AISLAMIENTO, CULTIVO, IDENTIFICACIÓN y DETERMINACION DEL COMPORTAMIENTODE BACTERIAS NATIVAS FRENTE AL MALATIÓN EN LOS SUELOS AGRÍCOLAS DE LA

CAMPIÑA DE CHILINA.

Jurgen Bedoya Brandacher, Eduardo Carrera Vizcarra, Richard ChavezRomero, Brian Málaga Téllez, Yoselin Sandoval Gamboa,

Universidad Nacional de San Agustín, Facultad de Ciencias Biológicas yAgropecuarias, Escuela Profesional de Biología

Palabras claves: Comportamiento, Malathion, Chilina, Bacillus spp., Pseudomonasp.

1. INTRODUCCIÓNLa contaminación del suelo consisteen la acumulación de sustancias comolos plaguicidas a unos niveles deconcentración que repercutennegativamente en el comportamiento delos suelos afectando a las cadenastróficas y al hombre mismo,volviéndose toxicas para losorganismos del suelo. A su vez laagricultura contamina los recursosnaturales existentes como es el casodel rio Chili que presentacontaminación por parte deplaguicidas como el DDT, Malatión yotros organofosforados que producenefectos muy adversos sobre elecosistema acuático y terrestre,produciendo la extinción de especiesde flora y fauna acuática y pérdidade la productividad de los suelos.

El ministerio de agriculturadetermino 3 focos de contaminación enel rio Chili los cuales son lacampiña de Chilina, el Valle Vitor yValle Quilca. Por tal motivo esindispensable un tratamiento de lasaguas del rio Chili con sistemas dedescontaminación que se basan en la

digestión de las sustancias orgánicaspor los microorganismos, las cualesutilizan tecnologías no impactantesal medio ambiente como es labioremediación por microorganismosdescontaminantes de plagicidas desuelos agrícolas evitando asi sufiltración a las aguas del rio Chili.

En el siguiente trabajo se tiene comoobjetivos la obtención de suelosagrícolas de la Campiña de Chilinapara su análisis microbiólogo, elaislamiento e identificación demicroorganismos obtenidos de lasmuestras recogidas, y a su vez elcomportamiento frente al pesticidaMalation (organofosforado).

2. MATERIALES Y MÉTODOS2.1. Lugar de estudio El valle de Chilina se ubica en laregión Sur Andina del Perú,política y administrativamentepertenece al distrito de Cayma,provincia y departamento de

Arequipa. A una altitud de 2 506m.s.n.m. y con coordenadasgeográficas.Latitud: 16º 19´28,2” SurLongitud: 71º 31´34,4” Oeste

Figura N°1: Áreas de muestreo

2.2. Obtención de la muestraSe visitó un medio de cultivoafectado por pesticida (Malation),la muestra se tomó a unaprofundidad aproximadamente de 5cm.; dicha muestra se depositó enun envase de plástico debidamenteesterilizado para luego ser llevadoal laboratorio.2.3. Aislamiento de la muestraEl método usado para el aislamientoes el método de dilución, la cualse pesó 1 g de muestra, este sepuso en un frasco se adiciono 9 mlde agua destilada, se agitasuavemente y se dejó en reposo por15 minutos. Seguidamente setraspasó 1 ml del sobrenadante, aun frasco de penicilina quecontenía 9 ml de agua destilada yfinalmente una segunda dilución ensimilares condiciones. Se procedióa realizar la siembra de la en el

agar nutritivo, se utilizó elsembrado por agotamiento.2.4. Determinación de bacterias

y pruebas bioquímicasSe eligió en función de sumorfología y color, tomandoaquellas que se encontraronaisladas para asegurar la pureza. Yse realizaron pruebas de coloraciónde Gram para su determinación y asu vez pruebas bioquímicas segúnBergey’s Manual of DeterminativeBacteriology; aplicándose latinción de gram, las prueba defermentación de lactosa en agarmacconkey y la prueba de laOxidasa.2.5. Curva de calibraciónSe realizaran la siembra de dosbacterias seleccionadas de 100 mlde caldo nutritivo, el desarrollobacteriano fue medido porespectrofotómetro a 500 nm se lesrealizo curvas de crecimiento cada2 h y a su vez el conteo debacterias con la cámara de Cámarade Neubauer. RECUENTO DE BACTERIAS

1.1. Prueba de tolerancia alMalathion

Una vez realizada la curva decalibración se procederá evaluaciónde la resistencia, los cual sepreparó un total de 5 tubos decaldo nutritivos enriquecidos condiferentes concentraciones deMalation (0.5%, 1.0%, 1.14%, 1.5%,

2.0%) para cada bacteriaseleccionada.

