� :��$@ � :�� ���������� � ������� ��� ����� ���� ���� ��������� ������ � ���������� ������������ ������� "����� ���������� ��� 39,J33@�

���� �� !�6���� �� 5����-�"� �� *+++� 5���� �����������������!� ������� � �� ��������!��� �� ������ � ����4����� ����� ����� ��� <G+J<@G�

��0* �,� �"�$��. �� ��3�� � ��.�0��6 �� '�"����6 �

��"���. ��� ���6���. �� *+++� ���������� ������� ���������������� ���� �� �������� "����� ������������� +.+J+,<�

���"�" �� "�.�$��� �� 2��0��++ �� ����� &� *++1� "�� ��/������ ����� ��� ��������� � �����#� ����������� �'7��� ���������� � ������� �������� ��� ������� ����������� <9@J<3*�

���0�� �� ���#0�" (�� *++,� ����������� � ��� ������������� ������ � ���� ������� � �������������"����� ���������� ��� +.*J+.9�

��6����� � "���3�#� /� !��- �� ����� � � *+++� %������ ���������!� /�@� ����������� ���� �����!� ��������� ���������� � ��� "������ ������� � ��������# �� ��� @*<3J@*9G�

��$��� ��� ��.6 ��� ���� ��� ��00� �� ���� �" ��� *++,�"���4�� � ���������� � �����!����$�� ���� ���������� � ���������� ����� � & �� $����� ���� ��������������� ���� ��������(��� ��� *.@J*.,�

��"��6 ��� ����"��� ��� *++,� "�� ����������K � �� ������ ��������� ������ ������� ������� ����� �� 1,GJ1,.�

5�)� �� %���� �� ��-�"� 5� ��$� � ���0� �� *++1� F�����$ ��� �� ������� � �� ���4 ��������� � ����������������� ���� � ����� ��������������� �!��!� � ������������������ ��� ���������� � ������� ����� � ����������������� ��� <@,<+J<@,93�

/��"�� ��� ��3�"0� � ���0� �"�* �� &��.��� �� �"��" (��

�-�#�-3� � *++,� E��� ��� �� ��� � !���� �!���� � ����� � ���� �������� "����� � 9G*J9G@�

���� �'� (�3��" (�� 2�� � � � ��60�� � � 5���" ���

"-�0"��� ��� �"6 �1� !��#��� �2� �"�-- �1� *++.�� �����!� ���� ��������� ������ ��� �� � !���� ���4��� ������ ����� �������� ���� 1+<J+GG�

��00�"��� !� ���3� ��� ���"�+ 2(� ���� ��� ���0�� (2�

*++,� E�� � ��� ���� ��������� ������ � ��� ������� ���������!� ���������� ���������� ��������� ������� @,1@J@,+G�

��"0����� � /.�#*�6 &� ���-���0��� �� �� � ,�"�-�� ��

*++1� '��� ����� � ���� ��������� ������ ���� ������� ���� ������� ����� � ���� ����� ����1@*J1@+�

�����"��� �� �;��"� � ��6 �� &��0����� �%!� *+++�6���������� ������� � �������� ���� ��������� �������� ��!� ����� �� ���������� ������� ������ ������������������ ����� �� @.+J@,@�

���0�� �� &"��� �� &��0����00� �� ��+0 �� ��**�� �� ��**�0� ��

*++1� 7�� ����� � ������� ���� �������� ��������� @9<J@3<�

���#� &� !��- �� *+++� E��� ��� � �'�"$����

������������ ������ �� ���� ����� �� 3,J.G����#�� �� &��#�6 �5� *++1� "������ ������ !���� ������

� ���� ��!��� ������������� ������ � ��� � ������������������ ���������� � ��� "������ ������� � ��������# �� ��� ***.+J***,9�

���#�� �� ��0��" �� 1#��� �� ��������-��" �� ���#* ��

�#�� �� ����� &� ���� �� *++.� ����� ���� ����������

�� ��� ��������� � � �$%���� �������� ���� ��������������� ����� � ���$ � ������� ���� ���� ���������������� � ��� "������ ������� � ��������# �� ��3111J31+<�

��#�-��$ �� ��������� ��� ���-���$� �� &�"��$�"+ �� @GGG�

������� ����� �� �� ����� � ���� ��������� ����������������� ��� ���������� )������� ������������ ����[email protected]

��**�0� �� &"��� �� (� ��"�� �� ����� �� !��- �� ����� � �

��**�� �� *++.� %����� �������� � ����������� ����������

���� ��������$������� ��� ������ �� ����� ������� ������� *1<J*11�

������$� �� ���$�� /� 2�3�"0 1�!� (�&��" (� *++,�

����� ��������� � ������� � ��� ��� ��� �� ������������� ������ �� �� �#����� � ��� �� � ������ ������������� ����� � +1+J+++�

