Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity

10
Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane ¯uidity Bjo È rn La Ârus O È rvar* , Veena Sangwan, Franz Omann and Rajinder S. Dhindsa Department of Biology, McGill University, 1205 Avenue Docteur Pen®eld, Montre Âal, Que Âbec H3A 1B1, Canada Received 5 May 2000; revised 23 June 2000; accepted 30 June 2000. *For correspondence (fax +35 457 07111; e-mail [email protected]). ² Present address: Technological Institute of Iceland, Keldnaholt, IS-112 Reykjavik, Iceland. Summary Many plants acquire freezing tolerance through cold acclimatization (CA), a prolonged exposure to low but non-freezing temperatures at the onset of winter. CA is associated with gene expression that requires transient calcium in¯ux into the cytosol. Alfalfa (Medicago sativa) cells treated with agents blocking this in¯ux are unable to cold-acclimatize. Conversely, chemical agents causing increased calcium in¯ux induce cold acclimatization-speci®c (cas) gene expression in alfalfa at 25LC. How low temperature triggers calcium in¯ux is, however, unknown. We report here that induction of a CA-speci®c gene (cas30), calcium in¯ux and freezing tolerance at 4LC are all prevented by cell membrane ¯uidization, but, conversely, are induced at 25LC by membrane rigidi®cation. cas30 expression and calcium in¯ux at 4LC are also prevented by jasplakinolide (JK), an actin micro®lament stabilizer, but induced at 25LC by the actin micro®lament destabilizer cytochalasin D (CD). JK blocked the membrane rigidi®er-induced, but not the calcium channel agonist-induced cas30 expression at 25LC. These ®ndings indicate that cytoskeleton re-organization is an integral component in low-temperature signal transduction in alfalfa cell suspension cultures, serving as a link between membrane rigidi®cation and calcium in¯ux in CA. Keywords: cold acclimatization, signalling, actin, membrane ¯uidity. Introduction Cold acclimatization (CA) in plants, resulting in acquisition of increased freezing tolerance, requires exposure to low but non-freezing temperatures over a periods of days or weeks (Levitt, 1980). Transient in¯ux of Ca 2+ into the cytosol is an early event during CA (Knight et al., 1991; Monroy and Dhindsa, 1995). Blocking this Ca 2+ in¯ux prevents cold-induced gene expression and development of freezing tolerance in alfalfa (Medicago sativa) cells (Monroy et al., 1993) and in Arabidopsis (Tahtiharju et al., 1997). Conversely, chemical agents that increase Ca 2+ in¯ux, such as the Ca 2+ channel agonist Bay K 8644 or the Ca 2+ ionophore A23187, induce CA-speci®c (cas) gene expression in alfalfa cells at 25°C (Monroy and Dhindsa, 1995). These results demonstrate that cold-induced in¯ux of Ca 2+ is an integral component of the low-temperature signalling cascade during CA. However, the nature and temporal sequence of events leading to this Ca 2+ in¯ux are largely unknown. A direct and perhaps the earliest effect of an alteration of temperature on cells is the change in ¯uidity of their membranes (Levitt, 1980). A decrease in temperature lowers membrane ¯uidity, whereas its increase enhances membrane ¯uidity (Alonso et al., 1997; Mejia et al., 1995). Previous studies (Murata and Los, 1997) have suggested that the plasma membrane acts as the primary sensor of temperature change through dynamic changes in its physical state. Rigidi®cation of plasma membranes by Pd-catalysed hydrogenation leads to the induction of the cold-inducible gene, desA, encoding a fatty acid desatur- ase in the cyanobacterium, Synecocystis (Vigh et al., 1993). It is not known if, and how, membrane ¯uidity modulates ion channel activity. Mazars et al. (1997) have shown that cold-induced Ca 2+ in¯ux in tobacco protoplasts was stimulated by disruption of microtubules and actin micro- ®laments. Recent studies have also demonstrated roles for actin micro®laments in K + channel activity in stomatal opening (Hwang et al., 1997), and in mechanical stress signalling in plants (Morelli et al., 1998). Although Ca 2+ channel proteins have yet to be characterized in plants, a plant gene (AKT1) encoding a putative K + channel has The Plant Journal (2000) 23(6), 785±794 ã 2000 Blackwell Science Ltd 785

Transcript of Early steps in cold sensing by plant cells: the role of actin cytoskeleton and membrane fluidity

����� ���� � � �� ������ �� ���� ������ ��� � �� � ������� ������ � ��� �������� �����

�� � �� ��� ��� �� ����� ! "���� #���$�� %���& ����� ��� '������ #( )�����

���������� �� ��� ���� ����������� ���� ������ ������ ����� �� ����� � � !�� "�� #$� ���� %�����

�������� � � ���� ������� �� ���� ���� ������� �� ���� ��������� �������������� ��� ��� ��� �� �!"�# $%�&'�(������)�*+������ ������, -��.��#�/��# 0�������� �� 0��#��1 2�#��.�#�1 03! � ��45��41 0��#���

#������

*��� ����� ��+��� ����&�� � ������� ��� ��� � �� �������&�� � ,-./ � � � ���� �0 ���� � � $

��� � �1����&�� ����������� �� ��� ���� � $����( -. � ��� ����� $�� ���� �0���� � ���� ��+����

�������� ������ ���0 �� ��� ��� � �( .������ ,�������� ����/ ����� ������� $�� ������ �� ���� ���

���0 ��� ������ � � ��1�������&�( - �������� ������� ������ ������ �������� ������ ���0 �����

� �� �������&�� �1���2� ,��/ ���� �0���� � � ������� �� 34�-( 5 $ � $ ���������� �������

������ ���0 � � $���� ���� $�( 6� �� �� ���� ���� ����� � � � -.1���2� ���� ,��� / ������

���0 ��� ����&�� � ������� �� 7�- ��� ��� �������� �� ���� �������� ���&�� � ��� � �������� ���

������ �� 34�- �� �������� ���2��� �( ��� �0���� � ��� ������ ���0 �� 7�- ��� ��� ��������

�� ������� ��� ,89/ �� ���� ��� 2������ �����&�� ��� ������ �� 34�- �� ��� ���� ��� 2������

�������&�� ��� ������� ) ,-)/( 89 �� ���� ��� �������� ���2��1������ ��� � � ��� ������ �������

�� ���1������ ��� �0���� � �� 34�-( :���� 2����� ������ ���� ��� ������ � ��1 ����&�� � � ��

������� � � ���� � � $1���������� ����� ��������� � � ������� ���� ������ � �������� ������ �� �

��� ���$��� �������� ���2��� � ��� ������ ���0 � -.(

9��$ ���� � �� �������&�� � �������� ���� �������� �����(

;��� ���� �

6�#� ��#�"��7���� �6') �� �#���1 ����#���/ �� �8��������

�� �������� ����7��/ ��#�����1 ��8����� �������� �� #�9

:�� ���!����7��/ ��"�������� ���� ������� �� �� ��

9��4� �;�����1 <=�)� -������� ��>�� �� 6�� ���� �.�

�����# �� � ��# ����� �����/ 6' �2��/.� �� � �1 <<

����� �� ?.����1 <<�)� $#��4��/ �.�� 6�� ��>��

�������� ��#�!������� /��� ���������� �� ����#��"���

�� ����7��/ ��#����� �� #�#� �������� ������) ��##�

������ �� � �1 <<�) �� �� ���"������ �-.��.�5� �� � �1

<<�)� 6�������#1 �.�"��# /���� �.� ������� 6��

��>��1 ���. � �.� 6�� �.���# /����� $2 =@�� ��

�.� 6�� �����.��� '�� =�1 ������ 6'!�����A� ����) /���

���������� �� #�#� ��##� � ���6 ������ �� ?.����1

<<�)� -.��� ����#�� ��"������� �.� ��#�!������� ��>��

�� 6�� �� � ����/�# ��"������ �� �.� #�9!��"�������

��/�##��/ ����� �����/ 6'� B�9����1 �.� ����� ��

��"���# ��8����� �� ������ #����/ �� �.�� 6�� ��>�� ��

#�/�# ��4��9��

' ������ �� ���.�� �.� ��#���� ������ �� � #������� ��

��"������� �� ��##� �� �.� �.�/� �� >����� �� �.���

"�":���� �;�����1 <=�)� ' ������� �� ��"�������

#�9��� "�":��� >�����1 9.���� ��� ������� ��.����

"�":��� >����� �'#���� �� � �1 <<� ��5� �� � �1 <<�)�

+������� ������� ����� �� ;��1 <<�) .�� ��//�����

�.� �.� �#�" "�":��� ��� � �.� ���"� ������ ��

��"������� �.�/� �.���/. ��"�� �.�/�� �� ���

�.���# ����� ��/���A����� �� �#�" "�":���� :

+�!��#��� .���/������ #��� �� �.� ��������� �� �.�

��#�!������:#� /���1 ���'1 �������/ ��� ��� ������!