Tabla N°1: cálculo de lasconcentraciones para la prueba deBioremediación.N° deTubo

Concentración deMalathion

Cantidad deMalathion

Cantidad decaldonutritivo

1 0.5 % 0.05 ml 5.95 ml2 1.0 % 0.1 ml 5.30 ml3 1.14 % 0.12 ml 5.88 ml4 1.5 % 0.15 ml 5.85 ml5 2.0 % 0.20 ml 5.80 ml

3. RESULTADOS3.1. Bacterias identificadasPara la prueba de tinción de Gram;una vez realizado esteprocedimiento se observó enmicroscopio para su determinaciónde las cuales se obtuvo lassiguientes Bacterias:

Tabla N°2: Características bioquímicas parala Identificación de Bacterias

Bacteria Gram

agarmacconk

eyOBS

Bacillusspp. + Fermen

-Esporulada

Pseudomonasp. - Fermen

-Oxidasa

-

Figura N°5: tinción de Gram (Bacillusspp.)

Figura N°5: tinción de Gram (Pseudomonasp..)

3.2. Curva de calibraciónSe procedió a realizar la toma demedidas de absorbancia con unalongitud de onda de 500 nm (azul demetileno) cada dos horasobteniéndose un total de cuatromedidas para cada bacteria y almismo tiempo el conteo de bacteriasen la cámara de Neubauer,obteniendo los siguientes datos:

Bacillus spp.Tabla N°3: Datos de absorbancia yconteo de bacteriasTIEMPO ABSORBANC

IAN° bacterias x

UFC /ml(x10

5 cuadrado

4)

12:00 0.038 7 1.414:00 0.103 14 2.816:00 0.198 24 4.818:00 0.40 50 10.0

Grafica N°1: Curva de crecimiento paraBacillus spp.

0 1 2 3 4 5 6 7024681012

Tiempo (h)

N°B/ml (104)

Se aprecia un crecimiento exponencialde concentración de bacterias y tiempoen relación a la bacteria Bacillus spp.

Grafica N°2: Curva de Abs vs Tiempopara Bacillus spp.

0 2 4 6 8 10 12 140

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Tiempo

Abso

rban

cia

Grafica N°3: curva de calibración paraBacillus spp.

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5024681012

Absorbancia

NB/m

l (x

104)

La ecuación resultante de la curvade calibración en la bacteriaBacillus spp. es:

N° bacterias /ml = 21.667 xabsorbancia + 0.5574

Con un R = 0.9987 Pseudomona sp.Tabla N°4: Datos de absorbancia yconteo de bacterias

TIEMPO ABSORBANC

IA

N° bacterias x 5 cuadrado

UFC/ml(x104

)

12:00 0.037 5 114:00 0.094 13 2.616:00 0.157 21 4.218:00 0.510 43 8.6

Grafica N°4: curva de crecimiento paraPseudomona sp.

0 1 2 3 4 5 6 70246810

Tiempo

N°B/

ml (

104)

Grafica N°5: Curva de Abs vs Tiempopara Pseudomona sp.

0 1 2 3 4 5 6 70

0.10.20.30.40.50.6

Tiempo (h)

Abso

rban

cia

Se aprecia un crecimiento exponencialde absorbancia y tiempo en relación ala bacteria Pseudomona sp.

Grafica N°6: curva de calibración paraPseudomona sp.

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60

2

4

6

8

10

Absorbancia

N°B/

ml (10

4)

La ecuación resultante de la curvade calibración en la bacteriaBacillus spp. Es:

N° bacterias /ml = 15.138 xabsorbancia + 1.08

Con un R = 0.9841

3.3. Comportamiento de lasbacterias frente al Malathion

Una vez obtenida la curva decalibración se procede a calcularla curva de crecimiento para cadabacteria con los diferentestratamientos (0.5%, 1.0%, 1.14%,1.5%, 2.0%). La tabla muestra las curvas decrecimiento para cada uno de lasbacterias.

Bacillus spp.Tabla N°5: Datos de UFC/ml yconcentración de malathion.

Concentración deMalation

Bacillus spp (UFC/mlx104)

0 4 8 12

0.50% 27.00

27.04

27.13

27.15

1.00% 23.39

23.54

25.32

26.28

1.14% 25.13

25.27

27.28

29.62

1.50% 26.75

27.00

28.69

28.78

2.00% 28.30

27.83

26.62

26.59

Grafica N°7: curva de calibración paraBacillus spp.Con 0.5 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1426.90

26.95

27.00

27.05

27.10

27.15

27.20

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°8: curva de calibración paraBacillus spp.1.0 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1421.00

22.00

23.00

24.00

25.00

26.00

27.00

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°9: curva de calibración paraBacillus spp. 1.14 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1422.0023.0024.0025.0026.0027.0028.0029.0030.00

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°10: curva de calibración paraBacillus spp. 1.5 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1425.5026.0026.5027.0027.5028.0028.5029.00

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°11: curva de calibración paraBacillus spp. 2.0 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1425.50

26.00

26.50

27.00

27.50

28.00

28.50

Tiempo

UFC/

ml

Pseudomona sp.Tabla N°6: Datos de UFC/ml yconcentración de malathion.

Concentración deMalation

Pseudomona sp.(UFC/ml x104)

0h.

4h.

