Características de la contracción de células mioides peritubulares de los túbulos seminíferos...

UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN LUIS

FACULTAD DE QUÍMICA BIOQUÍMICA Y FARMACIA

Características de la contracción de células mioides

peritubulares de los túbulos seminíferos de testículo de rata

Trabajo de Tesis

Presentado por

Licenciado Darío Fernández

Para optar el grado académico de

Doctor en Bioquímica

Asesor Científico: Doctor Luis Alberto López

Co-asesor Científico: Doctor Juan Carlos Cavicchia

San Luis. República Argentina

2008

AGRADECIMIENTOS

La presente investigación representa un esfuerzo que culmina con

varios años de estudios y dedicación hacia la ciencia.

Agradezco al Dr. Luis López, por sus observaciones atentas, sus

críticas y sugerencias, sus investigaciones paralelas a las mías y a la

orientación personal y profesional, que imprimió a mi labor, para poder

comenzar a recorrer el camino de la ciencia.

Expreso mi cordial gratitud al Dr. Juan Carlos Cavicchia por su gran

aporte y co-asesoramiento científico.

Estoy muy agradecido de todo el personal del Instituto de Histología y

Embriología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad

Nacional de Cuyo.

También quiero agradecer a mis compañeros de trabajo del

Laboratorio de Citoesqueleto y Ciclo Celular, por los momentos

compartidos a lo largo del desarrollo de esta investigación.

Por último, agradezco a Diego Fernández por la colaboración que me

ha prestado en el desarrollo de imágenes y animaciones de la molécula

de miosina.

Darío Fernández

Mendoza, 2 008.

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

Para Mario y Aurora

A mis Hermanos, Mario y Diego

A Cami, Joe y Timoteo

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

ÍNDICE GENERAL

CAPÍTULO I 11

INTRODUCCIÓN 11

1. EL TESTÍCULO 12

1.1. Estructura del testículo 12

1.1.1. Túbulos seminíferos del testículo 13

1.1.2. Células mioides peritubulares 13

1.1.3. El epitelio seminífero 14

1.1.4. Desarrollo del túbulo seminífero 16

1.1.5. Desarrollo del epitelio seminífero 17

1.1.6. Espermatogénesis 21

1.1.7. El ciclo del epitelio seminífero 21

1.1.8. Organización del epitelio seminífero 24

1.1.9. Regulación de la contracción del túbulo seminífero 29

2. CARACTERÍSTICAS DE MIOSINA 31

2.1. Miosinas 31

2.1. Descubrimiento de Miosina 31

2.2. Estructura de la molécula de Miosina II 32

2.2.1. Estructura de la porción C-terminal de miosina II 35

2.3. Estructura de los filamentos gruesos de miosina II 35

2.3.1. Ensamble y desensamble de filamentos gruesos 37

2.3.2. Implicancia de la fosforilación de las cadenas livianas en la

formación del filamento 38

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

2.3.3. Implicancia de la fosforilación de la cadena pesada en la

formación de filamentos de miosina II 40

3. PROPÓSITO DEL TRABAJO DE TESIS 41

CAPÍTULO II 42

CARACTERÍSTICAS DE LA MOLÉCULA DE MIOSINA DE CÉLULAS

MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO 42

1.1. Contenido de miosina en el túbulo seminífero de testículo 43

1.2. Purificación de miosina-CMP 47

1.2.1. Método agregación-desagregación 47

1.2. 2. Purificación de miosina-CMP en gradiente de sacarosa 49

1.2. 3. Purificación de miosina-CMP en columna de hidroxiapatita

50

2. CARACTERÍSTICAS PEPTÍDICAS DE LA CADENA PESADA DE

MIOSINA-CPM 52

2.1. Digestión Enzimática 52

2.2. Espectrometría de masas 53

2.2.1. Miosina-CMP de testículo de rata 53

2.2.2. Miosina-CMP de testículo de toro 58

3. PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD DE MIOSINA-CMP 60

3.1. Solubilidad in vitro 60

3.1.1. Solubilidad de miosina de otros tejidos 61

3.2. Agregación in vitro 63

3.3. Desagregación in vitro 66

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

4. LOCALIZACIÓN DE MIOSINA-CMP EN LOS TEJIDOS DEL TESTÍCULO

70

4.1 Células mioides peritubulares. 70

5. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO II 73

CAPÍTULO III 76

CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL

TESTÍCULO 76

1. IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES EN

TÚBULOS SEMINÍFEROS AISLADOS 77

1.1. Tinción con nitrato de plata 77

1.2. Contracción de las células mioides peritubulares 79

1.2.1. Diámetro de los túbulos seminíferos y tamaño de las células

mioides peritubulares 80

2. GRADO DE AGREGACIÓN DE MIOSINA-CMP 83

2.1. Efecto de endotelina-1 83

3. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO III 85

CAPÍTULO IV 86

ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES

RELACIONADA CON EL EPITELIO SEMINIFERO 86

1. DESARROLLO DEL TÚBULO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS

MIOIDES QUE LO RODEAN 87

1.1. Diámetro del túbulo seminífero de testículos en desarrollo 87

1.2. Caracteres morfológicos de las células-MP en túbulos

seminíferos en desarrollo 89

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

1.3. Isotipos de miosina-CMP en las células mioides peritubulares en

desarrollo 92

2. CARACTERÍSTICAS DE LA CONTRACCIÓN DE LOS SEGMENTOS DEL

EPITELIO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS MIOIDES QUE LO RODEAN

94

2.1 Diámetro de distintos segmentos de túbulos seminíferos 95

2.2 Morfología de las células mioides peritubulares en los distintos

segmentos del túbulo seminífero 96

2.3. Isotipos de miosina-CMP en los distintos segmentos del túbulo

seminífero 99

3. DISCUSIÓN DEL CAPITULO IV 101

CAPÍTULO V 103

DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES 104

1. Características de miosina-CMP 104

2. Contracción de las células MP y expresión de isotipos de miosina-

CMP 111

CAPÍTULO VI 117

MATERIALES Y METODOS 118

1. Animales y materiales biológicos 118

2. Aislamiento de túbulos seminíferos y de células del testículo 118

3. Visualización y medición de las células mioides peritubulares en el

túbulo seminífero 119

4. Tratamiento de los túbulos seminíferos con endotelina-1 120

5. Análisis de proteínas 120

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

6. Obtención y purificación de proteínas 122

7. Digestión de proteínas con tripsina 125

8. Cuantificación de proteínas 125

9. Precipitación de proteínas 126

10. Agregación y desagregación de miosina 126

11. Análisis de datos 127

Bibliografía 129

Publicaciones relacionadas con los resultados presentados 141

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

ABREVIATURAS

ASB: Albúmina de suero bovino.

ATP: Adenosina trifosfato.

Células MP: Células mioides peritubulares.

ET-1: endotelina-1.

E.S.M: error standart medio.

H: hora

kDa: kilo Dalton.

M: concentración molar.

mM: concentración milimolar.

mm (minúscula): milímetro.

µM: concentración micromolar.

nM: concentración nanomolar.

Min: minuto.

µm: micrómetro.

µm2: micrómetro cuadrado.

Miosina-CMP: Miosina proveniente de células mioides peritubulares.

PAGE-SDS: Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.

PBS: bufer fosfato salino.

Pn: posnacimiento

SDS: Dodecil sulfato de sodio.

SMM-II: Miosina II de músculo liso.

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Índice General

TS: Túbulo(s) seminífero(s).

Xg: unidad gravitatoria.

CAPÍTULO I

INTRODUCCIÓN

Capítulo I. Introducción _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Introducción 12

1. EL TESTÍCULO

1.1. Estructura del testículo

Los órganos reproductores masculinos, se clasifican en órganos

sexuales internos y externos. Los internos incluyen testículo,

epidídimo, conducto deferente y glándulas sexuales anexas, (estas

últimas incluyen vesícula seminal, próstata y glándula bulbouretal).

Los externos son pene y escroto.

El testículo, como se ilustra en la figura I.1. Está rodeado por

una gruesa cápsula de tejido conectivo, la túnica albugínea, que se

extiende hacia el interior del testículo. Dentro de las cavidades que

forma la túnica, se encuentran los túbulos seminíferos que son los

responsables de la producción y transporte de los espermatozoides.

Los túbulos seminíferos están separados por tejido intersticial

que contiene células de Leydig y vasos sanguíneos.


_____________________________________________________________________ Introducción 13

Figura I.1. Esquema general de la organización del testículo.

(Figura extraída de Geneser y col 2000)

1.1.1. Túbulos seminíferos del testículo

Los túbulos seminíferos son una serie de conductos que

contienen en su interior el epitelio seminífero y están rodeados por

células mioides peritubulares y tejido conectivo.

1.1.2. Células mioides peritubulares

Las células mioides peritubulares (células MP) son de origen

mesenquimático, representan el mayor componente celular de la pared

de los túbulos seminíferos y participan en la regulación paracrina de la

función testicular.


_____________________________________________________________________ Introducción 14

Estudios in vitro han demostrando que las células MP secretan

un número de sustancias, incluyendo componentes de la matriz

extracelular y factores de crecimiento, algunos de los cuales estimulan

en forma paracrina la secreción de las células de Sértoli

Las células MP son contráctiles, expresan proteínas de

verdaderas células musculares lisas tales como alfa-isoactina, y

miosina y forman prominentes haces de microfilamentos. En la rata

adulta los microfilamentos dentro de cada célula están orientados en

forma circular y longitudinal al eje mayor del túbulo seminífero.

La actividad contráctil de las células MP es responsable de la

contracción de los túbulos seminíferos para el transporte de

espermatozoides y fluido testicular, y por lo menos parcialmente,

para la liberación de espermatozoides durante la espermiación

(Virtanen y col., 1986); (Tung y Fritz, 1990).

Varios agonistas (endotelina-1, vasopresina, el factor de

crecimiento derivado de las plaquetas, oxitocina y prostaglandinas,

entre otros, regulan la contracción de las células MP (Rossi y col.,

2002)

1.1.3. El epitelio seminífero

El epitelio seminífero es un epitelio estratificado complejo

compuesto por dos tipos celulares básicos: células de Sertoli y células

espermatogénicas.

Las células de Sértoli, representan una población no proliferante

que se extienden desde la membrana basal hasta la luz del túbulo


_____________________________________________________________________ Introducción 15

seminífero. Tienen forma cilíndrica, con complejas prolongaciones

apicales y laterales que rodean las células espermatogénicas

adyacentes y llenan los espacios vacíos entre ellas.

Las células de Sértoli adyacentes están unidas entre sí por

complejos de unión que forman la barrera hematotesticular, que es

una barrera fisiológica que separa el tejido de las sustancias

transportadas por la sangre.

Las células de Sertoli desempeñan un papel esencial en el

desarrollo de las células espermatogénicas, ya que secretan líquidos o

restringen el movimiento de moléculas, creando micro ambientes

esenciales para el desarrollo y la diferenciación de las mismas.

Además las células de Sértoli median el movimiento a través del

epitelio seminífero de esteroides, metabolitos y sustancias nutritivas;

restringen la filtración de moléculas extracelulares al epitelio por medio

de los complejos de unión; fagocitan las células espermatogénicas en

degeneración y el exceso de citoplasma eliminado por las espermátides

en diferenciación; secretan proteínas ligadoras de andrógenos, que

concentran la testosterona dentro del epitelio seminífero y la parte

proximal de las vías de conducción; secretar varias sustancias

inhibidoras y estimuladoras que regulan la mitosis, meiosis, funciones

esteroidogénicas de las células de Leydig y la liberación de

gonadotropinas; controlan el movimiento de células espermatogénicas

en el epitelio seminífero y la liberación de los espermatozoides a la luz

del túbulo. (Brinster, 2007)


_____________________________________________________________________ Introducción 16

1.1.4. Desarrollo del túbulo seminífero

La más extensa y detallada investigación del desarrollo de los

túbulos seminíferos ha sido llevada a cabo en ratas de laboratorio. Los

túbulos fueron reconstruidos de cortes seriados de testículos,

comenzando con el día 16 de vida embrionaria y continuando hasta los

de ratas adultas.

En cada testículo fetal hay 20-31 cordones sexuales distintos

que están organizados en arcos en forma de C, apilados entre si como

el cartílago de la tráquea. Se pueden distinguir dos grupos de arcos;

unos localizados periféricamente, formando los cordones externos y

corriendo próximos a la túnica albugínea y los otros formados por

grupos mas pequeños alejados de la túnica albugínea. Los cordones

tienen solo dos conexiones a la rete testis. A medida que el

desarrollo de los cordones progresa, su crecimiento longitudinal causa

más ondulaciones y plegamiento de los arcos.

En el momento del nacimiento, los arcos están extensamente

plegados formando alrededor de 90 pequeñas circunvalaciones. El

desarrollo de los túbulos continúa por el crecimiento longitudinal de las

porciones entre las circunvalaciones sin variar el número de ellas. El

subsiguiente desarrollo de los túbulos seminíferos está dado por el

crecimiento en longitud y en diámetro. Como se muestra en la figura

I.2 el diámetro de los túbulos seminíferos tiene un crecimiento

sostenido hasta los 50 días postnacimiento (pn), donde adquiere la


_____________________________________________________________________ Introducción 17

medida de los túbulos seminíferos de los testículos adultos (Greep y

Astwood, 1975)

1.1.5. Desarrollo del epitelio seminífero

Los túbulos seminíferos en la rata fetal contienen dos tipos de

células. Las células de sostén (precursores de las células de Sértoli y

los gonocitos (células germinales primordiales). Los dos tipos celulares

están en activa división mitótica durante la vida fetal.

En la rata, en el momento de nacimiento, alrededor del 95 % de

los túbulos no presentan lumen, son cordones macizos. Entre los 10-

14 días pn, algunos cordones comienzan a mostrar pequeñas zonas

con lumen que van progresando marcadamente, hasta llegar al día 18

pn donde el 85 % de los cordones están abiertos. Para el día 30 pn

todos los cordones ya son verdaderos túbulos con lumen. El diámetro

de la luz de los túbulos crece lentamente hasta el día 20 pn y luego

rápidamente hasta el día 50 pn. (Ver figura I.3)

En el momento del nacimiento, las células de Sertoli no

presentan características especiales de su citoplasma y recién

comienzan a tener el aspecto de células maduras desde el día 16 pn.

Se observan transformaciones del citoplasma apical, denominadas

especializaciones ectoplásmicas (ES) y la formación de uniones

laterales entre células de Sértoli, formando una barrera tipo epitelial.

Para el día 22 pn las células de Sértoli presentan las características de

células maduras.


_____________________________________________________________________ Introducción 18

Hay evidencias, que en la rata, algunos gonocitos embrionarios

degeneran y mueren en los primeros días del nacimiento, pero los

restantes, proliferan por mitosis en el día 4 pn y forman las

espermatogonias tipo A que entrarán en el ciclo espermatogénico para

formar la bases para la definitiva línea de células germinales. En el día

15 pn las espermatogonias y los espermatocitos primarios están

presentes. Espermátides redondas se encuentran en el día 30 pn.

Espermátides elongadas comienzan a observarse en algunos túbulos

en el día 40 pn y en todos al día 50 pn. A los 50 pn se considera que el

primer ciclo espermatogénico se ha completado. Recién a los 60 días

pn el epidídimo está maduro y contiene un gran número de

espermatozoides (Greep y Astwood, 1975).


_____________________________________________________________________ Introducción 19

Figura I.2. Diámetro del túbulo seminíferos en ratas de varias edades

(Figura extraída de Greep y Astwood, 1975)


_____________________________________________________________________ Introducción 20

Las células mioides peritubulares se originan de células

precursoras mesenquimáticas en los primeros días posnatal y

presentan escaso desarrollo hasta el día 14 pn (Campagnolo y col.,

2001). En el día 16 pn comienza a desarrollarse microfilamentos

paralelos aislados (filamentos de actina) en forma de haces orientados

en forma circular al eje mayor del túbulo seminífero, y en el día 30 pn

comienzan a aparecen en adición a los circulares, haces que corren

longitudinalmente al eje mayor del túbulo. Por el día 40 pn, hay un

gran desarrollo de haces de microfilamentos formando una red con

orientación circular y longitudinal, que luego pierde intensidad en la

edad adulta (Maekawa y col., 1995).

Figura I.3. Diámetro del lumen tubular en ratas de varias edades

(Figura extraída de Russell y col. 1989)


_____________________________________________________________________ Introducción 21

1.1.6. Espermatogénesis

La organización de las células internas del túbulo seminífero ha

sido estudiada especialmente en ratas. (Leblond y Clermont, 1952. a y

b; Clermont, 1957). En menor grado en ratones (Oakberg, 1956 a y

b) y eventualmente en otras especies.

