Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la ...

Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.

Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.

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Universitat d'Alacant Universidad de Alicante

Tesis Doctoral

Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de

crecimiento similar a la insulina-I en el deterioro del músculo esquelético con el

envejecimiento

Directores: Osvaldo Delbono Andrés Morales

UNIVERSITAT D'ALACANT C E D í P

o 1 OCT. 200/;

m....\ Niim

Estela González Rodríguez Alicante, septiembre, 2004



Universitat d'Alacant Í ¿ ^ Universidad de Alicante

Departament de Fisiología, Genética i Microbiología Departamento de Fisiología, Genética y Microbiologí

Dr. Osvaldo Delbono, Catedrático del Departamento de Fisiología y Farmacología de Wake Forest * University Scliool of Medicine (Winston-Salem, Carolina del Norte) y Dr. Andrés Morales, Profesor Titular del Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de Alicante,

CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación conducente a la obtención del grado de Doctor titulado: "Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento similar a la insulina-I en el deterioro del músculo esquelético con el envejecimiento", de la que es autora Dña. Estela González Rodríguez, ha sido realizado bajo su dirección en los Departamentos de Fisiología y Farmacología de Wake Forest University School of Medicine y de Fisiología, Genética y Microbiología de la Universidad de Alicante.

Y para que así conste, y surta los efectos oportunos, firman el presente certificado en Alicante, a dieciséis de septiembre de dos mil cuatro.

jiW^ áldo Delbono Andrés Morales

Tel, + 34 965 90 9494- Fax + 34 965 90 9569 Campus de Sant Vicent del Raspeig

Ap. 99. E-03080 Alacant e-mail; [email protected]

web: http.//www,ua.es/fgm



mailto:[email protected]

http://http.//www,ua.es/fgm

AGRADECIMIENTOS

Al Dr. Osvaldo Delbono, por toda la paciencia y la dedicación demostrada a lo

largo de estos años. Agradezco sobre todo, su cálida acogida, la oportunidad

de haber trabajado en su laboratorio y la comprensión que ha manifestado

siempre hacia mi falta de conocimientos e inexperiencia. Al Dr. Andrés

Morales por su apoyo incondicional y por todo el tiempo dedicado a este

trabajo. La pasión y dedicación de ambos por la ciencia me ha animado y me

ha provisto de ejemplos en los cuales modelar mi propia carrera científica.

Mis compañeros de trabajo, en el laboratorio del Dr. Delbono, se merecen un

reconocimiento muy especial; María-Laura Messí, Zhenlin Zheng, ZhongMin

Wang, HongQu Shan y Anthony Payne. Todos han sido y son unos

compañeros y amigos excelentes. Agradezco a Laura por llevar a cabo los

experimentos de SDS PAGE e inmunohistoquímica para la determinación del

tipo de fibras y a Zhenlin por las determinaciones de IGF-1 en músculo.

Mis familiares y amigos han llenado mi carrera de post-grado de memorias

maravillosas.



índice



ÍNDICE

Lista de abreviaturas v/

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Estructura y función del músculo esquelético 2 1.2. Acoplamiento excitación-contracción en músculo esquelético 5 1.3. Subtipos de fibras musculares y tipos de contracción 8 1.4. Importancia de la pérdida de función muscular con la edad 8 1.5. Mecanismos responsables de la pérdida de la función muscular

con el envejecimiento 10 1.6. El desacoplamiento de EC como mecanismo responsable de

la debilidad muscular 15 1.7. La técnica de fibra única e intacta como excelente aproximación

experimental para determinar la fuerza específica del músculo esquelético 16

1.8. Eventos elementales de la liberación de Ca^*(EELC) -Chispas de Ca^^ del RS 17

1.9. El músculo esquelético y el factor de crecimiento similar a la insulina de tipo I (IGF-1) 19

2. OBJETIVOS 21

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Disección y montaje de fibras únicas intactas 25 3.2. Registros de contracción de fibra única 26 3.3. Registros de contracción de los experimentos de fatiga 27 3.4. Experimentos de contracción de músculo entero 27 3.5. Registros de Ca " intracelular en fibras únicas intactas de FDB 28 3.6. Calibración del indicador Fluo 3-AM y cálculo de la

concentración intracelular de Ca^* 29 3.7. Análisis del tipo de fibra en músculo esquelético 31 3.8. Medida de la concentración de IGF-1 en músculo FDB 32 3.9. Preparación de las fibras musculares para el registro de

chispas de Ca^" 32 3.10. Imágenes de fluorescencia de las chispas Ca^* 33 3.11. Análisis de las imágenes de chispas de Ca "" 34 3.12. Composición de cadena pesada de miosina (CPM) 36 3.13. Preparación de las membranas e Immunoblots del RyR 36 3.14. Análisis estadístico 38

4. RESULTADOS

4.1. Efecto del envejecimiento sobre la fuerza específica de células únicas intactas de los músculos extensor común de los dedos (EDL) y soleo de ratón disminuye

III



4.1.1. La fuerza específica máxima en células de músculos rápidos y lentos 41

4.1.2. Cinética de contracción de fibras de EDL y soleo de ratones jóvenes, de mediana edad y viejos 45

4.2. índice de fatiga en fibras musculares del EDL y Soleo de ratones jóvenes y viejos

4.2.1. índice de fatiga en fibras musculares de EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos 48

4.2.2. Curso temporal del índice de fatiga de fibras de EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos 52

4.3. El factor de crecimiento similar a la insulina-I previene la disminución de Ca^^ intracelular y fuerza específica en fibras únicas intactas de músculo de ratones transgénicos

4.3.1. La expresión de IGF-1 en músculos FDB de ratones transgénicos 56

4.3.2. La fuerza específica de músculo FDB entero de ratones normales y lGF-1-transgénicos 57

4.3.3. Área de la sección transversal y fuerza específica máxima registrada en células únicas intactas del músculo FDB 58

4.3.4. Valores máximos de [Ca " ]! en fibras únicas intactas del músculo FDB 64

4.3.5. Efecto de la cafeína en la disminución de la fuerza específica y en el pico de [Ca^""]! con el envejecimiento 65

4.3.6. Tipo de fibras que componen el músculo FDB a distintas edades en ratones control y transgénicos

(IGF-1) 67

4.4. Eventos elementales de liberación de Ca^^: "chispas" y "ascuas" en fibras de músculo esquelético de ratones viejos

4.4.1. Eventos de liberación de Ca " en imágenes XY y de escan de línea 71

4.4.2. Efecto de los moduladores de RyRs en la frecuencia de las chispas de Ca^^ 73

4.4.3. Propiedades de los EELC identificados en imágenes X-Y o de escan de línea en fibras de ratones jóvenes y viejos 75

4.4.4. Eventos tipo "ascua" en imágenes de escan de línea en fibras de EDL de ratones jóvenes y viejos 80

4.4.5. Subtipos de fibras musculares y frecuencia de las chispas de Ca * 82

4.4.6. Función mitocondrial y frecuencia de las chispas de Ca "" en fibras musculares de ratones jóvenes y viejos 83

4.4.7. RyRI expression in EDL muscle from ageing mice 84

IV



g DISCUSIÓN

5.1. Efecto del envejecimiento sobre la fuerza específica de células únicas intactas de los músculos extensor común de los dedos (EDL) y soleo de ratón disminuye

5.1.1 La fuerza específica de fibras intactas de los músculos esquelético EDL y soleo de ratón disminuye con la edad 88

5.1.2. Mecanismos responsables de la disminución de fuerza específica en músculo esquelético con el envejecimiento 89

5.1.3. Cinética de contracción en fibras de EDL y soleo de ratones jóvenes, de mediana edad y viejos 91

5.2. índice de fatiga en fibras musculares del EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos

5.2.1. Fatiga muscular en ratón y otras especies 94 5.2.2. Fatiga en fibras de los músculos EDL y soleo 95 5.2.3. Mecanismos responsables de la alteración del

funcionamiento neuromuscular con el envejecimiento 95

5.3. El factor de crecimiento similar a la insulina-I previene la disminución de Ca^* intracelular y fuerza específica en fibras únicas intactas de músculo de ratones transgénicos

5.3.1. IGF-1 previene la disminución de fuerza específica con el envejecimiento 98

5.3.2. Mecanismos responsables de la disminución de fuerza específica de fibras musculares con el envejecimiento 100

5.3.3. Mecanismos del efecto de IGF-1 en ratones IGF-1-transgénicos 102

5.4. Eventos elementales de liberación de Ca^*: "chispas" y "ascuas" en fibras de músculo esquelético de ratones viejos

5.4.1. EELC en músculo esquelético de ratón adultos 105 5.4.2. Efectos del envejecimiento en las propiedades

de los EELC 107

6. CONCLUSIONES 113

7 BIBLIOGRAFÍA 115



Abreviaturas



LISTA DE ABREVIATURAS

AMM

ATP

AST

Ca *

CPM

CICR

DE

DEC

DHPR

DMM

EC

EEM

EDL

EELC

FE

FDB

IGF-I

MA

RDI

RS

RyR

SERCA

TMB

Anchura a la mitad del máximo

Adenosina trifosfato

Área de la sección transversal

Ion calcio

Cadena pesada de miosina

Liberación de Ca "" inducida por Ca ""

Desviación estándar

Desacoplamiento de excitación-contracción

Receptor de la dihidropiridina

Duración a la mitad del máximo

Excitación-contracción

Error estándar de la media

Extensor común de los dedos {Extensor digitorum longus)

Eventos elementales de liberación de calcio

Fuerza específica

Flexor corto de los dedos {Flexor digitorum brevis)

Factor de crecimiento similar a la insulina-I

Mediana edad

Región de interés

Retículo sarcoplasmático

Receptor de la rianodina

ATPasa de Ca "" del retículo endoplasmático

Tetrametilbenzidina

vn



^ Túbulos-T TT ^ Sensor de voltaje



1. Introducción



Introducción

1. INTRODUCCIÓN

1.1, Estructura y función del músculo esquelético

Los músculos permiten a los animales convertir energía química, en forma de

ATP, en energía mecánica. Atendiendo a criterios morfofuncionales los músculos de los

vertebrados se pueden clasificar en dos tipos: i) músculo estriado, que presenta

estriaciones características producidas por grupos organizados de filamentos de actina

y miosina que forman los sarcomeres; dentro de este grupo se incluye el músculo

cardiaco, que forma parte de la pared del corazón y se caracteriza, entre otras cosas,

por carecer de innervación específica para cada fibra y generar potenciales de acción

de muy larga duración; y el músculo esquelético, en el que cada fibra recibe inervación

de una motoneurona y , como su nombre indica, está unido al esqueleto; y ii) músculo

liso, localizado en las paredes de los órganos huecos, excepto el corazón, y

caracterizado por carecer de las típicas estriaciones del músculo esquelético y generar

contracciones más lentas.

