DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS,...

DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA

OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS, LÍPIDOS Y CLOROFILAS

A PARTIR DE CULTIVOS MIXOTRÓFICOS DE Chlorella vulgaris UTEX 1803.

AUTOR: IVÁN SEBASTIÁN QUINTERO RANGEL.*

C.C. 1098407574

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FISICOQUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

BUCARAMANGA

2014

DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA

OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS, LÍPIDOS Y CLOROFILAS

A PARTIR DE CULTIVOS MIXOTRÓFICOS DE Chlorella vulgaris UTEX 1803.

AUTOR: IVÁN SEBASTIÁN QUINTERO RANGEL.

C.C. 1098407574

Proyecto de Jóvenes Investigadores financiado por COLCIENCIAS

TUTOR:

PH.D. VIATCHESLAV KAFAROV.

C.E. 264762

Ingeniero Químico Dr. Sc

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FISICOQUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA

BUCARAMANGA

2014

AGRADECIMIENTOS

El autor agradece a:

COLCIENCIAS y su programa de Jóvenes Investigadores, por darme la

oportunidad de trabajar como Joven Investigador en el laboratorio de Biomasa

perteneciente al grupo de investigación CIDES de la Universidad Industrial de

Santander.

DR. SC. VIATCHESLAV KAFAROV, por la oportunidad de trabajar en su grupo de

investigación CIDES y por su respaldo como Tutor del proyecto.

BIÓLOGO ANDRÉS BARAJAS por su orientación, comprensión y apoyo para

contribuir al buen desarrollo del presente proyecto.

La Universidad Industrial de Santander, los profesores de Biología que hicieron

parte de mi formación profesional.

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 10

2. OBJETIVOS ............................................................................................................. 12

2.1. General: ........................................................................................................................... 12

2.2. Específicos: ..................................................................................................................... 12

3. DESCRIPCIÓN METODOLÓGICA ........................................................................... 13

3.1. Medio de cultivo y microalga. ....................................................................................... 13

3.2. Fotobioreactor ................................................................................................................. 14

3.3. Diseño experimental ...................................................................................................... 14

3.4. Cuantificación de metabolitos ....................................................................................... 15

3.4.1. Cuantificación de Carbohidratos Totales ............................................................ 15

3.4.2. Cuantificación de Proteínas .................................................................................. 15

3.4.3. Cuantificación de lípidos ........................................................................................ 15

3.4.4. Cuantificación de Clorofilas totales...................................................................... 16

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS ..................................................................................... 17

4.1. Caracterización de los metabolitos .............................................................................. 17

4.1.1. Carbohidratos .......................................................................................................... 17

4.1.2. Proteínas .................................................................................................................. 18

4.1.3. Clorofilas .................................................................................................................. 24

4.2. Análisis Estadístico ........................................................................................................ 27

4.2.1. Productividad de carbohidratos ................................................................................. 27

4.2.2. Productividad de Proteínas ........................................................................................ 29

4.2.3. Productividad de Lípidos ............................................................................................ 31

4.2.4. Productividad de Clorofilas ........................................................................................ 33

5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 35

6. RECOMENDACIONES ................................................................................................ 36

7. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 37

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Diseño experimental de los cultivos con Acetato de Sodio de C. Vulgaris ............ 14

Tabla 2. Diseño experimental de los cultivos con Carbonato de Amonio de C. Vulgaris ... 14

Tabla 3. Productividad de Carbohídratos(g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con acetato de sodio. ........................................................................... 17


tratamientos cultivados con carbonato de amonio. ................................................................... 17

Tabla 5. Productividad de Proteinas (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos

cultivados con Acetato de Sodio. ................................................................................................. 19


tratamientos cultivados con Carbonato de Amonio. ................................................................. 19

Tabla 7. Productividad de Lípidos (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos



cultivados con Carbonato de Amonio. ........................................................................................ 23

Tabla 9. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos


Tabla 10. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15 tratamientos

cultivados con Carbonato de Amonio. ........................................................................................ 25

Tabla 11. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos lípidos y

clorofilas empleando Acetato de sodio como fuente de carbono. ......................................... 26

Tabla 12. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos lípidos y

clorofilas empleando Carbonato de amonio como fuente de carbono. ................................ 26

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Metodología Experimental ............................................................................................ 13

Figura 4. Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días de

cultivo con Acetato de Sodio. ....................................................................................................... 20

Figura 5 Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días de

cultivo con Carbonato de Amonio. ............................................................................................... 20

Figura 8. Diagrama de Pareto para la producción de carbohidratos. a). cultivo con acetato

de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio. ........................................................................ 27

Figura 9. Superficie de respuesta para la producción de carbohidratos, Cultivo con Acetato

de sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Fosfato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).

Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio......................................................................... 28

Figura 10. Diagrama de Pareto para la producción de Proteínas. a). cultivo con acetato de

sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio ............................................................................... 29

Figura 11. Superficie de respuesta para la producción de proteínas, Cultivo con Acetato

de sodio: a). Tiempo-acetato, b). Tiempo-Nitrato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).

Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio......................................................................... 30

Figura 12. Diagrama de Pareto para la primera extracción de proteínas. a). cultivo con

acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio ........................................................... 31

Figura 13. Superficie de respuesta para la producción de Lípidos, Cultivo con Acetato de

sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Acetato de sodio; Cultivo con Carbonato de Amonio:

c). Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio ................................................................... 32

Figura 14. Diagrama de Pareto para la producción de Clorofilas. a). cultivo con Acetato de

Sodio, b). Cultivo con Carbonato de Amonio ............................................................................. 33

Figura 15. Superficie de respuesta para la producción de Clorofilas; Cultivo con Acetato


Tiempo-Fosfato, d). Tiempo-Carbonato Amonio ....................................................................... 33

RESUMEN

TITULO: DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS, PROTEÍNAS, LÍPIDOS Y CLOROFILAS A PARTIR DE CULTIVOS MIXOTRÓFICOS de Chlorella vulgaris UTEX 1803. AUTOR: QUINTERO RANGEL IVÁN SEBASTIÁN.* C.C. 1098407574

TUTOR: PH.D. KAFAROV VIATCHESLAV. ** C.E. 264762

PALABRAS CLAVES: Microalgas, proteínas, carbohidratos, lípidos, clorofilas, selectividad.

Las modificaciones en el medio de cultivo Bold Basal generadas por la incorporación de nutrientes como acetato y nitrato de sodio, además de incrementar la productividad de biomasa, carbohidratos, lípidos, proteínas y pigmentos, permite establecer escenarios específicos de producción en cultivos semi-contínuos, los cuales requieren la adición periódica de otros nutrientes como nitrato (NO3-N) y fosfato (PO4-P) que son consumidos por las microalgas durante el tiempo de cultivo para sintetizar tanto la biomasa como los demás compuestos metabólicos. Al acoplar estos escenarios, con sistemas de aprovechamiento como la biorefinería, se puede mejorar el uso de la biomasa generada, ya que cada uno de ellos posee otros metabolitos en menor proporción que pueden ser aprovechados en las diferentes corrientes del proceso de valorización de dicha biomasa. En el presente trabajo se analizó el efecto del carbonato de amonio, acetato de sodio, nitrato de sodio, fosfato de potasio y del tiempo de cultivo en la productividad de metabolitos de valor agregado en Chlorella vulgaris UTEX 1803. Para ello, se realizó dos diseños de experimentos 33 utilizando el software STATISTICA 7.0, éstos fueron realizados para evaluar el efecto de las variables acetato de sodio (3,27; 10,00; 20,00; 30,00; 36,73 mM), carbonato de amonio (0.351, 1.074, 2.149, 3.223 y 3.947 mM), nitrato de sodio (0.320, 0.98, 1.96, 2.94 y 3.60 mM) y fosfato de potasio (0.187, 0.574, 1.147, 1.721 y 2.107 mM), posteriormente se midió la cantidad de biomasa formada, así como los carbohidratos, proteínas, pigmentos y lípidos producidos durante los días 0, 2, 5, 7 10, 12 y 15 de cultivo. Según los resultados obtenidos se puede concluir que el diseño de cultivo que mejora la producción de proteínas es T3 (30 mM Acetato de sodio, 2,94 mM Nitrato de sodio y 1,721 mM Fosfato de sodio) a los 5 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 0,953 g/L y 76% de la biomasa total; mientras, que el diseño de cultivo que mejora la producción de carbohidratos es T4 (30 mM Acetato de sodio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 0,574 mM Fosfato de sodio) a los 12 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 1,008 g/L y 70% de la biomasa total; para lípidos, se encontró, que el diseño de cultivo que mejora la producción de Lípidos es T13 (20 mM Acetato de sodio, 0,32 mM Nitrato de sodio y 1,147 mM Fosfato de sodio) a los 10 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 0,169 g/L y 14% de la biomasa total. Por último, para Clorofilas se observó, que el diseño de cultivo que mejora producción de Clorofilas es T2 (1,074 mM Carbonato de amonio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 1,721 mM Fosfato de sodio) a los 10 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 0,178 g/L y 13% de la biomasa total.