Se denomina espermatogénesis al proceso sumamente ordenado

y definido que envuelve el desarrollo del espermatozoide desde células

progenitoras que residen dentro del epitelio germinal del testículo.

Las células germinales maduras, las espermatogonias, se

dividen para formar las células meióticas o espermatocitos primarios

que al final de la división reduccional forman las células haploides

denominadas espermatides (espermatocinesis). Las espermátides se

convierten en espermatozoides por el resultado de una complicada

metamorfósis envolviendo dramáticas modificaciones estructuras del

núcleo, formación de nuevas organelas, y la adquisición de

mecanismos que le permiten una movilidad direccional independiente

(espermogénesis).

1.1.7. El ciclo del epitelio seminífero

Un detallado estudio de los cambios estructurales progresivos

que se producen en las espermátides en el curso de su desarrollo y en

la formación de los espermatozoides llevó a los investigadores a

describir en la rata 14 etapas bien definidas de la espermiogénesis.


_____________________________________________________________________ Introducción 22

Además se comprobó que cada sección transversal del túbulo

seminífero contiene espermátides en alguno de los 14 estados

mencionados formando una asociación específica con ciertas células

del resto del epitelio germinal. Estas evidencias llevó el concepto

original de ciclo espermatogénico a la idea de ciclo del epitelio

seminífero definido como “una serie de cambios en una determinada

área del epitelio seminífero ubicada entre dos áreas del mismo estado

de desarrollo (Leblond y Clermont, 1952 a y b)

En la rata el ciclo del epitelio seminífero consiste de 14 estados o

asociaciones celulares características como se muestra en la figuras I.4

y I.5. Tanto la formación de asociaciones específicas de células como

la secuencia de su aparición en una determinada área del túbulo

seminífero son eventos altamente sincronizados.

La duración del ciclo del epitelio seminífero en ratas depende de

la variedad. En las ratas Sherman el ciclo es de 12 días, en ratas

Sprague-Dawley el ciclo es 12,9 días, en ratas Wister 13 días y en

ratas Vandicoot 10 días.


_____________________________________________________________________ Introducción 23

Figura I. 4. Micrografía electrónica de una porción de la pared del

epitelio seminífero de un testículo que muestra una asociación celular

o estado, compuesto de espermatogonia, espermatocitos y dos

generaciones de espermátides. A la derecha son las células

individuales que constituyen una asociación celular

(Figura extraída de Russell y col. 1990).


_____________________________________________________________________ Introducción 24

Figura. I.5. Mapa del ciclo de la espermatogénesis de la rata, las

columnas verticales, están designadas con números romanos

representan las asociaciones celulares o estados. La progresión del

desarrollo de las células es seguida horizontalmente hasta el borde

derecho del mapa del ciclo, la progresión continúa de la izquierda del

mapa en fila, éste termina con formación del espermatozoide

(Figura extraída de Russell y col. 1990).

1.1.8. Organización del epitelio seminífero

Las asociaciones de las células se desarrollan y permanecen en

una región del túbulo seminífero, por ejemplo, el estado I se convertirá

finalmente en el estado II sin movimientos con respecto al eje

longitudinal del túbulo. Hay distintos ordenamientos de asociaciones

celulares a lo largo de la longitud del túbulo. Perey y col. 1961 han

examinado muy meticulosamente las secciones longitudinales de


_____________________________________________________________________ Introducción 25

túbulos de rata y describieron el patrón de la espermatogénesis a lo

largo de la longitud del túbulo y comprobaron que los segmentos de

los túbulos están formados de asociaciones de célula solas o estados.

Los segmentos como asociaciones de células son designados por

números romanos, por ejemplo, una porción longitudinal del túbulo

seminífero ocupada por el estado IV es llamado segmento IV. Figura

I.6. (Greep y col. 1975)

Figura I.6 Esquema de una sección longitudinal de un túbulo

seminífero mostrando los segmentos que son designados por

números romanos. La sección proximal es la mas cercana al rete.

Cuando el final de la serie es alcanzado (estado I), la serie comienza a

descender desde el estado XIV. Nótese que la medida de los

segmentos con diferentes designaciones numéricas romanas no son

iguales, como no así los segmentos que poseen la misma designación

numérica romana. (Figura extraída de Russell et al. 1990).

Un segmento es una porción del túbulo seminífero en su eje

longitudinal ocupado por una simple asociación de células.


_____________________________________________________________________ Introducción 26

La longitud de un segmento en particular es variable y sólo

puede ser expresado como una media de la longitud para una especie

en particular, la longitud media del segmento es proporcionalmente

más larga para estados con mas frecuencia observados.

El desarrollo sincrónico de las células dentro del segmento no es

completamente homogéneo, distintos criterios morfológicos pueden

ser usados para dividir varios estados en subsegmentos; Perey y col.

1961 destaca que el subsegmento es bruscamente demarcado a lo

largo de la longitud del túbulo (figura I.7). (Greep y col. 1975)

Figura I.7. Se muestran los subsegmentos en una sección longitudinal

del segmento XIV. El subsegmento XIVa representa la porción de la

asociación o estado XIV con figuras meióticas en meiosis I (metafase,

anafase y telofase). El subsegmento XIVb representa la porción del

estado XIV con espermatocitos secundarios y el subsegmento XIVc

muestra la porción del estado que contiene las figuras mitóticas en

meiosis II. (Figura extraída de Russell et al. 1990).

En secciones del túbulo seminífero, una asociación celular con

células características de un sub-segmento es llamada sub-estado. Los


_____________________________________________________________________ Introducción 27

sub-estados son designados con números romanos con un sufijo

alfabético ej. VIIa, XIVb.

Los segmentos están ordenados dentro del túbulo seminífero;

comenzando desde la rete testis (proximal), presentan un orden

descendiente, si por ejemplo el segmento XI es cercano a la rete

testis, entonces más distante a lo largo de túbulo se encontrará

primero el segmento X, IX, VII y VII, etc. Cuando el segmento I es

alcanzado, el siguiente segmento es el XIV, seguido por el XIII y el XII

y así sucesivamente de manera descendiente. Las uniones de los

segmentos consecutivos, son llamadas continuidad de orden

segmentaria. El patrón general de orden descendiente en una dirección

lejana a la rete testis es llamada orden segmentaria descendiente.

Figura I.8. Ocasionalmente las modulaciones ocurren a cortas

distancias a lo largo del túbulo invirtiendo el orden. Sin embargo a una

corta distancia de orden descendiente se observa lo contrario. Figura

I.8 (Russell y col. 1990)

Figura I.8 Una modulación en la pendiente de orden segmental.

Aunque el patrón de orden descendiente es evidente, una corta

porción del túbulo invierte la orden del segmento a un patrón

ascendente. (Figura extraída de Russell et al. 1990).


_____________________________________________________________________ Introducción 28

El orden segmentario descendiente ocurre desde ambos

extremos de un túbulo seminífero que parte del rete. Hay un punto en

el que la orden descendiente de ambos extremos se reúnen. Este

punto es conocido como el sitio reverso. Fig I.9

Figura I-9. Sitio reverso. Es obvio que el descenso de la orden

segmental no puede ser mantenido indefinidamente desde el rete

hacia ambos extremos del túbulo. Hay un punto en éste llamado sitio

de reversa que marca el lugar de unión de los dos patrones de

descenso. (Figura extraída de Russell y col. 1990).


_____________________________________________________________________ Introducción 29

El sitio de reversa no es equidistante del rete a ambos lados del

túbulo. Si hay o no modulación, la orden descendiente del segmento

eventualmente guiará a una serie completa de segmentos. Una serie

completa a lo largo de la longitud del túbulo se define como una onda.

Figura I.9.

Una onda del epitelio seminífero es una serie completa de

segmentos, incluyendo algunas modulaciones que ocurren a lo largo de

túbulo.

Muchas ondas (eventualmente cerca de 24) están presentes en

un túbulo seminífero, éstas no son iguales en longitud varían de 1 a 5

cm. (Russell y col. 1990)

1.1.9. Regulación de la contracción del túbulo seminífero

Una ver terminada la espermiogénesis los espermatozoides se

desprenden de las células de Sertoli y son transportados a la rete

testis. En esta función participan en forma sincronizada las células de

Sértoli y las células MP.

El estimulante de la contracción de las células MP en el túbulo

seminífero es el péptido endotelina (ET), que es un potente

vasoconstrictor de origen epitelial secretado por las células de Sertoli

(Fantoni, 1993)

Las células MP de rata expresan dos tipos de receptores de alta

afinidad a ET, (receptores ET-A y ET-B) que controlan la contracción

celular a través de la movilización de calcio intracelular (Tripiciano,

1997).


_____________________________________________________________________ Introducción 30

Un aspecto central relacionado con el control de la

contractibilidad del túbulo seminífero se relaciona con la producción de

ET por las células de Sértoli.

ET es secretado como un precursor inactivo que es activado en

el espacio pericelular por un clivaje específico de la molécula por la

enzima convertidora de endotelina (ECE) (Opgenorth y col. 1992).

La ECE solo es expresada en las células MP donde en el epitelio

seminífero los espermatozoides han terminado su maduración y están

listos para ser liberados al lumen del túbulo, es decir los estadíos IX-XI

(Palombi, 2002).


_____________________________________________________________________ Introducción 31

2. CARACTERÍSTICAS DE MIOSINA

2.1. Miosinas

Un gran número de proteínas conocidas como miosinas

constituyen la parte motriz del sistema miosina-microfilamentos. Las

miosinas son proteínas motoras que convierten la energía química en

fuerza mecánica.

2.1. Descubrimiento de Miosina

A finales de siglo XIX, Kühne transformó la teoría de la

contracción muscular cuando observó un nematodo que nadaba

libremente dentro del tejido muscular (Kühne 1863). El concluyó que

el contenido del músculo no era sólido como se había pensado, y en

lugar de eso era una solución concentrada de “albúmina”. Encontró

que soluciones que contenían altas concentraciones salinas extraían

una sustancia del músculo a la que él llamó “miosina” (Kühne 1864).

Engelhardt y Ljubimowa en 1939 descubrieron que la miosina de

Kühne, poseía actividad ATPasa y era la fuente de energía para la

producción de fuerza durante la contracción muscular. Más tarde,

Albert Szent-Gyorgyi en 1942, demostró in vitro la formación de fibras

artificiales de miosinas y de otras proteínas a las que ellos llamaron

“actina” (debido a que activaban a miosina). Desde ese tiempo hasta

la actualidad trabajos bioquímicos y fisiológicos han contribuido al

entendimiento de la estructura básica de la molécula de miosina.

Además, se han encontrado diversas miosinas clasificándolas en dos


_____________________________________________________________________ Introducción 32

grupos: Miosinas convencionales a aquellas que forman filamentos y

comprenden a la familia de proteínas conocidas como miosinas II.

Miosinas no convencionales a las que no forman filamentos y tienen

una función distinta a la de la contracción muscular y se conocen las

miosinas I y III a XVII (Redowicz, 2007).

2.2. Estructura de la molécula de Miosina II

La molécula de miosina II es uno de los principales componentes

del sistema contráctil y comprende más del 50% de las proteínas

totales. Las moléculas de miosina II se organizan en forma de

filamentos gruesos y se convierten en elementos de transducción de

energía y desarrollo de fuerza. La familia de miosina II incluye a

miosinas del músculo esquelético y liso, de músculo cardíaco y

también de sistemas no musculares. Todas las moléculas de miosina II

tienen algunas propiedades comunes y otras específicas de cada tipo

celular.

La molécula de Miosina II es larga, asimétrica y de un peso

molecular de aproximadamente 450 kDa. Posee dos cabezas

globulares localizadas en el extremo amino (NH2) de la molécula,

seguida de una larga cola semejante a varas entrelazadas.

Cada molécula de miosina II es un hexámero compuesto por dos

cadenas pesadas de aproximadamente 205 kDa cada una, dos cadenas

livianas esenciales de 16 kDa a 20 kDa cada una y dos cadenas

livianas reguladoras de aproximadamente 16 kDa a 20 kDa de peso

molecular cada una. Las cadenas livianas regulatorias ( rLCM ),


_____________________________________________________________________ Introducción 33

participan en la regulación de la contracción del músculo por el calcio,

y las cadenas livianas esenciales ( eLCM ), regulan la actividad ATPasa

de la molécula. (Lehman, 1978; Szent-Györgyi, 1980; Wagner y

Stone. 1983).

Las cadenas pesadas son asimétricas y cada una contiene una

cabeza globular y una cola semejante a una vara. La porción globular

tiene actividad enzimática (hidroliza ATP) y sitios de interacción con

actina y con las cadenas livianas.

La porción de la cola es la responsable del ensamble de la

molécula en filamentos gruesos. En la Figura I.10 se observa una

molécula de miosina II con sus dominios.

Figura I.10. Características de la molécula de miosina II.

A. Esquema de la proteína mostrando las cadenas y dominios que la

componen.


_____________________________________________________________________ Introducción 34

B. Aspecto de la proteína observada por micrografías electrónicas

de alta resolución. (Figura extraída de Alberts y col. 2002)

Los dominios peptídicos de miosina II se pueden separar por

tratamientos proteolíticos controlados. La molécula de miosina II

puede digerirse con quimiotripsina y papaína. La digestión con

quimiotripsina (Prince y col. 1981), produce un corte dando dos

fragmentos, uno denominado meromiosina pesada HMM (Heavy Mero-

Myosin) y otro meromiosina liviana LMM (Light Mero-Myosin). La

digestión con papaína (Cohen y col. 1970) del fragmento HMM genera

dos nuevos subfragmentos, S1 (Subfragmento 1) y S2 (Subfragmento

2). S1 comprende la porción globular de la molécula y S2 el cuello. Ver

Figura I.11.

Figura I.11. Clivaje proteolítico de miosina II. El tratamiento de

miosina II con quimiotripsina genera dos fragmentos, llamados

meromiosina pesada (HMM), y meromiosina liviana (LMM). El


_____________________________________________________________________ Introducción 35

tratamiento del fragmento HMM con papaína genera dos fragmentos

más, S1 constituido por las dos cabezas globulares y S2 por el tallo

restante. (Figura extraída de Lodish y col. 2005)

2.2.1. Estructura de la porción C-terminal de miosina II

La porción carboxilo terminal del LMM de la cadena pesada de

miosina II es el responsable de las propiedades de agregación,

solubilización y forma el núcleo de los filamentos. El fragmento LMM

mide 156 nm de longitud, posee una conformación “coiled coil”, motivo

estructural encontrado en muchas proteínas, constituido por las largas

hélices alfa, con un patrón de aminoácidos hidrofóbicos que se repite.

Los aminoácidos hidrofóbicos se combinan con los de otras moléculas

de miosinas y forman los filamentos gruesos.

La información contenida en la secuencia primaria de las LMM es

importante para entender las interacciones que ocurren entre las

moléculas de miosina adyacentes en el filamento grueso.

La porción LMM tiene una secuencia de aminoácidos

característicos, posee un heptapéptido repetido (-a-b-c-d-e-f-g-),

donde los aminoácidos a y d son hidrofóbicos y forman una interfase

entre las hélices alfa de la proteína plegada. (Parry, 1981; McLachlan;

Ueno y Harrington. 1981 a y b 1981; Stewart M. 1982).

2.3. Estructura de los filamentos gruesos de miosina II

La molécula de miosina II forma dos tipos de filamentos

gruesos, los filamentos bipolares y los de polaridad lateral. Los

filamentos bipolares son característicos de miosina II de músculo


_____________________________________________________________________ Introducción 36

estriado y de músculo liso. Se forman por la nucleación de moléculas

de miosina II orientadas en forma antiparalela. Las colas se

entrecruzan y forman una región central desprovista de las cabezas,

denominada zona desnuda. (Craig y Megerman. 1977; Hinssen y col.

1978).

Los filamentos de polaridad lateral o side polar son

característicos de miosina II de músculo liso y de células no

musculares, se interpreta que se forman por la unión de dímeros

antiparalelos de miosina II. Cada nuevo dímero que se incorpora al

filamento se une evitando la cabeza de las moléculas vecinas.


_____________________________________________________________________ Introducción 37

Figura I.12. Esquema de filamentos bipolares y de polaridad lateral

(side polar). a corte longitudinal de los dos filamentos; b vistas

longitudinales de transformaciones de FOURIER, y c vistas

transversales del filamento (negro: núcleo, punteado:

entrecruzamiento). (Figura extraída de Xu y col. 1996)

2.3.1. Ensamble y desensamble de filamentos gruesos

Como se mencionó anteriormente miosina II tiene la propiedad

de ensamblarse en filamentos y es así como se encuentra en los

tejidos.


_____________________________________________________________________ Introducción 38

Los filamentos de todos los tejidos musculares se disocian al ser

expuestos a altas concentraciones salinas, aproximadamente 0,6 M de

NaCl, sugiriendo que las uniones entre las moléculas son

principalmente de naturaleza iónica (Szuchet. 1977; Emes y Rowe.