El músculo estriado esquelético está rodeado de una cubierta de tejido conectivo

denominado epimisio. Además, bandas de fibras musculares y las propias células

están delimitadas por tejido conectivo que constituye, respectivamente, el perimisio y el

endomisio. A través de este tejido fibroso discurren los vasos sanguíneos, linfáticos y

nervios musculares. Adicionalmente, el tejido conectivo en el músculo genera

estructuras más fuertes como los tendones, aponeurosis, rafes y capa reticular de la

dermis o periostio, que proveen soporte para la inserción y contracción del músculo.

Las fibras musculares esqueléticas son células multinucleadas cilindricas de una

gran longitud (pueden alcanzar varios centímetros) y un diámetro que puede variar

entre 5 y 100 |am. Las fibras musculares están rodeadas de una membrana



Introducción

denominada sarcolenna y contienen miofibrillas formadas por las proteínas contráctiles

como la miosina, actina, tropomiosina, el complejo troponina y proteínas de soporte

estructural como la actinina y tinina. La organización espacial específica de los

filamentos contráctiles finos (constituidos por actina, tropomiosina y el complejo

troponina) y gruesos (formados por miosina) es responsable de la estriación cruzada

característica de los músculos estriados. Las diferencias en el índice de refracción de

distintas regiones de la fibra muscular determinan la alternancia de bandas claras,

isótropas o bandas " I " y bandas oscuras, anisótropas o bandas "A". La figura 1 ilustra la

organización de las bandas I y A en la sección de una fibra única. Las líneas Z,

localizadas en el medio de las bandas I determinan el límite del sarcomere. Los

filamentos gruesos están formados por la miosina, proteína con capacidad de unirse a

la actina que posee una unidad catalítica con un sitio que hidroliza ATP, la fuente de

energía para la contracción muscular. Las moléculas de actina-G se polimerizan en

filamentos largos y finos formando una hélice con hendiduras donde se localizan las

moléculas de tropomiosina. Las moléculas de troponina se sitúan a intervalos regulares

a lo largo de las moléculas de tropomiosina. El complejo troponina tiene tres

componentes: troponina T que se une a los componentes de la tropomiosina; troponina

I que inhibe la interacción entre miosina y actina y troponina C que contiene 4 sitios

HLH para unión de Ca "", que es el responsable del inicio de la contracción muscular

(Loeser y Delbono, 2003).

1.1.1. La Unidad Motora

Las motoneuronas, localizadas a nivel de los núcleos motores troncoencefálicos

y en el asta ventral de la médula espinal, constituyen la vía final común para la

transmisión de señales de centros motores al músculo esquelético. La motoneurona



Introducción

Sarcómero

Retículo Sarc opla siná tic o

Mítocondiia Tíibiüo-T Saicoleina

Figura 1. Esquema tridimensional de la relación entre los elementos de la membrana y la organización de los filamentos del aparato contráctil (Adaptada de Leeson y Leeson, 1976, WB Sanders).

integra la información recibida y envia su señal por el axon, que a través de las raíces

ventrales y nervios periféricos alcanza el músculo. Cada motoneurona inerva un

número variable de fibras musculares dentro del mismo músculo, pero en vertebrados

adultos cada fibra muscular recibe innervación de una única motoneurona. Todas las

motoneuronas que inervan un músculo están agrupadas en uno o, generalmente, en

varios segmentos de la medula espinal. Las terminaciones axónicas de las

motoneuronas establecen sinapsis con las fibras musculares a nivel de la placa motora.

La generación de un potencial de acción en la motoneurona hace que todas las fibras

musculares con las que establece sinapsis superen el umbral de excitación y se

contraigan. Por ello, una motoneurona y las fibras musculares que inerva constituyen la

unidad motora, que es la unidad cuantal mínima de ejecuciónon motora. En base a

criterios funcionales (velocidad de contracción, índice de fatiga y fuerza tetánica

generada), se pueden diferenciar tres tipos principales de unidades motoras: S, o

4



Introducción

lentas; FR, o resistentes a fatiga; y FF, o de fatiga rápida. Las diferencias funcionales

(Je los distintos tipos de unidades motoras están basadas en diferentes propiedades

bioquímicas y estructurales de las fibras musculares que las constituyen (Loeser y

Delbono, 2003).

1.2. Acoplamiento excitación-contracción en músculo esquelético

La secuencia de eventos que tienen lugar para la conversión de una señal

eléctrica (potencial de acción) de la fibra muscular en desarrollo de fuerza se define

como acoplamiento de excitación-contracción (EC). El potencial de acción en la fibra

muscular se genera como consecuencia de la liberación de acetilcolina por el terminal

nervioso a nivel de la placa motora, unión del neurotransmisor a receptores nicotínicos

de acetilcolina en el elemento post-sináptico (membrana de la fibra muscular o

sarcolema), y aumento a este nivel de las conductancias al sodio y potasio

responsables de los potenciales sinápticos que, si superan el umbral de excitación,

generan la respuesta activa. El potencial de acción muscular es conducido a lo largo

del sarcolema y por medio de los túbulos-T (Fig. 2) se distribuye la excitación hasta el

interior de la fibra muscular. La transducción de la señal eléctrica en mecánica requiere

de la participación de una proteína localizada en la membrana de los túbulos T, el

receptor de dihidropiridina (DHPR). El DHPR es un canal de Ca "" dependiente del

voltaje, subtipo L, que al ser activado por la despolarización que acompaña al potencial

de acción sufre un cambio de conformación, asociado a movimientos de carga dentro

de la membrana y genera una corriente de Ca^* de entrada (Fig.3). Se cree que la

interacción física entre el DHPR y el receptor de la rianodina (RyR1), un canal de

liberación de Ca "" localizado en la membrana del retículo sarcoplasmático (RS), como



Introducción

Motoneurona

Triada

Figura 2. Propagación del potencial de acción a lo largo del sarcolema y en los túbulos-T. (Adaptada de Heiny, J.A. 2001)

consecuencia del cambio conformacional del DHPR, produce la activación del RyR1 y

liberación masiva de Ca " de las cisternas terminales del RS (Schneider y Chandler,

1973). El Ca "" se une a la troponina C y esta por medio de la troponina T desplaza la

tropomiosina hacia un lado, exponiendo los sitios de unión de la actina y permitiendo la

formación de los puentes cruzados entre la miosina y los filamentos de actina, que

median el deslizamiento de los filamentos delgados sobre los gruesos y la generación

de fuerza (Looser y Delbono, 2003). Por todo esto, el Ca "" juega un papel muy

importante en el desarrollo de la fuerza muscular. La figura 3 representa los pasos del

proceso de acoplamiento EC en fibras musculares esqueléticas de mamíferos. La

corriente de Ca "" de entrada es debida a la activación de los DHPRs localizados en la

membrana de los túbulos-T. El movimiento de carga es el resultado del desplazamiento



Introducción

Voltaje de membrana fvn

-80 mV

MoElamentos

Figura 3. Acoplamiento de excitación-contracción en músculo esquelético de mamíferos. La corriente de Ca^* entra a través del receptor de dihidropiridina (DHPR) localizado en la membrana de los túbulos T. El movimiento de carga es el resultado del movimiento de la unidad del DHPR que actúa como sensor de voltaje. La liberación de Ca "" del retículo sarcoplasmático (RS) ocurre a través del receptor de la rianodina (RyRI) y produce un aumento transitorio de Ca "" en el citoplasma. El Ca "" citoplasmático produce la contracción mediante la activación del ciclo de los puentes cruzados. Barras de calibración vertical: 5 nA, 10 ijMms"\ 5 fjM, y 200 kPa para la corriente de Ca "" y movimiento de carga, liberación de Ca * del RS, transitorio de Ca "" y fuerza, respectivamente (Payne y cois., 2004); adaptada de Melzer, W., A. Herrmann-Frank, y H. Luttgau. Biochim.Biophys.Acta 1241:59-116, 1995]

de la subunidad del DHPR que actúa como sensor de voltaje. La liberación de Ca^* del

RS ocurre a través de la isoforma muscular del receptor de la rianodina (RyRI), cuya

activación produce el aumento transitorio de la [Ca^*] mioplasmático (transitorio de

Ca^*). El incremento de la [Ca^^l resulta finalmente en la formación de los puentes

cruzados y la generación de fuerza.



Introducción

1.3. Subtipos de fibras musculares y tipos de contracción

Se han identificado distintos tipos de fibras musculares mediante tinciones

inmunológicas o de ATPasa, basadas en la dependencia del pH de la actividad ATPasa

de la miosina, que se correlaciona con las propiedades antigénicas de la miosina en

musculo de contracción rápida y lenta (ver Tabla 1). De acuerdo con la clasificación

histoquímica, las fibras musculares están divididas en tipo I y tipo II (A, B y X) (Tabla 1).

Las fibras humanas se clasifican en rápidas y lentas en base a sus propiedades de

contracción en respuesta a una estimulación aislada (genera un único potencial de

acción). Las fibras rápidas, también denominadas tipo II, glicolíticas o blancas, se

contraen en menos de 10 ms y participan mayoritariamente en movimientos rápidos,

finos y precisos. Las fibras lentas, también denominadas tipo I, oxidativas o rojas,

muestran un tiempo de contracción de hasta 100 ms y participan en movimientos

sostenidos y menos precisos. En contra de lo pensado en el pasado, las fibras

musculares son estructuras dinámicas con una capacidad de adaptación excepcional.

Sus perfiles fenotípicos pueden ser afectados tanto por la inervación, el ejercicio,

sobrecarga mecánica e inactividad, hormonas y envejecimiento (Greenlund y Nair,

2003; Pette y Staron, 2001).

1.4. Importancia de la pérdida de la función muscular con la edad

La población de ancianos esta creciendo a nivel mundial. En la actualidad, en los

Estados Unidos solamente hay alrededor de 39 millones de individuos mayores de 65

años de edad y este número sigue creciendo, aumentando así la demanda y los gastos

del cuidado a largo plazo. En el año 2001, la administración del cuidado y la salud de



Introducción

Tabla 1.