*Facultad de Ciencias. Escuela de Biología.

** Facultad de ingenierías fisicoquímicas. Escuela de ingeniería química. Director. Dr. Sc Viatcheslav Kafarov.

ABSTRACT

TITLE: DESIGN METHODOLOGY FOR CULTURE MICROALGAS OBTAINING CARBOHYDRATE, PROTEIN, LIPID AND CHLOROPHYLL FROM CROP OF MIXOTROPHIC Chlorella vulgaris UTEX 1803.

AUTHOR: QUINTERO RANGEL IVÁN SEBASTIAN * C.C. 1098407574

TUTOR: PH.D. KAFAROV VIATCHESLAV. ** C.E. 264762

KEYWORDS: Microalgae, proteins, carbohydrates, lipids, chlorophylls selectivity.

Changes in Bold Basal medium generated by the addition of nutrients such as nitrate and sodium acetate, and increase biomass productivity, carbohydrates, lipids, proteins and pigments, allows for specific production scenarios in semi - continuous cultures, which require periodic addition of other nutrients such as nitrate (NO3 - N ) and phosphate (PO4 -P ) that are consumed by the microalgae in the culture time to synthesize both biomass and other metabolic compounds. By coupling these scenarios, with harvesting systems as biorefinery, it can improve the use of biomass generated, since each of them has to a lesser extent other metabolites that can be exploited in different process streams for recovery of the biomass. In this paper the effect of ammonium carbonate, sodium acetate, sodium nitrate, potassium phosphate and culture time on the productivity of value-added metabolites in Chlorella vulgaris UTEX 1803 was analyzed. To do this, two designs was performed 33 experiments using the STATISTICA 7.0 software, they were self made to evaluate the effect of varying sodium acetate (3.27 , 10.00 , 20.00 , 30.00 , 36.73 mM), ammonium carbonate (0.351 , 1.074 , 2.149 , 3.223 and 3.947 mM), sodium nitrate (0.320 , 0.98 , 1.96 , 2.94 and 3.60 mM) and potassium phosphate (0.187 , 0.574 , 1.147 , 1.721 and 2.107 mM), then the amount of biomass was measured formed as well as carbohydrates, proteins , lipids and pigments produced on days 0, 2 , 5, 7, 10, 12 and 15 of culture . According to the results it can be concluded that the culture method of improving protein production is T3 (30 mM Sodium Acetate, 2.94 mM sodium nitrate and 1.721 mM sodium phosphate) at 5 days of culture, resulting in a concentration of 0.953 g/L and 76% of the total biomass; while, the method of cultivation to improve the production of carbohydrates is T4 (30 mM Sodium Acetate, 0.98 mM sodium nitrate and 0.574 mM sodium phosphate) at 12 days of culture, resulting in a concentration of 1.008 g/L and 70% of the total biomass; to lipid was found that the culture method that enhances the production of lipids is T13 (20 mM Sodium Acetate, 0.32 mM sodium nitrate and 1.147 mM sodium phosphate) at 10 days of culture, obtaining a concentration 0.169 g / L and 14 % of the total biomass. Finally, it was observed to chlorophylls, that the improved cultivation method chlorophylls production is T2 ( 1,074 mM ammonium carbonate, 0.98 mM sodium nitrate and 1.721 mM sodium phosphate) at 10 days of culture, resulting in a concentration of 0.178 g/L and 13% of the total biomass.

__________________________________

* Faculty of Science. School of Biology.

** Physical-Chemical Engineering Faculty. Chemical Engineering. Departament. Director: Dr. Sc Viatcheslav Kafarov.

1. INTRODUCCIÓN

Las microalgas son microorganismos autótrofos que emplean la radiación solar, nutrientes

inorgánicos, agua y CO2 [1], para producir diferentes metabolitos [2], tales como lípidos,

carbohidratos, aminoácidos, proteínas, pigmentos y triglicéridos [3], por medio de la

fotosíntesis [4]. Por esta razón, Las microalgas constituyen una buena opción para la

producción de metabolitos de valor agregado para sintetizar productos como biodiesel,

bioetanol, biometano, biohidrógeno, fármacos, productos de cosméticos, alimento para

animales y suplementos proteicos de alto nivel nutricional [5, 6].

En especial, las microalgas son una fuente atractiva para la obtención de biodiesel ya que

poseen mayores productividades en comparación con los cultivos de plantas y con

frecuencia pueden duplicar la biomasa dentro de 24 horas [4 y 7].

Por otro lado algunas especies pueden acumular grandes cantidades de triglicéridos, que

constituyen la principal materia prima para la producción de biodiesel [7]. La mayoría de

microalgas presenta un crecimiento muy rápido, produciendo lípidos transesterificables [1]

y muchas especies, son excesivamente ricas en aceites [4]. Otra ventaja, es que la

producción de alimentos no se verá afectada al emplear las microalgas para producir

biodiesel, ya que presentan la habilidad de crecer en condiciones poco comunes como en

aguas marinas o residuales [8], por tanto no necesitan grandes extensiones de tierra para

su crecimiento [9].

La producción de biodiesel a partir de la biomasa de microalgas no es un proceso rentable

[10], por lo cual los metabolitos presentes en la biomasa son separados y aprovechados

usando diferentes tecnologías con el fin de ser transformados por diferentes mecanismos

en productos de valor agregado y biocombustibles [11], proceso conocido como

biorefinería. Entre los productos de valor agregado se encuentran suplementos

alimenticios ricos en nutrientes y proteínas, biocombustibles renovables como el biodiesel

derivado del aceite de microalgas, el metano generado de la digestión anaeróbica de la

biomasa de la microalga, y el biohidrógeno producido fotobiológicamente [4]. De esta

manera se reduce la concentración de gases de efecto de invernadero en la atmósfera

como el CO2 y la quema de combustibles fósiles [2, 12 y 13].

Las microalgas pueden cultivarse bajo condiciones autótrofas, heterótrofas, y mixotróficas.

Las células autótrofas cosechan la luz como fuente de energía y asimilan el CO2 como

fuente de carbono, las células heterótrofas utilizan sustratos orgánicos como fuente de

carbono y energía, y las células mixotróficas cosechan luz y utilizan sustratos inorgánicos

y orgánicos como fuentes de energía y carbono [14]. Las áreas de interés actual en la

investigación de microalgas están dominadas principalmente en la selección de las cepas

de autótrofos y condiciones de cultivo que conducen a los rendimientos más altos de

lípidos en menos tiempo [14, 15]. Las microalgas heterotróficas y mixotróficas están

relativamente menos estudiadas debido a su exigencia de carbonos orgánicos.

La microalga Chlorella vulgaris, es una de las cepas microalgales ampliamente

disponibles comercialmente para fines alimentarios y nutricionales [16]. Sus aplicaciones

actuales más representativas son la producción de biomasa para la alimentación, la

acuicultura y los suplementos alimenticios, y muchos otros avances en el tratamiento de

aguas residuales, la fijación de CO2 industrial y futuras y mejoradas aplicaciones

potenciales para fines relacionados con la energía y sistemas de soporte de vida en el

espacio [17]. Por otro lado, productos comunes pero menos contaminantes como el

biodiesel y los ésteres de alquilo son obtenidos a partir de los lípidos [6], y el bioetanol se

obtiene mediante la fermentación de los azúcares disponibles de la biomasa [18].