�� �� �.� ���:������"1 &���������� �&�/. �� � �1 <<�)�

0� �� ��� 4��9� ��1 �� .�91 "�":��� >����� "���#���

��� �.���# ������� �7�� �� � � � <<�) .�� �.�9� �.�

��#�!������� 6�� ��>�� �� ��:��� ������#��� 9�

���"�#��� : ���������� �� "������:�#�� �� ���� "����!

A#"����� ������ ������� .�� #�� ��"�������� ��#�� ���

���� "����A#"���� �� 2� �.���# ������ �� ���"�#

������/ �B9�/ �� � �1 <<�)1 �� �� "��.���# ������

��/�##��/ �� �#��� �����##� �� � �1 <<=)� '#�.��/. 6��

�.���# �������� .�� �� �� :� �.������7�� �� �#���1

�#�� /��� ��'( ) �������/ ������� 2� �.���# .�

()� � ��� *���� �����) 3<�@)1 �=�C�<�

����� $#�49�## 3������ ;�� �=�

:��� �#���� �3������ �� � �1 <<�)� -.� ������� �������

������� �4���!#�4� ������ ��//�����/ �.� ��� �.���#

�������� �� �#��� " ������� 9��. �.� ����4�#����

�3������ �� � �1 <<�)�

-.� :��� �:��������� #�� �� �� ���#��� 9.��.��

�.�/�� �� "�":��� >����� �� ��!��/��7���� �� �.�

���� ����4�#���� .�� ��#� �� �.� ��# ��/�� �� #�9!

��"������� ��/�##��/ �� �#�� ��##�� D� #�� �������/���

9.��.�� �.��� ������ �� #��4�� �� 6�� ��>�� �� 6'� D�

.�� ���� �.� ��������� #���# �� 6'!�����A� /��� ����$�)

�� �.� ����#��"��� �� ����7��/ ��#����� �� #�#� ��##

���������� ��#����� � ���!����� "�4��� �� #�9!��"���!

���� ��/�##��/� %�� ����#�� ��//��� �.� ��#� ��/�##��/ ��

�#��� " ������� ���" "�":��� ��/���A����� �.���/.

���� "����A#"��� ��!��/��7���� �� 6�� ��>�� �� 6'!

�����A� /��� ����������1 ������## #����/ �� 6' ��

�������� ����� ��#������

'������

%)����� ��� ���� ���"���� +������ �� � � �

���� ����

$��. ?�3% �� :��7# #��.�# �$') .�� :���

�������# ���� � "�":��� ��/���A�� �� >����7��1

����������#� �#���������� ��#��7���� �� 1@!���.��#!

1�1�!.�������� �?+B) 9� ���� �� ���A�" �.� �������

�� �.��� /���� �� #�#� ������#���1 :�� �.� ��#��7!

���� ����� � �� �������# ��#��� �� "�":��� >�����

�6.�� �� E�1 <<�)� -.� �� ��������� �� -:#� �.�9

�.� ?�3% ����"��� ������� "�":��� >����� � ���6� ��"�������� : � ������� �� �.� ��#��7����

����� �� 6�������#1 ���!����"��� �� ������#��� 9��.

$' ��.�:��� �.� ��#�!������� ������� �� �1 �� �������

�� "�":��� >������

���"���� +����,���� ��)�"��� � � ����� ��� �� � � �

�� �

-� ���� �.� .���.���� �.� "�":��� >����� �#�

����"���# ��#� �� #�9!��"������� ��/�# �����������

�� #�#�1 ��������� ���"�#���� �� 6'!�����A� /���1

���$�1 �� �.� ����#��"��� �� ����7��/ ��#����� �� #�#�

��## ���������� ��#����� 9��� ���� � ���!����� "�4����

-.� ���������� �� ���$� �� �����A�## ������� : ��#�

����"��� �� �� ��� ���������� �� ��.�� �������� �������!

/��� ���.��� �� � �1 <=<)1 �� �.������� ������ �

��#�:#� ���!����� "�4�� ��� 6'� 6�#� ����"��� �����

���� �� �������:#� ���"�#���� �� ���$� ����������

���/��� �� ��� �.�9�)� $'1 9�##!���:#��.�� "�"!

:��� >����7�� �6���� �� � �1 <<@ 2��/9 �� B���1

<<�)1 9� ���� �� ������� ��#�!������� "�":���

��/���A������ D.�� ��##� 9��� ���!������ 9��. $' ��� .

� ���6 :����� :���/ ����:��� � ��6 ��� @�� �� �.�

�������� �� �.� #��.�#1 �.� ��#�!������� ���$� ����������

9� ��.�:���� � ## ������������� ������ ���/��� �)� $'

����"��� #�� �����/# ��.�:���� �.� ����#��"��� ��

����7��/ ��#����� ���/��� �:) 9��.��� �������/ ��## ��:�!

#�� ��� ��� �.�9�)� 3�"�#� ����#�� 9��� �:����� :

������/ ��##� 9��. ��.��#1 ���.�� "�":��� >����7��

���41 <<�) ��� ��� �.�9�)� -� �������/�� 9.��.��

#�9����/ �� �.� ���$� ��������� #���#� : $' ����"��� ��

��� �� ������� �� ��������� #���#� �� /����#1 ���������

#���#� ��� �.� ���#��"��� .������ B��� ������� �� ��� �.�

������� ;� ��:���"# ������� ���" #�#� 9��� �����!

"����� -.� B��� ���:������ �� � �1 <<@) �� ;� �'��"��

�� � �1 <<�) ���������� �� ������������# ��������� ��

#�#�� $��. �.� ;� �� B��� ��������� #���#�1 9.��. ��

��� ������:# ������� ���� �=. 6' �� �����/ ��!

��#�"��7���� ���/��� )1 �� #�� ��� ������� : $'

����"��� ���/��� �)� -.�� �.� ������� �� $' �� ���$�

��������� #���#� �� ��� ��>��� /����# ��9�!��/�#����

�� �������������

6' �� #�#� ���������� ��##� ����#��� ���� ��>�� ��

6�� ���� �.� �����# � �����"���� : ��6�� �����

���.�/� �.��"��/��. � ��������# ������:��

������ �� ?.����1 <<�)� 0��#��� ������#��� 9���

���� �� "����� 6�� ��>�� �� ����� �� ���� ��"�#��!

����� ��� �� 6��!���. ��## 9##�1 :�� ��#�!������� ���!

"�#���� �� ���$� ���������� #�� ������ �� ���#���

������#��� ��� ��� �.�9�)� -.� ������ ��� �.� ��#�!

������� 6�� ��>�� .� :��� �.�9� �� :� ���"��#

���#���� �� #�#� ��##� �� �� �����/# ��.�:���� : 6��

�.�#���� �� 6�� �.���# :#��4��� ������ �� ?.����1

<<�)� F���/ ��6�� ����� ���.�/� �.��"��/��.

������ �� ?.����1 <<�)1 9� ��"���� �.� ������� ��

�"� $' ����"��� �� ��#�!������� 6�� ��>��� -.��

������������ �� $' 9� ���� ����� �� .� �� ������ ��

������#�� ��:�#��1 � �����"���� : G��H� :#�� ������/

��� ��� �.�9�)1 �� �� ��.�:��� ��#�!������� "�":���

��/���A����� �-:#� )� -���"��� �� ������#��� 9��. �"�

$' ��.�:���� 6�� ��>�� ���/��� ��)� -.��1 � ��61 6��

��>��1 ���$� /��� ���������� �� ����7��/ ��#����� �� ##

��������� : $'!������� ��## "�":��� >����7�����

���"���� ������������ ��������� � � ����� ��� ��

� � � �� � �� ���%

D� ������� �.� �� ������� "�":��� >����� "������

�.� ��#�!������� ���$� ��������� ���"�#����1 6�� ��>��

�� �������� ����7��/ ��#�����1 �.�� ��������� ��

"�":��� >����� � ���6 : �.�"��# /���� �.��#�

"�"�� �.��� ���������� -���"��� �� ��##� � ���6 9��.

?�3%1 9�##!����"����� "�":��� ��/���A�� �;"�

�� +����#��1 <�@)1 � ������������� � #�9 � I1

������� ���$� ��������� ���"�#���� ���/��� �)1 :��

��� ��� ����� �.� B��� �� ;� "�J' #���#� ���/��� �)�

?�3% ����"��� � ���6 �������� "�":��� ��/���A�!