Clasificación histoquímica de las fibras musculares

Subtipos de Características

fibras funcionales e

musculares histoquímicas

Tinción de ATPasa

Tipo 1

Tipo HA

Tipo MB

Tipo IIX

Contracción

lenta, oxidativa

Contracción

rápida,

oxidativa,

glicolítica

Contracción

rápida,

glicolítica

Fetal

pH9.4

Clara

Oscura

Oscura

Oscura

pH4.6

Clara

Clara

Oscura

Oscura

pH4.3

Oscura

Clara

Oscura

Oscura

Adaptada de (Loeser y Delbono, 2003)

EEUU gastó aproxinnadamente 103 billones de dólares en residencias para la tercera

edad y este gasto aumentara hasta mas de 183 billones (un aumento del 77 %) en el

2010. Por lo tanto, el envejecimiento representa un tema muy relevante tanto desde el

punto de vista de la salud como socioeconómico. La asistencia a residencias de la

tercera edad es requerida con mayor frecuencia por ancianos que no son capaces de

cuidar de si mismos. Aunque la pérdida de independencia ocurre a varios niveles, la

disminución de fuerza muscular se considera una de las causas mas importantes que

produce fragilidad y discapacidad en los ancianos. La disminución de fuerza muscular

es responsable de caídas y fracturas que pueden agravar otros cuadros clínicos y

contribuyen enormemente a la discapacidad en los ancianos (Greenlund y Nair, 2003).

Así pues, a medida que la población envejece, se vuelve más importante comprender



Introducción

(OS mecanismos responsables de la disminución de fuerza muscular para contribuir al

desarrollo de tratamientos e intervenciones que contrarresten la pérdida de función y

masa muscular con el envejecimiento, y mejoren así la calidad de vida de los ancianos.

1.5. Mecanismos responsables de la pérdida de la función muscular con el

enveiecimiento

A pesar de la importancia de la fuerza muscular en la prevención de

discapacidades, los mecanismos responsables de este fenómeno sólo se conocen

parcialmente. No obstante, en los últimos años se han realizado estudios a nivel

morfológico, celular y molecular de los mecanismos responsables de la pérdida de

función muscular, tanto en humanos como en modelos animales de envejecimiento.

Los factores que determinan alteraciones del músculo esquelético se pueden englobar

en cuatro grupos: 1) primariamente neurogénicos, 2) primariamente miogénicos, 3) la

combinación de alteraciones musculares y neurales y 4) mecanismos generales

relacionados con el músculo esquelético (Tabla 2) (Loeser y Delbono, 2003).

1.5.1. Mecanismos primariamente neurogénicos

Los mecanismos primariamente neurogénicos incluyen la reducción en el

número y/o tamaño de las motoneuronas espinales, y alteraciones en el flujo axonal y

en la unión neuromuscular. Cada uno de estos factores, individualmente o en

combinación, produce denervación muscular crónica y remodelado de las unidades

motoras. No sorprende, por tanto, que algunos ancianos presenten evidencias

electromiográficas de denervación muscular, sugiriendo alteraciones de las

motoneuronas que no se vinculan a la clásica enfermedad amiotrófica (esclerosis

10



Introducción

lateral amiotrófica). La denervación muscular se asocia con la reinervación de fibras,

que se refleja en la agrupación de fibras musculares en secciones histológicas. Los

ciclos de denervación muscular asociados con la reinervación son los responsables de

la remodelación de las unidades motoras. En la actualidad no está claramente

establecida la importancia funcional de este remodelado de las unidades que se

produce con el envejecimiento. El remodelaje de motoneuronas que ocurre con el

envejecimiento involucra fundamentalmente la denervación de fibras rápidas y la

reinervación de estas fibras por colaterales axónicas de motoneuronas que inervan

fibras lentas. De esta forma, el remodelado de las unidades motoras se acompaña de

cambios en la distribución del tipo de fibras en músculos mixtos. A pesar de que la

reinervación de fibras musculares tiende a compensar la denervación, con el

envejecimiento, se produce una pérdida neta de fibras musculares indicando que el

grado de denervación de fibras musculares excede al de reinervación. No está claro si

la denervación muscular es debida a alteraciones en las motoneuronas, en los

terminales nerviosos, o en el transporte axonal. La velocidad de conducción de los

nervios periféricos no se afecta significativamente con el envejecimiento (Loeser y

Delbono, 2003), sugiriendo que con el envejecimiento no existen probablemente

alteraciones en la mielina o reducciones importantes en el calibre de los axones.

Aunque se ha sugerido que la denervación es un factor que contribuye a las

alteraciones del músculo esquelético observadas con el envejecimiento, el nivel de

denervación en músculos individuales y su efecto en músculos de humanos esta por

determinar.

1.5.2. Mecanismos primariamente miogénicos

Estudios previos han contemplado la hipótesis de que la pérdida de masa

11



Introducción

Tabla 2

Patogenia de las Alteraciones del Músculo Esquelético con el Envejecimiento

I. Alteraciones primariamente neurogénicas

A. Motoneuronas espinales

1. Reducción en el número

2. Reducción de tamaño

B. Alteraciones del flujo axonal

C. Alteraciones de la transmisión neuromuscular

1. Disminución del número de terminales nerviosos

2. Reducción de la liberación de neurotransmisor

3. Disminución del número de receptores de Acetilcolina

II. Alteraciones primariamente miógénicas

A. Daño causado por contracción

B. Disminución de la estabilidad de los puentes de actina-miosina

C. Alteraciones de la señal de transducción (factores tróficos/resistencia a

hormonas)

D. Disminución de la proliferación de las células satélite

III. Combinación de factores

A. Músculos en suspensión

B. Desacoplamiento de excitación-contracción

iV. Mecanismos generales relacionados con el músculo esquelético

A. Estrés oxidative

B. Mutaciones del DNA mitocondrial

C. Vasculopatías relacionadas con el envejecimiento

Adaptada de Loeser y Delbono, 2003.

12



Introducción

muscular puede ser responsable de la disminución de fuerza nriuscular. Sin embargo, la

disminución de fuerza con el envejecimiento es mayor que la disminución de masa

muscular en humanos (Brooks y Faulkner, 1988). Estudios in vitro sobre contractilidad

realizados en músculos de ratones y ratas han revelado una disminución de fuerza

específica (fuerza normalizada por el área de la sección transversal del músculo) con la

edad (Brooks y Faulkner, 1994a). Esto sugiere que la capacidad intrínseca del músculo

esquelético de generar fuerza esta alterada en mamíferos de edad avanzada, incluidos

los humanos (Delbono, 2002). Varios mecanismos primariamente miogénicos podrían

ser responsables de la disminución de fuerza específica con el envejecimiento, estos

incluyen: /) Alteraciones en la capacidad de recuperación después de daños inducidos

por contracciones (Brooks y Faulkner, 1990), //) disminución de la estabilidad de los

puentes de actina-miosina (Lowe y cois., 2002), iii) alteraciones en la transducción de la

señal en el músculo (acoplamiento de excitación-contracción) (Delbono, 2003) y iv)

disminución de la proliferación de las células satélite (Rennie y cois., 2004).

Las alteraciones producidas por la contracción han sido relacionadas con un

aumento de la fragilidad mecánica y una disminución de la capacidad restaurativa con

la edad, fenómeno que no ha sido bien caracterizado. Cuando los músculos

experimentan repetidos ciclos de contracción/relajación sufren un daño que se acentúa

de forma significativa en animales viejos. Además, los músculos de animales viejos se

recuperan más lentamente que los de animales jóvenes o incluso no llegan a

recuperarse de forma completa (Brooks y Faulkner, 1990).

Alteraciones que impiden la activación completa de la maquinaria contráctil para

desarrollar fuerza pueden contribuir a la disminución de fuerza específica. Existen

numerosos datos experimentales que indican que con el envejecimiento se produce

una disminución de fuerza específica en los distintos tipos de fibras musculares (I, lia,

y llb/llx), tanto de músculos humanos como de rata (Frontera y cois., 2000; Larsson y

13



Introducción

cols., 1997; Li y Larsson, 1996; Lowe y cols., 2002; Thompson y Brown, 1999). La

observación de que fibras musculares carentes de membrana externa de músculos de

humanos ancianos y otros mamíferos pequeños desarrollan menos fuerza específica

que la de músculos de individuos jóvenes cuando son activadas a nivel máximo sugiere

que la capacidad intrínseca de generar fuerza del aparato miofibrilar está alterada

(Lowe y cois., 2002). Los experimentos realizados en células sin sarcolema no reflejan

las alteraciones en el proceso de acoplamiento excitación-contracción, ya que las fibras

carecen de membrana plasmática y, por ello, cualquier cambio en la fuerza contráctil

generada en fibras de animales viejos refleja directamente alteraciones del aparato

contráctil.

El proceso de acoplamiento de EC se ha demostrado que está alterado con el

envejecimiento. En 1995, Delbono y cois propusieron, por primera vez, que el

mecanismo de acoplamiento de EC esta alterado en músculo esquelético de mamíferos

viejos. Desde entonces se han descrito nuevas evidencias experimentales que apoyan

esta hipótesis (Ryan y cois., 2000; Delbono, 2003) (ver abajo).

Las fibras musculares de mamíferos adultos son células completamente

diferenciadas y; por ello, carecen de actividad mitótica para producir mionúcleos

adicionales cuando aumenta la síntesis de proteínas y el músculo se hipertrofia. El

incremento en el número de mionúcleos se obtiene por diferenciación de células

satélite, que están localizadas en las invaginaciones del sarcolema debajo de la lámina

basal. Dado que para alcanzar una hipertrofia muscular se requiere la activación de

estas células es posible que en la atrofia o en las alteraciones del proceso de

regeneración que sufren los músculos de sujetos de avanzada edad si que pueda estar

disminuida la capacidad proliferativa y el número de estas células satélite. (Decary y

cois., 1997; Renault y cois., 2002; Rennie y cois., 2004).

14



introducción

Otros mecanismos generales relacionados con el músculo esquelético son: daño

oxidative (Weindruch, 1995), mutaciones en el DNA de la mitocondria (Hoopes, 2002) y

vasculopatías relacionadas con el envejecimiento (Rogers y Evans, 1993).

1.6. El desacoplamíento de EC como mecanismo responsable de la

debilidad muscular

Aunque se ha propuesto que son varios los mecanismos que causan la

disminución de fuerza específica (ver arriba Mecanismos primariamente miogénicos),

este trabajo esta enfocado en los mecanismos que alteran el acoplamiento EC.