Estudios anteriores han mencionado que las especies de Chlorella son capaces de crecer

utilizando glucosa (C6H12O6), acetato (C2H3O2-), glicerol (C3H5 (OH) 3), y otras fuentes

de carbono [2 y 19], pero hasta donde sabemos, sólo hay la escasez de datos acerca de

sus productividades de lípidos cuando se cultivan en estas fuentes de carbono con

diferentes condiciones de cultivo. Las especies de Chlorella son microorganismos

resistentes que pueden crecer en muchas condiciones de todo el mundo, ya que pueden

servir de ejemplo para los crecimientos heterótrofos y mixotróficos suministrados con

glucosa, glicerol, acetato, u otros compuestos orgánicos a partir de los recursos

residuales con cero o costos negativos como fuente de carbono para acumular lípidos

para la producción de biodiesel.

La concentración de metabolitos presentes en la biomasa de C. vulgaris, se encuentra entre un 12-17% en carbohidratos, 51-58% en proteínas y 14-22% en lípidos [20], a diferencia del contenido general presente en la mayoría de algas (40-70% de carbohidratos, 10-20% de proteínas) con otro tipo de metabolismo [1]. En las microalgas marinas se ha encontrado que alrededor del 20-30% de la biomasa está conformada por celulosa o almidón, junto con otros monosacáridos como la xilosa y glucosa, entre otros [21].

Los carbohidratos son a menudo las principales reservas de energía [22]. Comúnmente la

glucosa y el almidón se emplean para la producción de biocombustibles, principalmente el

bioetanol [23]. Por otro lado los pigmentos son metabolitos empleados como colorantes

naturales en la industria de alimentos, cosméticos [24], en la industria farmacéutica para

el tratamiento de enfermedades junto con las proteínas. Contribuyendo de esta manera

con la viabilidad de la producción de biocombustibles a partir de microalgas gracias a su

gran valor comercial.

La composición química de la biomasa está relacionada con el diseño del medio de

cultivo; donde factores ambientales como la temperatura, la intensidad luminosa y

factores químicos como el pH del medio afectan directamente la productividad [25].

Además, Factores como la concentración de los nutrientes presentes en el medio juegan

un papel fundamental en la optimización de la producción de biomasa [26]. El nitrógeno

constituye uno de los nutrientes que más afecta el crecimiento celular en la microalga

[24], y la producción de lípidos [27]. Cambios en la concentración de nitrógeno en el

medio puede incrementar la productividad en la composición de la biomasa [28],

especialmente los pigmentos, proteínas y carbohidratos. De acuerdo a lo descrito

anteriormente, el objetivo principal de esta investigación es diseñar medios de cultivo

selectivo mediante la modificación del nitrógeno, carbono y fósforo del medio de cultivo

Bold Basal que mejoren la productividad de metabolitos específicos (proteínas,

carbohidratos, lípidos, y clorofilas) presentes en Chlorella vulgaris UTEX 1803.

2. OBJETIVOS

2.1. General:

Diseñar medios de cultivo selectivo, que mejoren la productividad de metabolitos

específicos (carbohidratos, proteínas, lípidos y clorofilas) presentes en Chlorella vulgaris

UTEX 1803, mediante la modificación de la fuente de nitrógeno, fósforo y carbono del

medio de cultivo Bold Basal.

2.2. Específicos:

Diseñar un medio de cultivo selectivo, que mejore la productividad de proteínas presentes

en Chlorella vulgaris, a escala de laboratorio.

Diseñar un medio de cultivo selectivo, que mejore la productividad de carbohidratos

presentes en Chlorella Vulgaris, a escala de laboratorio.

Diseñar un medio de cultivo selectivo que mejore la productividad de Lípidos presentes en

Chlorella vulgaris, a escala de laboratorio

Diseñar un medio de cultivo selectivo que mejore la productividad de clorofilas totales

presentes en Chlorella vulgaris, a escala de laboratorio.

3. DESCRIPCIÓN METODOLÓGICA

La metodología experimental se desarrolló mediante la realización de un diseño de

experimentos donde se varían las condiciones de cultivo (Acetato de sodio, Nitrato de

sodio y Fosfato de potasio) y se determinan los experimentos a realizar, a los cuales se

les cuantificaron los principales componentes de la biomasa, como lo son: lípidos,

carbohidratos, proteínas y pigmentos. Para finalizar se realiza un análisis estadístico de

los datos obtenidos en las pruebas y se realizan las conclusiones pertinentes.

Figura 1. Metodología Experimental

3.1. Medio de cultivo y microalga.

La microalga Chlorella vulgaris UTEX 1803 es proveniente de la colección de cultivo de

algas de la universidad de Texas (Austin, TX, USA). Inicialmente, esta cepa se mantuvo

en crecimiento en fotobiorreactores a escala de laboratorio, en medio de cultivo Bold

basal (MBB), cada litro de medio está compuesto por: NaNO3, 2,94x10-3 M; MgSO4.7H2O,

3,04x10-4 M; NaCl, 4,28x10-4 M; K2HPO4, 4,31x10-4 M; KH2PO4, 1,29x10-3 M; CaCl2.2H2O,

1,70x10-4 M; H3BO3, 1,85x10-4 M; KOH, 5,53x10-4 M; EDTA, 1,71x10-4 M ; FeSO4.7H2O

1,79x10-5M y 1 mL de solución de metales [29].

Cultivo Inoculo

Biomasa

Siembra

experimentos

medición días

2-5-7-10-12-

15

Centrífuga

Medio

Bold Basal

10 ml

muestra

Cuantificación Proteínas

1 ml

muestra

10 ml

muestra

Horno

Cuantificación Clorofílas

Cuantificación Lípidos

Cuantificación Carbohidratos

0.05 g

Biomasa

Método

colorimét

rico

fenol-

ácido

sulfúrico

[30].

Método

de

proteína

s por

reacción

de Folin

[32]

Método espectrofotométrico propuesto por Wiley & Songs (2005)

Método

espectrofotométrico de

lípidos por formación de

complejos de Cu-FA.

Propuesto por Chen

(2012) [33].

El medio debe cumplir con las siguientes condiciones: temperatura ambiente (23°C), pH

neutro, aireación permanente y ciclos luz-oscuridad 12-12 horas, sin ningún suministro

complementario de CO2 considerándose este cultivo como tratamiento control.

3.2. Fotobioreactor

Se usaron botellas de vidrio de 1 L de capacidad. En el extremo superior de cada uno de

los reactores se colocó un sistema de suministro de aire continuo por burbujeo (tubo-

difusor) con el fin de proveer de aire los cultivos y garantizar que todas las células estén

expuestas a la luz y los nutrientes del medio.

3.3. Diseño experimental

Para el desarrollo del diseño experimental se realizó en la herramienta informática

STATISTIC 7.0. Los diseños realizados están basados en composición central, no

factorial 33 de 17 experimentos , cada uno con su original y dos replicas (Tabla 1 y 2), éste

fue realizado para evaluar el efecto de las variables acetato de sodio (3,27; 10,00; 20,00;

30,00; 36,73 mM), carbonato de amonio (0.351, 1.074, 2.149, 3.223 y 3.947 mM), nitrato

de sodio (0.320, 0.98, 1.96, 2.94 y 3.60 mM) y fosfato de potasio (0.187, 0.574, 1.147,

1.721 y 2.107 mM), los demás componentes del medio se mantuvieron contantes

(macronutrientes y micronutrientes) según las especificaciones del Medio Bold Basal

(MBB).

Tabla 1. Diseño experimental de los cultivos con Acetato de Sodio de C. Vulgaris

Tabla 2. Diseño experimental de los cultivos con Carbonato de Amonio de C.