1978 a y b; Trinick y Cooper, 1980).

Estudios de microscopía electrónica demuestran que el

tratamiento con 160 mM de NaCl provoca el acortamiento de los

filamentos a un tamaño intermedio, con 170 mM de NaCl se obtienen

fragmentos más cortos y con 300 mM de NaCl la completa disociación.

Estos tres estados de desensamble demuestran que existen distintos

grados de empaquetamiento de la molécula de miosina II para formar

el filamento (Trinick y Cooper, 1980).

2.3.2. Implicancia de la fosforilación de las cadenas livianas en

la formación del filamento

La cadena liviana regulatoria de miosina II ( rMLC ), es

fosforilada por una quinasa denominada, quinasa de la cadena liviana

regulatoria (MLCK), y es dependiente del complejo calcio-calmodulina.

Asimismo la cadena liviana es defosforilada por una fosfatasa tipo I

(MYPT 1). (Onishi y col. 1978); (Scholey y col. 1980).

Cuando la cadena liviana está fosforilada, miosina II adquiere un

estado conformacional conocido como 6 S. Estudios por microscopía

electrónica demuestran que en estas condiciones la molécula tiene la

cola o porción helicoidal desplegada.


_____________________________________________________________________ Introducción 39

Si la cadena liviana regulatoria se defosforila, miosina II cambia su

conformación a un estado de 11 S y la cola de la molécula se pliega.

(Suzuki, y col. 1978; Trybus y col. 1982; Kendrick-Jones y col. 1982;

a, b y c).

La condición natural de miosina II en el tejido es en estado 6S,

es decir los sitios hidrofóbicos de las colas están expuestos y se

combinan en forma antiparalela con otras moléculas de miosina II.

(Craig y col. 1983).

Cuando miosina II se encuentra en estado 11 S, la molécula es incapaz

de formar filamentos y permanece soluble. Ver Figura I.11.

Figura I.13. Ensamblaje controlado de miosina II. ( A ) La

fosforilación controlada de una de las dos cadenas ligeras tiene al

menos dos efectos in vitro:provoca un cambio en la conformación de

la cabeza de miosina, exponiendo su lugar de unión a la actina, y

libera la cola de miosina de la “zona pegajosa” de la cabeza,

permitiendo que la molécula se ensamble formando cortos filamentos

bipolares. La enzima responsable de esta fosforilación es la quinasa

de la cadenaligera de la miosina. ( B ) Tinción negativa de filamentos

cortos de miosina II quehan sido inducidos a ensamblarse por


_____________________________________________________________________ Introducción 40

fosforilación de sus cadenas ligeras. (Figura extraída de Alberts y col.

2002)

2.3.3. Implicancia de la fosforilación de la cadena pesada en la

formación de filamentos de miosina II

El fragmento LMM de miosinas de músculo liso y de células no

musculares, es fosforilado en múltiples serinas cerca del extremo

carboxilo terminal por la proteína quinasa C (PKC) y la caseína quinasa

II, (Bresnick, 1999).

Las fosforilaciones en la porción LMM inhiben el ensamble de miosina II

en filamentos. Ver figura I.14.

Figura I.14. Secuencia de aminoácidos del extremo carboxilo terminal

de dos isoformas de miosina II. Los sitios marcados con asteriscos

son fosforilados por la PKC, y las puntas de flecha indican los sitios

fosforilados por la caseína quinasa II. (Figura extraída de Bresnick 1999)


_____________________________________________________________________ Introducción 41

3. PROPÓSITO DEL TRABAJO DE TESIS

El túbulo seminífero es una estructura compleja que contiene los

distintos tipos celulares que participan en la formación de los

espermatozoides y su posterior traslado a la rete testis. Es de nuestro

interés estudiar las características contráctiles de las células mioides

peritubulares del túbulo seminífero en el testículo de rata en desarrollo

y adulto.

Se aislará miosina de las células mioides peritubulares y se

analizará: la estructura peptídica, la solubilidad en medios de baja y

alta fuerza iónica y la participación en el proceso de contracción.

Se desarrollará un método de tinción indispensable para medir

los parámetros de las células MP en túbulos seminíferos aislados tanto

en reposo como estimulados a contraerse.

Por último se estudiará la relación de las características

morfológicas de las células MP con la expresión de isotipos de

miosina-CMP en túbulos seminíferos del testículo en desarrollo y en los

segmentos conteniendo los distintos estados del epitelio seminífero.

CAPÍTULO II


MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO

Capítulo II. Características de la molécula de miosina de células mioides peritubulares del testículo

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 43


MIOIDES PERITUBULARES DEL TESTÍCULO

Introducción:

En este capítulo se analizará las característica de miosina de las

células mioides peritubulares del testículo, se determinará las

propiedades de la proteína tanto en su estructura peptídica como en la

solubilidad en medios de baja y alta fuerza iónica.

1. AISLACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MIOSINA PRESENTE EN

LOS TÚBULOS SEMINÍFEROS

1.1. Contenido de miosina en el túbulo seminífero de testículo

Cuando se homogenizan testículos de rata desprovistos de la

túnica albugínea, en soluciones de baja fuerza iónica, se comprueba la

existencia de una proteína de 205 kDa. (Figura II. 1)


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 44

Figura II.1. Proteínas de un homogeneizado de testículo. SDS-PAGE

7,5% teñido con azul de Coomassie. C+: miosina de músculo liso purificada

parcialmente; Homogeneizado: homogeneizado de testículos de rata

sembrados en dos concentraciones. Las flechas en el interior de las figuras

indican la posición de 205 kDa. Las flechas a la izquierda de la figura indican

la posición de las proteínas de peso molecular conocido.

Cuando el homogeneizado se centrifuga a 100.000 xg por 60 minutos,

se comprueba la existencia de una proteína de 205 kDa (que

denominamos proteína 205) que se encuentra en su totalidad en el

sobrenadante. Si el sobrenadante es incubado 30 minutos a 20° C, la

proteína 205 se agrega y es posible sedimentarla por centrifugación.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 45

La proteína 205 sedimentada puede ser nuevamente solubilizada por la

incubación con 4 mM ATP (Sobrenadante ATP). (Ver figura II.2).

Figura II 2. Solubilización de la proteína 205 por ATP. Proteína de 205

kDa en el sobrenadante ATP. SDS PAGE 7,5% teñido con azul de Coomassie

Se muestran las proteínas de tres experimentos. Las flechas indican la

posición de las proteínas de peso molecular conocido (PM).

Debido a que la proteína 205 tiene la misma movilidad

electroforética que la cadena pesada de miosina de músculo liso, se

procedió a analizar por inmunoensayos la capacidad de un anticuerpo


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 46

monoclonal anti-miosina II de músculo liso de aorta de reconocer a la

proteína. Para su comparación se utilizaron miosinas de músculo liso

de varios tejidos. Como se muestra en la figura II.3, el anticuerpo

reconoce a la proteína 205, de la misma manera que a otras miosinas

de músculo liso conocidas.

Actividad ATPasa: Se ha comprobado que la proteína de 205

kDa aislada en testículo de rata, es reconocida por un anticuerpo

monoclonal anti-miosina de músculo liso. Llama la atención que la

proteína 205 se encuentre soluble en medios de baja fuerza iónica,

siendo que las proteínas miosinas de músculo liso no son solubles en

esas condiciones. Para asegurarse de que se trata de miosina, la

proteína 205 fue sometida a un ensayo de actividad ATPasa. Se conoce

que solo las proteínas de la familia de las miosinas hidrolizan ATP en

medios de alta concentración de KCl (0,6 M) y EDTA (medio EDTA-K).

Los ensayos indicaron que las fracciones ricas en la proteína 205 kDa,

hidrolizaron ATP a 0,8 ± 0.01 µM ATP/min/mg de proteína en

coincidencia con la hidrólisis de ATP en medio EDTA-K de miosina de

músculo liso de estómago de pollo (McKenna y col. 1989).

Debido a que la proteína 205 coincide con la movilidad relativa

de la cadena pesada de miosina de músculo liso, es reconocida por un

anticuerpo anti-miosina de músculo liso y además fracciones

enriquecidas de la proteína hidrolizan ATP en medio EDTA-K,

mostrando una actividad de ATPasa propia de las proteínas miosina, se


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 47

procedió a denominar a la proteína 205 como miosina -CMP. (Más

adelante en el texto se explicará el motivo de la denominación).

Figura II.3. Reconocimiento de la proteína 205, con anticuerpo anti-

miosina II de músculo liso. A. SDS-PAGE 5% teñido con azul de

Coomassie. B. Inmunoensayo del gel. 1 y 2 citosol de testículo de rata en dos

concentraciones; 3-6, miosina de tejidos de rata:3 y 4: de aorta (edad

perinatal y adulta respectivamente); 5: útero, 6, cordón umbilical; 7 proteína

205 concentrada por agregación-desagregación. Las flechas indican las

posiciones de miosinas reconocidas en las bandas del gel y en la lámina de

nitrocelulosa.

1.2. Purificación de miosina-CMP

1.2.1. Método agregación-desagregación: En base a que miosina-

CMP está soluble en el citosol, se agrega a 20° C y se resuspende con

ATP, se desarrolló un método sencillo para poder aislarla. (Ver figura

II.4).

El método que llamamos de agregación-desagregación permite

obtener una fracción enriquecida de miosina-CMP, sin utilizar columnas


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 48

cromatográficas. Como se observa en la figura II.5, por este método

se obtienes muestras donde aproximadamente el 70 % de las

proteínas corresponde a miosina-CMP.

Figura II.4. Esquema del método de agregación-desagregación de

miosina-CPM

Diagrama esquemático del método utilizado para aislar miosina-CMP de

testículo de rata y toro.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 49

Figura II.5. Aislamiento de miosina-CMP por el método de agregación-

desagregación. SDS-PAGE 7,5 % teñido con azul de coomassie. La flecha

indica la posición de miosina-CMP.

1.2. 2. Purificación de miosina-CMP en gradiente de sacarosa

Una vez puesta a punto la técnica para obtener una fracción

enriquecida de miosina-CMP, se utilizó esta preparación para purificar

la proteína. Para ello se carga la muestra en un gradiente de sacarosa

(5 %-20 %). El gradiente se centrifuga a 100.000 xg, 18 horas, 4 °C.

Se colectan 18 fracciones, que se numeran desde el fondo del tubo.

Las fracciones 7 a 11 contienen miosina-CMP altamente purificada,

aunque perdura una pequeña contaminación con proteínas de bajo

peso molecular. Ver figuras II.6.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 50

Figura II.6. Purificación de miosina-CMP en un gradiente de sacarosa.

SDS-PAGE al 7,5 % teñido con azul de Coomassie. .Gel A: Muestra de

proteínas sembradas en el gradiente ( C+) y primeras 11 fracciones (1-11).

Gel B: fracciones 11-18. La migración de proteínas de peso molecular

conocido es mostrado a la izquierda de la figura.

1.2. 3. Purificación de miosina-CMP en columna de

hidroxiapatita

Miosina-CMP, parcialmente purificada por el método agregación-

desagregación, se sembró en una columna de hidroxiapatita, la

columna se eluyó con un gradiente de 0 - 400 mM de fosfato de sodio

en 0,6 M de NaCl y se recogieron 28 fracciones. En las fracciones 16-

24 se obtiene miosina-CMP purificada al 100 %, como se observa en la

figura II.7.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 51

Figura II.7. Purificación de miosina-CMP por cromatografia de

hidroxiapatita. SDS-PAGE 7,5 % teñido con azul de coomassie. C+:

proteínas sembradas en la columna. fracciones de la elusión (2-28). La flecha

indica la posición de la cadena pesada de miosina-CMP.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 52

2. CARACTERÍSTICAS PEPTÍDICAS DE LA CADENA PESADA DE

MIOSINA-CPM

2.1. Digestión Enzimática

Para conocer la composición peptídica de miosina-CMP se

procedió a realizar cortes de la proteína con tripsina a distintos

tiempos. Miosinas de músculo liso de la túnica albugínea y la arteria

espermática del testículo fueron digeridas en paralelo. Los péptidos de

la digestión, fueron analizados en un inmunoblotting con un anticuerpo

antimiosina de músculo liso (Figura II.8)

Figura II.8. Digestión de miosina con tripsina. Miosina de arteria

espermática (Art. Esp.), túnica Albuguinea (Tunica Alb.) y túbulos seminíferos

(miosina cmp) fueron digeridas con tripsina 20 y 40 min a 20 °C. A: SDS-

PAGE 7,5 % teñido con azul de Coomassie , B: inmunoensayo del gel con

anti-miosina de músculo liso. Las cabezas de flechas a la derecha de la figura

indican los péptidos producidos por la digestión de miosina CMP. La migración

de proteínas de peso molecular conocido es mostrado a la izquierda de la

figura.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 53

La digestión con tripsina mostró que se producían péptidos de

distinto peso molecular de miosina-CMP con respecto a la miosina de

músculo liso de la túnica albugínea y de la arteria espermática Figura

II.8).

2.2. Espectrometría de masas

Debido a que miosina-CMP presenta un patrón de péptidos

distintos a los de otras proteínas de músculo liso (ver figura II.8), se

procedió a analizar la huella peptídica por espectrometría de masas.

Bandas de un gel al 7,5 % de la cadena pesada de miosina-CMP

de rata y toro, teñidas con azul de Coomassie fueron escindidas, y

analizadas por Maldi-TOF (MALDI: Matrix-Assisted Laser

Desorption/Ionization, desorción/ionización mediante láser asistida por

matriz). En la ionización, los analitos cocristalizados con una matriz

apropiada son convertidos en iones mediante la acción de un láser.

Esta fuente de ionización suele asociarse a un analizador de tiempo de

vuelo (TOF: Time-Of-Flight) en el que los iones se separan en función

de su relación masa-carga tras ser acelerados en un campo eléctrico, y

de allí se obtiene la huella peptídica de las masas de la proteína. La

comparación de los péptidos obtenidos fueron analizados utilizando el

programa MASCOT de Matrix science. Se determinó la búsqueda

considerando que miosina-CMP había sido digerida con tripsina y había

sido modificada por carboximetilación.

2.2.1. Miosina-CMP de testículo de rata: En un análisis de

amplio espectro se comprobó que con un “score” significativo de 95 %,


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 54

de los 65 péptidos de miosina-CMP analizados, 27 de ellos coincidían

con miosina de músculo liso de rata Rattus norvegicus (número de

acceso al banco de datos gi|34868040). Estos resultados indicaban

que los péptidos de miosina CMP que coincidían con los de músculo liso

de rata representaban el 18% del total de la proteína. (Ver figura II.9)