La hipótesis del desacoplamiento EC sugiere que con el envejecimiento se

produce una reducción en el número y/o función de los DHPR y RyRI, lo que

DISMINUCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE DHPR Y RyRI EN MÚSCULO ESQUELÉTICO

^ '

DISME^ÍUCIÓN DEL NÚMERO DE DHPR EN EL

SARCOLEMAYRyRl OR RyRI

y r DESACOPLAMÍENTO ENTRE DHPR-RyRl

^ r REDUCCIÓN DE LA

LIBERACIÓN DE Ca^^ DEL RETÍCULO

SARCOPLÁSMICO

^ r

DISMESrUCIÓN DE LA FUERZA ESPECÍFICA

Fulgura 4. Esquema de la hipótesis del desacoplamiento de excitación-contracción con el envejecimiento (Adaptada de Delbono, 2002).

15



Introducción

disminuye la liberación de Ca^* del RS (retículo sarcoplasmático) y, como

consecuencia, la fuerza específica (Delbono y cois., 1995) (Fig.4).

Para estudiar los cambios que se producen con el envejecimiento en el

acoplamiento EC se ha determinado en fibras musculares de animales jóvenes y viejos

los siguientes parámetros: el movimiento de carga, la corriente de Ca " del DHPR y el

transitorio de Ca^* mioplasmático. Las principales conclusiones aportadas por estos

estudios son: i) El número de DHPR y DHPR/RyR1 en el músculo extensor común de

los dedos (EDL) disminuye con el envejecimiento (Renganathan y cois., 1997a; Ryan y

cois., 2000); ii) el movimiento de carga y la corriente de Ca "" del DHPR disminuyen con

la edad en fibras del músculo cuadríceps de humanos y en el flexor corto de los dedos

(FDB) (Delbono y cois., 1995; Wang y cois., 2000); iii) El incremento transitorio de la

[Ca ""]; disminuye con la edad (Delbono y cois., 1995; Wang y cois., 2000). El

porcentaje de reducción de la liberación de Ca^* intracelular (transitorio de Ca^*) es

similar al de la disminución del número de DHPR y el movimiento de carga.

1.7. La técnica de la fibra única e intacta como excelente aproximación

experimental para determinar la fuerza específica del músculo esquelético

La preparación de fibra única e intacta ha mostrado ser muy útil para determinar

la fuerza específica en músculo esquelético (Lannergren y Westerbiad, 1987). La fibra

única tiene todos los elementos necesarios para reproducir la contracción muscular,

manteniendo el sistema de túbulos T, sarcolema y retículo sarcoplasmático intactos. De

esta forma se pueden realizar estudios funcionales que relacionen cambios controlados

en el voltaje con valores de fuerza específica y cambios en la [Ca^^ji, mediados por la

liberación de Ca "" del RS. En fibras musculares de ratones adultos jóvenes, pero no de

16



Introducción

ratones viejos, se han obtenido registros simultáneos de la fuerza específica y de la

[Ca^*], (Lannergren y Westerbiad, 1987).

El RS desempeña un papel importante en la regulación del Ca "" mioplasmático.

La magnitud del incremento de la [Ca^""]! libre durante la contracción es el mayor

determinante del desarrollo de fuerza y depende de varios factores, siendo uno de ellos

el contenido de Ca^* del RS. Una menor cantidad de Ca " en el RS podría ser la causa

de la disminución de fuerza específica con la edad. Aunque experimentos de fijación de

voltaje en células humanas han demostrado que existe una cantidad extra de Ca ""

disponible en el RS en fibras de ratones viejos, se desconoce todavía si este Ca^* está

también disponible en fibras únicas musculares durante la contracción evocada por un

estímulo eléctrico. Además, si esta cantidad de Ca "" extra pudiera ser liberada, no se

sabe si el resultado sería un aumento del desarrollo de fuerza en fibras de ratones

viejos. La cafeína es un activador muy potente del RyRI y se ha utilizado ampliamente

para aumentar la liberación de Ca " del RS. Experimentos con cafeína en células

únicas de músculo de ratones jóvenes y viejos podrían proveer información muy útil en

lo que al contenido de Ca^* del RS se refiere.

1.8. Eventos elementales de liberación de Ca^^fEELC) - (Chispas de Ca^ )

delRS

Los eventos elementales de liberación de Ca^* del RS, también denominados

chispas de Ca " , son fenómenos discretos y localizados que surgen de la apertura de

un grupo pequeño de canales-RyR1s de liberación de Ca " . El concepto de que es

necesaria una elevación espacial homogénea del Ca^* citoplasmático para el

reconocimiento de una señal de Ca^* ha sido totalmente abandonado con el

descubrimiento de las chispas de Ca^*. Las chispas de Ca^* presumiblemente ocurren

17



Introducción

en tal alta frecuencia y número durante la despolarización de la fibra muscular, que los

eventos individuales son difíciles de distinguir durante el transitorio de Ca^''. El

desarrollo de condiciones experimentales bajo las cuales las chispas de Ca "" pueden

ser observadas y caracterizadas ha constituido un enorme avance en el estudio del

proceso de liberación de Ca "" del RS (Schneider y Ward, 2002). Las chispas de Ca ""

son capaces de elevar localmente la [Ca " ]; a valores muy altos (10-100 pM), mientras

que el aumento global de la [Ca ""]! es de menos de 2 nM (Jaggar y cois., 2000). Las

chispas de Ca "" se detectaron por primera vez con imágenes de microscopia confocal

en células musculares cardíacas (Cheng y cois., 1993) y más tarde en una variedad de

tejidos incluyendo el músculo esquelético de anfibios y mamíferos (Fig. 5) (Klein y cois.,

1996) (Shirokova y cois., 1998; Tsugorka y cois., 1995).

Figura 5. Chispas de Ca ^ registradas en una fibra del músculo EDL de un ratón joven. Las imágenes corresponden a una serie de 50 imágenes tomadas a una velocidad de 3 s/imagen con una resolución espacial de 512x512 píxeles y tamaño de pixel de 0.134 pm.

Las chispas de Ca "" han sido estudiadas para entender el proceso celular de la

liberación de Ca "" y su control, ya que aportan información sobre la apertura de los

RyRIs (dispersión espacial, amplitud y duración) en células vivas. El análisis de las

propiedades de las chispas ayudara a conocer mejor el proceso de acoplamiento EC y

a comprender las alteraciones que experimenta este proceso en estados

patofisiológicos como la hipertrofia cardíaca., paro cardíaco e hipertermia maligna

(Cheng y cois., 1999). Por ejemplo, se ha demostrado que las chispas de Ca ""

espontáneas están significativamente alteradas en la disfunción del músculo

18



Introducción

esquelético asociada a la insuficiencia cardíaca congestiva (Ward y cois., 2003). El

estudio de las chispas de Ca^* también esta siendo utilizado para determinar algunos

aspectos de la regulación metabólica de la liberación de Ca "" por el RyR1 (Isaeva y

Shirokova, 2003a). Esta aproximación experimental es de gran relevancia ya que

existen evidencias que indican que la modulación y función de la actividad del RyR1

esta alterada con la edad (Margreth y cois., 1999). Hasta ahora no se ha realizado

ningún estudio sobre chispas de Ca^* en músculo esquelético de mamíferos viejos.

1.9. El músculo esquelético y el factor de crecimiento similar a la insulina

detipoKIGF-D

IGF-1 es un peptide estructuralmente similar a la proinsulina que tiene como

función principal el producir el crecimiento y diferenciación del músculo esquelético

(Florini y cois., 1996). Con la edad, la producción y actividad del eje de la hormona del

crecimiento/ IGF-1 disminuye lo cual se ha asociado con el aumento de los procesos

catabólicos (Lamberts y cois., 1997) que llevan a la pérdida de masa muscular y fuerza.

La expresión de IGF-1 en fibras musculares, mediante la infección de un adenovirus,

previene la pérdida de masa y fuerza muscular con el envejecimiento mediante la

estimulación de la regeneración del músculo a través de la activación de las células

satélite (Barton-Davis y cois., 1998). Además, la expresión de la isoforma muscular de

IGF-1 produjo hipertrofia sostenida y regeneración en músculo esquelético de animales

viejos (Musaro y cois., 2001). La expresión de IGF-1 dirigida específicamente al

músculo esquelético puede prevenir algunos aspectos de las alteraciones en el

mecanismo de acoplamiento de EC, como por ejemplo: i) IGF-1 previene la disminución

del número de DHPRs con el envejecimiento (Renganathan y cois., 1998)

(Renganathan y cois., 1997b); ii) protege de la disminución del movimiento de carga del

19



Introducción

DHPR y de la liberación de Ca "" intracelular en fibras del músculo FDB de ratones

viejos (Wang y cois., 2002); iii) puede estimular la transcripción de la subunidad a1S

del DHPRR en células musculares mediante la acción sobre el factor de transcripción

CREB (Zheng y cois., 2002a); este proceso ocurre mediante un mecanismo que

involucra a las proteínas calcioneurina y calmodulina cinasa (Zheng y cois., 2004); y iv)

protege de alteraciones en el área pre y post sináptica de la unión neuromuscular

(Messi y Delbono, 2003). Sin embargo, no existe información sobre el efecto de IGF-1

en la eficiencia del proceso de contracción muscular o la capacidad generadora de

fuerza específica. El impacto de los cambios arriba mencionados sobre la contractilidad

de fibras únicas necesita ser investigado mediante la medida de la fuerza específica y

el Ca " intracelular en fibras únicas de músculos de animales IGF-1- transgénicos.

20



2. Objetivos



Objetivos

2. Objetivos

A pesar de la importancia de la conservación de la fuerza muscular en la

prevención de la discapacidad física, los mecanismos biológicos responsables del

deterioro funcional y estructural del músculo esquelético asociados al envejecimiento se

conocen sólo parcialmente. Se desconoce si la debilidad muscular es consecuencia de

alteraciones en las propiedades intrínsecas de las fibras musculares, y/o de un mayor

nivel de fatiga de las mismas, que conduce a un menor desarrollo de fuerza durante el

proceso de envejecimiento. Uno de los eventos cruciales del proceso que lleva a la

contracción muscular (el acoplamiento de excitación-contracción-EC) es la liberación de

Ca^* del retículo sarcoplasmático (RS). No se sabe si una alteración en el proceso de

liberación de Ca^* en células de ratones viejos es responsable de la disminución de

fuerza específica. Además, la debilidad muscular esta asociada a la disminución de los

niveles circulantes del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), que ocurre

durante el envejecimiento. Aunque se ha demostrado que IGF-1 puede restaurar

algunos aspectos del acoplamiento de EC durante la edad avanzada no se sabe si este

factor puede restaurar la fuerza muscular específica. Por todo ello, en este trabajo se

estudiara si la debilidad muscular que ocurre con el envejecimiento es una

consecuencia de alteraciones en las propiedades intrínsecas de las fibras musculares,

y/o de un mayor nivel de fatiga de las mismas. Además, estudiaremos, utilizando la

técnica de contracción de fibra única e intacta, si la disminución de la fuerza específica

esta asociada a la disminución de la liberación de Ca^* del RS, y si esta disminución se

puede prevenir mediante la expresión transgénica de IGF-1 en el músculo esquelético.