Vulgaris

Tratamientos T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15

Carbonato de Amonio (mM) 1,074 1,074 3,223 3,223 2,149 1,074 1,074 3,223 3,223 0,351 3,947 2,149 2,149 2,149 2,149

Nitrato sodio (mM) 2,94 0,98 2,94 0,98 1,96 2,94 0,98 2,94 0,98 1,96 1,96 3,6 0,32 1,96 1,96

Fosfato potasio (mM) 0,574 1,721 1,721 0,574 1,147 1,721 0,574 0,574 1,721 1,147 1,147 1,147 1,147 0,187 2,107

TRATAMIENTO T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T14 T15

Acetato de sodio (mM) 10,00 10,00 30,00 30,00 20,00 10,00 10,00 30,00 30,00 3,27 36,73 20,00 20,00 20,00 20,00

Nitrato sodio (mM) 2,940 0,980 2,940 0,980 1,960 2,940 0,980 2,940 0,980 1,960 1,960 3,600 0,320 1,960 1,960

Fosfato potasio (mM) 0,574 1,721 1,721 0,574 1,147 1,721 0,574 0,574 1,721 1,147 1,147 1,147 1,147 0,187 2,107

3.4. Cuantificación de metabolitos

Se realizaron mediciones para cada tratamiento, durante los días 0, 2, 5, 7, 10, 15 de

cultivo en los que se cuantificó la cantidad de biomasa y de cada uno de los metabolitos

producidos (carbohidratos, proteínas, lípidos y clorofilas).

3.4.1. Cuantificación de Carbohidratos Totales

Se utilizó el método colorimétrico fenol-ácido sulfúrico [30]. Se tomó 1mL de cada extracto y a

estos se les adicionó por separado 0,5 mL de fenol al 5% se homogenizó la mezcla y adicionó 2,5

mL de ácido sulfúrico al 95%. Por último la muestra se medió en un espectrofotómetro

(Spectroquant Pharo 300, Merck) a longitudes de onda de 480nm, 485 nm y 490nm para identificar

Xilosa, Arabinosa, Glucosa y Fructosa presentes en la biomasa. Se calculó el contenido de

carbohidratos de las muestras en mg de carbohidrato/L a partir de la correlación contra las curva

de calibración de solución de xilosa, arabinosa, glucosa y fructosa estándar.

3.4.2. Cuantificación de Proteínas

La extracción de proteínas se desarrolló siguiendo el procedimiento de Rausch, T. (1981) [31] empleado por Chen & Vaidyanathan (2013) [22]. En el proceso se centrifugó 10 mL de la muestra a 3400 rpm durante 20 minutos, 1 mL 1M de NaOH se añadió al sedimento y se extrajo a 80°C por 10 minutos con agitación ocasional. Después de enfriar y centrifugar, el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo. La extracción alcalina fue repetida 3 veces. La última repetición fue calentada a 100 °C por 10 minutos para extraer completamente las proteínas. Las tres extracciones fueron combinadas y mezcladas antes del análisis. El contenido de proteínas totales en el extracto fue estimado usando el método de proteínas por reacción de Folin [32], empleado por Dorey y Draves (1998). Un volumen de 1 mL de las muestras extraída junto a 1.4 mL de solución Lowry fue añadido a un tubo de ensayo, luego se mezcló con un vortex por 3 min. Después de 20 minutos de incubación se agregó 0.2 mL del reactivo de Folin en solución con agua, el cual se dejó reaccionar por 30 minutos con agitación ocasional. Los ácidos amino aromáticos de la muestra tratada reducen el ácido presente en el reactivo de Folin. Finalmente el producto de esta reacción tiene un color azul. La concentración de proteínas en la muestra se estimó por lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300 (Merck) a una longitud de onda de 750 nm. Se calculó el contenido de proteína de las muestras en mg de BSA / L a partir de la correlación contra una curva de calibración de solución de proteínas estándar (solución de albúmina de suero bovino con concentración máxima de 2 g/L).

3.4.3. Cuantificación de lípidos

La cuantificación de lípidos se estimó siguiendo el procedimiento de Chen (2012) [33], que consiste, en realizar la lisis celular, seguida, de la saponificación de los lípidos, extracción de FA, y la formación de complejos de Cu-FA. Para cada experimento realizado, se tomó 0,05 g de biomasa de los días 5, 10 y 15 de cultivo. Esta biomasa se resuspendió en 100 µl de Tris - HCl (1 M, pH 8,0). Seguidamente, de añadió 2.400 µl de reactivo de saponificación (25 % de metanol en 1 M NaOH) y se añadió aproximadamente 250 mg de perlas de vidrio de 0,1 mm (Sigma - Aldrich).Posteriormente, se realizó la ruptura celular mediante la agitación con vórtex vigorosa durante 3 min. Luego, se añaden otros 2.500 µl de del reactivo de saponificación. Después, la mezcla se saponifica en baño maría a 90 °

C durante 30 min y se agitó con vórtex cada 5 min para hidrolizar los enlaces éster de los lípidos de membrana y triglicéridos [33, 34]. Después de la saponificación, las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y se tomaron 3.000 µl de la mezcla saponificada y se añadieron a un tubo Eppendorf (Eppendorf) que contenía 4.500 µl de una mezcla disolvente de cloroformo y metanol (2:01). Después de agitación durante 2 min, las muestras se centrifugan a 5.000 rpm durante 2 min. A continuación, se tomó un volumen de 2.500 µl de la fase orgánica y se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf que contenía reactivo de cobre (9 vol. AQ. 1 TEA M, 1 vol. Ácido acético 1 M, 10 vol. 6,45 % w / v de Cu (NO3) 2.3 H2O). Después de este paso, 1.500 µl de la fase orgánica se transfirió cuidadosamente a una cubeta de cuarzo y se mide la absorbancia a 260 nm usando un espectrofotómetro (Spectroquant Pharo 300, Merck).

3.4.4. Cuantificación de Clorofilas totales.

Un volumen de 10 mL de muestra de cada tratamiento se centrifugó a 3400 rpm durante

15 minutos (Centrifuga PowerSpin™ MX). Luego se extrajo el sobrenadante con el fin de

eliminar el medio presente, 3 ml de etanol al 95% se añadió al sedimento. La mezcla se

calentó al baño maría durante 10 minutos a 80°C. Después de enfriar se aforó hasta 5 mL

con etanol al 95% y se centrifugó nuevamente a 3400 rpm durante 15 minutos para

eliminar la biomasa libre de pigmento. La concentración de la clorofila a (Ca) y clorofila b

(Cb) en el sobrenadante se cuantificó al usar el método espectrofotométrico propuesto por

Wiley & Songs (2005), por lectura de la absorbancia a longitudes de onda de 645 nm y

663 nm en un espectrofotómetro Spectroquant Pharo 300 (Merck). La relación de la

cantidad de clorofila (a), (b) y (a+b) en el sobrenadante Ca (mg/L), Cb (mg/L) y Ca+b (mg/L)

con el valor de la absorbancia fue correlacionado de acuerdo a las ecuaciones:

( 1)

( 2)

( 3)

4. RESULTADOS Y ANÁLISIS

4.1. Caracterización de los metabolitos

En las Tablas 3-9, se observan los resultados de cuantificación en gramos por litros de las

mejores productividades de metabolitos, entre ellos, carbohidratos, proteínas, lípidos y

clorofilas para cada una de las pruebas de los diseños experimentales.

4.1.1. Carbohidratos

La tabla 3 y 4, se resume la producción de carbohidratos en función del tiempo para los

cultivos en acetato sodio y carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores

productividades: T4 (con acetato de sodio al día 12) y T3 (con carbonatao de amonio al

dia 15), observandose que la mejor productividad de carbohidratos se obtiene con acetato

de sodio a los 12 días de cultivo en el tratamiento 4 (30 mM de Acetato de sodio, 0,980

mM de Nitrato de sodio y 0,574 mM de Fosfato de Potasio), obteniéndose una

concentración de 1,008 g/L y 69,9 % de carbohidratos.


tratamientos cultivados con acetato de sodio.