1 MAQKGQLSDD EKFLFVDKNF INSPMAQADW VAKKLVWVPS EKQGFEAASI

51 KEEKGDEVVV ELVENGKKVT VGKDDIQKMN PPKFSKVEDM AELTCLNEAS

101 VLHNLRERYF SGLIYTYSGL FCVVVNPYKH LPIYSEKIVD MYKGKKRHEM

151 PPHIYAIADT AYRSMLQDRE DQSILCTGES GAGKTENTKK VIQYLAVVAS

201 SHKGKKDSSI TGELEKQLLQ ANPILEAFGN AKTVKNDNSS RFGKFIRINF

251 DVTGYIVDLL EKSRAIRQAR DERTFHIFYY LIAGAKEKMR NDLLLESFNS

301 YTFLSNGFVP IPAAQDDEMF QETLEAMSIM GFSEEEQLAI LKVVSSVLQL

351 GNIVFKKERN TDQASMPDNT AAQKVCHLVG INVTDFTRAI LTPRIKVGRD

401 VVQKAQTKEQ ADFAIEALAK ATYERLFRWI LSRVNKALDK THRQGASFLG

451 ILDIAGFEIF EVNSFEQLCI NYTNEKLQQL FNHTMFILEQ EEYQREGIEW

501 NFIDFGLDLQ PCIELIERPN NPPGVLALLD EECWFPKATD KSFVEKLCSE

551 QGNHPKFQKP KQLKDKTEFS IIHYAGKVDY NASAWLTKNM DPLNDNVTSL

601 LNASSDKFVA DLWKDVDRIV GLDQMAKMTE SSLPSASKTK KGMFRTVGQL

651 YKEQLGKLMT TLRNTTPNFV RCIIPNHEKR SGKLDAFLVL EQLRCNGVLE

701 GIRICRQGFP NRIVFQEFRQ RYEILAANAI PKGFMDGKQA CILMIKALEL

751 DPNLYRIGQS KIFFRTGVLA HLEEERDLKI TDVIMAFQAM CRGYLARKAF

801 TKRQQQLTAM KVIQRNCAAY LKLRNWQWWR LFTKVKPLLQ VTRQEEEMQA

851 KEEEMQKIKE RQQKAESELK ELEQRHTQLA EEKTLLQEQL QAETELYAEA

901 EEMRVRLAAK KQELEEILHE MEARLEEEED RSQQLQAERK KMAQQMLKEE

951 KSRQELEKLK RKLEGDASDF HEQIADLQAQ IAELKMQLAK KEEELQAALA

1001 RLDEEITQKN NALKKIRELE GHVSDLQEDL DSERAARNKA EKQKRDLGEE


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 55

1051 LEALKTELED TLDSTATQQE LRAKREQEVT MLKKALDEET RSHEAQVQEM

1101 RQKHTQAVEE LTEQLEQFKR AKANLDKSKQ TLEKENADLA GELRVLGQAK

1151 QEVEHKKKKL EGQLQELQSK CSDGERARTE LSDKVHKLQN EVESVTGMLN

1201 EAEGKAIKLA KEVASLGSQL QDTQELLQEE TRQKLNVSTK LRQLEDERNS

1251 LQDQLDEEME AKQNLERHVS TLNIQGPYGS PLGLCGLFVQ LFPLLLDFLS

1301 WRKSVHFSGF HSWPLQLSDS KKKLQDLAST IEVMEEGKKR LQKEMEGLGQ

1351 QYEEKAAAYD KLEKTKNRLQ QELDDLVVDL DNQRQLVSNL EKKQKKFDQL

1401 LAEEKNISSK YADERDRAEA EAREKETKAL SLARALEEAL EAKEELERTN

1451 KMLKAEMEDL VSSKDDVGKN VHELEKSKRA LETQMEEMRT QLEELEDELQ

1501 ATEDAKLRLE VNMQALKGQF ERDLQARDEQ NEEKRRQLQR QLHEYETELE

1551 DERKQRALAA AAKKKLEGDL KDLELQADSA VKGREEAIKQ LRKLQAQMKD

1601 FQRELDDARA SRDEIFATSK ENEKKAKSLE AELMQLQEDL AAAERARKQA

1651 DLEKEELAEE LASSLSGRNT LQDEKRRLEA RIAQLEEELE EEQGNMEAMS

1701 DRVRKATLQA EQLSNELVTE RSAAQKNESA RQQLERQNKE LRSKLQEVEG

1751 AVKAKLKSTV AALEAKIVQL EEQIEQEARE KQAATKLLKQ KDKKLKEVLL

1801 QVEDERKMVE QYKEQAEKGN TKVKQLKRQL EEAEEESQRI NANRRKLQRE

1851 LDEATESNEA MGREVNALKS KLRRGNEASF VPSRRAGGRR VIENTDGSEE

1901 EMDARDSDFN GTKASE

Figura II.9. Comparación de los péptidos de miosina-CMP de rata.

Secuencia peptídica de miosina de músculo liso de rata (Rattus norvegicus

gi|3486804). Se muestra el resultado del análisis de 65 peptidos de miosina-

CMP, de los cuales, 27 (resaltados en rojo) coincidieron con los de miosina de

musculo liso y cubrieron el 18% de la proteína.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 56

1 MSLWLTALES LQGSALSGTM QDRTQRQSLP TGQTDETDTQ GTKQVWILVP

51 VFLVRTVSCL RGGAWQSFQV ALLQRPCSFD NVAPESGDQM HVLRPHCGLW

101 DGEEGHHLLG GDEAREKNLF LAALLEEKVG EEVQRKRRIL TCRVWSVGSW

151 ASPESLRARF GGGTTGVLYL FGKLTGRLAC PRPDPKSGEK EEREGHVWKV

201 RVSPRCPRQA SLRPVAGAVS FPRLRAVCFQ WECPRPEVPD GPLLPLLGTS

251 YREDQSILCT GESGAGKTEN TKKVIQYLAV VASSHKGKKD TSITQIGGLE

301 TASGVTAPAI AGAVTETARL EALGGLGQAP LVAGGALLPA TDAGNPAFPS

351 RLWHNVLEHT ILRLSLRGSE RGFSLRRLSL RLMALLWHAS LPLLPAVIPE

401 FLPRALAPAH RCVLVHIPTD PSYGNFTRAQ DFHGGAPSEG AGGLWTASAA

451 FNLMNGAQAT CFEALFCSSV KTIPDVNKFQ GELEKQLLQA NPILEAFGNA

501 KTVKNDNSSR FGKFIRINFD VTGYIVGANI ETYLLEKSRA IRQARDERTF

551 HIFYYLIAGA KDKMKNDLLL EGFNNYTFLS NGFVPIPAAQ DDEMFQETVE

601 AMAIMGFSEE EQLSAQKVCH LMGINVTDFT RSILTPRIKV GRDVVQKAQT

651 KEQADFAIEA LAKATYERLF RWILSRVNKA LDKTHRQGAS FLGILDIAGF

701 EIFEDAHRAS PVSHTQVNSF EQLCINYTNE KLQQLFNHTM FILEQEEYQR

751 EGIEWNFIDF GLDLQPCIEL IERPNNPPGV LALLDEECWF PKATDKSFVE

801 KLCTEQGNHP KFQKPKQLKD KTEFSIIHYA GKVDYNASAW LTKNMDPLND

851 NVTSLLNASS DKFVADLWKD VDRIVGLDQM AKMTESSLPS ASKTKKGMFR

901 TVGQLYKEQL GKLMTTLRNT TPNFVRCIIP NHEKRSGKLD AFLVLEQLRC

951 NGVLEGIRIC RQGFPNRIVF QEFRQRYEIL AANAIPKGFM DGKQACILMI

1001 KALELDPNLY RIGQSKIFFR TGVLAHLEEE RDLKITDVIM AFQAMCRGYL

1051 ARKAFAKRQQ QLTAMKVIQR NCAAYLKLRN WQWWRLFTKP VCTRGLRLNW

1101 SWHQFFGPEK GPLLVRHVKP LLQVTRQEEE MQAKEDELQK TKERQQKAEN

1151 ELKELEQKHT QLAEEKNLLQ EQLQAETELY AEAEEMRVRL AAKKQELEEI

1201 LHEMEARLEE EEDRGQQLQA EKKKMAQQML DLEEQLEEEE AARQKLQLEK

1251 VTAEAKIKKL EDDILVMDDQ NNKLSKEGLS SGRLSGGLHL LRGPGFVAVR

1301 LKKEEKSRQE LEKLKRKLEG EASDFHEQIA DLQAQIAELK MQLAKKEEEL

1351 QAALGRPSLV YTCARSPFHW PLKHHLPEAG TTLLPLLRRV FFVNASLPFT


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 57

1401 LLLALRPPPG CSGPHTPRAL RNLSPHHPCV LQDGARVTGQ NHHLGCEPAW

1451 KTLLQSKRPA PPLDDEIAQK NNALKKIREL EGHISDLQED LDSERAARNK

1501 AEKQKRDLGE ELEALKTELE DTLDSTATQQ ELRAKREQEV TVLKKALDEE

1551 TRSHEAQVQE MRQKHTQAVE ELTEQLEQFK RAKANLDKNK QTLEKENADL

1601 AGELRVLNQA KQEVEHKKKK LEVQLQELQS KCSDGERARA ELNDKVHKLQ

1651 VTHFLWEPRN CRDQPHHGSG ISQSVDSHKT YHNEVESVTG MLNEAEGKAI

1701 KLAKDVASLG SQLQDTQELL QEETRQKLNV STKLRQLEDE RNSLQDQLDE

1751 EMEAKQNLER HISTLNIQLS DSKKKLQDFA STVEALEEGK KKFQKEIEGL

1801 TQQYEEKAAA YDKLEKTKNR LQQELDDLVV DLDNQRQLVS NLEKKQKKFD

1851 QLLAEEKSIS SKYADERDRA EAEAREKETK ALSLARALEE ALEAKEELER

1901 TNKMLKAEME DLVSSKDDVG KNVHELEKSK RALETQMEEM KTQLEELEDE

1951 LQATEDAKLR LEVNMQALKG QFERDLQARD EQNEEKRRQL QRQLHEYETE

2001 LEDERKQRAL AAAAKKKLEG DLKDLELQAD SAIKGREEAI KQLRKLQAQM

2051 KDFQRELEDA RASRDEIFAT AKENEKKAKS LEADLMQLQE DLAAAERARK

2101 QADLEKEELA EELASSVSGR NTLQDEKRRL EARIAQLEEE LEEEQGNMEA

2151 MSDRVRKATQ QAEQLNNELA TERSAAQKNE SARQQLERQN KELRSKLQEM

2201 EGAVKSKFKS TIAALEAKIA QLEEQVEQEA REKQATAKSL KQKDKKLKEV

2251 LLQVEDERKM AEQYKEQAEK GNAKVKQLKR QLEEAEEESQ RINANRRKLQ

2301 RELDEATESN EAMGREVNAL KSKLRRGNET AFVPSRRSGG RRVIENADGS

2351 DEEVDARDAD FNGTKASE

Figura II.10 Comparacion de los peptidos de miosina-CMP de toro.

Secuencia peptídica de miosina de músculo liso Myh11 de perro (Canis

familiaris gi|57088007). Se muestra el resultado del análisis de 65 peptidos

de miosina CMP de toro, de los cuales, 24 (resaltados en rojo) coinciden con

los de miosina Myh 11 y cubrieron el 13% de la proteína.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 58

Además, los análisis de espestrometría de masas indicaron que

diez péptidos con masas entre 855 y 1277 no coincidían con los

peptidos de ninguna proteína conocida. (Ver tabla I).

2.2.2. Miosina-CMP de testículo de toro: Debido a que se

habían aislado y purificado miosina-CMP de testículo de toro, se

procedió también a analizar por Maldi-Tof. Utilizando el mismo

programa y el mismo banco de datos que para miosina CMP de rata, se

comprobó que con un score significativo de 81 %, de los 65 peptidos

analizados, 24 de ellos coincidían con miosina de músculo liso de

perro, Myh 11 Canis familiaris (número de acceso al banco de datos:

gi|57088007). Estos resultados indicaban que los peptidos de miosina-

CMP que coincidían con la proteína Myh 11 y que representaban el

13% del total de la proteína. (Ver figura 10).

Coincidentemente con miosina-CMP de rata, miosina-CMP de

toro presenta siete péptidos con masas entre 855 y 1670 que no

coinciden con los peptidos de ninguna proteína conocida. (Ver tabla

II.I).

Tabla II. I. Masa estimada de péptidos específicos de miosina-

CMP


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 59

MASA DE LOS PÉPTIDOS

MIOSINA-CMP DE RATA

MIOSINA-CMP DE TORO

1. 855,09

2. 861,10

3. 877,05

4. 1050,11

5. 1066,09

6. 1072,10

7. 1277,10

8. 1552,75

9. 1624.84

10. 1706.87

1. 855,09

2. 861,05

3. 864,20

4. 877,00

5. 1034,52

6. 1615,79

7. 1670,85


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 60

3. PROPIEDADES DE SOLUBILIDAD DE MIOSINA-CMP

3.1. Solubilidad in vitro

Como se mencionó anteriormente, miosina-CMP se encuentra

soluble cuando se homogeniza el testículo, de todas maneras no

conocemos la relación de miosina-CMP soluble y agregada. Para

determinar el porcentaje de miosina-CMP soluble realizamos el

siguiente ensayo. Homogenizamos túbulos seminíferos con baja y alta

fuerza iónica, purificamos miosina-CMP por el método de agregación-

desagregación y ulterior centrifugado sobre 20 % de sacarosa.

Determinamos la concentracion de miosina-CMP en S3. Como se indica

en la figura II.11, fue similar la cantidad de miosina-CMP obtenida con

y sin fuerza iónica. La cuantificación de las bandas de miosina-CMP por

comparación de bandas conocidas de albúmina indicó que se habían

extraído 14,8 ± 1,9 µg/g de miosina-CMP por el uso del medio sin

fuerza iónica y 15,8 ± 2,2 µg/g de miosina-CMP por el uso de fuerza

iónica (0,6 M NaCl). Estos resultados confirman que la mayoría de

miosina-CMP se encuentra soluble en el citoplasma de la célula.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 61

Figura II.11. Extracción de miosina-CMP de testículo de rata con y sin

fuerza iónica. 5µl y 10 µl de S3 de la extracción de miosina-CMP sin fuerza

iónica (a-b) y con fuerza iónica (c-d). 1, 2 y 3 µg de ASB (e-g). La figura

muestra un gel de poliacrilamida al 7,5 %, teñido con azul de Coomassie.

La posición de miosina-CMP es mostrada a la izquierda de la figura y la de

albúmina (66 Kda) a la derecha.

3.1.1. Solubilidad de miosina de otros tejidos: Hemos

demostrado que miosina-CMP es una proteína que se asemeja a

miosina II de músculo liso, pero llama la atención que se encuentre

soluble en el citosol.

Nos preguntamos si existe miosina soluble en otros tejidos del

testículo. Para ello se comparó la solubilidad de miosina-CMP de los

túbulos seminíferos con la solubilidad de miosina de la arteria

seminífera y de la túnica albugínea. Los tres tejidos se trataron en

forma idéntica. Se homogenizaron con buffer PM, se centrifugaron, se

separó el sobrenadante (S1) y el sedimento se resuspendió con 0,65 M


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 62

de NaCl en PM, se centrifugó y se obtuvo un sobrenadante (S2). Al

analizar el contenido de miosina en S1 y S2 se observó que solo

miosina-CMP del túbulo seminífero se encontraba soluble en S1,

mientras que miosina de músculo liso de la arteria espermática y de la

túnica albugínea se encontraba en S2. Por la tanto en las condiciones

utilizadas, la miosina II de músculo liso se encuentra agregada

formando filamentos, como ya ha sido demostrado en numerosos

ensayos, en contraposición a miosina-CMP. Ver figura II.12.

Figura II.12. Grado de solubilidad de miosina de distintos tejidos.

Sobrenadante (S1) y sedimento resuspendido con fuerza iónica (S2) de

túbulos seminíferos (A), arteria espermática (B) y túnica albugínea (C). SDS-

PAGE al 7,5 % teñido con azul de coomassie (coomassie blue) y

reconocimiento de miosina de músculo liso en el blotting (anti-SMM II). La

migración de proteínas de peso molecular conocido es indicada a la izquierda

de la figura.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 63

Estos resultados indican que si se trata de filamentos de miosina

II de músculo liso las condiciones de homogeneización con buffer PM

no alteran su estabilidad. Por lo tanto, en este momento se puede

inferir que la molécula de miosina-CMP tiene alguna diferencia

estructural que le impide formar filamentos en medios de baja fuerza

iónica.

3.2. Agregación in vitro

Debido a que hemos comprobado que más del 90 % de miosina-

CMP se encuentra soluble en los túbulos seminíferos, nos intereso

analizar el comportamiento que presenta in vitro cuando se la expone

a soluciones de distinta fuerza iónica. Además se observó el

comportamiento de miosina II de músculo liso y estriado. Como se ha

comprobado en otros laboratorios, a 4° C, miosina II de músculo liso y

estriado, dializadas en una solución sin NaCl, están completamente

agregadas. Mientras que en solución 100 mM de NaCl, 80 % de

miosina II de músculo estriado y el 79 % de miosina II de músculo liso

permanecen agregadas respectivamente. Con 150 mM y 300 mM, el

50 % y el 40 % de miosina II de músculo estriado permanecen

agregadas respectivamente (figura II.13)

Cuando se determina el grado de solubilidad de miosina-CMP se

comprueba que en diálisis con 0 mM de NaCl sólo el 10 % esta

agregada y ese porcentaje se mantiene con las otras soluciones de

NaCl probadas ( 100 - 300 mM ) (ver la figura II.13). El mismo grado

de solubilidad presenta miosina-CMP de toro sometida a las mismas


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 64

concentraciones de NaCl. Es decir, miosina-CMP tiene un alto grado de

solubilidad en soluciones de baja fuerza iónica a 4° C en contraste con

el comportamiento de miosina II de músculo liso y estriado. (Ver figura

II.13).

Figura II.13. Ensayo de agregación de distintos tipos de Miosina a

4°C. Soluciones conteniendo miosina-CMP de rata y toro, miosina II de

músculo estriado y liso, de aproximadamente 150 µg/ml fueron dializadas

por 12 horas en contra de 0-300 mM de NaCl a 4ºC. En el gráfico se muestra

el porcentaje soluble de cada tipo de miosina en las distintas concentraciones

de NaCl. Los datos presentados corresponden al promedio de dos

experimentos y la dispersión no es mayor a un 5 %.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 65

Debido a que nosotros teníamos experiencia de que a 20 °C miosina-

CMP se agrega, repetimos el experimento anterior utilizando las

mismas soluciones de diálisis, pero efectuando el ensayo a 20° C.