�=@ �-.�� /� ��� 0.���� �� #�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

���� �� ���#��� ������#��� �-:#� )1 ��.���� �.� ����7��/

��#����� �� ��##� ���/��� �:) �� ���"���� 6�� ��>��

���/��� ��)� 6�## �� ������#�� ��:�#�� 9� ��� ������� :

�.�� �.�"��# ��� ��� �.�9�)� -.�������1 �.� ��"����

������ �.���������� �� 6'1 �"�# ��#�!������� ���$�

��������� ���"�#����1 6�� ��>�� �� �������� ����7��/

��#�����1 �� :� ������� : "�":��� ��/���A����� �

���61 �� ��������� � ��6 : "�":��� >����7�����

��������� ����� ����� ������ �� ��1����� � � �

����� ��� �� � � � �� �

E""��� � <=<) ��"�������� �.� "�":��� ��/���A��!

������� 6�� ��>�� �� .�������� �� ���"����� : ����

"����A#"��� ��!��/��7����� 0� .� #�� :��� �.�9� �.�

��#�!������� 6�� ��>�� �� ��:��� ������#��� �� :�

��.���� �#"��� ���:#��) : �.�"��# ���. �

����.#���? �6?) �.� "���#�� ���� "����A#"���

��/��7���� ��7�� �� � �1 <<�)� D� �.������� ��"����

9.��.�� "���#���� �� ���� "����A#"��� ��!��/��7����

"�"�� �.� ������ �� ��#�!������� ��/���A����� �� �.�

"�":��� �� 6�� �.���#� �� ���$� ����������� -�

"���#�� ���� "����A#"��� ��/��7���� 9� ���� 6?

�6�����1 <=�) �� 5��#4���#��� ��2)�$�:: �� � �1 <<�)1

:��. "�":���!���"����/ �.�"��#� �.� .�� :���

���������## ���� � ����:�#�7�� �B9�/ �� � �1 <<�

�7�� �� � �1 <<� ����##� �� � �1 <<=) �� ��:�#�7��

���.�� �� � �1 <<< 39��74 �� � �1 <<<)1 ����������#1 ��

�#�� ���� "����A#"����� -���"��� 9��. �2 ��.�:���

��#�!������� ���$� ��������� ���"�#���� ���/��� �) ��

6�� ��>�� ���/��� �:)1 �� #�9��� ����7��/ ��#�����

���/��� ��)� 6�������#1 ����"��� �� ��##� 9��. 6? �����

:��. ���$� ��������� ���"�#���� ���/��� �) �� ��!

������ 6�� ��>�� ���/��� �:) � ���6� B�9����1 6?

����"��� � ���6 ������� �.� ������������ #���# �� ����7��/

��#����� ���/��� ��)� 6�## �� ������#�� ��:�#�� 9�

��������� : ����"��� 9��. �2 �� 6? ��� ��� �.�9�)�

����.��"���1 "�":��� >����� �-:#� ) �� ���������

#���#� �� B��� �� ;� 9��� ������# ��������� : ���.��

�2 �� 6? ����"��� ���/��� � �� ��/��� �)� -.��1 6��

��>�� �� ���$� ���������� �� ������� : � ����

"����A#"��� ����:�#�7��/ /���1 ��1 ��������#1 ��.�:!

���� : � ���� "����A#"��� ��:�#�7��/ /����

(����� ���� ���"���� ������������ ��� �����

����� ����� ��2����������� �� � � ����� ��� �� � � �

�� �

-.� ����#�� ��������� :��� ��//��� �.� ��#�!�������

��/���A����� �� "�":���� �� ���� "����A#"��� ��!

��/��7���� �� ��8����� ��� 6�� ��>�� �� ���$�

��������� ���"�#����� B�9����1 �.� ��"���# ����� ��

�.��� ������ ��"���� �� :� �����"����� $ ����/

��":������ �� �.�"��# ����"����1 9� �����"�� �.�

���"����/ � ��#��� ����� 9.�#� :#��4��/ ��:��8����

��� �.��#� ������� ���$� ��������� ���"�#�����

6�������#1 :#��4��/ � ��#��� ����� :�� ���"����/

��9�����" ��� �.��#� ����#� �� ���$� ��������� ���!

"�#����� 0� .� :��� ��������# ��"�������� �.� �.�

��#� ��������� �� ���$� ��8����� 6�� ��>�� ������ �� � �1

<<�)� -.� �� �� ��/��� @ �.�9 �.� ���$� ����������

������� � ���6 : ���.�� ?�3% ����"��� �"�":���

��/���A��) �� : 6? ����"��� �"����A#"��� ����:�#�7��) ��

��.�:���� : �.� 6�� �.�#��� 1�!"����!"����.����)!

:���� =( +�#��7���� ����� ��) �� ���#��� ������#��� ������9��. ��#�1 $'1 ?�3%1 �2 �� 6?

-���"��� -�"������� ��6) +�#��7���� ����� ��)

G�����"��� 6�����# �� ���<��� ������

6�����# � �� � �� ��� �=:

G�����"��� �6�����# �� ���=��� ������

6�����# � �� ��� ��� ��:

$' ��"�) � ���=��� ����@�

G�����"��� �6�����# �� ���=��� ���� �

6�����# � �� ���� �����=:

?�3% ��I) �� �� ���� �����<�

G�����"��� �6�����# �� ���<� � ��� �<

6�����# � �� ���� ��� �@:

�2 ����) � �� ���� ����=�:

G�����"��� �6�����# �� �� �=�� ��� �

6? �����) �� �� ���� ��� ��

?� �� ��������� � �.� "�� �3? �� �.��� ���#������ &#���9��. ��������� #������ �� ��/��A���# ��������� �� K����) �� ��.������"��� � �����"���� : 3������H� �!�����

%���� =( %��$� ��������� ���"�#���� �����/ �=. ��#� ��#�"��7�����6')1 �� ��:��8���� ���������� ��##�9��/ ��!��#�"��7���� �?') ����6�-��# �J' � ��/) 9� .:����7�� �� #:�##�� ���$� �?J'� ��#���� 9����������� �� ��!���:�� 9��. #:�##�� ;� �� B��� �?J'�� G8�# #����/�� �.� /�# 9� ���A�"�� : ��/���� �"/��/ �� �.� �J' :#���

3�� � ����� �� � � ������� "� � ��� �� � �=�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

��.�� 41414�14�!��������� ��� �$'+-'1 ��/��� @1:)�

-.��� ����#�� ������� �.� 6�� ��>�� �� ��9�����" ��

:��. "�":��� ��/���A����� �� ���� "����A#"��� ��!

��/��7����1 �� ����.�� ������ �.� ����#�� ��������� ��

��/���� ���) �� ��:)� -.� ?�3%!������� ���$� ����������

� ���6 �� #�� ��.�:���� : �.� ���� "����A#"���

��:�#�7��1 �2 ���/��� @�)� B�9����1 �.� ��������� �� ���$�

� ���6 : �.� 6�� �.���# /����� $2 =@��1 #�.��/.

��������� �� $'+-'1 �� ��� ��.�:���� : �2 ���/��� @�)�

-.��� �� ��"������� �.� ��#�!������� ��!��/��7����

�� ���� "����A#"���� �� #����� ��9�����" �� "�"!