Para ello:

22



Objetivos

1) Se medirán las propiedades contráctiles de fibras únicas del músculo

esquelético lento y rápido de ratones jóvenes, de edad mediana y viejos, utilizando la

técnica de contracción de fibra única intacta, para determinar si la disminución de

fuerza específica con el envejecimiento es el resultado de alteraciones en las fibras que

componen el músculo.

2) Se determinará el nivel de fatiga de fibras únicas del músculo esquelético de

ratones jóvenes y viejos para saber si la resistencia muscular contribuye a una

limitación de la fuerza desarrollada por el músculo esquelético de mamíferos de edad

avanzada.

3) De existir cambios en los niveles de fuerza específica con la edad se

estudiará si la disminución de la fuerza específica que ocurre con el envejecimiento

esta asociada a una disminución de la liberación de Ca "" del RS. Para ello, mediremos,

simultáneamente, los niveles de Ca "" intracelular y la fuerza especifica de fibras

musculares esqueléticas de ratones jóvenes y viejos.

4) De existir una disminución en la liberación de Ca "" del RS se estudiará la

fuerza específica y la liberación de Ca^* en fibras musculares de ratones transgénicos-

lGF-1 para determinar si la expresión transgénica de IGF-1 en músculo esquelético

puede prevenir la disminución de la liberación de Ca "" del RS y/o la fuerza específica.

5) Por último, y en el caso de que exista una disminución en la liberación de

Ca "" del RS se caracterizarán los eventos elementales de la liberación de Ca "" (EELC-

0 chispas de Ca "") en fibras musculares de ratones jóvenes y viejos. El estudio de las

chispas de Ca^* nos permitirá averiguar si existen alteraciones en los RyR1s que

contribuyen al proceso de desacoplamiento de EC.

23



3. Material y Métodos



Material y Métodos

3. MATERIAL Y MÉTODOS

3.1. Disección v montaje de fibras únicas e intactas

Mediante disección se aislaron fibras únicas e intactas de los músculos EDL y

soleo de ratones de 2 a 6 (joven; n=17) de 12 a16 (edad mediana; n= 7) y de 20-24

meses de edad (viejo; n=15) de cepa DBA (colonia del Instituto Nacional de Harían-

Instituto Nacional del envejecimiento-NIA) o FVB (nuestra colonia). También se aislaron

fibras del músculo FDB de ratones de 2-4 meses de edad de cepa DBA o FVB. Ambas

cepas se han utilizado en estudios previos como modelo de animal de envejecimiento

(Bakker y cois., 1997a; Renganathan y cois., 1998). Los procedimientos con animales

siguieron un protocolo previamente aprobado por el comité del cuidado y uso de

animales de la Universidad de Wake Forest (Winston-Salem, NC, USA). Los animales

se sacrificaron mediante dislocación cervical y los músculos se disecaron de ambas

patas posteriores. Las fibras únicas fueron disecadas bajo estereoscopio (30-50X),

poniendo especial atención en dejar la menor cantidad posible de restos celulares de

células vecinas. Para permitir un montaje estable y seguro de la fibra, la conexión de la

fibra con el tejido conectivo y los tendones se mantuvo intacta. Los tendones fueron

fijados con unos micro-clips hechos de papel de aluminio y la preparación transferida a

la cámara de registro. Las fibras musculares fueron montadas entre un transductor de

fuerza (403 A Aurora Scientific) y un microposicionador que permitió la regulación de la

longitud de la fibra. Las fibras fueron perfundidas continuamente con la solución de

registro (concentraciones expresadas en mM: NaCI 121, KCI 5, CaCb 1.8, MgCb 0.5,

NaH2P04 0.4, NaHCOs 24, glucosa 5.5) aireada continuamente con una mezcla de 5%

CO2 y 95% O2 para conseguir un pH de 7.4. Para el registro se ajustó la longitud de las

fibras musculares de tal forma que pudieran desarrollar la fuerza máxima en respuesta

25



Material y Métodos

a la estimulación eléctrica.

3.2. Registros de contracción de fibra única

Las fibras se estimularon directamente mediante un campo eléctrico generado

entre dos electrodos de platino conectados a un estimulador con unidad de aislamiento

eléctrico. Trenes de pulsos rectangulares de frecuencia variable, entre 5 y 100 Hz, de

una duración de 350 ms se aplicaron mediante estimulación eléctrica con un intervalo

de 5 minutos para determinar la fuerza máxima específica. Trenes de duración más

larga fueron necesarios para conseguir la fuerza máxima específica en células del

músculo soleo. Para la adquisición de datos se utilizó un ordenador personal, un

convertidor analógico digital (Digidata 1200, Axon Instruments, Foster City, CA) y el

programa de adquisición y análisis PCLAMP (Axon Instruments). El diámetro de la

célula fue medido en la cámara de registro a una magnificación de 200-400X por dos

investigadores y la sección transversal calculada como n(cl/2)^, donde d es el diámetro

de la célula.

Un experimento típico se desarrolló de la siguiente manera: La fibra muscular

intacta fue montada en la cámara de registro y estirada hasta alcanzar la longitud

óptima (Lo) (longitud que permite el desarrollo de la fuerza máxima) mediante

estimulación breve. Después de obtener Lo, las fibras se dejaron descansar entre 5-7

min. Seguidamente se estudió la relación fuerza-frecuencia mediante la aplicación de

trenes de pulsos eléctricos de 350 ms de duración a diferentes frecuencias, que

variaron, de forma creciente, entre 5 y 200 Hz. Cuando dos frecuencias consecutivas

desarrollaron la misma fuerza, la frecuencia siguiente no fue aplicada, con el fin de

reducir la duración del experimento.

26



Material y Métodos

3.3. Registros de contracción de los experimentos de fatiga

Se utilizaron dos protocolos para el estudio de fatiga, llamados de intervalo corto

(IC) y de intervalo largo (IL). Ambos protocolos fueron estudiados a la frecuencia que

evocó la fuerza máxima (ver capítulo I). Los trenes de pulsos fueron de 350 ms de

duración y el intervalo entre trenes fue de 1 ó 3.65 s para los protocolos IC o IL,

respectivamente; estos protocolos se aplicaron durante 5 y 10 min. para IC y IL,

respectivamente. Las células de los músculos EDL fueron de contracción rápida,

mientras que las del soleo de contracción lenta. Para determinar si una célula es de

contracción rápida o lenta se midieron varios parámetros: tiempo al pico de contracción,

tiempo de relajación media y duración de la estimulación necesaria para desarrollar la

fuerza máxima.

3.4. Experimentos de contracción de músculo entero

Para los experimentos de contracción de músculo entero la parte distal del

músculo FDB fue disecado de ambas patas traseras del ratón. El músculo fue montado

entre un transductor de fuerza 404A (Aurora Scientific) (complianza: 0.1 pm mN-1,

frecuencia de resonancia: 2 KHz) y un microposicionador ajustable para permitir el

control de la posición y la longitud del músculo. El músculo se perfundió continuamente

por medio de una bomba peristáltica, de forma similar a como se ha descrito

previamente en la sección de experimentos de fibra única.

Los registros de contracción y el análisis de experimentos de músculo entero

siguieron la misma técnica descrita para los experimentos de fibra única con algunas

modificaciones. Para producir la contracción máxima a diferentes frecuencias se

aplicaron normalmente trenes de pulsos de 500 ms. En ocasiones, se aplicaron trenes

27



Material y Métodos

de mayor duración, cuando la contracción no alcanzó un nivel estable de meseta

durante el estimulo. El diámetro del músculo se midió en la cámara de registro a través

de un microscopio a una magnificación de 30X o con preparaciones histológicas de

secciones transversales. Estas últimas fueron adquiridas digitalmente y el área de las

secciones se midió usando el programa Isee (Inovision, Durhan, NC, USA). El área de

la sección transversal (AST) de cada músculo se midió trazando una región de interés

(RDI) en la imagen digital a lo largo del borde de varias secciones de cada músculo. El

área se calculó en base a las dimensiones de altura y anchura de cada pixel y al

número total de píxeles en la RDI.

3.5. Registros de Ca ^ intracelular en fibras únicas intactas de FDB

La [Ca^*]i de una fibra muscular se registró simultáneamente con la fuerza

específica, usando el indicador de fluorescencia fluo-3-AM (Molecular Probes, Eugene,

OR, USA). Las fibras se incubaron con 5 f M fluo 3-AM por 30-40 min usando una

concentración preparada de fluo 3-AM de 1 mM en DMSO, lo que permitió una muy

baja concentración de DMSO en la cámara de registro durante la incubación (<0.5%).

Después de la incubación las células se perfundieron con solución de registro durante 5

min antes de empezar el protocolo de contracción. Para los registros de fluorescencia

la fibra se iluminó con un rayo láser de longitud de onda 488 nm. El rayo láser pasó a

través de un módulo de sean OZ (Noran Instruments Confocal System, Middieton, Wl,

USA) y a través de un objetivo Fluar 20 X (Zeiss, Oberkochen, Germany) montado en

un microscopio invertido (Axiovert S100 2TV, Zeiss) antes de iluminar la preparación.

La fluorescencia emitida fue recogida por el objetivo y dirigida al módulo de sean OZ,

en la configuración "sin banda" y a través del filtro de emisión de longitud de onda de

500 nm antes de ser recogida por el fotomultiplicador y digitalizada (Fig. 6). El control

28



Material y Métodos

de los equipos, la adquisición de las imágenes y el procesado se hicieron a través del

programa Intervision (Noran Instruments) en un ordenador Silicon Graphics 02

(Mountain View, Ca, USA).

Para el análisis de datos, varias RDI fueron seleccionadas de cada célula y los

valores de la emisión máxima de fluorescencia fueron utilizados para las

comparaciones estadísticas.