(figura II. 14). Diálisis con 0 y 50 mM de NaCl muestra que el 100 %

de miosina-T está agregada, de la misma forma que miosina II de

músculo liso y estriado. Con diálisis de 100 mM de NaCl el 90 % de

miosina-T de rata y el 100 % de miosina-T de toro estan agregadas,

de manera similar a miosina II de músculo liso y estriado ( 89 % y 87

% respectivamente). Con 150 mM de NaCl los porcentajes observados

fueron 50 % y 20 % de agregación para miosina-T de rata y toro

respectivamente, y 75 % y 70 % para miosina II de músculo liso y

músculo estriado, respectivamente. Con 300 mM de NaCl todas las

miosinas probadas presentan un muy bajo grado de agregación (0 %

para miosina-CMP de rata y toro, 30 % y 20 % para miosina II de

músculo liso y estriado).

Por lo tanto, miosina-CMP en medio de baja fuerza iónica tiene

la particularidad de estar totalmente soluble a 4 °C y totalmente

agregada a 20 °C.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 66

Figura II.14. Ensayo de agregación de distintos tipos de Miosina a 20°

C. Soluciones conteniendo miosina-CMP de rata y toro, miosina II de músculo

estriado y liso, de aproximadamente 150 µg/ml fueron dializadas por 12

horas en contra de 0-300 mM de NaCl a 4ºC. En el gráfico se muestra el

porcentaje soluble de cada tipo de miosina en las distintas concentraciones de

NaCl. Los datos presentados corresponden al promedio de dos experimentos y

la dispersión no es mayor a un 5 %.

3.3. Desagregación in vitro

Debido a que miosina-CMP presenta la característica que es

soluble a en soluciones de baja fuerza iónica y solo se agrega a 20 °C,

nos preguntamos si los filamentos formados a 20 °C era más lábiles

que los filamentos de miosina de músculo liso de pollo que se forman

espontáneamente a 4 °C. Por lo tanto filamentos de miosina-CMP y de

miosina músculo liso de pollo fueron sometidos a fuerza iónica. Como


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 67

la figura II.15 lo indica, es necesario 200 mM de NaCl para solubilizar

alrededor del 20 % de los filamentos de ambas miosinas, y 300 mM de

NaCl para solubilizar el 60 % de los filamentos de ambas miosinas. Por

lo tanto cuando se logran obtener las condiciones para polimerizar

miosina-CMP, los filamentos formados tienen la misma estabilidad a

fuerza iónica que los de miosina-músculo liso de pollo.

Figura II.15. Desagregación de filamentos de miosina por fuerza

iónica. Filamentos de miosina-CMP de rata y miosina II de liso, (formados de

aproximadamente 150 µg/ml de miosina, fueron incubados con 0-300 mM de

NaCl a 20 ºC. En el gráfico se muestra el porcentaje soluble de cada tipo de


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 68

miosina en las distintas concentraciones de NaCl. Los datos presentados

corresponden al promedio de dos experimentos ± SEM.

Se conoce que los filamentos de miosina de músculo liso en

general son lábiles a la presencia de ATP, por ello analizamos la

solubilidad de miosina-CMP y las comparamos con la de los filamentos

de miosina de músculo liso. Como la figura 15 lo indica, los filamentos

de miosina-CMP resultados muchos más lábiles que los de miosina de

músculo liso.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 69

FIGURA II.16. Desagregación de filamentos de miosina por ATP.

Filamentos de miosina-CMP de rata y miosina II de músculo liso, (formados

de aproximadamente 150 µg/ml de miosina, fueron incubados con de 0-35

mM de ATP a 20 ºC. En el gráfico se muestra el porcentaje soluble de cada

tipo de miosina en las distintas concentraciones de ATP. Los datos

presentados corresponden al promedio de dos experimentos ± SEM.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 70

4. LOCALIZACIÓN DE MIOSINA-CMP EN LOS TEJIDOS DEL

TESTÍCULO

4.1 Células mioides peritubulares.

Para analizar en que células del testículo se encuentra miosina-

CMP, testículos de rata desprovistos de la túnica albugínea y vasos

sanguíneos, fueron sometidos a dos tratamientos enzimáticos ( ver

sección Materiales y Métodos)

Se separaron los túbulos seminíferos del tejido intersticial por un

tratamiento suave con tripsina; y luego los túbulos seminíferos (TS)

fueron disgregados utilizando una solución de digestión que contiene

colagenasa y hialuronidasa (ver materiales y métodos), separando de

esta manera a las células mioides peritubulares (células MP) del resto

de las células del TS (TSd).

Para analizar el grado de desprendimiento de las células MP

durante el tratamiento enzimático del TS, en distintos momentos del

tratamiento, muestras de TS se tiñeron con nitrato de plata y se

observaron en una lupa.

Debido a que las células MP tienen la particularidad de ser las

únicas células del testículo que presentan reacción a fosfatasa alcalina

(Chapin y col. 1987; Palombi y Di Carlo, 1988; Anthony y Skinner,

1989), las fracciones celulares obtenidas del tratamiento enzimático

del TS fueron sometidas a la reacción de fosfatasa alcalina. Además en

la fracción de células MP se determinó el porcentaje de células con

reacción positiva a fosfatasa alcalina.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 71

El anticuerpo anti-miosina detectó miosina en los túbulos seminíferos

intactos y en la fracción de las células mioides peritubulares Fig. 13 B.

Además el análisis de fosfatas alcalina en las las fracciones indicó un

alto porcentaje de actividad en la fracción de células MP. Por lo tanto,

con estos resultados podemos confirmar que la miosina encontrada en

el testículo proviene de las células MP como lo indica la figura 13 C.

C.

Fracciones TS TSd I CMP

Actividad de Fosfatasa

alcalina

( % del total)

100

16,7± 2,3

4,5± 2,1

70± 5,3

Figura II.16. Localización de miosina-CMP en el tejido testicular.

Túbulos seminíferos intactos (TS); túbulos seminíferos sometidos a la

digestión (TSd); intersticio (I); y fracción de células MP (CMP) fueron

analizados por SDS-PAGE al 7,5 % teñido con azul de Coomassie (A).

Inmunoensayo con anti-miosina (B) y actividad fosfatasa (C). Control positivo

para miosina-CMP(C+), La posición de la cadena pesada de miosina se indica


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 72

en B con una flecha. Las flechas a la izquierda de la figura indican la posición

de proteínas con peso molecular conocido. En C se indica el porcentaje de

actividad de fosfatasa alcalina recuperada en las fracciones, siendo el 100%

de la actividad el corresponde al de los túbulos seminíferos intactos.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 73

5. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO II

Los resultados indican que en el túbulo seminífero de la rata se

encuentra una proteína con movilidad relativa de 205 kDa. Dicha

proteína es reconocida por un anticuerpo monoclonal anti miosina de

músculo liso. Dicha proteína fue bautizada por nosotros miosina-CMP.

Miosina-CMP tiene la particularidad que se encuentra soluble en

el citosol del homogeneizado de túbulos seminíferos mientras que se

mantenga a 4 °C. Si la suspención se incuba a 37 °C por 30 min,

miosina-CMP se agrega en filamentos.

En base al comportamiento de miosina-CMP a 4 y 37 °C se

desarrolló en este laboratorio un método para purificar la proteína a

partir de un citosol de homogeneizado de tubulos seminíferos. Dicho

método, que consiste en agregar y desagregar la proteína en medios

de baja fuerza iónica, permite obtener una suspención de miosina-CMP

con un 90 % de pureza. Si este material es sometido a centrifugación

en gradiente de sacarosa, se obtienen fracciones de miosina-CMP con

100 % de pureza. Además, se obtuvieron fracciones puras de miosina-

CMP por cromatografía en columna de hidroxiapatita, a partir de

proteínas obtenidas por el método de agregación-desagregación.

Con miosina-CMP purificada se continuó caracterizando la

proteína. Se comprobó que miosina-CMP presenta gran capacidad para

hidrolizar ATP en medio EDTA-K, condiciones solo inherentes para

hidrolizar ATP por la familia de miosinas.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 74

La digestión parcial de miosina-CMP con tripsina y la

comparación de bandas en electroforesis en geles de poliacrilamida,

permitió evidenciar que presentaba péptidos con movilidad relativa

distinta a la de miosina de músculo liso de arteria espermática y túnica

albugínea de rata.

Además, la composición peptídica de miosina-CMP fue analizada

utilizando espectrometría de masa, específicamente realizando el

análisis Maldi-Tof. Este análisis permitió dilucidar la composición

peptídica de miosina-CMP de testículo de rata y toro y se comprobó

que tenía una baja homología con miosina de músculo liso de rata y de

pollo respectivamente. Además miosina-CMP de rata y toro, mostró

masas de péptidos que entre 10 y 12 no presentaban homología con

ninguna proteína conocida y otros, que solo coincidían con peptidos de

proteínas muy alejados de la familia de proteínas.

Además en este capítulo se analizó la localización de miosina-

CMP y se comprobó que se encontraba en las células mioides

peritubulares del testículo.

Por lo tanto, los resultados obtenidos en este capítulo se pueden

resumir que se encontró una proteína de la familia de las proteínas,

que tiene la particularidad de no ensamblar en filamentos en medios

de baja fuerza iónica. Que miosina-CMP tiene parcial homología con

miosina de músculo liso conocida y que varios péptidos son inéditos.

Nos preguntamos sobre la naturaleza de la solubilidad de

miosina-CMP y en base a los resultados obtenidos comprobamos que la


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 75

temperatura puede producir agregación. Por otro lado miosina-CMP

purificada presenta la misma característica que la obtenida en el

citosol. Es decir solo se agrega por temperatura. Además

comprobamos que los filamentos formados de miosina-CMP son

estables como los de miosina de músculo liso conocidas. Solo que los

filamentos son más lábiles que los de miosina de músculo liso.

La falta de agregación de miosina-CMP es atribuida a diferencias

peptídicas con la de miosinas de músculo liso convencionales.

Nos preguntamos la función de miosina-CMP en las células

miodes peritubulares del testículo.

Es conocido que muchas miosinas no convencionales se

encuentran solubles en el citoplasma de las células y se les atribuye

función de transporte intracelular. Otras proteínas se encuentran

solubles en determinados momentos y se agregan en filamentos en

circunstancias que las células necesitan de la tracción de estas

proteínas motoras.

Por lo tanto en el próximo capítulo analizaremos la característica

de miosina-CMP en las células mioides peritubulares en desarrollo y

adultas en distintos tramos del túbulo seminífero. Además

relacionaremos la expresión de isotipos de miosina-CMP con la

morfología de las células MP tanto en reposo como en contracción.

CAPÍTULO III

CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES DEL

TESTÍCULO

Capítulo III. Características de las células mioides peritubulares del testículo _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 77

CARACTERÍSTICAS DE LAS CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES

DEL TESTÍCULO

Introducción:

Se ha comprobado que las células mioides peritubulares

contienen miosina-CMP que se encuentra soluble en el citoplasma

(datos presentados en el Capitulo II ). Debido a ello nos preguntamos

si miosina-CMP participa activamente en el proceso de contracción.

En este capítulo se describe un método de tinción útil para medir los

parámetros de las células MP. Se determinan las dimensiones y radios

de las células MP en túbulos seminíferos aislados tanto en reposo como

contraídos, y se determina el estado de agregación de miosina-CMP en

túbulos seminíferos contraídos.

1. IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS MIOIDES PERITUBULARES EN

TÚBULOS SEMINÍFEROS AISLADOS

1.1. Tinción con nitrato de plata

Rutinariamente, para observar las células MP en los TS se utiliza

microscopía electrónica de Barrido (Palombi y col. 1992). Esta técnica,

es laboriosa y permite la visualización de porciones discretas de los

segmentos.

Debido a que necesitábamos analizar las células MP en

segmentos completos de TS utilizamos la técnica de tinción con nitrato

de plata, que nos permitió analizar en forma sencilla gran número de

células MP.


_____________________________________________________________________ Resultados 78

El fundamento de esta técnica es que al incubar los TS con una

solución de nitrato de plata (AgNO3), el ion plata (Ag+) se deposita

sobre los carbohidratos de las uniones estrechas de las células MP

(comunicación personal de JC Cavicchia). Luego al incubar los TS con

la solución reductora, se reduce Ag+ a Ag0, produciéndose un fino

precipitado de plata metálica de color marrón en los bordes de las

células MP. Como se puede observar en la figura III.1B la tinción

permitió identificar el límite de las células MP con muchos detalles,

similares a los mostrados por el método de microscopio electrónico de

barrido (figura III.1A). Es decir, por ambas técnicas se identifican las

células MP, con su aspecto de mosaico y con las uniones

intercelulares definidas. (Palombi y col. 1992; Chiarenza y col. 2000).

Debido a que la técnica de tinción con plata es sencilla nos

permitió analizar los parámetros de un gran número de las células MP

de los TS aislados.


_____________________________________________________________________ Resultados 79

Figura III.1. Detalles de la pared del túbulo seminífero: A: Microscopía

electrónica de barrido. B: Tinción con nitrato de plata.

1.2. Contracción de las células mioides peritubulares

Se conoce que las células MP tienen la posibilidad de contraerse por

acción de hormonas tales como, oxitocina, angiotensina II y Endotelina

I (ET-1) (Tripiciano y col. 1996; Tripiciano y col. 1997).

Figura III.2. Túbulo seminífero estimulado con Endotelina-1. La flecha

negra indica las células contraídas por endotelina-1 y las flechas blancas los

espermatozoides expulsados.

Debido a que ET-1 es una hormona secretada por las células de

Sértoli, consideramos que era útil para analizar los parámetros de

contracción de las células MP en TS aislados. Para ello los TS del

testículo de rata de 90 días fueron aislados en medio MEM a 32oC, una

fracción fue usada como control y la otra tratada con 50 nM de ET-1


_____________________________________________________________________ Resultados 80

por 20 segundos. Los TS fueron fijados con 3% de glutaraldehído y

teñidos con nitrato de plata.

Al observar en la lupa los TS tratados con ET-1 se comprobó que

presentaban un movimiento ondulatorio y expulsaban espermatozoides

por los extremos. (Figura III.2), signos que indican que ET-1 produce

la contracción del TS.

Figura III.3. Túbulos seminíferos teñidos con nitrato de plata. Túbulos

seminíferos de ratas 90 días. A. Control; B. Tratados con 50 nM de ET-1 por

20 seguntos.

1.2.1. Diámetro de los túbulos seminíferos y tamaño de las

células mioides peritubulares

El diámetro del TS control fue de 235.25 ± 6.19 µm, mientras

que el de los TS tratados con ET-1 presentó segmentos de 200.83 ±

5.13 µm y de 251.67 ± 7.89 µm. (Figura III.4).


_____________________________________________________________________ Resultados 81

La superficie de las células MP de los TS controles fue de 810.48

± 185.8 µm2 y el de la las células de TS tratados 539.36 ± 144.7 µm2

(figura III.5).

El largo del eje x e y de las células MP controles fue de 34.79 ±

5 µm y 26.1 ± 5.5 µm respectivamente. Mientras que el eje x e y de

las células MP de TS tratados fue de 28.15 ± 3.5 µm y 26.7 ± 4.5 µm

respectivamente (Figura III.5).

Para poder interpretar en que forma se contraen las células MP,

calculamos la relación entre los ejes x e y antes y después de la

contracción. Las mediciones mostraron una relación x/y de 1.24 en el

control y de 0.84 en el tratado. Estos resultados indican que las células

MP al contraerse, mayormente reducen el eje x, es decir aquel

longitudinal al eje mayor del TS.

Figura III.4. Diámetro de los túbulos seminíferos. A: controles y B:

tratados con ET-1.


_____________________________________________________________________ Resultados 82

Figura III.5. Tamaño de las células mioides peritubulares. A. Célula de

TS control. B. Células de TS tratado con ET-1.C. Superposición de la figura A

sobre la B


_____________________________________________________________________ Resultados 83

2. GRADO DE AGREGACIÓN DE MIOSINA-CMP

2.1. Efecto de endotelina-1

En el capítulo II se mostró que miosina-CMP de las células MP,

es un isotipo de miosina de músculo liso que tiene la particularidad de

ser soluble en soluciones con fuerza iónica similar a la fisiológica (50-

100 mM de NaCl). Además se mostró que miosina-CMP se ensamblaba

en filamentos a 37 °C.

Debido a que miosina-CMP, bajo ciertas condiciones, se

ensambla in vitro a 37 °C, pensamos que podría participar en la

contracción de las células MP. Como ya se mostró arriba, ET-1 produce

la contracción de cada célula MP del TS. Para analizar la distribución de

miosina-CMP, túbulos seminíferos incubados con ET-1, por 20

segundos, fueron inmediatamente homogeneizados y analizados para

determinar la distribución de miosina-CMP en el sobrenadante y

sedimento.