:��� ��/���A����� :�� ������" �� 6�� ��>���

%���� 3( ��":��� >����7���� ��.�:��� ��#�!���//���� ���$� ������������"�#����1 ����#��"��� �� ����7��/ ��#����� �� 6�� ��>�� ��#�#� ��##���) 0�.�:����� �� ��#�!������� ���$� ��������� ���"�#���� : �.�"�":��� >����7�� $'� 6�##� 9��� ������ ��� . � ���6 9��. �.��������� ������������� �� $' �� ��:��8����# �#��� � ��6 ��� �� .:����� �J' ���������� ��#���� 9��� �������� �� ��!���:�� 9��. #:�##��;� �� B��� �?J'�� �:) 0�.�:����� �� ��#�!������� ����#��"��� ������7��/ ��#����� : $'� 6�##� 9��� ������ ��� . � ���6 9��. $'1 �.������:��� ��� @�� � ��6� ����7��/ ��#����� �� ��������� � �.� �����I) �� $'!������ ������ �������� ��##�� ��) $' ��.�:����� �� ��#�!���//���� 6�� ��>��� +�����#��� 9��� ������ 9��. �"� $' ��� ��"��1��##�9�� : ��"�� ����:���� 9��. ��6�� � ��6� ��6�� ��>�� ����������� � �.� ���� �I) �� $'!������ ������ �������� �6) ������#���1:��. � ��6� '#�.��/. ��"� $' ����"��� ��� ��� ����� �.� ��:�#�� ������� ��##�1 �� ������� �.� ��:�#�� �� ���#��� ������#��� : ��I19.���� �"� .� �� ������� ��� ��� �.�9�)� G���� :�� �� �:) �� ��)��������� �.� ������ �������� �� �.� "�� �� �.��� �� ���� ���#�����1����������#�

%���� <( ��":��� ��/���A����� ������� ���$� ��������� ���"�#����1����#��"��� �� ����7��/ ��#����� �� 6�� ��>�� �� #�#� ��##� � ���6��) 0�������� �� ���$� ��������� ���"�#���� : �.� "�":��� ��/���A��?�3% � ���6� 6�##� 9��� ����:��� ��� � . 9��. ?�3% :����� �J'���������� ��#���� 9��� �������� �� ��!���:�� 9��. #:�##�� ;� �� B����?J'�� �:) 0�������� �� ����7��/ ��#����� : ?�3%� 6�##� 9��� ��������� � �� 9��. ?�3% � ���6� ����7��/ ��#����� �� ��������� � �.����� �I) �� ?�3%!������ ������ �������� ��##�� ��) 0�������� �� 6��

��>�� : ?�3% � ���61 ��"���� �� ��#�!������� 6�� ��>���+�����#��� 9��� ������ ��� ��"�� 9��. �I ?�3% :����� ����:����9��. ��6�� � ���6� G���� :�� �� �:) �� ��) ��������� �.� �������������� �� �.� "�� �� �.��� �� ���� ���#�����1 ����������#�

�== �-.�� /� ��� 0.���� �� #�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

)����� �

-.� �����#��/ "��.���"� �� #�9 ��"������� ������/

�� ��/�# ����������� �� �#��� �� ����# �����������

B��� 9� ��"������� �.�1 �� #�#� ��##�1 �) ��#�!�������

6�� ��>��1 ���$� ��������� ���"�#���� �� ����#��!

"��� �� ����7��/ ��#����� �� ��.�:���� : �.�"��#� �.�

���.�� >����7� "�":���� �� ��:�#�7� ���� "����A#!

"���� �:) �.�"��#� �.� ���.�� ��/���� "�":���� ��

����:�#�7� ���� "����A#"���� ���� 6�� ��>�� ��

���$� ���������� � ���6 �� ��) �.� ��#� �� ����

����4�#���� �� #�9!��"������� ��/�# ����������� ��

#����� ��9�����" �� "�":��� ��/���A����� :�� ��!

����" �� 6�� ��>���

-.� �"������� �� "�":��� >����� �� #�9!��"���!

���� ���������� .� #��/ :��� ����/��7�� �;�����1 <=�

���� �� ;��1 <<�)� B�9����1 ��� ��#�����.�� ��

��:��8���� ��������� �� ��#� .� :��� ���#��� %��

����#�� �.�9 �.� ?�3% ����"��� ������� "�":���

��/���A����� �� "�"��� �.� ������� �� ��#� �� /���

����������1 6�� ��>�� �� ��#� ��#�"��7�����

����.��"���1 �����������/ �.� ��#�!������� "�":���

��/���A����� 9��. �.�"��# >����7��� .#�� ## ��"����

��������� �� ��#�1 ��//�����/ �.� "�":��� ��/���A�!

���� �� ��� ��# ���A����� :�� ������� ��������� ���

��#� ��/�##��/ �� �#�� ��##�� 0� �.��#� :� �����1 .�9����1

�.� #�.��/. �I ?�3% .� #"��� �������/ ������� ��

����7��/ ��#�����1 ��� ������ �� ���$� ���������� �� ���

�������� D.�#� �.� ������ ��� �.�� �� ���#��1 �� ��

�����:#� �.� ?�3% ������� :���� �� ��� /����1

:������ ���$�1 #����/ �� ��.���� ����7��/ ��#������

'#��������#1 ?�3% " #�� :� �������/ ��� 9�##!4��9�

������������� ������ 9.��. " �� " ��� :� ��#��� ��

��� ������ �� "�":��� ��/���A������

0� �� 9���# ������� �.� 6�� ��>�� ���� �.� �����# ��

���//���� : ��#� �2��/.� �� � �1 << ) �� �� ��8����� ���

%���� 7( 6�#�!��������� �� ���$� ��������� ���"�#����1 6�� ��>�� ������7��/ ��#����� �� ��.�:���� : �.� ���� "����A#"��� ��:�#�7��5��#4���#��� ��2)��) 0�.�:����� �� �.� ��#�!������� ���$� ��������� ���"�#���� : �2��J' 9� ���#��� ���" ��##� ������ ��� . � ���6 9��. �2 �� ��) ����#���� ��.��#� #��� �6 �� �I ?�3%)1 ��##�9�� : ��. ����:���� ���6� ��#���� 9��� �������� �� ��!���:�� 9��. #:�##�� ;� �� B����?J'�� �:) 0�.�:����� �� ��#�!������� 6�� ��>�� : �2� +�����#��� 9��������� ��� ��"�� 9��. �2 ����) �� ��#���� ��.��#� #��� �6) � ���6:����� ����:���� 9��. ��6�� � ��6 ��� ��"��� ��) 0�.�:����� �� ��#�!������� ����#��"��� �� ����7��/ ��#����� : �2� 6�##� 9��� ������ ��� . � ���6 9��. �2 �� ��) �� ��#���� ��.��#� #��� �� �.�� ����:��� ���@ �� � ��6� ����7��/ ��#����� �� �2!������ ��##� �� ��������� � �.����� �I) �� �.� �� ��##� ������ 9��. ��#���� ��.��#� #���� G���� :�� ���:) �� ��) ��������� �.� ������ �������� �� �.� "�� �� �������#������

%���� 4( ���$� ���������� ���"�#���� �� 6�� ��>�� �� ������� :�.� ���� "����A#"��� ����:�#�7�� ����.#���? �6?)��) 6?!������� ���$� "�J' ���"�#���� � ���6� �J' 9� ���#������" ��##� ������ ��� � . � ���6 9��. 6? �����) �� ��#���� ��.��#� #����6 ��@�I ?�3%)� �:) 0�������� �� 6�� ��>�� : 6?� +�����#��� 9��������� ��� ��"�� 9��. 6? �����) �� ��#���� ��.��#� #��� �6) � ���6:����� ����:���� 9��. ��6�� ��� ��"��� ��) 0�.�:����� �� ��#�!�����������#��"��� �� ����7��/ ��#����� : 6?� 6�##� 9��� ������ ��� ���9��. 6? �����) �� ��#���� ��.��#� #��� � ���6� ����7��/ ��#����� 9��#��#��� � �.� �������/� �� �.� �� ��##� ��:5����� �� ��#���� ��.��#�����"��� #���� G���� :�� �� �:) �� ��) ��������� �.� ������ ���������� �.� "�� �� ���� ���#������

3�� � ����� �� � � ������� "� � ��� �� � �=<

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

��#�!������� /��� ���������� �� ����#��"��� �� ����7!

��/ ��#����� �2��/.� �� � �1 <<@ ����� �� ?.����1

<<� ����� �� � �1 <<� -.��.�5� �� � �1 <<�)� -.� ��

��������� .��� ������� �.� ��#�!���//���� 6�� ��>�� ��

��9�����" �� "�":��� ��/���A�����1 :����� �.�

��>�� �� ��.�:���� : "�":��� >����7���� ���/��� ��)

:�� ���//���� � ���6 : "�":��� ��/���A�����

���/��� ��)� '#�.��/. "�":��� ��/���A�����!�������

6�� ��>�� .� ��� :��� �������� �� �#���1 ?�3%!�������

"�":��� ��/���A����� ������� 6�� ��>�� �� .��������

�E""���1 <=<) �� ���.���� ��##� �J/��� �� � �1

<=�)� 6.�#������#1 ���.�� ���8����# ���� "���#��� ��

"�":��� >�����1 �������� "�":��� ��/���� ��

����� 6�� ��>�� �� �::�� �"���. "���#� ��##�

�L#���� �� � �1 << )� -.��1 "�":��� ��/���A����� ��

6�� ��>�� ���� �� :� ����#��� 0� �.��#� :� ����� �.�

��� �� ������� #���#� :��� �.� �.�/�� �� ���#

������������ �� 6�� �� �.� �����# �� ����� ������# ��

��>�� �� ������##�#� 6�� ���� �.� ��##� -.� �������� ����

�� �����#�� 6�� ������������ ��� �� ��#� �.��4 �� 9�##

���:#��.�� �.���/. ��������� ������. : "� ������.!