8h.

12h.

0.50% 29.76

29.76

29.81

29.83

1.00% 31.13

30.83

28.20

28.57

1.14% 32.15

30.18

28.49

27.77

1.50% 34.81

32.54

30.76

26.71

2.00% 35.81

34.88

28.14

24.46

Grafica N°12: curva de calibración para Pseudomona sp. 0.5 % Malathion

-1 1 3 5 7 9 11 13 1529.72

29.74

29.76

29.78

29.80

29.82

29.84

Tiempo

UFC/

ml(x

104)

Grafica N°13: curva de calibración para Pseudomona sp. 1.0 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1426.00

27.00

28.00

29.00

30.00

31.00

32.00

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°14: curva de calibración paraPseudomona sp. 1.14 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1425.0026.0027.0028.0029.0030.0031.0032.0033.00

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°15: curva de calibración paraPseudomona sp. . 1.5 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1425.00

27.00

29.00

31.00

33.00

35.00

37.00

Tiempo

UFC/

ml

Grafica N°16: curva de calibración paraPseudomona sp. 2.0 % Malathion

0 2 4 6 8 10 12 1424.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.00

Tiempo

UFC/

ml

Como se muestra en las gráficas labacteria Pseudomona sp. Presenta unacurva de crecimiento negativo apartir de la concentración de 1.0,1.5, 1.14 y 2.0 % de Malathion;siendo el Malathion poco tolerante yaque a la concentración de 0.5 %

empieza con población de bacterias de29.76 UFC/ml x104 terminando a las 12horas con una población de 29.83UFC/ml x104.La bacteria nativa del genero Bacilluspresenta una curva de crecimientopositivo en las concentraciones 0.5,1.0, 1.5 y 1.14 % de Malathion,siendo más tolerante al pesticida quela Pseudomona.

4. DISCUSIÓN Según Antolines N. et al 2007 la

degradación se debe a que todas labacterias tiene la maquinariaenzimática necesaria para utilizaral malathion como única fuente decarbono, sin embargo el compuestose trona toxico a mayoresconcentraciones según la prueba detoxicidad aplicada; a su vez elconsorcio de baterías degradadorasde malathion se encuentran dentrode los géneros Seratia, Bacillus,Pseudomonas poseen capacidaddegradativa del organofosforadoMalathion.

Según Morales O. 2009, Se hareportado para la degradación delorganofosforado Parathion bacteriastales como los géneros, Bacillussp, Pseudomonas sp, Flavobacteriumsp, de igual forma organismosdegradadores de Paration Metílicocomo Klebssiella sp, Burkholderiasp, Enterobacter sp, Citrobactersp; otros organofosforados como elFenetotrion, Coumafos y Malationtambién ha sido degradados poralgunos de estos microrganismos.

5. CONCLUSIÓN Se identificaron dos géneros de

bacterianas nativas: Bacillus spp,Pseudomonas spp.

Los géneros de las bacterias Bacillusspp, presentan un crecimientopositivo en las concentraciones0.5, 1.0, 1,14, 1.5 % de Malation,la bacteria Pseudomonas spp en laconcentración 0.5%.

6. REFERENCIAS Antolines N., Acero S., Martinez

Nieto P., bernal Castillo J.;2009; Degradación del malathionpor bacterias aisladas de la bahíade Cartagena. Colombia Cartagena.

Botero, L.R. y otros, 2011, Efectode la concentración del metilparatión y el extracto de levaduracomo factores de selección demicroorganismos degradadores delpesticida a partir de sueloscontaminados, Revista IngeniaríasUniversitarias De Medellín, Vol.10, Numero 19, Medellín, Colombia

Cruz, R.G y otros, 2006, Bacillusspp. Como biocontrol en un sueloinfestado con Fusarion spp,Rhizoctonia salani Kuhn y Phytophthoracapsici leonian y su efecto en eldesarrollo y rendimiento delcultivo de chile (Capsicum annuumL.), Revista Mexicana DeFitopatología, Año/Vol. 24, Número002, Ciudad Obregom , Mexico

Llenque L.A., 2011, Aislamiento eidentificación de bacteriasheterótrofas de sueloscontaminados con petróleoprovenientes de oleocentros de la

ciudad de Trujillo, Perú, Revistade la Facultad de CienciasBiológicas, Universidad Nacionalde Trujillo, 31 (2), Trujillo.Perú

Roberto Mosquera B, Gustavo APeñuela; 2009; Biodegradación delMalatión utilizando microrganismosnativos de suelos agrícolas;Colombia.

Roberto Mosquera B., Gustavo APeñuela, 2009; Biodegradación delmalatión utilizandomicroorganismos nativos de suelosagrícolas, Colombia

Páginas web http://www.uiweb.uidaho.edu/

micro_biology/250/IDFlowcharts.pdf http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20SOYA

%20TRIPTICASEINA.pdfhttp://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20NUTRITIVO.pdf

http://www.mcd.com.mx/pdfs/agar_dextrosa_papa.pdf