En TS controles (no tratados con ET-1) 85 ± 5% de miosina-

CMP se encuentra soluble, mientras que en los TS contraídos con ET-1,

solo el 40 ± 6 % queda en el sobrenadante. (Ver figura III.6). De

estos resultados se desprende que miosina-CMP es capaz de

ensamblarse en filamentos cuando la célula MP se contrae.


_____________________________________________________________________ Resultados 84

Figura III.6. Agregación de miosina-CMP por ET-1. Miosina-CMP en

sobrenadante y sedimento de túbulos seminíferos controles (A) y tratados con

50 nM de ET-1 por 20 segundos (B), purificada por el método agregación-

desagregación. 3 µg de sobrenadante y 8 µg del sedimento fueron analizados

por SDS-PAGE al 7.5% y teñido con azul de coomassie de. La intensidad de

las bandas proteicas se analizó con el software Scion Image.


_____________________________________________________________________ Resultados 85

3. DISCUSIÓN DEL CAPÍTULO III

Los resultados presentados en este capítulo indican que se

desarrolló una técnica sencilla de tinción con nitrato de plata, que

permitió determinar las características morfológicas de las células MP

en la pared del TS.

Asimismo, por el tratamiento con ET-1 se logró, a juzgar por el

movimiento de los TS y por la expulsión de espermatozoides, la

contracción de los TS aislados.

La tinción de los TS con nitrato de plata permitió dilucidar

claramente el límite de cada célula MP y determinar sus dimensiones.

Se comprobó que las células MP tienen una superficie de

alrededor 810 µm2 que se reduce un 33,5 % por acción de ET-1. El eje

x de las células MP es de alrededor 34 µm y se reduce en 9 µm por el

efecto de ET-1, mientras que el eje y de las células MP es de alrededor

26 µm y no cambia por acción de ET-1; indicando que la célula se

contrae acortando el eje x. El acortamiento del eje x podría inducir un

incremento del diámetro del TS, que podría justificar el hallazgo

experimental de encontrar sectores de TS tratados con ET-1 con un

diámetro mayor al del control.

El análisis del grado la distribución de miosina-CMP entre soluble

y agregada permitió comprobar que una significativa cantidad de

miosina-CMP se agrega en filamentos cuando los TS se contraen, lo

que indica que miosina-CMP participa activamente en la contracción de

las células MP.

CAPÍTULO IV


RELACIONADA CON EL EPITELIO SEMINIFERO

Capítulo IV. Actividad de las células mioides peritubulares relacionada con el epitelio seminífero

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 87


RELACIONADA CON EL EPITELIO SEMINIFERO

Introducción:

Ya se ha mostrado en este trabajo que las células MP tienen un

tipo particular de miosina que denominamos miosina-CMP. Miosina-

CMP se encuentra soluble en el citoplasma y es capaz de formar

filamentos en el momento que las células MP se contraen.

Además se ha desarrollado un método para identificar las células

MP en los TS, tinción con plata, que permite el análisis morfométrico

de un gran número de células.

En este capítulo se analizan las características morfológicas de las

células MP y la expresión de isotipos de miosina-CMP en los TS del

testículo en desarrollo y en los segmentos del TS relacionados con los

estados del epitelio seminífero del testículo de rata adulta.

1. DESARROLLO DEL TÚBULO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS

MIOIDES QUE LO RODEAN

Desde el primer día de nacimiento, los TS del testículo

comienzan a madurar y van cambiando su morfología. Nos

preguntamos en que momento comienzan a tener capacidad de

contraerse, como es la morfología de las células MP y que isotipos de

miosina-CMP expresan.

1.1. Diámetro del túbulo seminífero de testículos en desarrollo

En los primeros días postnatal (pn), el testículo presenta

esbozos de los TS, pero en realidad son cordones sólidos. Recién en el


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 88

día 10 pn, algunos cordones muestran lumen y recién en el día 30 pn

todos los túbulos presentan lumen. (Ver capitulo I).

Se ha comprobado que el diámetro del TS va creciendo

sostenidamente desde el nacimiento hasta día 40 pn (capítulo I).

Mediciones propias nos indican la dinámica de crecimiento de los

TS en los primeros 30 días pn. Como la figura IV.1 lo indica desde el

día 14 pn al 18 pn el diámetro crece de 60 a 120 µm, luego del día 18

al 24 pn, crece solo de 120 µm a 150 µm, retomando luego el ritmo de

crecimiento de los primeros días desde el día 24 pn hasta el 30 pn.

Figura IV.1. Diámetro de los túbulos seminíferos de ratas en desarrollo. Se

determinó el diámetro de los túbulos seminíferos en cortes


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 89

histológicos de testículos de rata. Los datos son el valor medio ± SEM

de tres ratas.

1.2. Caracteres morfológicos de las células-MP en túbulos

seminíferos en desarrollo

Analizamos las células MP en los primeros días de desarrollo

postnatal, en el día 16 pn las células muestran una superficie de 136,2

µm2 con un diámetro en el eje x de 10,6 µm y en el y de 12,1 µm. En

el día 20 pn la superficie de las células MP ya es de 412,9 µm2 siendo

el diámetro del eje x e y de 19,2 µm y 21,5 µm respectivamente.

Además en el día 30 pn el área de las células MP es de 481,6 µm2 y el

diámetro en el eje x e y es 22,7 µm y 23,0 µm respectivamente.

(Figura IV.2 y tabla IV.1)


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 90

FIGURA IV.2. Túbulos seminíferos de ratas en desarrollo. Tinción con

nitrato de plata. A-B de 16 días control y tratados. C-D de 20 días

control y tratado y E-F de 30 días control y tratado. Las barras indican

200 µm.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 91

TABLA IV.1. Área y diámetros de las células MP en ratas en desarrollo

AREA

(µm2 ±ESM)

Diámetro (x)

(µm ±ESM)

Diámetro (y)

(µm ±ESM)

EDAD (días pn) control tratado control tratado control tratado

16

136,2

±10,2

139,1

±8,5

10,6

±0,5

11,9

±0,3

12,1

±0,14

11,7

±0,61

20

412,9

±10,1

220,3

±11,1

**

19,2

±0,35

14,3

±0,71

**

21,5

±0,12

16,6

±0,21

**

30

481,6

±24,1

343,6

±18,4

**

22,7

±1,5

19,3

±1,4

**

23,0

±2,2

18,5

±1,4

**

** p < 0,01

Nos preguntamos si las células MP en los primeros días de

desarrollo postnatal responden al tratamiento con ET-1. Como se

puede observar en la figura IV y tabla IV.1, ET-1 no indujo cambios ni

el área ni en los diámetros de los x e y en las células de 16 días pn. En

cambio ET-1 produjo una reducción del alrededor del 50 % del área de

las células del día 20 pn y una significativa disminución del diámetro

del los dos ejes (x, y). Además ET-1 en células de 30 días pn produjo

una reducción de alrededor del 30 % en el área y una significativa

reducción en el diámetro solo del eje y.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 92

1.3. Isotipos de miosina-CMP en las células mioides

peritubulares en desarrollo

Si se analiza la movilidad electroforética de miosina-CMP

proveniente de testículos de rata adulta, en geles de 4,5 %, se

detectan dos bandas de 205 y 200 kDa que denominamos isotipos de

miosina-CMP A y B respectivamente. Las dos bandas son reconocidas

por los anticuerpos anti-miosina de músculo liso. Comprobamos que en

el testículo adulto, el 40 % de miosina-CMP es del isotipo A y 60 %

del isotipo B. (Figura IV.3).

Figura IV. 3. Isotipos de miosina-CMP en testículo de rata adulta. Gel

SDS-PAGE al 4,5 %, teñido con azul de coomasie.

Se analizó la expresión de los isotipos A y B de miosina-CMP en

túbulos seminíferos de testículo de rata en desarrollo. Para ello se

purificó miosina-CMP de testículos de rata de 12 a 43 días de edad y

cada muestra se analizó por electroforesis.

Los resultados indican que en los túbulos seminíferos de ratas

desde el día 12 de edad van expresando más cantidad del isotipo B


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 93

que del A hasta llegar al día 27 donde expresan 70 % del isotipo B y

solo 30 % del A (Figuras IV.4 y 5).

Figura IV.4. Isotipos miosina-CMP A y B de túbulos seminíferos de

ratas en desarrollo (12-43 días de nacimiento). SDS-PAGE al 4,5 %

teñido con azul de coomassie. Se muestra un experimento típico.

Llamativamente, desde el día 27 pn comienza a decrecer la

expresión del isotipo B y por ende a expresarse el A, llegando al día 35

donde se expresan ambos isotipos en el mismo porcentaje, 50 %.

Luego desde el día 35 pn, nuevamente comienza a expresarse mayor

cantidad del isotipo B, 60%, manteniéndose esa relación hasta los

túbulos seminíferos de los testículos de rata adulta.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 94

Figura IV.5. Distribución relativa de los isotipos A y B de miosina-CMP

en túbulos seminíferos en desarrollo. Isotipo de miosina-CMP A (azul) y

B (marrón). Días pn: 1. 16; 2. 21; 3. 27; 4. 29; 5. 35 y 6. 43. Se muestra el

valor medio ± SEM de tres experimentos.

2. CARACTERÍSTICAS DE LA CONTRACCIÓN DE LOS SEGMENTOS

DEL EPITELIO SEMINÍFERO Y DE LAS CÉLULAS MIOIDES QUE

LO RODEAN

Debido a que cada segmento del TS contiene un estadio

específico del epitelio germinal (ver capítulo I), nos preguntamos si

estos segmentos presentaban características propias.

Se seleccionaron por transparencia bajo lupa tres segmentos de

TS, el que contenía mayor cantidad de espermatozoides, segmento


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 95

VII-VIII; el segmento inmediato al VII-VIII que no contenía

espermatozoides, segmento IX-XIV; y el inmediato al segmento VII-

VIII que contenía relativa cantidad de espermatozoides, segmento I-

VI. Cada segmento fue tratado con y sin ET-1 y fue analizado el

diámetro del TS, la morfología de las células MP y la expresión de

isotipos de miosina-CMP.

2.1 Diámetro de distintos segmentos de túbulos seminíferos

El diámetro del segmento I-VI fue de alrededor 230 µm y por el

tratamiento con endotelina incrementó su diámetro a 250 µm. El

segmento IX-XIV tiene un diámetro de 200 µm y por el tratamiento

con ET-1 no sufre ningún aumento significativo en su diámetro. En

cambio el segmento VII-VIII con un diámetro de 200 µm cambió a

uno de 280 µm por el tratamiento con ET-1. (Figuras IV.6 y 7).


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 96

Figura IV.6. Diámetro de distintos segmentos del túbulos seminífero.

Se midieron los segmentos I-VI, VII-VIII y IX-XIV antes (controles) y después

del tratamiento con ET-1 (tratados). Se muestra el valor medio ± SEM de tres

experimentos.

2.2 Morfología de las células mioides peritubulares en los

distintos segmentos del túbulo seminífero

Se determinó el área y los diámetros de los ejes x e y de las

células MP de los tres segmentos del TS.

El área de las células MP del segmento I-VI fue de 1141 µm2 y

por el tratamiento con endotelina-1 (ET-1) se redujo a 995 µm2


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 97

produciendo un cambio del 12,8 %. El diámetro en los ejes x-y fueron

de 38,9 µm -31,7 µm respectivamente y después del tratamiento con

ET-1 34,1 µm -31,1 µm respectivamente mostrando una reducción

significativa en diámetro del eje x. (Figura IV.7 y tabla IV.2)

Figura IV.7. Túbulos seminíferos en estadíos I –VI. Tinción con plata. A:

Control, B: Tratado con ET-1 durante 20 segundos.

El área de las células MP del segmento VII-VIII fue de 964 µm2

y por el tratamiento con ET-1 se redujo a 769 µm2 produciendo un

cambio del 20,2 %. El diámetro en los ejes x-y fueron de 35,9 µm -

30,3 µm respectivamente y después del tratamiento con ET-1 28,3 µm

- 30,0 µm respectivamente mostrando una reducción significativa solo

en el diámetro del eje x. (Figura IV.8 y tabla IV.2).


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 98

Figura: IV.8. Túbulos seminíferos en estadío VII-VIII. Tinción con plata. A:

Control, B: Tratado con ET-1 durante 20 segundos.

Mientras que las células MP del segmento IX-XIV tienen un área

938 µm2 que no se modifico por el tratamiento con E-1. Por

consiguiente no se modificaron el diámetro en el eje x e y que fue de

34,8 µm y 29,5 µm respectivamente. (Figura IV.9 y tabla IV.2)

Figura IV.9. Túbulos seminíferos en estadío IX-XIV. Tinción con plata.

A: Control, B: Tratado con ET-1 durante 20 segundos.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 99

Tabla IV.2. Áreas y diámetros de las células MP en el estadío I-VI, VII-

VIII y IX-XIV.

AREA

(µm2 ±ESM)

Diámetro (x)

(µm ±ESM)

Diámetro (y)

(µm ±ESM)

ESTADIOS control tratado control tratado control tratado

I-VI

1141,2

±55,1

995,3

±67,2

**

38,9

±0,8

34,1

±0,9

**

31,7

±0,8

31,1

±0,9

VII-VIII

964,9

±59,1

769,7

±81,2

**

35,9

±0,8

28,3

±1,6

**

30,3

±1,2

30,0

±0,7

IX-XIV

938,9

±64,3

970,2

±67,2

34,8

±0,9

35,3

±0,8

29,5

±0,7

29,8

±0,8

** p < 0,01

2.3. Isotipos de miosina-CMP en los distintos segmentos del

túbulo seminífero

En los tres segmentos del TS se purificó miosina-CMP y se

analizó el grado de expresión de los isotipos A y B.

Como ya se había mostrado en la figura IV.3 en las células MP

del conjunto de los TS del testículo adulto se expresan 40 % del isotipo

A y 60 % del isotipo B. Cuando se analiza la expresión de los isotipos A

y en el segmento I-VI de los TS se observa que la expresión es 40 %

de A y 60 % de B y la misma expresión se encuentra en el segmento

IX-XIV. Mientras que en el estadio VII-VIII se expresa 75 % del A y

solo 25 % del B. De estos resultados se desprende que hay


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 100

preponderancia en la expresión del isotipo B en el segmento IX-XIV del

TS.

Figura IV.10. Distribución relativa de los isotipos de miosina-CMP en

segmentos de túbulos seminíferos. Isotipos de miosina-CMP A (azul) y B

(rojo) en los segmentos del túbulo seminífero conteniendo los estados I-VI,

VII-VIII y IX-XIV del epitelio seminífero y en el túbulo seminífero entero,

control. Se muestra el valor medio ± S.E.M de tres experimentos. Inserto en

la parte superior de la figura se muestra un ejemplo típico de las bandas A y B

de miosina-CMP en los tres segmento del túbulo seminífero y en el control.

Tinción con azul de coomassie.


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 101

3. DISCUSIÓN DEL CAPITULO IV

Los resultados presentados indican que los TS presentan desde el

día 14 pn un marcado crecimiento en diámetro que se mantiene hasta

el día 18 pn, luego se aprecia un enlentecimiento en el ritmo de

crecimiento hasta el día 18, donde comienza a crecer en forma

sostenida.

Durante el desarrollo del TS las células MP presentan cambios

notables. A los 16 días pn las células MP tienen un diámetro de 136

µm2 que se incrementa a 412 µm2 en el día 20 pn. Además desde el

día 20 pn las células MP manifiestan la capacidad de contraerse por

estímulo con ET-1.

Junto con el cambio morfológico de las células MP y su capacidad

de contraerse se aprecian cambios en la expresión de los isotipos de

miosina-CMP. En el día 16 pn se manifiesta el 40 % del isotipo A y 60

% del isotipo B. Mientras que en el día 21 pn se observa incremento en

la expresión del isotipo B, 65%, y en el día 27 pn al valor máximo de

70%.

En una segunda parte de éste capítulo se muestra que las

células MP de los distintos segmentos del TS presentan características

propias.

Las células MP del segmento I-VI son de mayor área y se

reducen un 12 % al contraerse. Las células MP del segmento VII-VIII

se contraen fuertemente y reducen su área un 20 %. En cambio las


_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Resultados 102

células MP del segmneto IX-XIV no cambian su área al ser estimuladas

a contraerse, interpretándose que no se contraen.

Miosina–CMP además presenta particularidades de expresión en

las distintas porciones del TS. En el segmento I-VI 40 % corresponde

al isotipo A y 60% al isotipo B, mientras que en el segmento VII-VIII,

25 % corresponde al isotipo A y 75 % corresponde al isotipo B. En el

segmento IX-XIV se restablece la proporción 40 % isotipo A, 60 %

isotipo B.