�#�00 � 26�00 �� ���� �7�� ��3�"0��� (� �� 5�� *+++�

2� �� ������ �� ���� ���� �������K ��� ������ � ��!����� ��� ����� ������ ��������(��� ��� **@3J**<@�

�#����$�" �� ��0��" �� &��$��#� �� 2�� &� (��� ��

��3�"0� �� *++1� "�� '88" )�F'5�66 * ��� ��� �� �

������ ������ ������� �� ���� ���� �������� ������������ ����� ��� +�,������� ��� @G*<J@G@*�

�#���� �� !���0� 8� ���0� �� 2�33 22� *+++�� 2��������

������ � ��!�� ����� �����!� �� ���������� ���������������������� ���� ��$ � ���$����� ���������� �������������� ��� @@3*J@@.3�

�#���� �� ��"�#� �� 2�33 22� *+++�� �����������

���������� ����������� ���� ����� �������� ������!��� ����� � �� �� ��������� �������� �� *,.J*1@�

��$�"�. ,� ���0�� (� ���� �7'� !�)$������#* ��� �0��3 ��

��$ 5��"� 5�� *+++� 6����� ����������� ����������� �

������& ��� � ���� ��������� ������ �� � ������ ���4������ ����� ����� ��� @G+J@*.�

����� ��� %��#�++ 1 � *++,� � ���������� ��� � �������

����� � ������� !������� "���� ��� ,<3J,9*��-� %� 2��0* !� ���6� � ����� !� ��"��� !� *++1� "��

��� � ���� �� ����K ���� ���� ��� � ��� ���� ������� �� ��� �� ���� ������������ ����� �������� ������ @.3J@,,�

���-���0��� �� !���� ��� ,�"�-�� �� *++,� �������������

����!��� � ��������� ���� � ���� ��������� ���������$6.3" � ������� � �����K /���������� !�������� ����� �� ���� ��������� ������ ����������� � ��������� ������ ��������� ����� ��� *+GGJ*+G,�

�.�3 '� ����� �� *++<� )���$������� ������ ��������$

��� � ������� �� �������� �� � �������� �� � �������������� � ��� "������ ������� � ��������# �� ���+*<J+*,�

��������� !� ����-� 2� ���0� �� *+++� /���� � �

���������� �%7� ��� �� � ����������� ������ � ������������������ ������� ����� � �*���������� ����� ���*,*<J*,*9�

+�1 /���� ��� 01 ����

��"���" 8�� (���� %� ����� &� ���"�" �� /�-��" �� *+++�/��������� ���� � ��� ����!��� � � ������ $������� ������������� ������ � ����������� ������� ����� � ��������� �� @<<J@9G�

���-���� 5�� *++*� ����������� ���������� ������������� FK5�4���� H'& � � ����� �� &��������� ����������& 0��� *&7�� ?��4K ����� �����& <<,J<,1�

��3�� �� *++@� ����� ���������' �������������� � ����-%���� �� ������������ ������ /����� ��& ���� & 7��?��4& E6�K /����� �� E�!������ ������

8�$� �� ��0��6�-� �� !����-�0� �� *+++� 0������ ���� ������������� � ��!�� ����� � �������� ���������� � ���������������� ���� @G*J@G.�

,�� "��- � (��� <2� �0�#�6 � � *++1� /���� !�������� ��� ��������� � ���� ��������� ������ ���� �������� �������� ������ ���� ���� <3J9<�

<� �� '��+� 2� ����" �&� 2���-� ��� 2�33 22� *++.�2��������� ���������� ���������K �� �������� �� ����� ���������� ������ ����������� ���������� � ���"������ ������� � ��������# �� �� *G,.<J*G,.1�

�-���#�� �� 5���-�"� �� ��#��*��� 5� ��6 �� 5���0��� �*+++� 5����$ ��� �� ����������� � � �����������:$��� ���� ������ �� ��� ������ � ������������������� ����� � ���� ����� ���� 9<,J993�

���� 5� !�"��� �� ����-�0� �� ���-�*� �� ��3�6���� !�

*+++� 7�$�!���!� ���������!� ������� � ������������ �$�����& 6.3"$���� ���� ��������� ������ � ��!�������� ��� ����� ����� �� 933J9.<�

2�$� �� �0��$��� &�� &�"��$�*�� �� ��"�����" ��� *+++�

'��� ������$�� �� ����� ���� ���� ��������� �������"����� ���������� ��� .+*J.+3�

2��0� �� �0�*�" 1� *+++� ������������� ��� ��!����

������ ������ ��� � ��!� ������ ������ �� �������� ������� .*J.3�

2��0�"� ��� &��0����� �%!� *+++� ����������� �������

������ � �������� ������� 4���� ����!���� � ������ ������������ �� **@,J**<G�

'�� ���� �-�0� ��� ����#�#��� ��� 0�� 5� ��� 5�

1��3�"� �� !�"�#�3�"� �� �"���6 ��� ��3�"0� �!� ������ 1�

����" �(� ������#�007�#���"0* �� *+++� ����� �������� ���

������� ��� � �������� ��� ��� �' ���� �������� ������� 31+J.G*�

'�� <�� ��*��� �� ���0� �� /��$� �� ������ �� 5�������� ��

��0��$� !� ����-���� �� *++,� ������������ ����$

��������� ������� ��� � �� ��� ���� ������� ������6. ������������� � ������ �� ������ � � ������� ��������� �������� ����� �� <<*J<9*�

�23 ������� �� ������������� +��