Objetivo

jjlaiio de foco

Figura 6. Esquema del microscopio utilizado para los registros de fluorescencia

3.6. Calibración del indicador Fluo 3-AM y cálculo de la concentración

jntracelular de Ca ^

Para cuantificar la [Ca^*]¡, las señales fluorescentes se transformaron en

concentraciones de Ca "". Para ello, se calibró en fibras musculares la fluorescencia

29



Material y Métodos

emitida por fluo S-AIVI a distintas concentraciones de Ca^*. Aunque la constante de

disociación, Kd, es una propiedad del indicador de Ca "*" y por ello tiene un valor

relativamente constante, se conoce que puede ser afectada por diversos factores como

el pH, la viscosidad y la fuerza iónica, entre otros. Debido a esto, medimos la Kd del

indicador fluo 3-AM para Ca^* en células disociadas de músculo FDB. Los músculos

FDB de ratones jóvenes fueron incubados con colagenasa a una concentración de

2mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA) en una solución de disociación que contenía 155

mM aspartate de cesio, 5 mM aspartate de magnesio y 10 mM HEPES (pH 7.4 con

CsOH) (Beam y Franzini-Armstrong, 1997), durante 3h a 37 C. Las fibras musculares

se disociaron usando pipetas Pasteur de diferentes tamaños de punta. Seguidamente,

las fibras fueron incubadas con fluo 3-AM (5 p-M) durante 30-40 min. Tras la incubación,

se lavó el fluo 3-AM y las células fueron expuestas a soluciones estandarizadas de

diferentes concentraciones de Ca^*. La concentración de Ca "" en las soluciones

estandarizadas se calculó de acuerdo con el procedimiento previamente descrito (Tsien

y Pozzan, 1989). En estas condiciones se midió la fluorescencia basal. Después, las

fibras se permeabilizaron con el detergente saponina a una concentración de 0.01%

para permitir la entrada de Ca^* y se midió la fluorescencia máxima alcanzada antes de

que las células se movieran o su forma se distorsionara. Los valores correspondientes

a cada punto experimental se obtuvieron de la media de al menos 4 células. La

fluorescencia a diferentes niveles de Ca "" se normalizó con la fluorescencia máxima y

los valores de la media se ajustaron a la siguiente ecuación: y= 1/(1+(Kd/[Ca^''])) (Wang

y cois., 1999a). La Kd de fluo 3-AM, medida en estas condiciones, fue 708 nM. La

[Ca^*]¡ se calculó usando la siguiente ecuación: [Ca^*] = Kd (F-Fmin)/(Fmax-F) (Tsien y

Pozzan, 1989), donde Kd es la constante de disociación; F el valor de fluorescencia de

pico registrado en cada célula; Fmax, la fluorescencia máxima, que se midió al final del

experimento en cada célula, perfundiendo solución Ringer con 0.01% de saponina; y

30



Material y Métodos

Fmin, la fluorescencia en condiciones de reposo, que se midió en un grupo de células

equilibradas con 2 mM BAPTA AM. Este procedimiento dio resultados similares a los

obtenidos en células individuales disecadas manualmente y que no habían sido

incubadas con BAPTA-AM.

3.7. Análisis del tipo de fibra en músculo esquelético

Después de los registros de contracción, los músculos FDB se recogieron de la

cámara de registro, se estiraron a una longitud aproximada a la U, se sumergieron en

medio OCT (Tissue-Tek, Torrance, CA, USA), y se congelaron rápidamente en 2 -

metilbutano (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) enfriado en hielo seco a -40 C.

Los músculos se conservaron a -80 C hasta ser usados posteriormente. Las muestras

congeladas se seccionaron en un criostato (Leica CM3000, Nussioch, Germany) a 21

C. Las secciones (10 ¡am) se guardaron a 4 C hasta ser procesadas para

inmunohistoquímica. Para la identificación de los tipos de fibras, las secciones

musculares fueron expuestas a anticuerpos primarios NCL-MHCs (tipo I), NCL-MHCf

(rápidas totales) (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK), A4.74 (type IIA) (Alexis

Biochemicals, San Diego, CA, USA), o BF-F3 (tipo MB) (ATCC, Rockville, MD, USA) a

una dilución de 1:20 en PBS. Como anticuerpo secundario se usó un conjugado de

conejo anti-ratón fluoresceína isotiocianato (FITC) a una dilución de 1:100. El tipo IIX se

obtuvo restando las fibras de tipo HA y MB al número total de fibras rápidas detectado

con el anticuerpo NCL-MHCf (Novocastra). Como en FDB no se detectaron fibras de

tipo MB, el músculo EDL fue usado como control positivo para el anticuerpo BF-F3. La

fluorescencia de las secciones fue adquirida usando un microscopio invertido (Axiovert

100, Zeiss) y un sistema de imagen con una cámara CCD PXL-EEV-37 (Photometries,

Tucson, AZ, USA). El programa Isee de Inovision se utilizó en una estación de trabajo

31



Material y Métodos

Silicon Graphics O2 para el procesado de las imágenes.

3.8. Medida de la concentración de IGF-1 en músculo FDB

Para medir la concentración de IGF-1 humano (hlGF-1) en los músculos FDB se

utilizó el kit Active IGF-1 Elisa (DSL-10-5600, Diagnostic System Laboratories, Inc.,

Webster, TX, USA). Los músculos individuales de animales control y transgénicos se

congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -80 C para su uso posterior. Los

músculos fueron descongelados en solución de ensayo (1 mg de músculo en 10 |JL de

solución de ensayo), homogeneizados, sonicados y centrifugados durante 10 min a

12000g. El sobrenadante y el estándar se añadieron en los pozos y se incubaron con el

complejo anticuerpo-enzima durante 2 h. Después de lavar este complejo, se

añadieron, secuencialmente, la solución de cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) y la

solución de parado. La absorbancia de cada pozo se determinó a 450 nm en un lector

de microplaca AB Biosystem. Para la normalización, la concentración de proteína en

los sobrenadantes se midió usando el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL,

USA). El límite de detección de hlGF-1 fue 0.03 ng (g proteína)"\

3.9. Preparación de las fibras musculares para el registro de chispas de

Caf:

Los músculos EDL de ambas patas traseras fueron disecados de ratones

jóvenes (3-6 meses de edad; n= 7) y viejos (21-24, n= 10) de cepa FVB, DBA y CB6F1.

Los restos de vasos sanguíneos, nervios y el tejido conectivo que rodea al músculo

fueron eliminados y los músculos se trataron con colagenasa 2 mg/ml y 10% suero

bovino fetal durante 10-15 min en una solución que contenía (en mM): ácido aspártico

32



Material y Métodos

155, aspartato de magnesio 5 mM y Hepes 10, pH 7.4 ajustado con CsOH (Beam y

Franzini-Armstrong, 1997). Los músculos fueros transferidos después a una solución

relajante que contenía (in mM): ácido glutámico 140, Hepes 10, glucosa 5, EGTA 1,

MgCb 10, CaCl2 0.3, pH 7 (ajustado con KOH) y segmentos de células individuales

fueron disecados cuidadosamente y fijados en una posición ligeramente estirada (a

longitud de sarcomere de 2.5-3 )j,m) al fondo de una cámara de Lucite de 200 ML- Las

fibras se permeabilizaron con saponina 0.01% durante 2 min en la solución relajante.

Las células se incubaron después con fluo-4 en una solución interna que contenía (en

mM): glutamato de sodio, 140; Hepes, 10; glucosa, 5; EGTA, 0.5; NaaATP, 5;

fosfocreatina-Na2, 5; MgCb, 5.5, CaCb, 0.9 y fluo-4 0.08 (Molecular Probes, Eugene,

OR, USA), pH: 7 (Kirsch y cois., 2001). Los productos químicos utilizados se diluyeron

en solución interna el día del experimento a partir de las siguientes soluciones

concentradas: rianodina, 10 mM (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), Imperatoxina-A, 10

I M (Alomone Labs, Jerusalem, Israel) diluidas en agua destilada. La solución

concentrada de cafeína (100 mM) (Sigma, ST. Louis, MO, USA) se preparó en solución

interna el día del experimento. Las soluciones de Carbonyl cyanide p-

(Trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) (Sigma, ST. Louis, MO, USA) (39 mM) y

ologomicina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (10 mM) se prepararon en etanol 95 y 100 %,

respectivamente.

2+ 3.10. Imágenes de fluorescencia de las chispas Ca

La cámara experimental se montó en la base de un microscopio invertido

Axiovert 100 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un sistema de láser confocal

(Radiance 2100 K1, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Las fibras se

observaron a través de un objetivo C-Apochromat de inmersión en agua de 40X y

33



Material y Métodos

apertura 1.2 (Zeiss) usando un láser de Criptón-Argón de longitud de onda 488 nm. La

fluorescencia emitida se midió a 528 ± 25 nm. Para la mayoría de los experimentos la

intensidad del láser se mantuvo entre el 6-12% con un filtro de densidad neutra. Se

tomaron dos tipos de imágenes: de cuadro completo xy y de escan de línea xt. Las

imágenes xy tuvieron una dimensión 512x512 píxeles, siendo el tamaño del pixel de

0;134 \xm, en ambas direcciones, xe y, donde imágenes consecutivas se tomaron cada

1.2 y 3.2 s. La fibra se orientó de forma paralela al eje x de escaneo. Se registraron

series de 50 imágenes en 3-5 sitios diferentes en cada fibra. Las imágenes de escan de

línea se adquirieron de 512 píxeles (0.134 pm/pixel) en la dirección x y 1000 píxeles (2

ms/línea) en la dirección t. Se escaneó la totalidad del diámetro de la célula a intervalos

de 20 píxeles. Para la adquisición de imágenes se utilizó el programa Radiance

LaserSharp 2000 sofware (Bio-RAD).