Es interesante destacar que la expresión del isotipo B de

miosina-CMP está relacionada con la mayor actividad de contracción de

las células MP tanto en el desarrollo como en el testículo adulto.

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES

Discusión General _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Discusión 104

DISCUSION GENERAL Y CONCLUSIONES

1. Características de miosina-CMP

En este trabajo se muestra que una proteína de testículo de rata

que denominamos miosina-CMP tiene movilidad electroforética de 205

kDa (cadena pesada) y de 22 y 17 kDa (cadenas livianas), presenta

características que la permiten clasificar dentro de la familia de las

miosinas. La cadena pesada presenta una secuencia de aminoácidos

con parcial homología a la cadena pesada de miosina II de músculo

liso y además es reconocida con anticuerpos monoclonales anti-

miosina II de músculo liso. El perfil de péptidos de la cadena pesada

presenta diferencias con miosina II de la arteria espermática y de la

túnica albugínea.

Miosina-CMP se encuentra en las células MP de los TS del

testículo de rata, basándonos en los siguientes criterios. Se aísla de las

células que revisten los TS y la remoción de dichas células deja

desprovisto al TS de miosina-CMP.

El 90 % de miosina-CMP se encuentra soluble (sin formar

filamentos) en el citoplasma celular. Este comportamiento se puso en

evidencia al recuperar miosina-CMP en el sobrenadante de

homogeneizados de TS con soluciones de baja fuerza iónica.

Miosina-CMP, en medios de baja fuerza iónica, permanece

soluble a 4°C y se agrega y forma filamentos a 20 °C.


_____________________________________________________________________ Discusión 105

Los filamentos formados in vitro de miosina-CMP tienen la

misma estabilidad a fuerza iónica que los filamentos de miosina II de

músculo liso, pero mayor labilidad a ATP.

De los resultados detallados arriba llama la atención el siguiente

hecho, miosina-CMP presenta muchas de las características de la

familia de moléculas de miosina II de músculo liso, excepto que se

encuentra soluble en el citosol de las células y no forma filamentos in

vitro a 4°C.

En principio, el comportamiento de miosina-CMP puede atribuirse

a algunas de las siguientes razones: Desfosforilación de sitios de las

cadenas livianas o fosforilación de sitios de la cadena pesada. Falta de

dominios peptídicos en el extremo carboxilo terminal.

Desfosforilación de la cadena liviana. Las moléculas de miosina

II de músculo liso deben mantenerse fosforiladas para ensamblarse en

filamentos. La falta de fosforilaciones hace soluble a las moléculas de

miosina. (Ver Capitulo I sección 2.3.2).

Fosforilación de las cadenas pesadas. Se ha comprobado que en

las células no musculares, en ciertas circunstancias, miosina II se

solubiliza por la fosforilación de la cadena pesas (ver Capitulo I sección

2.3.3) y una ulterior defosforilación permite que forme filamentos

nuevamente.

Dominios peptídicos. Hodge y col. 1992, han propuesto que la

función de la porción no helicolidal de la cola de miosina II es la de

promover o potenciar el ensamble mediante la unión a sitios


_____________________________________________________________________ Discusión 106

específicos de las moléculas vecinas. La ausencia o mutación de esta

pieza provoca la acumulación de una conformación intermedia que no

es apta para el ensamble en filamentos.

En base al comportamiento de otras miosinas II en los sistemas

descriptos, se puede interpretar que miosina-CMP en el citoplasma de

las células MP tiene desfosforilada la cadena liviana o fosforilada la

cadena pesada, de tal modo que se mantiene soluble.

Si tenemos en cuenta el comportamiento de miosina-CMP in

vitro, que a 4° C está soluble, mientras que a 20° C se agrega, sin

que medien reacciones de fosforilación/desfosforilación, nos lleva a

considerar poco probables las hipótesis anteriores y plantear que

miosina-CMP carece de dominios de ensamble o que no están

expuestos.

Es de destacar, que el cambio de solubilidad de miosina-CMP

por la temperatura sólo se produce in vitro, y es probable que esté

reflejando un comportamiento que se repite en el citoplasma celular

activado por otros factores, tales como proteínas.

Se conocen proteínas como “kinase-related protein ” (KPR),

telokin y proteína de 38 kDa que confieren estabilidad a miosina II en

condiciones donde la concentración de ATP es elevada y los niveles de

fosforilación de las cadenas livianas es escasa ,(Shirinsky y col., 1993;

Okagaki y col., 2000). KRP previene que miosina II adopte

conformación 10 S porque compite con al región de miosina II donde

la cola se pliega (Olney y col., 1996; Silver y col., 1997).


_____________________________________________________________________ Discusión 107

¿ Forma miosina-CMP filamentos en las células mioides perituburales?.

Una vez que comprobamos que la proteína soluble miosina-CMP

proviene de las células MP, que es un isotipo de miosina II de músculo

liso, que presenta mayor solubilidad in vitro, que se ensambla in vitro

en filamentos por tratamiento térmico, nos preguntamos si miosina-

CMP en el citoplasma de la célula se ensambla y participa en la

contracción de la célula.

Para contestar esta pregunta era necesario contar con un

método sencillo y reproducible que nos permitiera observar y medir las

células MP en la pared de los TS para corroborar su contracción. El

intercambio de ideas con el Dr. Juan C. Cavicchia nos llevó a ensayar

con la tinción con plata de los TS. De esta manera se puso a punto un

método que nos permitió en pocos minutos observar en lupa

estereoscópica las células MP con todos sus detalles.

El primer paso fue analizar in vitro la contracción del TS con ET-

1, una hormona que participa activamente en el testículo en la

contracción del TS. (Fantoni y col. 1993).

Utilizando ET-1 en segmentos aislados de TS, se observó que

producía la expulsión de espermatozoides por los extremos y cambios

en la sección de los TS. El TS en conjunto presentó un diámetro de

235 µm y cuando se lo trató con ET-1, ciertos segmentos presentaron

un diámetro significativamente mayor, 251 µm.

Las mediciones morfológicas de las células MP en el testículo

adulto indicaron que tienen el aspecto hexagonal con un área de 810


_____________________________________________________________________ Discusión 108

µm2 que se reduce a 539 µm2 por el tratamiento con ET-1. Presenta un

eje x (longitudinal al eje mayor del TS) de 34 µm que es mayor al eje

y (perpendicular al eje mayor del TS) de 28 µm. Sólo en los

segmentos donde el TS aumenta de diámetro se observaron células MP

con cambios morfológicos. Nos llamó la atención que en la contracción

de la célula MP, el eje x es el que se reduce, mientras que el eje y no

cambia, indicando que las células MP presentan una organización del

citoesqueleto que le permite contraerse en forma anisodiamétrica.

Habiendo comprobado en forma morfológica la contracción de

las células MP, nos preguntamos si miosina-CMP participa en el

mecanismo de contracción. Para ello, a TS aislados antes y después de

la contracción se les analizó la distribución de miosina-CMP.

Se comprobó que durante la contracción de las células MP, una

significante cantidad de miosina-CMP faltaba en el sobrenadante y se

encontraba agregada como filamentos, interpretándose que miosina-

CMP participa activamente en la contracción de las células.

De estos resultados se infiere que miosina-CMP participa dentro

de la célula en el sistema contráctil. Se encuentra soluble cuando está

inactiva, forma filamentos en respuesta a un estímulo y vuelve a

solubilizarse después de la contracción.

Existen antecedentes relacionados con un estado cíclico de

solubilidad de miosina en las células. Las células en división, disponen

de un mecanismo por el cuál solubilizan miosina II citoplasmática, la

trasladan, la ensamblan en filamentos y forman el anillo contráctil de


_____________________________________________________________________ Discusión 109

la citocinesis. Este es un modelo de desensamble-ensamble llevado a

cabo por la fosforilación-desfosforilación de la cadena pesada de

miosina II. (Burgess, 2005)

En células satélites del hígado, que participan en la contracción de

los sinusoiedes hepáticos, la fosforilación de las cadenas livianas de

miosina II induce la formación de filamentos en el momento de la

contracción. Este modelo de desensamble-ensamble de miosina II es

llevado a cabo por la desfosforilación-fosforilación de las cadenas

livianas (Saab y col. 2002).

Volviendo a miosina-CMP en las células MP, de acuerdo a los

resultados obtenidos in vitro, no sería el estado de fosforilación el que

determina la solubilidad de miosina-CMP, sino proteínas que facilitarían

el ensamble de la proteína en filamentos, por lo tanto miosina-CMP

alternaría entre el estado soluble o agregado dependiendo de proteínas

que estabilizaran la unión entre miosinas.

¿Cual es la ventaja de disponer de un sistema de ensamble-

desensamble de miosina? Las moléculas de miosina son verdaderos

motores celulares que generan la tracción mecánica de la célula. En

las células del músculo estriado y cardíaco las moléculas de miosina

son parte de la unidad de contracción, el sarcómero, en forma de

filamentos gruesos constituidos cada uno por mas de 50 moléculas de

miosina, que generan contracción al desplazar los microfilamentos.

Tanto en las células de músculo estriado como cardíaco, los

sarcómeros permanecen armados toda la vida de la célula, que en


_____________________________________________________________________ Discusión 110

muchos casos coincide con la vida del organismo (Landsverk y Epstein.

2005).

En cambio, en las células de músculo liso, la unidad de

contracción es más laxa, aunque los filamentos de miosina se

mantienen armados durante toda la vida de la célula Landsverk y

Epstein. 2005.)

En las células no musculares, miosina sigue siendo la unidad de

contracción, pero la organización de los filamentos de miosina es

temporal y depende de la actividad de la célula. De esa manera,

cuando una célula se desplaza sobre un sustrato, continuamente esta

reorganizando los filamentos de miosina y de actina, y en muchos

casos las moléculas de miosinas cambian de estado, de solubles pasan

a formar filamentos y luego a ser solubles nuevamente (Conrad y col.

1995).

Las células MP presentan características de células de músculo

liso, pero de acuerdo a nuestros resultados miosina-CMP, que es la

principal proteína con característica de miosina que presenta la célula,

se mantiene soluble y solo se ensambla en filamentos por el estímulo

de la contracción.

En este aspecto miosina-CMP se comporta como una miosina de

células no musculares, y podría estar indicando la plasticidad que

presenta el citoesqueleto para cambiar en cada instante la forma de la

célula MP. El hecho de que hemos encontrado células MP con distinta

morfología en los segmentos del TS con diferentes estados del epitelio


_____________________________________________________________________ Discusión 111

seminífero podría confirmar la hipótesis de un citoesqueleto

sumamente dinámico.

2. Contracción de las células MP y expresión de isotipos de

miosina-CMP

En el desarrollo del testículo. En el testículo de rata miosina-CMP

se expresa en gran cantidad en las células MP y participa en la

contracción de las mismas provocando la reducción del área celular y

modificando la forma de la célula (se reduce en mayor proporción el

eje x).

Cuándo se analiza la movilidad electroforética de la cadena

pesada de miosina-CMP se observan dos bandas que corresponden al

isotipo A (205 kDa) y B (200 kDa).

Desde el momento del nacimiento el TS presenta profundos

cambios morfológicos, primero aparece el lumen y luego va creciendo

en diámetro y longitud (Ver CAPII). Observamos que los TS, desde el

día 14 pn al día 18, duplican el diámetro, luego desde el día 18 pn al

24 el crecimiento en diámetro se enlentese y nuevamente retoma el

ritmo de crecimiento en el día 24 pn.

De la misma manera las células MP en los TS aumentan tres

veces el área desde el día 16 pn al 20 pero luego conservan las

mismas dimensiones hasta el día 30 pn.

Con respecto a miosina-CMP, Las células MP del día 16 pn

expresan 40 % del isotipo A y 60 % del isotipo B. Luego las células del


_____________________________________________________________________ Discusión 112

día 21 pn al día 24 van expresando mayor cantidad del isotipo B,

llegando al día 24 pn a expresar el 70 %.

Es conocido que las células MP comienzan a producen

microfilamentos circulares del citoesqueleto desde el día 16 pn y en el

día 30 pn aparecer en adición a los circulares, haces que corren

longitudinales al eje mayor del TS. (Ver Cap. I Sección 1.1.5).

Por lo tanto en este período 16-20 días pn, donde las células MP

cambian significativamente el área el citoesqueleto de actina se

reorganiza profundamente de la misma forma que se incrementa la

expresión del isotipo B de miosina-CMP.

Concomitantemente con la reorganización del citoesqueleto, las

células MP comienzan a tener una marcada actividad contráctil que se

pone de manifiesto el día 20 pn.

¿Es necesaria la expresión elevada del isotipo B de miosina-CMP para

que la célula se contraiga apropiadamente? Es conocido que dos

isotipos de la cadena pesada de miosina II de músculo liso se

encuentran en las células de músculo liso y son conocidos como SM1

(204 kDa) y SM2 (200 kDa). SM1 presenta un extremo C-terminal con

9 aminócidos más que SM2. En la rata, SM2 aparece mas tarde en el

desarrollo embrionario y es expresado a elevados niveles en células

diferenciadas de músculo liso. (Nagai R y col. 1989; Loukianov y col.

1997).

Debido a los antecedentes descriptos y teniendo en cuenta que

SM2 es equivalente al isotipo B de miosina-CMP, podemos inferir que


_____________________________________________________________________ Discusión 113

en el desarrollo postnacimiento de las células MP, el isotipo B de

miosina-CMP se expresa en el momento de mayor diferenciación de las

células MP y es posible que sea fundamental para el desarrollo

morfológico y contráctil de la célula.

En los segmentos del túbulo seminífero conteniendo las células

del ciclo espermatogénico. Hemos comprobado que en el testículo de

rata adulta la dinámica de contracción de los segmentos del TS está

relaciona a los estados del epitelio seminífero que contienen. Así, en el

segmento I-VI la contracción es discreta si se compara con el

segmento VII-VIII y la desaparece en el segmento IX-XIV.

Por otro lado la expresión de los isotipos de miosina-CMP

también esta relacionada con el estado contráctil de las células MP, en

el segmento I-VI y el IX-XIV donde la contracción es escasa o nula se

expresa 40 % del isotipo A y 60 % del isotipo B. En cambio en el

segmento VII-VIII el isotipo A se expresa solo un 22 % y el B el 78 %.

En conclusión, en el segmento VII-VIII, donde los

espermatozoides están maduros y deben ser transportados a la rete

testis, el TS se contrae más activamente, las células MP cambian mas

profundamente la morfología por la contracción y producen una

elevada expresión del isotipo B de miosina-CMP.

Nuestros resultados coinciden con experimentos realizados en

otro laboratorio, donde demuestran que la estimulación con oxitocina

produce el mayor efecto contráctil en el segmento VII-VIII del TS.

(Harris y Nicholson 1998).


_____________________________________________________________________ Discusión 114

En los TS de testículos de rata adulta, la espermatogénesis es

un proceso constante, donde las células germinales están

continuamente desarrollándose desde las espermatogonias tipo A. La

reestructuración de la citoarquitectura ocurre en discretos estados del

epitelio seminífero, correlacionado con la translocación de clones de

células germinales en meiosis temprana desde el compartimiento basal

al luminal. (Fantoni y col. 1993). En este caso los testículos están bajo

cambios que rememoran algunos de los que ocurren en otros órganos

durante el desarrollo fetal. Es conocido que el efecto morfogenético de

las hormonas esta ligado a la interacción del epitelio con las células del

estroma.

Las principales células tipo somáticas del túbulo seminífero son

las células MP (mesenquimaticas) y las células epiteliales de Sertoli.

Resultados de co-cultivos in vitro realizados por Palombi y col. 2002

demostraron que las células de Sertoli y las células MP interaccionan

entre sí llevando a la formación de la lámina basal y una arquitectura

similar a la de TS. La presencia de células MP además resulta en un

incremento de la producción de “androgen binding protein” (ABP) por

las células de Sertoli. Proteínas liberadas por las células MP estimulan

la producción de ABP y transferrina por las células de Sertoli. (Palombi

y col. 2002). Las células de Sertoli producen y secretan ET-1 que

activan a las células MP que contienen los receptores ETA y ETB para

ET-1 (Fantoni y col. 1993; Tripiciano y col. 1997). Es conocido que la

expresión cíclica de la enzima convertidora de ET-1 (ECE) por las


_____________________________________________________________________ Discusión 115

células de Sertoli regula funcionalmente la contracción del TS. Se ha

comprobado que las células de Sertoli solo en el estadio IX-X del

epitelio seminífero secretan ECE, por ende aportan ET-1 a las células

MP vecinas para contraerse. (Tripiciano y col. 1999).

¿ Las células MP presentan un ciclo de diferenciación en sincronía con

el epitelio espermático?. Durante el desarrollo del testículo hemos visto

que las células MP se transforman profundamente desde el día 16 pn,

cambiando su tamaño, morfología, organización de los microfilamentos

y expresión de isotipos miosina-CMP.