���1 ���:# : -��9�� �� ��##�/��� �2��/.� �� � �1

<< )�

0� ��� ����1 ����"��� 9��. 6? ����� :��. 6�� ��>��

���/��� �:) �� ���$� ���������� � ���6 ���/��� �)�

6�������#1 ����"��� 9��. �2 ��.�:��� :��. �.��� ������

� ��6 ���/��� �1:)� �2 �� ��"�#������# ��:�#�7� ���

����#���� �� ���� "����A#"���� �� ����:�#�7� �!

��.��1 �� ����# ������ ���#����� �� ���� ��#"���7����1

��������/ �� �.� ��##�#� ��"�� �3������ �� � �1 <<<)�

0""����.�"��# ����"���� �� �!���� #���#� .� �.�9�

�.� �2 ���!����"��� ����� ��"��� ������� �� �!����

#���#� �� ��#�!�.��4�� ��##� �%M ��� �� � �1 ����:#��.�� ��)1

��������/ �.� �2 ��:�#�7�� �.� "����A#"����� B�9����1

�.� "��.���" �� 6? ����� �� 8���� ��"�#��� 6? �� ��

�.� :�:�� ��� �� ���� "����A#"����1 ������ �.�

"����A#"���� �� ��8������ ���� "���"���1 �� �.��

����� �.� :������ �� ��/��7���� �� "����A#"����

�6�����1 <=� L������� �� �������1 <=@ 3"��. ��

+�##��1 << )� '#�.��/. #������#�� $1 ��9����# ����

"����A#"���!���������/ /��� �3������ �� � �1 <=�)1 .�

��"�#� ������� �� ���$� ���������� � ���� 6? ��� ���

�.�9�)1 �� �� #�� �#���:#� �.� �.� ��#�!������� 6�� ����

"�"��4�� : 6? ����"��� ���/��� �:)1 ���� ��� ��8����

����#"���7��� �� "����A#"����1 :�� ������ ��"���#!

#��/ �� �.� ���!�������/ ���9��4� -� ���1 #�.��/. #�9!

��"������� ���������� �� �.� ���� ����4�#���� .� :���

��"�������� �� ��"# ��##� �6##��� �� � �1 << D���

�� B�9��1 <<�)1 �.��� �� �� ������ �������� �.� #�9

��"������� �������� �.� ���� ����4�#���� �� �#����

B�9����1 �� �.��#� :� ����� �.� 9.�� /��� �������/

� ���� ����#"���7���� ����� �'?�N��A#��) �� ����# ��!

��/�#��� : ��#� �?�#�4 �� � �1 <<@)� 0� �� ����9���.1 ��

�.�� �������1 �.� ������# �.������7�� ����!���������

��� "���� �� ��#�!��������� ���6�##�" �� � �1 <<<)�

-���"��� �� ��##� 9��. ��� �2 ��.�:��� ��#�!�������

6�� ��>��1 ���$� ���������� �� ����7��/ ��#�����

��:�����## :�� ��� ��"�#���# ���/��� �)� �2 ��������!

����� ���" �� C ��� .� ��"�#� ������� �� ���$� ������!

���� ��� ��� �.�9�)� -.�� ����� �.� �����:�#�� �.� �.���

��#�!������� ��������� " :� � #��� ����## "���!

#��� �.���/.1 � �� ��������A��1 "��.���"� �.�

������ �����������# �� ��!��/��7���� �� �.� ����

����4�#����� -.� ��:�����# ������� �� 6? �� �2 ��

6�� ��>�� �.���/. ������/ �� 6�� �.���#� �:������ ��

�.�� ���� ������� �.� ���. 6�� ��>�� ��8����� �.� ��!

��/��7���� �� �.� ����4�#����� B�9����1 �� �.��#� :�

�"�.��7�� �.� �.� ����4�#���� " #�� :� �#����"

��� �����# ��.�� �.���#�/��# ��������� ����#��� �� ��#�

��#�"��7����1 ���. � ������� ���A�4��/ �� "���#����

�� ��������� �� ������� 4�����N�.���.��� �.� " ��

" ��� :� ��������� �� 6�� ��>���

'� �����/���/ �:�������� �� �.� ������� ���� �� �.� 6?

����"��� � ���6 ������� �.� ������������ #���# �� ����7��/

%���� >( 6�#�!������� ��!��/��7���� �� ���� "����A#"���� �������� #��4 :��9��� "�":��� ��/���A����� �� 6�� ��>����) 0�������� �� ���$� ��������� ���"�#���� : ?�3% � ���6 ����.�:���� : �.� 6�� �.�#��� $'+-'� 6�##� 9��� ������ ��� . 9��.$'+-' �$+ �"�) �� �.�� ��� �. 9��. ?�3% �?� �I)� 6�����# ��##�9��� ������ 9��. ?�3% ��I) �� ��#���� "����" #��� �6) ��� �.� �:)0�������� �� ���$� ��������� ���"�#���� : 6? �� ��.�:���� : $'+-'�6�##� 9��� ������ ��� . 9��. $'+-' ��"�) �� �.�� ��� � . 9��. 6?�����)� 6�����# ��##� 9��� ������ 9��. 6? �����) �� ��#���� ��.��#�#��� �6 ��@�I ?�3%) ��� �.� ��) 0�������� �� ���$� ������������"�#���� : ?�3% � ���6 �� ��.�:���� : �2� 6�##� 9��� ������ ��� . 9��. �2 � ��) �� �.�� ��� �. 9��. ?�3% ��I) � ���6� 6�����# ��##�9��� ������ � ������:�� �� �)� ��) 0�������� �� ���$� ������������"�#���� � ���6 : �.� 6�� �.���# /����� $2 =@�� �� ��.�:����: $'+-' :�� ��� : �2� 6�##� 9��� ������ ��� . 9��. ���.�� �2 � ��)�� $'+-' ��"�) �� �.�� ��� � . 9��. $2 =@�� �$2 ����)� 6�����#��##� 9��� ������ 9��. $2 =@�� � ����) �� ��#���� ��.��#� #��� �6)#��� ��� �.�

�<� �-.�� /� ��� 0.���� �� #�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

��#����� ���/��� ��) #�.��/. �� ������� 6�� ��>�� ��

���$� ���������� ���/��� �1:)� D.�#� �.� ������ ��� �.��

�� �������# ���#��1 �� �� �����:#� �.� ���//����/ �� 6'

��8����� ��# �������� ���������� �� �.� ���� "����A#!

"��� ���9��41 �� ��"�#����� �� �.� 6' ���������

������� ���� �.� ��!��/��7���� �� �.� ���� ����4�#����

�� � #����� ������� -.� ��8����� ��!���":# �� �.� ����

����4�#���� "�/.� :� ��������� : �.� ��������� ���!

����� �� 6?� -.� ������������ #���# �� ����7��/ ��#����� ��

�.������� #��� : ���������� �� �.� ���!�������/ ����

����4�#���� ����#�� 9��. ��#��� �� ��!��/��7�� D� ��

�������# �������/���/ �.� ��"��� �� ���� ����4�#��#

�.�/�� ��!���� #���#�) �����/ ��#� �.��4 � 9�## �

��##�9��/ ����"���� 9��. "���#���� �� "�":���

>����� �� ���� "����A#"��� ��:�#�7�����

D.� �� �.� ����� �� "��.������ ��#�����.�� :��9���

"�":��� ��/���A�����1 ���� "����A#"��� ��!��/��7!

����1 �� 6�� �.���# ������/O -.� ������� �� 6? �� �2

�� 6�� ��>��1 �:������ �� �.� ������� ����1 ��//��� �.�

"����A#"���� �� ������# �� ��������# ��������� �� �.�

�.���#1 4�����/ �� ����� ������� �� �.� �#���� ����� 0� ��

��"����/ �� ��//��� �.� ��#�! �� �.�"��## ������� ��!

��/��7���� �� ���� "����A#"���� �� �������� �.�

������� ������ �.� 4��� �.� �.���# �#����1 �.���:

##�9��/ �.� �.���# �� ����� -.�� " ���#�� 9.

����"��� 9��. �.� ���� "����A#"��� ��:�#�7�� �2 9��#�

"����� �.� ������� ������ �.� 4��� �.� �.���# �#����

9.���� 6? ���#� �������� �.�"� %�� �� ��//��� �.�

��!��/��7���� �� ���� "����A#"���� �� ��#� ��/�##��/ ��

#����� ��9�����" �� "�":��� ��/���A�����1 ����� �.�

���$� ��������� ���"�#���� ������� : ��#� �� :

?�3% � ���6 �� ��.�:���� : �2 ���/��� @�)� ��":���

��/���A�����!������� ��!��/��7���� �� �.� ���� "����!