TIEMPO (días)

CARBOHIDRATOS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,040 0,107 0,248 0,236 0,306 0,303 0,427 T2 0,040 0,064 0,165 0,248 0,377 0,889 0,377 T3 0,040 0,191 0,357 0,201 0,447 0,531 0,545 T4 0,040 0,268 0,209 0,273 0,319 1,008 0,553 T5 0,040 0,113 0,233 0,297 0,497 0,327 0,529 T6 0,040 0,095 0,132 0,197 0,341 0,409 0,459 T7 0,040 0,008 0,113 0,389 0,487 0,248 0,644 T8 0,040 0,012 0,068 0,280 0,356 0,294 0,605 T9 0,040 0,225 0,266 0,394 0,581 0,797 0,412

T10 0,040 0,156 0,163 0,219 0,450 0,365 0,896 T11 0,040 0,131 0,411 0,422 0,465 0,500 0,231 T12 0,040 0,136 0,212 0,196 0,273 0,365 0,210 T13 0,040 0,115 0,339 0,219 0,745 0,542 0,326 T14 0,040 0,014 0,280 0,149 0,436 0,381 0,455 T15 0,040 0,112 0,300 0,376 0,449 0,602 0,503


tratamientos cultivados con carbonato de amonio.

TIEMPO (días)

CARBOHIDRATOS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,040 0,093 0,192 0,202 0,216 0,168 0,492

T2 0,040 0,087 0,085 0,218 0,183 0,379 0,620

T3 0,040 0,009 0,153 0,107 0,025 0,173 0,319

T4 0,040 0,006 0,062 0,108 0,094 0,092 0,247

T5 0,040 0,033 0,095 0,076 0,148 0,184 0,217

T6 0,040 0,027 0,175 0,272 0,275 0,309 0,421

T7 0,040 0,046 0,089 0,070 0,137 0,489 0,441

T8 0,040 0,023 0,043 0,075 0,052 0,129 0,189

T9 0,040 0,093 0,120 0,122 0,233 0,251 0,480

T10 0,040 0,121 0,111 0,121 0,187 0,321 0,537

T11 0,040 0,059 0,068 0,055 0,207 0,263 0,355

T12 0,040 0,081 0,138 0,157 0,275 0,266 0,249

T13 0,040 0,095 0,123 0,122 0,271 0,350 0,447

T14 0,040 0,059 0,121 0,142 0,278 0,204 0,432

T15 0,040 0,043 0,026 0,112 0,093 0,144 0,386

Todos los monosacáridos evidencian una disminución en la presencia de estos en la

biomasa durante los 5 primeros días, En la Figura 4 y 5, se puede observar, que tanto

para los experimentos cultivados con Acetato de sodio como, para los cultivados con

Carbonato de Amonio, las menores productividades de carbohidratos se presentaron en el

día 2 (tratamiento 7 con un 0,008 g/L, 1,1% de carbohidratos). A partir del 10º día

comienza un aumento gradual de la presencia de estos metabolitos en la biomasa hasta

estabilizarse en sus valores máximos alrededor del 15º día, los mayores porcentajes se

obtienen en el día 15 de cultivo.

Los carbohidratos a partir de microalgas son adecuados para la producción de bioetanol,

aunque aún debe crearse una tecnología más económica para la recolección de células y

así hacer factible la producción comercial de etanol basado en microalgas [22]. Algunos

cepas de C. vulgaris han logrado concentraciones en la biomasa de 55% [1 y 35] y 41%

[36]. Los monosacáridos estudiados componen hasta un 69,9% del total de la biomasa al

12º día, con una producción de biomasa de 1,44 g/L, esto en comparación a lo obtenido

en el cultivo en medio mixotrófico usando acetato de sodio como fuente de carbono

significa un aumento en promedio del 14,9%.

Como se observa en los resultados, la concentración de acetato está relacionada con la

producción de carbohidratos, permitiendo afirmar que altas concentraciones de dicho

nutriente (30mM) incrementan la productividad de éste metabolito con el tiempo

(p=0,0000), lo que concuerda con estudios realizados por Chinnasamy et al. (2009) [37] y

Laliberté (1993) [38], quien plantea además que las elevadas concentraciones de acetato,

promueven la síntesis de clorofila y la producción de lípidos.

4.1.2. Proteínas

La tabla 5 y 6, se resume la producción de proteinas en función del tiempo para los

cultivos en acetato sodio y carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores


dia 12), observandose, que la mejor productividad de proteínas se obtiene con acetato de

sodio a los 5 días de cultivo en el tratamiento 3 (30 mM de Acetato de sodio, 2,94 mM de

Nitrato de sodio y 1,721 mM de Fosfato de Potasio), obteniéndose una concentración de

0,953 g/L y 76,1 % de proteínas.

Tabla 5. Productividad de Proteinas (g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Acetato de Sodio.

TIEMPO (días)

PROTEÍNAS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,127 0,192 0,359 0,375 0,399 0,373 0,414

T2 0,127 0,242 0,218 0,233 0,236 0,391 0,402

T3 0,127 0,394 0,953 0,415 0,586 0,922 0,204

T4 0,127 0,142 0,653 0,649 0,183 0,298 0,457

T5 0,127 0,193 0,107 0,184 0,317 0,337 0,265

T6 0,127 0,133 0,090 0,172 0,443 0,679 0,291

T7 0,127 0,189 0,266 0,171 0,211 0,167 0,091

T8 0,127 0,283 0,316 0,384 0,405 0,307 0,196

T9 0,127 0,179 0,120 0,120 0,087 0,183 0,128

T10 0,127 0,190 0,082 0,196 0,156 0,254 0,265

T11 0,127 0,069 0,135 0,104 0,075 0,060 0,167

T12 0,127 0,121 0,131 0,115 0,119 0,067 0,253

T13 0,127 0,082 0,111 0,068 0,105 0,389 0,103

T14 0,127 0,088 0,081 0,083 0,214 0,412 0,170

T15 0,127 0,214 0,092 0,151 0,206 0,353 0,181


tratamientos cultivados con Carbonato de Amonio.

TIEMPO (días)

PROTEÍNAS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,127 0,170 0,297 0,142 0,271 0,371 0,292 T2 0,127 0,066 0,105 0,192 0,262 0,256 0,181 T3 0,127 0,130 0,075 0,134 0,212 0,229 0,268 T4 0,127 0,078 0,110 0,094 0,158 0,120 0,231 T5 0,127 0,089 0,115 0,191 0,208 0,225 0,292 T6 0,127 0,087 0,117 0,224 0,250 0,171 0,376 T7 0,127 0,074 0,115 0,151 0,155 0,228 0,263 T8 0,127 0,091 0,082 0,119 0,227 0,254 0,186 T9 0,127 0,086 0,185 0,175 0,226 0,213 0,319 T10 0,127 0,102 0,286 0,274 0,121 0,254 0,227 T11 0,127 0,116 0,133 0,150 0,183 0,371 0,214 T12 0,127 0,098 0,214 0,277 0,306 0,429 0,266 T13 0,127 0,069 0,213 0,194 0,280 0,293 0,175

T14 0,127 0,066 0,210 0,184 0,185 0,243 0,106 T15 0,127 0,075 0,168 0,098 0,319 0,267 0,280

En la Figura 4 y 5, se puede observar, que tanto para los experimentos cultivados con

Acetato de sodio como, Carbonato de Amonio, las menores productividades de proteínas

se presentaron en el día 2 de cultivo, mientras, que los mayores porcentajes se obtienen

en el día 15 de cultivo. Esto se debe a que durante este período de tiempo las microalgas

sufren un cambio en su composición interna debido a la adaptación al nuevo medio de

cultivo, donde pasan de ser fotoautótrofas a mixotróficas.

Estudios previos, han logrado una presencia del 54% (p/p) de la proteína en la biomasa

cultivada en medio Bol Basal al 5º día [39], esto en comparación a lo obtenido en el cultivo

en medio mixotrófico usando acetato de sodio como fuente de carbono significa un

aumento en promedio del 22,1%.

Figura 2. Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días

de cultivo con Acetato de Sodio.

Figura 3 Composición porcentual de la biomasa de C. vulgaris durante los 15 días

de cultivo con Carbonato de Amonio.