3.11. Análisis de las imágenes de chispas de Ca ^

La detección de los eventos espontáneos de la liberación de Ca " (EELC) se

llevó a cabo de dos formas: visualmente por dos investigadores y automáticamente

usando una versión modificada del programa descrito por Cheng y cois, (1999). Este

programa utiliza IDL 5.6 (Interactive Data Language, Research Systems Inc., Boulder,

CO., USA). El Dr. Sandor Gyorke (Dpt. de Fisiología, Texas, Tech University Health

and Sciences Center) cedió generosamente una versión modificada del programa. El

número de eventos por imagen se utilizó para el cálculo de los parámetros estadísticos

de la frecuencia de eventos en las series xyt (Kirsch y cois., 2001). La fluorescencia de

base (Fo) se determinó calculando la fluorescencia media de la imagen sin procesar

excluyendo posibles eventos (áreas de píxeles continuos que exhibieron una

fluorescencia > 1.5 veces la desviación estándar (DE) por encima de la fluorescencia

34



Material y Métodos

media de la fibra). La normalización de regiones de la imagen que contenían EELC se

llevó a cabo calculando el cociente F{x,y) o F{x,t) entre Fo(x) (Kirsch y cois., 2001). Las

regiones de posibles eventos locales de Ca "" se identificaron en las imágenes AF/Fo

como regiones continuas de píxeles con intensidad de fluorescencia > 2 DE por encima

de la fluorescencia media (Chun y cois., 2003). Las imágenes de fluorescencia

normalizadas fueron filtradas con un filtro kernel de 3 píxeles de tamaño. De las

imágenes de fluorescencia normalizadas y filtradas que contenían EELC se

determinaron cuatro parámetros: i) la amplitud (AF/Fo): fluorescencia máxima

normalizada en el área de la imagen que contiene el evento. Sólo se seleccionaron

eventos con F/Fo > 0.2 ; ii) duración a la mitad del máximo (DMM): el tiempo

correspondiente al número de píxeles cuya amplitud es mayor que la amplitud media

(la mitad de la amplitud máxima); iii) tiempo de ascenso: el tiempo entre el 10% y el

pico de amplitud; y iv) ancho a la mitad del máximo (AMM): la longitud correspondiente

al número de píxeles cuya amplitud es mayor que la amplitud media (ver Fig. 7; Kirsch

y cois., 2001).

AF/F=0.5 F/F.

DMM

Tiempo (ins)

Figura 7. Medida de los parámetros morfológicos de los EELC. MM corresponde a la mitad del máximo (Adaptada de Ward y Schneider, 2002)

35



Material y Métodos

3.12. Composición de cadena pesada de miosina (CPM)

La composición de CPM de las fibras se determinó mediante gel de

electroforesis de poliacrilamida (SDS-PAGE), como se ha descrito previamente (Giulian

y cois., 1983; Messi y Delbono, 2003) con algunas modificaciones. En breve, las fibras

únicas musculares se disolvieron en 40 n\ de una solución que contenía: TRIS, 62.5

mM, 1% de azul de bromofenol, 15% de glicerol, 5% betamercaptoetanol e inhibidor de

proteasas (1 tableta/10 mL Complete Mini: roche Diagnostic, Mannheim, Germany),

después del experimento de registro de chispas de Ca "* y se guardaron a -80 C.

Todas las muestras se utilizaron para la electroforesis entre 1 y 4 semanas después de

los registros de Ca "". El día del experimento, las muestras se sonicaron en hielo

durante 2 min con un desmembranador sónico (Modelo 60, Fisher Scientific).

Posteriormente, se incubaron durante 5 min a 95 C. Debido a la ausencia de

standards comercialmente disponibles en el mercado, un grupo de músculos que

contenía los cuatro tipos de MCP (I, Ha, lib y llx) o el diafragma de rata fueron utilizados

como referencias estándar. La concentración de acrilamida fue de 4 % en el gel de

apilamiento y de 6% en el gel de corrido. La matriz del gel incluyó glicerol al 30%. Para

la detección de la MCP se utilizó el kit Silver stain plus (Bio-Rad).

3.13. Preparación de las membranas e Inmunobiots del RvR

Las fracciones de membrana se prepararon de 12 músculos EDL disecados de 3

ratones jóvenes y 3 viejos. Para cada experimento se agruparon las membranas de dos

músculos y se realizaron 3 Western blots con muestras de ratones jóvenes y viejos. Un

grupo mixto de músculos de las extremidades traseras de rana Northern leopard se

utilizó como referencia positiva para ambos, RyRa y RyR[3, que son los homólogos de

36



Material y Métodos

RyR1 y RyR3 (Chun y cois., 2003). Los músculos EDL se homogeneizaron

manualmente en 150 |jl de solución de homogeneización enfriada en hielo (20 mM

Hepes, pH 7.4, 250 mM sucrosa, y un mezcla de inhibidor de proteasas, Roche) con

pipetas de diferentes tamaños de punta. Las fracciones de membrana se extrajeron

añadiendo 150 pl de solución de extracción (5 mM NaPOa, 75 mM NaCI, 1% Triton-X

100, 1% deoxicolato, 0.1% SDS), que también contenía el inhibidor de proteasas, y se

centrifugaron a 10000 g durante 15 min. Las proteínas en el sobrenadante se

separaron en geles SDS-PAGE 4% para la separación del RyR (Zheng y cois., 2002a;

Chun y cois., 2003) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno -

PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciences) en la solución de transferencia (12 mM

TRIS-base, 92 mM glicina, 0.02 % SDS y 20% metanol) a 25 V durante la noche a 4°C.

En cada línea se cargó la misma cantidad de proteína (40pg). Analizamos la expresión

de la ATPasa de calcio del retículo endoplásmico de fibras rápidas (SERCA-1), cuya

expresión no cambia con el envejecimiento, como control interno para el cargado del

gel (Ferrington y cois., 1997). Las membranas PVDF se bloquearon durante 3 h en una

solución de bloqueo que contenía: 5% de leche desnatada (Carnation) en 150 mM

NaCI, 10 mM Tris.HCI, pH 7.4, 0.1% Tween 20 (Tris buffer sodium Tween, TBST) a

temperatura ambiente. Las membranas se Incubaron después con el anticuerpo

monoclonal de RyR (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa)

diluido a 1:5000 en solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1h, y se

lavaron posteriormente 3 veces en TBST sin Tween-20. Después se incubaron durante

1h con el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa, diluido a 1:10000

en leche en polvo 5% TBST (Amersham Biosciences). Posteriormente, las membranas

se lavaron tres veces durante 5 min cada vez en TBS, 0.05% Tween 20 y una vez en

TBS. Finalmente, las membranas se incubaron en el reactivo de quimioluminiscencia

(ECL) (Pierce, Rockford, IL) y se visualizaron en película de rayos X.

37



Material y Métodos

3.14. Análisis estadístico

Todos los valores han sido expresados como la media ± el error estándar de la

media (ESM) o la desviación estándar (DS) con el número de observaciones (n).

El análisis estadístico para los experimentos de fibra única de EDL , soleo y FDB

se ha desarrollado con el test del análisis de la varianza (ANOVA) seguido de los tests

de BONFERRONI o DUNN o Student-Newman-Keuls dependiendo de la distribución de

los datos. Se aceptó como límite de significación un valor de p<0.05.

Para comparar los resultados de los experimentos de fatiga se utilizó el análisis

de la varianza (ANOVA) seguido de los test de Bonferroni o DUNN, y las pruebas CHI-

cuadrado y Fisher, de acuerdo con la distribución de los datos.

Los experimentos de las chispas de Ca " se compararon utilizando los test

paramétricos Student t-test, paired t-test y el test de Mann Whitney Rank sum.

38



4. Resultados



CAPITULO I:

EFECTO DEL ENVEJECIMIENTO SOBRE LA FUERZA ESPECIFICA DE CÉLULAS

ÚNICAS E INTACTAS DE LOS MÚSCULOS EXTENSOR COMÚN DE LOS DEDOS

(EDL) Y SOLEO DE RA TON



Resultados

4.1.1. La fuerza específica máxima en células de músculos rápidos v lentos

Se determinó la fuerza específica de fibras aisladas de los músculos EDL y

soleo en respuesta a una estimulación única (twitch) o prolongada (tétano), utilizando

los métodos previamente descritos. Debido a que éste es el primer estudio sobre las

propiedades contráctiles de fibras únicas de los músculos EDL y soleo, nos propusimos

determinar la reproducibilidad de la fuerza máxima con el tiempo. Para ello, calculamos

el cociente entre la fuerza máxima o tetánica al final del experimento y la fuerza

máxima al principio del experimento. Los resultados demuestran que la disminución de

fuerza no fue significativa durante un periodo de tiempo de 2-3 h. Los coeficientes

calculados para las fibras del músculo EDL de ratones jóvenes y viejos son,

respectivamente, 0.9 ± 0.2 y 0.99 ± 0.08 (P= 0.66); para las fibras del músculo soleo

0.95 ± 0.09 y 0.91 ± 0.05 (P= 0.74) y para las fibras del músculo FDB de ratones

jóvenes 0.92 ± 0.08. No se encontraron diferencias significativas entre edades o células

de diferentes músculos. Estos resultados demuestran que la fuerza tetánica en células

únicas intactas de músculo esquelético de ratón es estable durante un periodo de 2 ó 3

h y que la disminución de la fuerza durante el transcurso del experimento fue menor del

10% para todos los grupos. El análisis del diámetro y la sección muscular transversal

demostró que las fibras del soleo de ratones viejos son significativamente más

pequeñas que las fibras de músculo de ratón joven o de mediana edad y que las fibras

del músculo EDL de ratón viejo son más pequeñas que las fibras de ratones de

mediana edad (ver TABLA 3). La fuerza específica máxima se midió en fibras de FDB,

EDL y soleo de animales jóvenes. Los valores de fuerza específica de fibras de

distintos músculos de ratones de la misma edad no fueron significativamente

diferentes.

41



Resultados

TABLA 3

Fuerza especifica (FE) máxima de fibras intactas únicas

EDL SOLEO

DIÁMETRO DE LA FIBRA (|jm)

ÁREA DE LA SECCIÓN

TRANSVERSAL (Ijm^)

TWITCH FE

(kPa)

FS TETÁNICA MÁXIMA

FE (kPa)

FRECUENCIA DE LA MÁXIMA FE

(Hz)

JOVEN

38 ±2.0 n=12

1187 + 124 n=12

71 ±13 n=12

377 ±18 n=12

76 ± 6.8 n=12

MEDIANA EDAD

45 ±1.4 n=8

1578 ±97 n=8

106±11 n=8

417±20 n=8

76 ±19 n=8

VIEJO

40 ±2.0 n=25

1217±91 * n=25

53 ±4 .6* n=25

279 ±18** n=25

68 ±4 n=25

JOVEN

41 ±1.4 n=16

1310±100 n=16

48 ± 8.7 n=16

397 ±17 n=16

54 ± 4.7 ^ n=16

MEDIANA EDAD

41 ±1.6 n=11

1362 ±105 n=11

49 ± 7.2 ^ n=11

405 ±24 n=11

43±2.7'f n=11

VIEJO

35 ±1.6** n=10

958 ± 88 ** n=10

54 ±11 n=9

320 ± 33 ** n=10

40 ± 4.5 '^ n=10

Diferencias significativas entre fibras de ratones de mediana edad y joven (*), viejo y de mediana edad (#) y EDL y soleo de la misma edad C*"). Los valores representan la media ± EEM.