En el testículo de rata adulta, las células MP de los segmentos

del TS que contienen a las células de los distintos estados del epitelio

seminífero muestran distinto comportamiento en cuanto a su tamaño,

grado de contracción y expresión de isotipos de miosina-CMP. Se

interpreta que en el estado VII-VIII, donde los espermatozoides deben

ser transportados a la rete testis, es donde más activas se encuentran

las células MP, actividad que luego pierden cuando los

espermatozoides han dejado el lumen del TS.

Hay muchas evidencias en la bibliografía de la íntima relación de

la célula de Sertoli con la célula MP, de tal modo que la célula de

Sertoli determina cuándo se activan y contraen las célula MP. Pero

para que la célula MP sea sensible a ET-1, debe encontrarse en el

segmento VII-VIII del epitelio seminífero, de lo contrario es refractaria.

A lo largo de este trabajo hemos mostrado la aparición de

rasgos diferenciales de la célula MP en el estado VII-VIII como la


_____________________________________________________________________ Discusión 116

mayor expresión del isotipo B de miosina PM e incremento de la

capacidad contráctil, por lo que interpretamos que de la misma

manera como madura la célula MP en el desarrollo del testículo, las

células MP se van diferenciado a lo largo de cada ciclo del epitelio

seminífero para ser totalmente activas en el estado VII-VIII.

CAPÍTULO VI

MATERIALES Y MÉTODOS

Capítulo VI. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Materiales y Métodos 118

MATERIALES Y METODOS

1. Animales y materiales biológicos

Se utilizaron ratas Wistar (Charles River) criadas en el

animalario del IHEM y fueron alimentadas ad libitum hasta que se

sacrificaron por decapitación cervical. Los animales fueron mantenidos

de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de

laboratorio del NIH (USA). Los testículos de toro y los estómagos

musculares de pollo fueron obtenidos en un matadero de la ciudad.

2. Aislamiento de túbulos seminíferos y de células del testículo

Aislamiento de túbulos seminíferos y segmentos: Testículos de

rata desprovistos de la túnica albugínea y de la arteria seminífera se

digirieron con 1 % de tripsina en buffer fosfato, 5 minutos, a 25 ° C y

se centrifugaron en centrífuga de mesa. En el sedimento quedaron los

túbulos seminíferos y en el sobrenadante las células del intersticio.

Segmentos de túbulos seminíferos con distintos estados seminíferos.

Los túbulos seminíferos en una caja de petri, se colocaron en la platina

de la lupa. Se eligieron segmentos conteniendo la mayor cantidad de

espermatozoides (segmento VI-VII) y se seccionaron con una tijera.

Además se secciono la porción que seguía al segmento VI-VIII que no

contenía espermatozoides, segmento IX-XIV, y la porción que contenía

escasos espermatozoides, segmento I-V. Los tres segmentos fueron

colocados en recipientes distintos y utilizados para los experimentos.



Células mioides peritubulares: Los túbulos seminíferos desprovistos de

las células del intersticio se digieren con 0,2 mg/ml de colagenasa,

0,02 mg/ml de hialuronidasa, 2% de ácido etilendiamintetraacético

(EDTA), 1 mg/ml de albúmina, 4,5 mg/ml de HEPES, en buffer PBS

(Phosphate Buffer Saline), por 90 minutos a 34° C. La digestión se

centrifugó y en el sobrenadante quedan las células mioides. El

desprendido de las células mioides se monitoreó bajo lupa en túbulos

teñidos con nitrato de plata.

3. Visualización y medición de las células mioides peritubulares

en el túbulo seminífero

Tinción con Cloruro de Plata: Túbulos seminíferos o segmentos

con distintos estados del epitelio seminal fueron fijados con

glutaraldehído al 3% e incubados con cloruro de plata al 1% en H2O,

10 min. Se lavaron con H2O y se incubaron con solución reductora (30

% sucrosa, 0,4 M acido nítrico, 30 % alcohol etílico) por 20 min. Las

células MP fueron visualizadas con lupa estereoscópica a 20 X y

fotografíadas o gravadas para su análisis. En cada experimento una

regla graduada de referencia fue gravada en paralelo con las muestras.

El diámetro del TS y el área y los ejes x (longitudinal al eje mayor del

TS) e y (perpendicular al largo del TS) de las células MP fueron

cuantificados con el software Scion Image.

Microscopía electrónica de barrido: Los túbulos seminíferos se fijaron

con 3% de glutaraldehído en buffer cacodilato, postfijazo con 1% de

OsO4 en buffer Zetterquist, y deshidratados en 25%-100% de acetona.



Luego del punto crítico con acetona se los bañó con oro y los túbulos

seminíferos se analizaron en un microscopio de barrido.

4. Tratamiento de los túbulos seminíferos con endotelina-1

Túbulos seminíferos aislados o segmentos conteniendo distintos

estados germinales fueron incubados con 0-50 nM ET-1 en medio MEM

20 segundos y las células MP fueron visualizadas por tinción con

cloruro de plata.

5. Análisis de proteínas

Electroforesis en geles de poliacrilamida. Fueron utilizados geles

de poliacrilamida 4-7,5 % con dodecil sulfato de sodio (SDS) (SDS-

PAGE), bajo condiciones de reducción. Las proteínas se corrieron en

paralelo con marcadores de peso molecular. La corrida electroforética

se efectuó de 2-10 mA.

Transferencia de proteínas: Luego de corrido el gel, las proteínas

se transfirieron a lámina de nitrocelulosa utilizando el siguiente buffer

de transferencia (0,02 M de tris-base, 0,15 M de glicina, 20 % de

alcohol metílico y 0,1 % de SDS y una corriente de 250 mA. Las

proteínas transferidas se analizaron con colorante Ponceau S.

Inmunoensayo: Se bloqueó la lámina de nitrocelulosa con 0,1 %

de albúmina de suero bovino (ASB) en buffer TTBS (0,3 M NaCl, 0,1 M

tris, 0,05 M tween 20 y 0,01 % N3Na), 90 min a 20° C. Se Lavó con

buffer TTBS e se incubó dos horas con el primer anticuerpo diluido

disuelto en 1 % ASB en TTBS. Lavar con buffer TTBS e incubar con el

segundo anticuerpo, conjugado con fosfatasa alcalina disuelto en 1 %



ASB en TTBS, una hora. Lavar con TTBS y realizar la reacción de la

fosfatasa alcalina.

Reación de fosfatasa alcalina: Se incubó la lámina de

nitrocelulosa en 30 ml de solución AP (2 mg/ml de phenazine

methosulfate, con trazas de nitroblue tetrazolium y 5-Bromo-4-chloro-

3-indolyl phosphate en medio alcalino a pH 8,8). Se detuvo la reacción

por lavados con agua destilada.

Fosfatasa alcalina en suspención de células: Se utilizó el kit de

laboratorios Wiener, se les adiciona sustrato buffer al blanco, al estándar

y a la muestra, se incuban 10 minutos a 37° C y se agrega el reactivo

color. Se lee el color de la reacción en el espectrofotómetro a 520 nm.

ATPasa. La actividad K+-EDTA-ATPasa se midió en 0.2 mg/ml de

miosina purificada en 300 µl de 15 mM imidazole.ClH, pH 7.5, 0.6 M

KCl, 5mM EDTA, 1mM ATP a 20 °C. La reacción comienza por la

adición de miosina, se remueve en varios puntos de la reacción una

cantidad mínima, se lo lleva a una concentración de 0,4 N de ácido

percloroacético para detener la reacción, antes de comenzar con el

análisis espectroscópico con verde de malaquita a 600nm (Facemyer y

Cremo, 1992; Cremo y col. 1995).

Análisis de péptidos por espectroscopía de masa. Identificación

huella peptídica: Tras su localización, las bandas de interés se

recortaron de forma manual minimizando la cantidad de gel y se

digirieron in-situ en modo automático (empleando un robot-digestor de

Bruker), con tripsina utilizando el protocolo descrito por (Shevchenko y



col. 1996) con algunas modificaciones (variable dependiendo del

método de tinción utilizado). El sobrenadante de la digestión (que

contiene los péptidos) se acidificó con trifluoroacético (TFA) (0.1%

concentración final) y se secó en centrífuga “speedvac” y se

resuspendió en 5 ml de TA (TFA 0.1% Acetonitrilo 33%). Una pequeña

alícuota (0.5 ml) se depositó en una placa “Anchor-chip” (Bruker)

empleando DHB (2,5-Dihydroxybenzoic acid) como matriz a una

concentración de 5 g/l mediante el método “fast evaporation”. La

placa se introdujo en un espectrómetro de masas de tipo MALDI-TOF

(matriz-assisted laser desorption ionisation/time-of-flight), modelo

Autoflex de Bruker equipado con reflector. Los espectros de masas

obtenidos se utilizaron como huella peptídica para la identificación de

proteínas en las bases de datos utilizando los motores de búsqueda

(Mascot, Profound) accesibles en la red.

6. Obtención y purificación de proteínas

Miosina II de la túnica albugínea y de la arteria seminífera del

testículo: la túnica albugínea o la arteria seminífera de testículos de

rata se congela con nitrógeno líquido, se pulveriza en un mortero y se

resuspende con buffer PM (250 mM PIPES, 5 mM de sulfato de

magnesio y 10 mM de EDTA).

Miosina II de músculo liso: Miosina de músculo liso (MII-ML) se

extrajo de estómago de pollo por modificación del método de Ikebe y

Hartshorne, 1995. El estómago muscular de pollo recién faenado se

homgeneizó en una picadora de carne en buffer A (10mM NaPO4 pH



6,5, 0,3mM KCl, 1,5mM EGTA, 5mM MgCl2, 1mM ATP). Se diluyó la

muestra con 4 volúmenes de agua destilada y luego se filtró con lana

de vidrio (para eliminar lípidos). A la muestra obtenida desde el

filtrado se le agregó 10 volúmenes de agua destilada y se incubó toda

la noche a 4°C. Posteriormente se realizó una centrifugación de 15

minutos a 5.000 r.p.m. Se resuspendió el sedimento, conteniendo los

filamentos de miosina, con buffer B (0,6 M de KPO4 pH 6,5, 0,025 M

EGTA, 10 M KCl ) y se dializó 12 horas en contra de buffer C ( 0,025 M

de KPO 4, 0,6 M de KCl, 0,01 M de EGTA, 0,001 M de DTT). Se agregó

a la suspención 1 volumen de agua destilada y se centrifugó a 14.000

r.p.m. durante 30 minutos. El sobrenadante conteniendo miosina II se

conservó en 50 % glicerol a – 20 °C hasta su uso.

Obtención miosina-CMP por el método de agregación-

desagregación: Testículos de rata o de toro sin túnica albugínea ni

arteria espermática, se homogenizaron en medio PMEE (35 mM de

Pipes, 5 mM de MgSO4, 1 mM de EGTA, 0,5 mM de EDTA, pH 7,4) en

una relación 1:1. El homogenizado se centrifugó a 100.000 xg, 1 h a

4° C. El sobrenadante (S1) se incubó 30 min a 20° C y se centrifugó a

100.000g por 30 minutos sobre sacarosa al 20 % en PMEE. El

sedimento (P2) se lavó con PMEE y se centrifugó nuevamente. El

nuevo sedimento limpio (P2) se resuspendió en una solución de 4 mM

ATP en PMEE, se centrifugó y el sobrenadante (S3) se guardó a -20° C

hasta su uso.



Purificación de miosina-CMP en gradiente de sacarosa: Las

proteínas obtenidas por el método de agregación-desagregación se

sembraron en la parte superior de un gradiente de sacarosa (5 % - 20

% en PMEE), se centrifugaron a 150.000 xg 8 h a 4° C. Se colectaron

fracciones desde el fondo del tubo y se analizaron en SDS-PAGE al 7,5

%.

Purificación de miosina-CMP en columna de hidroxiapatita:

Miosina-CMP de rata o de toro aislada parcialmente por el método de

agregación-desagregación, se cargaron en una columna de

hidroxiapatita en buffer 0,6 M de NaCl en PM (Pipes-Magnesio), se

purgó la columna con el mismo buffer, y se eluyeron las proteínas con

un gradiente continuo de 0-400 mM de fosfato de sodio conteniendo

0,6 M de NaCl, pH 7,4. Se colectaron las fracciones, se precipitaron las

proteínas con ácido tricloroacético (TCA) y se analizaron por SDS-PAGE

al 7,5 %.

Purificación de miosina-CPM en geles de poliacrilamida:

Muestras de miosina-cmp se corrieron en SDS-PAGE al 7,5 %, se

cortaron la bandas de miosina-CMP y se enviaron a analizar o se

solubilizaron del gel con H2O2 20 volúmenes, por doce horas a 60° C.

Anticuerpos policlonales anti miosina-CPM: Se inyectaron

conejos por vía subcutánea con una suspención de miosina-CMP

purificada por electroforesis con adyuvante de Freund completo.

Después de un mes se obtuvo suero del conejo que se conservó en

solución de glicerol al 50 % a 70° C. Prueba del anticuerpo: La



actividad y especificidad de los anticuerpos obtenidos se probaron por

inmunoensayo.

7. Digestión de proteínas con tripsina

Suspensiones de miosina fueron incubadas en relación 200/1

(peso/peso) con tripsina por el tiempo decidido a 25° C. La digestión

se detuvo con 0,1 µg/ml de inhibidor de tripsina.

8. Cuantificación de proteínas

Método de Lowry: Se tomaron alícuotas de las muestras a

medir, se le adicionó reactivo alcalino de Lowry, se incubaron 15 m a

22 °C. Se adicionó reactivo de Folin, se incubaron 20-45 m y se

leyeron en el espectrofotómetro a 500 nm.

Utilización de geles: Geles de poliacrilamida al 7,5% fueron

sembrados con las siguientes concentraciones Albúmina sérica bovina

(0,5–4 µg), corridos y teñidos con Azul de Coomassie R-250. Los geles

obtenidos fueron fotografiados con una cámara digital Kodak y

grabados en un sofware propio sistema EDAS. Las fotografías se

analizaron con el programa SCION IMAGE y se determinó el área de

las bandas de SAB con los datos de la densidad óptica de cada una de

las concentraciones, para evaluar la lineabilidad. En base a los valores

obtenidos se confeccionó una curva de densidad de área de las bandas

versus la concentración de ASB. Cuantificación de miosina: Se

sembraron geles de poliacriamida al 7,5% con muestras de miosina de

concentración desconocida y SAB con concentraciones de 0,5- 2 µg.

Los datos de densidad óptica de las bandas de miosina obtenidos con



SCION IMAGE se extrapolaron a los de la curva confeccionada con los

correspondientes patrones de Albúmina.

9. Precipitación de proteínas

A una suspensión de proteínas conteniendo 5 % de ácido tricloro

acético en concentración final, se incubaron una hora a 0° C, se

centrifuga a 15.000 rpm por 30 minutos a 4° C. El sedimento se

resuspendió con sample buffer y se ajustó a pH 7.

10. Agregación y desagregación de miosina

Agregación in vitro: Suspensiones de miosina de distintos

orígenes en una concentración de 150 µg/ml se dializaron por 12 horas

a 4° C o a 20° C en soluciones de 0 - 300 mM de NaCl en buffer

fosfato (25 mM de NaPO4, 2 mM de MgCl2, 300 mM de NaCl a pH 7,5).

Después de la diálisis las muestras se centrifugaron a 30.000 rpm

sobre 20 % de sacarosa en buffer fosfato. Las proteínas del sedimento

y del sobrenadante de cada muestra se analizaron por SDS-PAGE al

7,5 % y las bandas de miosina se cuantificaron en el gel.

Agregación in vivo: Túbulos seminíferos, túnica albugínea y

arteria espermática de rata se homogenizaron en relación peso en

volumen 1:1 con buffer PM con y sin 0,6M NaCl a 0° C. Las proteínas

obtenidas fueron analizadas por SDS-PAGE al 7,5% y la cantidad de

miosina fue estimada por inmunoensayo.

Desagregación por fuerza iónica o ATP. Filamentos de miosina,

formados de aproximadamente 150 µg/ml de miosina, fueron

incubados con 0-300 mM de NaCl a 20 ºC o con 0-35 mM de ATP 30



min a 20 °C. Las muestras se centrifugaron a 30.000 rpm sobre 20 %

de sacarosa en buffer fosfato. Las proteínas del sedimento y del

sobrenadante de cada muestra se analizaron por SDS-PAGE al 7,5 % y

las bandas de miosina se cuantificaron en el gel.

11. Análisis de datos

Los datos fueron analizados estadísticamente con el programa

Excel y Prism y se expresaron como la media ± error estandart medio

(E.S.M) de n experimentos.

BIBLIOGRAFÍA CITADA

Bibliografía _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________ Bibliografía Citada 129

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