4.1.3. Lípidos

Los lípidos transesterificables presentres en la biomasa, se midieron en base seca, con el

fin de maximizar la eficiencia de la extracción [40]. En la tabla 7 y 8, se resume la

producción de Lipidos en función del tiempo para los cultivos con acetato sodio y

carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores productividades: T13 (con

acetato de sodio al día 10) y T13 (con carbonatao de amonio al dia 15), observandose,

que la mejor productividad de Lípidos se obtiene a los 10 días de cultivo en el tratamiento

13 (20 mM de Acetato de sodio, 0,320 mM de Nitrato de sodio y 1,147 mM de Fosfato de

Potasio) que emplea acetato de sodio como fuente de carbono, obteniéndose una

concentración de 0,169 g/L y 13,9 % de Lípidos.


cultivados con Acetato de Sodio.

TIEMPO (días)

LÍPIDOS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,081 0,084 0,097 0,092 0,085 0,094 0,088

T2 0,081 0,090 0,110 0,107 0,107 0,106 0,089

T3 0,081 0,098 0,126 0,118 0,112 0,113 0,098

T4 0,081 0,078 0,085 0,094 0,105 0,106 0,092

T5 0,081 0,091 0,112 0,110 0,110 0,127 0,129

T6 0,081 0,101 0,132 0,118 0,107 0,125 0,128

T7 0,081 0,105 0,139 0,119 0,102 0,121 0,124

T8 0,081 0,094 0,118 0,112 0,107 0,119 0,116

T9 0,081 0,094 0,117 0,118 0,121 0,123 0,110

T10 0,081 0,078 0,086 0,097 0,109 0,111 0,097

T11 0,081 0,074 0,078 0,108 0,140 0,113 0,070

T12 0,081 0,082 0,093 0,129 0,167 0,146 0,109

T13 0,081 0,077 0,084 0,126 0,169 0,144 0,102

T14 0,081 0,080 0,090 0,126 0,164 0,132 0,085

T15 0,081 0,078 0,086 0,121 0,158 0,136 0,098


cultivados con Carbonato de Amonio.

TIEMPO (días)

LÍPIDOS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,081 0,083 0,089 0,095 0,103 0,120 0,139

T2 0,081 0,091 0,105 0,102 0,101 0,107 0,115

T3 0,081 0,086 0,094 0,096 0,101 0,104 0,108

T4 0,081 0,092 0,106 0,110 0,117 0,107 0,100

T5 0,081 0,091 0,105 0,106 0,109 0,114 0,120

T6 0,081 0,081 0,084 0,098 0,114 0,106 0,100

T7 0,081 0,105 0,132 0,122 0,113 0,116 0,120

T8 0,081 0,072 0,067 0,069 0,072 0,093 0,115

T9 0,081 0,075 0,072 0,081 0,092 0,107 0,123

T10 0,081 0,087 0,096 0,094 0,094 0,105 0,119

T11 0,081 0,077 0,076 0,092 0,109 0,112 0,116

T12 0,081 0,086 0,095 0,102 0,111 0,119 0,128

T13 0,081 0,095 0,113 0,114 0,116 0,131 0,148

T14 0,081 0,083 0,089 0,093 0,100 0,103 0,107

T15 0,081 0,081 0,084 0,098 0,114 0,115 0,118


Acetato de sodio y Carbonato de Amonio, las menores productividades de lípidos se

presentaron en el día 5 de cultivo (tratamiento 8: 0,067g/L y 7,7 % de Lípidos usando

carbonato de amonio como fuente de carbono), mientras, que los mayores

productividades se obtienen en el 10° día con acetato de sodio y 15° día con carbonato de

amonio como fuentes de carbono, alcanzando productividades de 0,169 g/L y 13,9 % de

Lípidos (T13, día 10) y 0,148 g/L , 9,8 % de lípidos ( T13, día 15) respectivamente. El

mayor porcentaje de lípidos en la biomasa se obtiene en el 5° día de cultivo para el

tratamiento 7 cultivado en carbonato de amonio obteniéndose un porcentaje del 17,06 % y

una productividad 0,132 g/L de proteínas. Este valor es bajo comparados con otros

estudios en los cuales se alcanzan presencias del metabolito del 21% con un medio de

cultivo Bol Basal modificado con nitrato de sodio y acetato de sodio [39]. Esto en

comparación a lo obtenido en el cultivo en medio mixotrófico usando Carbonato de

Amonio como fuente de carbono significa una disminución en promedio del 3,9%.

Microalgas con elevadas productividades lipídicas son deseables para la elaboración de

biodiesel, razón por la cual la cantidad de lípidos contenidos en la biomasa y la velocidad

de crecimiento, sumados a la eficiencia metabólica y la robustez del microorganismo, son

relevantes para su selección [4, 41]. La determinación del contenido oleaginoso de las

microalgas resulta complicada a causa de su variación ante condiciones distintas de

cultivo; el crecimiento en ambientes desfavorables o bajo situaciones de estrés,

frecuentemente conlleva al incremento de la fracción lipídica, aunque en detrimento de la

productividad lipídica del cultivo. Los lípidos comprendidos en las microalgas por lo

general constituyen del 20 al 50% de su peso seco [42].

4.1.3. Clorofilas

En la tabla 9 y 10, se resume la producción de Clorofilas en función del tiempo para los

cultivos con acetato sodio y carbonato de amonio, en donde se destacan las mayores


dia 12), observandose, que la mejor productividad de clorofilas se obtiene a los 12 días de

cultivo en el tratamiento 2 con carbonato de amonio (1,074 mM de Carbonato de amonio,

0,98 mM de Nitrato de sodio y 1,721 mM de Fosfato de Potasio), obteniéndose una

concentración de 0,178 g/L de Clorofilas totales.

Tabla 9. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Acetato de Sodio.

TIEMPO (días)

CLOROFILAS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,040 0,107 0,248 0,236 0,306 0,303 0,427

T2 0,040 0,064 0,165 0,248 0,377 0,889 0,377

T3 0,040 0,191 0,357 0,201 0,447 0,531 0,545

T4 0,040 0,268 0,209 0,273 0,319 1,008 0,553

T5 0,040 0,113 0,233 0,297 0,497 0,327 0,529

T6 0,040 0,095 0,132 0,197 0,341 0,409 0,459

T7 0,040 0,008 0,113 0,389 0,487 0,248 0,644

T8 0,040 0,012 0,068 0,280 0,356 0,294 0,605

T9 0,040 0,225 0,266 0,394 0,581 0,797 0,412

T10 0,040 0,156 0,163 0,219 0,450 0,365 0,896

T11 0,040 0,131 0,411 0,422 0,465 0,500 0,231

T12 0,040 0,136 0,212 0,196 0,273 0,365 0,210

T13 0,040 0,115 0,339 0,219 0,745 0,542 0,326

T14 0,040 0,014 0,280 0,149 0,436 0,381 0,455

T15 0,040 0,112 0,300 0,376 0,449 0,602 0,503

Tabla 10. Productividad de Clorofilas (g/L) en función del tiempo para los 15

tratamientos cultivados con Carbonato de Amonio.

TIEMPO (días)

CLOROFILAS g/L

0 2 5 7 10 12 15

T1 0,040 0,093 0,192 0,202 0,216 0,168 0,492 T2 0,040 0,087 0,085 0,218 0,183 0,379 0,620 T3 0,040 0,009 0,153 0,107 0,025 0,173 0,319 T4 0,040 0,006 0,062 0,108 0,094 0,092 0,247 T5 0,040 0,033 0,095 0,076 0,148 0,184 0,217 T6 0,040 0,027 0,175 0,272 0,275 0,309 0,421 T7 0,040 0,046 0,089 0,070 0,137 0,489 0,441 T8 0,040 0,023 0,043 0,075 0,052 0,129 0,189 T9 0,040 0,093 0,120 0,122 0,233 0,251 0,480 T10 0,040 0,121 0,111 0,121 0,187 0,321 0,537 T11 0,040 0,059 0,068 0,055 0,207 0,263 0,355 T12 0,040 0,081 0,138 0,157 0,275 0,266 0,249 T13 0,040 0,095 0,123 0,122 0,271 0,350 0,447 T14 0,040 0,059 0,121 0,142 0,278 0,204 0,432 T15 0,040 0,043 0,026 0,112 0,093 0,144 0,386


Acetato de sodio y Carbonato de Amonio, las menores productividades de Clorofilas se

presentó en el día 15 de cultivo (T13: 0,003 g/L y 0,2 % de Clorofilas) con 20 mM acetato

de sodio, 0,320 mM de Nitrato de Sodio y 1,147 mM de Fosfatos de potasio. La

disminución en la productividad se debe a que las células no solo obtuvieron energía y

carbono de la fotosíntesis del CO2 presente en el aire, sino de la fosforilación oxidativa del

acetato [43], vale la pena mencionar, que una fuente de carbono diferente a CO2 puede

causar una disminución en la tasa fotosintética de la célula afectando así la productividad

de pigmentos [44].