A#"���� �� 6�� �.���# ������/ 9��#� ���� ��

��8���� �.� �.� ���� ����4�#���� :� ����#�� �� �.�

�#�" "�":��� � 9�## � �� 6�� �.���#�� 0� �� 4��9�

�.� ����4�#��# ��"������� �� ���.�� �� �.� �#�"

"�":��� �� 4��� �� ����� ������� �?��/ �� +��4��1

<<� 3�.��� �� 3�.����1 <<<)� -.�� �:��������

���"�� ������#� ��/��A���� :����� ��#�!�������

6�� �.���#� �� �#��� .�� :��� �.�9� �� :� ������.!

������� �?��/ �� +��4��1 <<�)1 ��������/ �.� �����#�

������ �� ����#��� �� �.� �������� �� �.��� �.���#�� 0�

A:��:#���1 ������##�� ������. ������ ��#��� �� �.� �#�"

"�":��� ���� #�/� 6�� ��������� �L#�/��� �� � �1

<<�)� 0� .� #�� :��� �.�9� �.� 6? ����"��� �������

6�� ��������� �.���/. ������.!������� 6�� �.���#�

�L#�/��� �� � �1 <<� B�9��. �� � �1 <<= D� �� � �1 <<<

P� �� � �1 <<�)� -.��� 6�� ��������� �� ��� �����

��##�9��/ ���������� �� "������:�#�� �D� �� � �1 <<< P�

�� � �1 <<�)� 0���������/#1 �7�� �� � � � <<�) ��"��!

������ �.� ����:�#�7���� �� "������:�#�� 9��. ��7#��

�������� 6�� ��>�� �� ��#�!�.��4�� ��:��� ������#����

D� ��� ��� �������/�� �.� ��#� �� "������:�#�� �� #�9!

��"������� ��/�##��/1 :�� #�#� ���������� ��##� ������

9��. ��7#�� � ���6 �� ���"�#�� ���$� ����������

�%M ��� �� � �1 ����:#��.�� ��)1 ��������/ �.� ��!��/��!

7���� �� :��. "����A#"���� �� "������:�#�� �� ����#���

�� #�9!��"������� ������/ �� �.��� ��##�� -.� ����������

:��9��� "����A#"���� �� "������:�#�� �� 9�## ���:!

#��.�� �� �.������� �� �� �����:#� �.� :��. �.���

����4�#��# ��"������� �� ����#��� �� #�9!��"�������

��/�# ������������

-� �.� :��� �� ��� 4��9#��/�1 �.�� �� �.� A��� ������

��"��������/ �.� ��/�##��/ ��#� �� �.� ���� ����4�#����

�� ��/�#���/ �#�� /��� ����������� 0� �.��#� :� �������

��� �.� �.� ����#�� ��������� .��� 9��� ������� ���" ��##

���������� ��#������ D.��.�� �.� �� :� �������� ��

����� �#��� 9��� ����.�� �������/����� 0� .� :���

�������� �.� �.� ����4�#���� ��� � �����#� 9.���

�.���# ������ �� ��������� ���� :���.�"��# ��/�#�

�3�."��� �� B##1 <<=)� B�9 ��"�������!�������

�.�/�� �� �.� �.���# ���� �� �.� "�":��� ��/�#��

���� ����4�#���� ��/��7���� ��"��� �� :� �����"�����

6�#�!������� "�":��� ��/���A����� �� :�#����� �� �����

�� �������� "������"��� �� �.� �#�""�":��� �����

�� ;��1 <<�)� -.��� "������"��� " ������� �.�

#��� 9��.�� 9.��. #�9!��"�������!������� "�":���

��/���A����� "���#��� ���� "����A#"��� ��/��7�����

0� ������ """#�� ��## ����1 ��/� ����.�#�# ��##�1

-����� P! ��!����#�:#� "�":��� "������"��� �##��

#���� ���� .�� :��� ������A�� �'�������1 <<=)� -.���

�.�#������#!���. ���� "��� 9��.�� �.� #���� :�#�� �� "

����� � �#����"� ��� :��. ����"�":��� ��/�# ����!

������� �� ����4�#��# ��!���/�"��� �'�������1 <<=

3�"��� �� 04����1 <<�)� D.��.�� ��"�#� �#����"� ��

"������"��� ��� ����"�":��� ��/�##��/ �� ���!

�4�#��# ��"���##��/ ����� �� �#���1 �� �� �"������ ��

��#� ������/1 9��� ����.�� �������/�����

�0�������� � �������

� ��� ������� ��� � � ��� �����,����

6��������� ��� /��9�. �� #�#� �������� ������ ���� �#�� ��'��4) ��## ���������� ��#����� 9��� � ��������# ������:�������� �� ?.����1 <<�)� 0� ## ������"����1 �! �� =!�!�#���#����� 9��� ����� 6' 9� �"��������� : ���#��/ �.� ��##����" �� �� ��6 ����#��/ ��� ���6"��C ) ����� #�9 #�/.���� �"�#�.����� "C� ���C ) �� ��!��#�"��7���� : ��������/�.� ��##� �� ���6 � ���"�# �.����� "C� ���C �##�"�������

������������� �)����� �

��� "���#���� �� "�":��� >�����1 :��7# #��.�# �$' 6������ � �1 <<@ 2��/9 �� B���1 <<�) �� ?�3% �;"� ��+����#��1 <�@) 9��� ���� ������# �� �.� ��## ���������� � �.�������������� ��������� -.� ��#� �� ���� "����A#"��� ��!��/������� �� �.� ��#� �������� 9� �������/��� ����/ �2���#���#� +��:��1 G�/���1 %��/��1 F3') �� 6? �3�/"1 %4��##�1

3�� � ����� �� � � ������� "� � ��� �� � �<

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

%�����1 6��)� 3���4 ��#������ �� :��. �.�"��#� 9��� "�� ����I ?�3% �� A�# ������������� �� ��� �� ��<�"�1 ������!����#� -.� A�# ����"��� ��#������ �� �.��� �.�"��#� ���������� �I �� ��@�I ?�3%1 ����������#� -� ������� 6�� ��>��1 �.�6�� �.�#��� 1�!"��!��!"����.����)��.�� 41414�14�!����!����� ��� �$'+-' 3�/"1 %4��##�1 %�����1 6��)1 �����#����� B�%1 9� ����� ��� ���"����/ 6�� ��>�� � ���61 �.� 6��

/����� $2 =@�� �6#:���.�"1 3� ?��/�1 6#������1 F3') ���.� 6�� �����.��� '�� =� �06J1 6��� ���1 6#������1 F3')1:��. �����#��� �� ?�3%1 9��� ���� � ��������# ������:�������� �� ?.����1 <<�)� 0� ��. ������"���1 �.� ��##���������� ��#����� 9��� A��� ������ ��� . 9��. �.� ���������.�"��# � ���6 :����� ����:���� � ���6 �� ��6� 0� ��.������"��� 9.�� ��#����1 ������# ��#����� 9��� ������ 9��. �.�?�3% ��#���� ������������ #���1 � �������� �� �.� A/���#�/�����

%� ���"� ��� ��� ���,��� � ������

����7��/ ��#����� �� ��## ���������� ��#����� 9� �����"���� :�.� �1�1�!����.��# ����7�#��" �.#����� �--6) ��������� "��.�������� �� � �1 <<�) ���" �9� ����������� ������"���� ����������� � �������/� �� ��:�#�� �� ���7��1 �������� ������#��##��

54� �� " � ��� ����

-��# �J' 9� ���#��� ����/ -�07�# �L�:�� $�;1 $��#��/���1%�����1 6��) �������/ �� �.� "���������H� ������������1�� ��/ ��:5����� �� :#�� �#��� 9��. .�/.!�����/���.:����7���� �� 9�.��/ � ������:�� �?��� �� � �1 <<�)� ������$� .:����7����1 �.� �� ��� ��=�:� ���B0N'��0 ��/"���) �����$� ������������/ �� �.� ��������# �������� �?J' �#����3����= ���.��� �� � �1 <=<) 9� ���� � ���:�� -������"��� 9.��.�� �.� �.�"��# ����"���� �������/��� �� �.������ ����� ���$� �����A�##1 �.� ���������� �� �9� ������#/���� 9� �������� ' ���:� ����@0N���0 �?J' ��/"��� ��� �.����#��"��� .������ B��� ������� ���" #�#� ���:������ �� � �1 <<@)1 �� �� :� �?J' ��/"��� ��� ������� ��:���"#������� ;� ���" #�#� �'��"�� �� � �1 <<�)1 9��� ���� � ���:���� �����"��� �.� ��������� #���#� �� �.��� ���������� /����� '##���:�� 9��� ����#:�##�� 9��. ��+ : ����" ���"��/ �-�Q���4+��"� 2�� '"���." +.�"��1 $�� �HF���R 1 Q��R:��16��) �������/ �� �.� "���������H� ������������� J�/������/��# �"/�� �� G�$�!������ :#��� 9��� ���� � #����/ ������#��-�������� #���#� ��##�9��/ ��. ����"��� ������:�� 9��������"���� �� � #��� �.��� ����������� ������"����� -.� ����#�����" ��� ������������� ������"��� �� �.�9��

%��6 ��+�7 ������������

+�����#���1 ���#��� ���" ��## ���������� ��#����� � ������:��: ����� �� ?.���� � <<�) 9��� ���� ��� 6�� ��>�� ��������-.� �#��� �� ��6�� ��>�� : ����� ���.�/� �.��"��/��.9� � ��������# ������:�� ������ �� ?.����1 <<�)1 ��������� �.� ������� �� ���"� 6�� �� ��:�#�7� "�":����1 �� �.���� �� ���C��� ������#��� ��� �# �� ��. ������"���� +�����#��������#) 9��� A��� ������ ��� ��"�� � ���6 9��. �.� �.�"��#/���� ����/ /���#� �.4��/ �@� ���"��C )1 :����� ����:������� ��"�� �9��.��� �.4��/) 9��. ��6�� � ��6 ����#��/ �����6"��C ) �� ���6� 6�� ��>�� 9� ��"���� �� ��>�� �� ���!������ �� ?�3%!������ ���#���� ��.��#� #���) ������#���� 6��

��>�� "�����"���� 9��� �����"���� �� � #��� �.��� ����!

������� ������"����1 ��. 9��. �.��� ���#�����1 ����/ �.������������ ������#�� ����������� -.� ����#�� ���" ��� ���������!���� ������"��� �� �.�9��

���"���� +������ ������������

��":��� >����� 9� �����"���� ����/ 1@!���.��#! 1�1�!.�������� �?+B1 3�/"1 %4��##�1 %�����1 6��)1 ������� ��7��������#�1 � ���:�� +�����#��� 9��� ������ � ���6 ��� ��"��1����:��� 9��. ?+B �@��) ��� ��"��1 ��##�9�� : ��"������:���� � ��6 �� ���6� 3���!���� >���������� ��#��7����"�����"���� 9��� ������ ��� � ������:�� ��������#��"��� �� +#1 <<@)1 ����/ 3.�"�7� ��!��� �������!>�����.���"���� 9��. �#�� :��9���. �� � �" �� ��������� ���"������ 9��#��/�.� �� �@� �� ����"1 ����������#� '##������"���� 9��� ������� � #��� �.��� ��"��� -.� ����#�� ���"��� ������������� ������"��� �� �.�9� �� ��������� ��#��� �� �.� >���������� ��#��7���� ����� ��) �.� �� �������#��#��� �� "�":��� >����� �6.�� �� E�1 <<�)�

���� ��� ���"� ���

-.� ��:�#�� �� ������ ������#��� 9� �����"���� : ���#������/ 9��. G��H� :#�� �2�� �� G�9���1 <��)� $���>1������#��� 9.��� ������ 9��. $' �� �� ��"�)1 ?�3% ��I)1 �2�� ��)1 6? ��� ��) �� ��#���� #���1 ��� ��"�� � ���61 9��. /���#��.4��/ �@� ���"��C )1 :����� ����:���� � ��6 �� ���6� -.���":�� �� ������#��� 9��� ������� �� @ �8���� �� .�"�!���"���� �� �.� ���/� ��:�#�� �3? �� ��/.� ���#������#��#����

.��� $����������

D� �.�4 ?�� $� -��.9�:�� �� �� '���� ��� �.��� �#�:#� .�#�9��. �.� "�":��� >����� "�����"����1 ?� �� G���#� ��� �.�;� �?J'1 ?�� -� 2���� �� ��B� D���:��/ ��� �.� B��� �?J'1�� ?�� -� $����1 $� 3����1 ���#� +��#� �� F� -.����������������� �.� ������# �����/ �� �.� "��������� -.�� 9��4 9���������� : J���# 3������� �� G�/�������/ ������. 6�����#�� 6���

'���������

.� �� .( ?��� & -(#( ��� *�������� .(-( � <<�) 6.�##��/������ #��� �� �������� "�":��� ��/���� �� ����� �� �������%�� ���"��� ;�) ����#��/�� ���)��8 ���)��8 ����1 =<3<1��C=��

.����� � '(@(6( � <<=) -.� ����#� "�":��� ����"� ����85��8 ���)��8 >A1 <<C����

.��� �� �( ����� -( #������ -( �� :��� 8( �� 9 &�� ;( ������� )( ������� '( ��� 9 �� � � .( � <<�) 6#����/ ������������ �� �?J' �������/ ����#�"�� ;� ��:���"#������� ���" #�#� �������� ������ ;�)� � ��� � 8 �� 8 3>1 �� C ����

���� *('( #����� $�& .(*( #������� �(.( )����� 9(�( ���9 �� �()( � <<�) ���#4���#���1 �������� ����# �������1������� ���� ��#"���7���� �� ��"��������# ��.�:��� �.�:�����/ �� �.##����� �� �!����� *8 �� 8 %)��8 3>B1 �=@<C �=� �

-����� @( )���� '( ��� '������ *(@( � << ) �����A#"���������:����� �� ��#�!������ ����)� � �":���� 37�8 %� 5��8=B71 � @C�� �

�<� �-.�� /� ��� 0.���� �� #�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

-������ �( %����������� #( C���� -(8( 9 ������ @(#( 5 ����� ;( "�� �( ��� *������ �( � <<@) ��":��� #����������:���� "���A�� �.� ��� ����� �� �.� ��"������� �� .���.��4 �������� �� ���� ���8 4�� ����8 &��8 �&�1 B<1 �=��C�=���

-� 8(5( ��� D� �(C( � <<�) $��� �������"# /��/, ��������#� �� "�":��� >������ 9��� 5��8 �� 8 ���8 =E1 ��C �<�

- �� 8(.( � <=�) G������ �� ����.#��� �� �.##����� �� �����*8 %� �� 8 =F41 ���C ��=�

)������ 8( -������� �( ��� #����� %( � <<@) 0�����A����� ���.������7���� �� #�9 ��"������� ��/�#��� /��� �������/� ����!:�����/ ������� ���" 9.��� 93�& /���8 <EB1 ���C����

)��� �( 9���� *( ��� ������ 8( � <<�) +�������� �� �#����� �J' ���" �������� ��##�� 0� ����� ���)�� �� � ��� ���� ��� J��9#41 6����������, '��#���� �� ;�/�1 ��� ���C����

)�� 8(C( ��� C����� �(@( � <<�) ����#���� ��"��.����������� �#���"!��#������ ����� �.���#� :��"�������� � ��� *8 <1 � �C����

@���� � *(*( *�� $ *(#( ��� :����� :(G( � << ) G�����"�":��� �.�#������# #���� �#���" "���"����1 �����#���#���" #���#�1 �� "�":��� >����� �� �����# �"���."���#� ��##�� %���8 5��8 >B1 � @C����

@� ����� *( %����� 8( ��� *�-��� �� -(.( � <<�) �/�����A�#�� ��#��� �� ��##/��!����� ������ ����� :��� ������������.!������� 6�� >�� �� A:��:#���� ��8 *8 �)��� 8 3>B1 �<�C ���

@ ������ )(6( ��� %����� -( � <=@) '���� ��#"���7����� -.�"��.���" �� ����� �� ����.#���?� *8 �� 8 %)��8 3>=1 �<��C �<=��

5 $���� %(-( � ���� *('( ��� 6��� �( � <<=) ���� ������� ������.#���!? �� ���������� �� ������##�#� �#���" �����/#� �� ��������#� "������ �+����� ���)8 7<>1 =��C=�@�

5$��� 8(1H( #�� #( 5���� D( 9� 8( ��� ��� D( � <<�) '����A#"���� "���#�� :��. ���"�# ������/ �� ��9�� 2�!�.���# ��������� �� /��� ��##� �� :���� �"� ;� � ��� �)��� 8==41 ���C����

9��� '( ��� ��$���� @(�( � <��) +���A����� �� ��7"���##���#��� "����.## ������#��� ���" 6�1 6�1 �� 6����#������ "��:�#��" �#��� ����/ � 8����� ������C��#��.#��� /#��# �9�!�.�� ����"� � ��� �)��� 8 431 �=��

9����$� #( ��� 5���� 5( � <<�) G������ �� #��.�#� ��>���������� ����������� �� ���.��#.�������� �� ������������� �� :����� :#��� �#��#���, ��#�����.��� �� �.�����.!��������� �.�/� �� "�":��� >����� : #��.�#�9��. �.��� ������� �� �#��#�� //��/���� �� ���#�� ��#��������� ���)��8 ���)��8 ����1 ===31 ��

9���� 5( :��$���� .(8( ��� 9���� *('( � <<@) 6�#� �#���"��/�#��/ �� '�:������� ����#��� �9� ��##�#� ���#� �� �.�/� �� �#���" ��/����� ���� ��#�"����� � ��� %� 1 E1�=<C����

9���� *('( -������ .(9( #��� #(*( ��� :��$���� .(8(� << ) -���/���� �#�� �8����� ������� �.� ������� �� ����.�� ��#�!�.��4 �� �#������� �� ����#�"�� �#���"� 4�����1<431 ���C��@�

����� 8( � <=�) ����7��/ ��������� C ����1 "�����"��� ���.�/��� 0� 5������� � ���� � 3���������� &�����1 &�#� ; %)� ���� 9���,���� ��� #��) (���������� &������ J�9 E��4,'���"�� +����1 ��� ��C � �

����� @(5( ��� C������ 5()( � <�@) ��":��� ����� �� ?�3%�� ��.�� �.�"��# �������� �� ������ #��4�"�� ��##��������������� 4�����1 3>31 �@�C�@��

*�- ���� )( �������������� *( ��� @ ��� 9( � <<<)

0�����A����� �� ��#�!��������� "������� �� �.�&�)�,����)������� ��"� ���� #����� 93�& /���8 74=1 �� C��@�

*����� 8( #��� ��� C( 9 �� �( ��� -��� G(15( � <<<) -.����� ����4�#���� �� ��8����� �� �#:���� �� "����� ����#��������/ �����/ ����.�"� ��## "���.�/������ �� ���"�������)� ����� ���� �����1 =3>1 ���<C��@=�

*�&��� -( :� � �( :������ C( @��&��� .( 9���� *('( * ���� *( ��� '������ '( � <<�) %�/��7���� �� ����4�#����������#� �.�/�� �� �����#�� �#���" �� ��#�!�.��4��4������� � ��"����� �� ������#���� %� %� ����1 331 � �C����

*��� '( @ ��&1��������� *(-( ��� %�������& *(#( � <<�)��":��� >����� �� 3��)����)�� � � �����/ .��!�.��4����)��8 ���)��8 ����1 =3<B1 <�C����

* ������ #(#( C �� '(8( ��� )����� '(8( � <=<) ��#���#��#����/ �� ��#�����.�� �� ����7��/ ��#����� �� ��#�!��#�"����!�����A� /���� �� #�#�� � ��� �)��� 8 E71 ��C �@�

* �� � .(%( ��� )����� '(#( � <<�) ;�9!��"������� ��/�#�����������, ��������� �� ��#� ��#�"����!�����A� /���� ��#�#� : �#���" � ���6� � ��� %� 1 A1 �� C�� �

* �� � .(%( %����� #( ��� )����� '(#( � <<�) 6�#�!��������.�/�� �� ����7��/ ��#�����1 ������� �.���.��#����1 ��/��� ����������� � ��� �)��� 8 =F31 ���C ����

* ���� 8(9( I� � 6( D� 8( �� -( ��� "���� *(�( � <<=) '��������#"���7���� ������ ������!������� ����#����# ������ ������� ��:�� ������� � ��� �)��� 8 ==>1 ���C ����

*��� '(�( � <<�) %������� ������� �� ��"��.# ��#������ ����.��# �� ������ "�":��� >������ � �) 1 B1 � �C� ��

*����� G( ��� � � )(.( � <<�) ��":��� >����� ����"������� ����������� � ��� �)��� 8 ==41 =��C=�<�

G����� C( ����� � '( '����� 8( .������ � @( ��� @���� �(� <=�) ?�"��.# ��#������ �������� ����#�"�� 6��

������������ �� ��.�:��� ���.���� .��"��� ��#��� �����"# :����� �� ��.�#�/��# .�"� ���.���� ��##�����)��8 ���)��8 ����1 B3E1 <�C <=�

'��� �� C( ��� C��� @(�( � <<@) 2����� ����������� ��.#�#4��!������� .�����������, 66#� �� 4����� ����"����� .����� "�":��� ����/���� *8 (7�� 8 3�����8 #�� �)1 7B1�=�C����

' ����� � .(8( 9�� � :( )���� )( ��� 6����� �� 8(5( � <<@)0�����A����� �� �.��� .�/.# ��������� ���#��"��� .������ B�/���� �� #�#�� �4� &�18 >1 ��C �@�

#����� C( ��� C ����� :(C( � << ) G������ �� ����.#���1�.##�����1 �� �B �� �.� �#��/���� �� ���� A#"��������)�������1 <F1 =��C <=��

#�$�&�� 5( ���� #( 6�������1:����� 8( ��� *��&�� )(� <<<) -.� ���!���#�������� /��� 5��#4���#��� �����/���.� ���� ����4�#���� �� �#�� ��##�� 3��8 *8 %� �� 8 AE1���C����

#������ )(.( ��� #��� �� :(.( � <<<) '����!��#��� �������������8 5��8 %� ���8 �� 8 =41 �� C�@��

#����� .( ��� 5��� *(G( � <<=) 3�/�#��/ �� �.� ��������4�#����� ����8 5��8 %� ���8 �� 8 =71 ���C��=�

#������� 5( � ������ G( *��� *( ���� ��� %( #��� � 8(1*( @������ %( ��� @��� � -( � <<�) 6#����/ ������������ �� ��� �� �#�� �������" ��� ������������"� &������1 34>1 @@�C@@��

#� �� 9( ��� ;� ��� �( � <<�) ��������# ���� �� ��##"�":����� 4�����1 <EA1 �@<C����

#��� � ;( #� ���� G('( 9������ D( ��� @� $��� .( � <=�);������#���, ����# "���� ������ �.� ������� "����A#"�����/��7���� �� ��#����� ��##�� &������1 3=B1 �<�C�<��

3�� � ����� �� � � ������� "� � ��� �� � �<�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�

#��� � ;( ����� %( #� ���� G('( ��� ���� *('( � <<<) J�9���!���� ���/� �� �.� ���� �� �.� ��/��7���� �� �������� ���.� ���� ����4�#����8 ������8 5��8 (��)8 7A1 =C���

:�������� #( #���$�� "( * �� � .(%( )����� '(#( ���� �� *( � <<�) -.� ��������� �� <�� /���� �� ��#�!��#�"���/���"������ �)� ����� G������� �� ��#� ��� �#���"� � ����13F<1 ���C����

"�� �( � � )(�( 5 ����� ;( ��� *����� G( � <<�) -.� ���"���/�# �� �.� :��#�/��# ���������� �� ��"�������, +�!��#7��.���/������ �� "�":��� #����� ���"�#��� �.� ������������ �.� ���' /��� �� &����)������ +66@=��� ���8 4�� ����8&��8 �&�1 BF1 <�<�C<�<��

6���� '(@( ��� 5 $��� :(5( � <<�) G������� ��� /�#��#��!���.1

#:�#� �!���� ���# �� .�"� ��#"���.����#�� #��4������%� ��� 8 %���<� ���1 3=1 ��C���

6� I( 6 �� 9( @� ����� *( ����� '(C( ��� *�-��� �� -(.(� <<<) ��/�#���� �� ������.!������� ������##�#� �#���"��������� : ���� A#"����� ���)��8 ���)��8 5��8%����8 3>=1 � <C����

J� 6(J( 9� #(8( # ;( ��� 9� 9(6( � <<�) ��#� �� ����"����A#"��� �� ��"���� ������.!������� ������� �� ��#�/�!������� �#���" �.���# ������� �� /����!��/ /�����"������ �+����� ���)8 7<71 ���C����

D���� � G( � <=<) G����� �� ��"��.# ��#������ �� �����#������7�� �#���" ������������ �� ����4�#��# ��/��7���� ��.�������� �� ���"� ��#����� %� &�����8 9����8 =71 ��C=��

�<� �-.�� /� ��� 0.���� �� #�

� $#�49�## 3������ ;��1 ()� � ��� *���� � �����)1 3< �=�C�<