Tabla 11. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos

lípidos y clorofilas empleando Acetato de sodio como fuente de carbono.

ACETATO DE SODIO TRATAMIENTO

DÍA

PROTEINAS CARBOHIDRATOS LIPIDOS CLOROFILAS Concentración g/L

Porcentaje g/g

Concentración g/L

Porcentaje g/g

Concentración g/L

Porcentaje g/g

Concentración g/L

Porcentaje g/g

T3 5 0,953 76% 0,357 29% 0,126 10% 0,014 1% T4 12 0,298 21% 1,008 70% 0,106 7% 0,036 3% T3 12 0,922 63% 0,531 36% 0,113 8% 0,14 10% T13 10 0,105 9% 0,745 61% 0,169 14% 0,004 0%

En la Tabla 11, se presenta la composición porcentual de proteínas, carbohidratos, lípidos

y clorofilas para los cultivos con Acetato de sodio, durante el tiempo de cultivo (5, 10 y 12

días), presentando los tratamientos que maximizan la productividad de cada uno de estos

metabolitos, se observa que el tratamiento que maximiza la producción de proteínas es T3

en el día 5 de cultivo obteniéndose una concentración de 0,953 g/L y 76% de la biomasa;

para la producción de carbohidratos el mejor tratamiento fue el T4 a los 12 días de cultivo

obteniéndose una concentración de 1,008 g/L y 70% de la biomasa; para la producción de

Lípidos el mejor tratamiento fue T13 a los 10 días de cultivo, obteniéndose una

concentración de 0,169 g/L y 14% de la biomasa y para la producción de Clorofilas el

mejor tratamiento fue T3 obteniéndose una concentración de 0,14 g/L y 10% de la

biomasa .

Tabla 12. Tratamientos que maximizan la producción de proteínas, carbohidratos

lípidos y clorofilas empleando Carbonato de amonio como fuente de carbono.

CARBONATO DE AMONIO TRATAMIENTO

DÍA

PROTEINAS CARBOHIDRATOS LIPIDOS CLOROFILAS

Concentración g/L

Porcentaje g/g

Concentración g/L

Porcentaje g/g

Concentración g/L

Porcentaje g/g

Concentración g/L

Porcentaje g/g

T12 12 0,429 29% 0,266 18% 0,119 8% 0,071 5% T2 15 0,181 12% 0,62 43% 0,115 8% 0,166 11% T2 12 0,256 19% 0,379 28% 0,107 8% 0,178 13% T13 15 0,175 12% 0,447 30% 0,148 10% 0,042 3%

En la Tabla 12, se presenta la composición porcentual de proteínas, carbohidratos, lípidos

y clorofilas para los cultivos con Carbonato de amonio, durante los mejores tiempo de

cultivo (12 y 15 días), presentando los tratamientos que maximizan la productividad de

cada uno de estos metabolitos, se observa que el tratamiento que maximiza la producción

de proteínas es T12 en el día 12 de cultivo obteniéndose una concentración de 0,429 g/L

y 29% de la biomasa; para la producción de carbohidratos el mejor tratamiento fue el T2 a

los 15 días de cultivo obteniéndose una concentración de 0,62 g/L y 43% de la biomasa;

para la producción de Lípidos el mejor tratamiento fue T13 a los 15 días de cultivo,

obteniéndose una concentración de 0,148 g/L y 10% de la biomasa y para la producción

de Clorofilas el mejor tratamiento fue T2 obteniéndose una concentración de 0,178 g/L y

13% de la biomasa.

Una de las principales ventajas de realizar modificaciones del medio de cultivo como es la

concentración de nitrógeno, fosforo, acetato de sodio y carbonato de amonio; conlleva a

modificar drásticamente la proporción de los diferentes metabolitos celulares, es por esto

que es posible separar los tratamientos propuestos y plantear escenarios de producción

de biomasa de microalgas con miras a la obtención de metabolitos de valor agregado. La

diferencia significativa entre los tratamientos nos permite escoger como mejor escenario

de producción al control.

El acoplar escenarios de cultivo de microalgas con un sistema de aprovechamiento como

la biorefinería, permite mejorar la utilización de la biomasa generada, ya que cada uno de

los escenarios planteados posee otros metabolitos en menor proporción, los cuales

pueden ser utilizados en las diferentes corrientes dentro del proceso de valorización de la

biomasa.

4.2. Análisis Estadístico

Para determinar la influencia de las variables (Tiempo, Carbonato de Amonio Carbonato

de sodio, Nitrógeno, fosforo) sobre los datos obtenidos en el diseño de experimentos, se

realizaron los diagramas de Pareto determinando la influencia significativa positiva o

negativamente de dichas variables en la producción de metabolitos (Figura 8), esta

significancia se aprecia cuando las variables cruzan el umbral (línea rojo) con un valor

p<0,05.

Para los diagramas de superficie de respuesta se realizaron 4 gráficos manteniendo

constante en cada uno, las mejores condiciones de carbonato de amonio, acetato de

sodio, nitrato de sodio y fosfato de potasio, para observar el efecto que tienen las

interacciones entre las variables que se han encontrado significativas con respecto a cada

uno de los metabolitos evaluados, donde se muestran las zonas de mayor (Rojo) y menor

(verde) productividades cuantificadas.

4.2.1. Productividad de carbohidratos

Figura 4. Diagrama de Pareto para la producción de carbohidratos. a). cultivo con

acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio.

b). a).

En la figura 8.a. se observa que para el diseño que uso acetato de sodio como fuente de

carbono las variables tiempo, nitrato de sodio, relación tiempo/nitrato y el fosfato de sodio

son significativas, de manera, que cada una de ellas es importante en los resultados de

productividad de carbohidratos, mientras que en la figura 8.b. se observa que, para el

diseño que uso carbonato de amonio como fuente de carbono las variables significativas

fueron tiempo, carbonato de amonio y las interacciones Carbonato Amonio-Tiempo,

Nitrato de sodio-Tiempo, son las más importantes en la productividad de carbohidratos.

Además, las superficies de respuesta para la productividad de carbohidratos con acetato

de sodio (Figura 9. a y b) demuestra que la mayor productividad de carbohidratos (0,8

g/L) se obtiene a los 15 días de cultivo, con una concentración de Nitrato de sodio de 0,5

mM, fosfato de sodio de 1,1473 mM y acetato de sodio de 20 mM, mientras, que las

superficies de respuesta para la productividad de carbohidratos con Carbonato de Amonio

(Figura 9. c y d) muestra que la mayor productividad de carbohidratos (0,4847 g/L) se

obtiene a los 15 días de cultivo, a una concentración de carbonato de amonio de 0,5 mM,

Nitrato de sodio de 1,96 mM y fosfato de sodio de 1,1473.

Figura 5. Superficie de respuesta para la producción de carbohidratos, Cultivo con

Acetato de sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Fosfato; Cultivo con Carbonato de

Amonio: c). Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio

4.2.2. Productividad de Proteínas

En diagrama de Pareto para la producción de proteínas (Figura 10.a.), se observa que en

los experimentos cultivados con acetato de sodio las variables tiempo, nitrato de sodio,

acetato de sodio y sus relaciones tiempo-nitrato, tiempo-fosfato, Acetato-nitrato y

nitrato/fosfato son significativas, de manera, que cada una de ellas es importante para

mejorar la productividad de proteínas, también, en la figura 10.b. se observó que para el

cultivo con carbonato de amonio las variables significativas fueron las mismas que para

los cultivos con acetato de sodio (tiempo, nitrato de sodio, acetato de sodio y sus

relaciones tiempo-nitrato, tiempo-fosfato, Acetato-nitrato y nitrato/fosfato), siendo las más

importantes las variables tiempo y nitrato de sodio. Estos resultados concuerdan con los

obtenidos por Fábregas et al. (1989).

Figura 6. Diagrama de Pareto para la producción de Proteínas. a). cultivo con

acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio

a).

a). b).

c). d).

b).

Las superficies de respuesta para la productividad de proteínas de los cultivos con acetato

de sodio (Figura 11.b) muestran, que la mayor productividad (0,3 g/L ), se obtiene a una

concentración de Nitrato de sodio de 4 mM, tiempo de cultivo 15 días, fosfato de potasio

de 1,1473 mM y Acetato de sodio de 20 mM, además, para los cultivos con Carbonato de

Amonio la productividad de proteínas fue mayor (0,3 g/L) (Figura 11.c) cuando las

condiciones de cultivo fueron de 3,5 mM Nitrato de sodio, 15 días de cultivo, 1,1473 mM

de fosfato de potasio y 2,1487 mM carbonato de amonio. Fábregas et al. (1989) demostró

que la concentración de nitrógeno en forma de nitrato afecta de manera directamente

proporcional a la producción de proteínas, lo cual concuerda con las altas productividades

de proteínas y la alta concentración de Nitrógeno observada en este estudio.

El consumo de nitrógeno juega un papel fundamental en el incremento o disminución de

la productividad de proteínas; a nivel bioquímico el deficit de éste nutriente, influye

directamente en la formación de aminoácidos y a su vez limita la traslación del mRNA,

reduciendo la síntesis de proteínas (Barsanti & Gualtieri, 2006).

Figura 7. Superficie de respuesta para la producción de proteínas, Cultivo con Acetato de

sodio: a). Tiempo-acetato, b). Tiempo-Nitrato; Cultivo con Carbonato de Amonio: c).

Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio

a). b).

c). d).

4.2.3. Productividad de Lípidos

En el diagrama de Pareto mostrado en la Figura 12. a., se observó que para el caso de la

producción de Lípidos en los cultivos con acetato de sodio, la variable significativa que

afecta la producción de este metabolito es el tiempo pues se observa, que a mayor tiempo

se produce la mayor cantidad de lípidos, mientras, que para los cultivos con carbonato de

amonio Figura 12.b., las variables que afectan significativamente la producción de Lípidos

fueron el tiempo y las concentraciones de nitrato de sodio y carbonato de amonio.

Figura 8. Diagrama de Pareto para la primera extracción de proteínas. a). cultivo con

acetato de sodio, b). Cultivo con carbonato de amonio

a).

De acuerdo a las figuras 13. a y b, la mayor productividad de lípidos posible para los

cultivos con Acetato de sodio es de 0,1073 g/L, la cual se logran entre un rango de

concentración de Acetato de sodio de 0-5 mM, tiempo de cultivo 15 días, fosfato de

potasio de 1,1473 mM, mientras que, la mayor productividad de lípidos posible para los

cultivos con Carbonato de Amonio (Figura 13. c y d) es de 0,1273 g/L a los 15 días de

b).

cultivo, usando una concentración de Carbonato de Amonio entre 0-0,5 mM, fosfato de

potasio de 1,1473 mM y Nitrato de sodio entre 0-0,5 mM.

Figura 9. Superficie de respuesta para la producción de Lípidos, Cultivo con Acetato de

sodio: a). Tiempo-Nitrato, b). Tiempo-Acetato de sodio; Cultivo con Carbonato de Amonio:

c). Tiempo-Nitrato, d). Tiempo-Carbonato Amonio

La producción de determinados metabolitos depende de la cantidad y tipo de nutrientes

que se encuentran en el medio de cultivo. Estudios demostraron que la cantidad total de

lípidos presentes en la biomasa es característica de cada tipo de microalgas, además de

factores ambientales como la intensidad de luz, pH, temperatura y nitrógeno, siendo este

último uno de los de mayor influencia tiene, debido a que a valores altos de nitrógeno en

el medio disminuye la producción de lípidos en la biomasa [38] esto coincide con la baja

concentración de lípidos a causa de las altas concentraciones de nitrógeno.

a). b).

c). d).

4.2.4. Productividad de Clorofilas

En la figura 14.a. se observa, que en los experimentos cultivados con acetato de sodio las

variables tiempo, nitrato de sodio y la relación tiempo-fosfato son significativas, de

manera, que cada una de ellas es importante en los resultados de productividad de

Clorofilas, también, en la Figura 14.b. se observó que para el cultivo con carbonato de

amonio las variables significativas fueron tiempo, fosfato de sodio, carbonato de amonio y

las relaciones carbonato-nitrato, nitrato-fosfato, tiempo-fosfato, siendo la más importantes

la variable tiempo.

Figura 10. Diagrama de Pareto para la producción de Clorofilas. a). cultivo con

Acetato de Sodio, b). Cultivo con Carbonato de Amonio

a).

La superficie de respuesta de la productividad de Clorofilas de los cultivos con Acetato de

Sodio (Figura 15. a), muestran que a una concentración de Nitrato de sodio de 4 mM,

tiempo de cultivo 15 días, fosfato de sodio de 1,1473 y Acetato de sodio de 20 mM, la

productividad de proteínas es de 0,3 g/L, además, la productividad de proteínas para los

cultivos con Carbonato de Amonio (Figura 15. c) es también de 0.3 g/L (Nitrato de sodio

de 3.5 mM, tiempo de cultivo 15 días, fosfato de sodio de 1,1473 y carbonato de amonio

de 2.1487 mM).

Figura 11. Superficie de respuesta para la producción de Clorofilas; Cultivo con Acetato


Tiempo-Fosfato, d). Tiempo-Carbonato Amonio

b).

a). b).

c). d).

5. CONCLUSIONES

1. A partir de los resultados, se puede concluir que el diseño de cultivo que mejora la

producción de proteínas es T3 (30 mM Acetato de sodio, 2,94 mM Nitrato de sodio

y 1,721 mM Fosfato de sodio) a los 5 días de cultivo, obteniéndose una

concentración de 0,953 g/L y 76% de la biomasa total.

2. El diseño de cultivo que mejora la producción de carbohidratos es T4 (30 mM

Acetato de sodio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 0,574 mM Fosfato de sodio) a los 12

días de cultivo, obteniéndose una concentración de 1,008 g/L y 70% de la biomasa

total.

3. El diseño de cultivo que mejora la producción de Lípidos es T13 (20 mM Acetato

de sodio, 0,32 mM Nitrato de sodio y 1,147 mM Fosfato de sodio) a los 10 días de

cultivo, obteniéndose una concentración de 0,169 g/L y 14% de la biomasa total.

4. El diseño de cultivo que mejora la producción de Clorofilas es T2 (1,074 mM

Carbonato de amonio, 0,98 mM Nitrato de sodio y 1,721 mM Fosfato de sodio) a

los 10 días de cultivo, obteniéndose una concentración de 0,178 g/L y 13% de la

biomasa total.

6. RECOMENDACIONES

1. Para estudios futuros se recomienda involucrar otras variables como la

concentración de Hierro y fuentes de carbono como CO2 con el fin de evaluar el

efecto que dichas variables puedan ocasionar en la producción de metabolitos.

2. Realizar los tratamientos propuestos aplicando otros métodos de extracción, con el

fin de evaluar y mejorar el rendimiento y eficiencia del proceso de extracción de

estos metabolitos.

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DISEÑO DE UNA METODOLOGÍA DE CULTIVO DE MICROALGAS PARA LA OBTENCIÓN DE CARBOHIDRATOS,...

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