La fuerza específica máxima fue medida en fibras musculares de FDB. El valor para

fibras de FDB de ratón joven es 418 + 28 kPa. (n= 8). Este valor no es

significativamente diferente a los registrados en fibras de EDL y soleo de ratones

jóvenes. La fuerza específica obtenida en fibras EDL y soleo de ratones viejos fue

significativamente inferior a la de ratones jóvenes y de mediana edad (Tabla 3). La

Figura 6 muestra registros representativos de la fuerza específica máxima de fibras de

EDL y soleo, en los que se observa que existe una disminución de la fuerza específica

42



Resultados

JOVEN VIEJO

EDL 200 kPa

200 ms A9917 B0505

SOLEO 200 kPa

1 s D0410 E0517

Figura 6. La fuerza específica de células únicas intactas de los músculos Extensor común de los dedos (EDL) y Soleo de ratón disminuye con la edad. Las contracciones aislada (breve) y tetánica registradas en fibras únicas intactas de EDL se tian graficado en la misma escala para comparar las relaciones tétano-aislada y los cambios con la edad. La contracción de fibras de soleo se ha ilustrado a una escala más lenta. Las contracciones aisladas se lian obtenido mediante pulsos de 0.5 ms mientras que los tétanos se han obtenido mediante trenes de pulsos de 350-ms o 2-s para EDL o soleo respectivamente. Es evidente que la fuerza específica en fibras de EDL y soleo es significativamente menor en ratones viejos que en jóvenes. La fuerza específica se ha obtenido normalizando la fuerza absoluta al área de la sección transversal de la fibra (ver tabla 3). La línea de puntos indica la línea base (fuerza 0). Los números cerca de los registros indican el nombre del registro.

con el envejecimiento. Los registros de contracción del soleo se muestran en una

escala temporal diferente ya que las fibras del soleo, al ser más lentas, requieren un

mayor tiempo para alcanzar la fuerza máxima. La Figura 7 muestra los valores de

fuerza específica máxima obtenidos en cada una de las células registradas de EDL y

soleo. Es aparente que, aunque algunas fibras de ratones viejos desarrollaron una

fuerza específica similar a la de fibras de ratones jóvenes, un número significativo de

fibras de ratones viejos desarrolló una fuerza específica menor de 300 kPa.

La relación fuerza-frecuencia fue analizada en cada una de las fibras aplicando

43



Resultados

un tren de pulsos (350 ms duración) a las siguientes frecuencias: 5, 10, 20, 30, 40, 50,

75, 100, 150 y 200 Hz. La Figura 8 muestra la relación fuerza- frecuencia de las fibras

de EDL y soleo. La frecuencia necesaria para alcanzar la fuerza máxima fue menor

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03

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E X

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E CD O

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200

100

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H

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S S S

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EDL

J ME V

SOLEO

Figura 7. Fuerza tetánica máxima específica desarrollada por fibras únicas e intactas de EDL y soleo de diferentes edades. Todas las fibras de EDL y soleo incluidas en este estudio han sido agrupadas de acuerdo con la distribución de la edad de los ratones en joven(J), mediana edad (ME) y viejo (V). Cada punto en el gráfico representa una sola medida de fuerza específica (FE). El asterisco (*) indica diferencias significativas con valores de otras edades del mismo músculo

en las fibras del soleo que en las de EDL. Cuando comparamos la curva fuerza-

frecuencia para cada uno de los tipos de fibras (rápidas o lentas) vemos que fibras de

ratones viejos necesitaron frecuencias de estímulo similares a las de ratones jóvenes

para desarrollar la máxima fuerza (Fig. 8).

44



Resultados

'o' CL

n (D N i _

0) 13 LL

1,0 1

0,8

U,b J

0,4 j

0,2

EDL

J,,,^

• • •

Joven Mediana edad Viejo

- Joven Mediana Edad Viejo

25 50 75 100

SOLEO

1,0

o ü . CL

en ü CD 3 LL

0,8 •

0,6 •

0,4 •

0,2

,.4--í

25 50 75

Frecuencia (Hz)

100

Figura 8. Relación Frecuencia-Fuerza en fibras únicas intactas de los músculos EDL y soleo . Fuerza tetánica (relación (P)/fuerza tetánica máxima (Po)) - frecuencia de fibras de EDL y soleo de ratones jóvenes, de mediana edad y viejos. Las fibras de contracción lenta (soleo) alcanzan máxima fuerza a frecuencias menores que fibras de contracción rápida (EDL). La frecuencia a la que se obtiene la fuerza tetánica máxima se muestra en la Tabla 3. Los datos representan media ± EEM. Los signos (*) y (#) indican diferencias significativas entre fibras de ratones de mediana edad y viejos, respectivamente, y fibras de ratones jóvenes.

4.1.2. Cinética de contracción de fibras de EDL v soleo de ratones jóvenes,

de mediana edad y viejos

máxima- y

El tiempo al pico - definido como el tiempo necesario para desarrollar la fuerza

el tiempo de relajación media -tiempo desde el pico hasta el punto de

45



Resultados

relajación correspondiente a la mitad de la máxima fuerza- se determinaron para las

contracciones aisladas de las fibras de EDL y soleo (Tabla 4). El tiempo al pico fue más

corto en fibras de EDL que de soleo de ratones jóvenes, de mediana edad y viejos.

Este parámetro fue más corto, aunque no significativamente, en fibras de soleo de

ratones de mediana edad comparado con las fibras de ratones jóvenes. El tiempo al

pico medido en fibras de soleo de ratones viejos no fue significativamente diferente del

de fibras de ratones jóvenes y de mediana edad. El tiempo medio de relajación fue

significativamente mas corto en fibras de EDL que de soleo de ratones jóvenes, de

mediana edad y viejos, sin embargo la comparación entre grupos de diferente edad no

mostró ninguna diferencia significativa para EDL o soleo. Esto indica que no se

observaron cambios significativos con la edad en el tiempo de relajación media.

TABLA 4

Cinética de contracción en fibras únicas intactas

EDL SOLEO

JOVEN MEDIANA VIEJO JOVEN MEDIANA VIEJO EDAD EDAD

n=11 n=8 n=25 n=12 n=10 n=7 Tiempo al pico(ms) 33 ±6.1 27 ±1.3 30 ±1.5 96 ± 7.5 + 73 ± 5.8 " 89 ±18 +

Tiempo medio de 62 ±12 60 ± 6.5 66 ± 8.2 130 ±14+ 170 ±18+ 170 ±39 + relajación

íms] Diferencias significativas entre fibras de EDL y soleo de ratones de la misma edad (+). Los valores indican la media ± EEM

46



CAPITULO II:

ÍNDICE DE FATIGA EN FIBRAS MUSCULARES DEL EDL Y SOLEO DE RATONES

JÓVENES Y VIEJOS



Resultados

4.2.1. índice de fatiga en fibras musculares de EDL y soleo de ratones

¿gxynes V viejos

Hemos estudiado el índice de fatiga en la resistencia muscular de fibras de los

músculos EDL y soleo de ratón de distintas edades. El índice de fatiga, definido como

el cociente entre la fuerza máxima desarrollada en la última contracción tetánica y la

primera, se midió usando los protocolos de intervalo corto (IC) y largo (IL). El protocolo

IC produjo más fatiga que el protocolo IL. La figura 9 muestra la secuencia de

contracciones tetánicas en respuesta a los protocolos IL (A) y IC (B) en una célula del

músculo EDL de un ratón joven (5 meses de edad). El índice de fatiga fue de 0.78 y

0.28 para los protocolos IL e IC, respectivamente.

2,5 min

200 kPa

1 mío

Figura 9. Curso temporal de la fatiga en una célula intacta de EDL en respuesta a dos protocolos de estimulación diferentes. Registros típicos de fatiga de una fibra de EDL estimulada con el protocolo de intervalo largo (A) y corto (B) durante 10 y 5 min, respectivamente. Cada contracción tetánica aparece como una barra vertical. La fuerza ha sido normalizada con respecto al área de la sección transversal. El intervalo entre (A) y (B) fue de 5 min. Obsérvese la recuperación completa de la fuerza entre (A) y (B).

48



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5i

5



Resultados

a figura 10 compara los índices de fatiga de fibras de los músculos EDL y soleo con

ambos protocolos de estimulación. Cada punto en el gráfico representa el experimento

de una sola fibra. A excepción de las fibras de EDL de ratones jóvenes, el resto de los

grupos (EDL viejo y soleo joven y viejo) exhibieron un índice de fatiga menor con el

protocolo IL. Las fibras musculares se clasificaron de acuerdo con el índice de fatiga

(Tablas 1 y 2) utilizando dos criterios diferentes previamente establecidos: índice de

fatiga > 1, 0.75-0.99, 0.5-0.74 y < 0.5 (Kadhiresan y cois., 1996) o índice de fatiga: > 1,

0.75-0.99, 0.25-0.74 y < 0.25 (Burke y cois., 1973). Los resultados de ambas

clasificaciones se muestran en las tablas 5 y 6 como primera y segunda clasificación,

respectivamente. Cuando las fibras de EDL y soleo se compararon de acuerdo con

estos criterios no se encontraron diferencias significativas entre fibras de ratones

jóvenes y viejos, en ninguno de los dos músculos.

1.25

_ 100 (O

3 Tí

Oí

a 0,50 -j

0.75

0.25

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E B

EDL Joven

n.1S

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A

A

EDL Viejo

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I

SOL Joven

tet9

O

o

SOL Viejo

n=tí

Figura 10. índice de fatiga registrado en fibras únicas e intactas de EDL y soleo de ratones Jóvenes y viejos. El índice de fatiga se calculó como el cociente entre la fuerza máxima desarrollada en el último y el primer de los estímulos del tren de pulsos. El número total de fibras estudiadas para los protocolos de intervalo corto (+) o intervalo largo (símbolos abiertos) ha sido incluido en la figura. Los asteriscos indican diferencias significativas y n es el número de fibras estudiadas.

51



Resultados

El índice de fatiga no mostró correlación alguna con la fuerza específica

registrada en cada una de las fibras. En concreto, la correlación índice de fatiga-fuerza

específica máxima para células de EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos tuvo

valores r de 0.148, 0.0015, 0.046 y 0.22, respectivamente (P < 0.05).

4.2.2. Curso temporal del índice de fatiga de fibras de EDL y soleo de

ratones jóvenes y viejos

Para determinar si la disminución de fuerza con el tiempo era diferente con la

edad, el índice de fatiga fue medido cada minuto, durante un total de 10 minutos

usando los protocolos IL y IC. La figura 11 muestra el cambio del índice de fatiga con el

tiempo de fibras de EDL (A) y soleo (B) usando el protocolo IL. Es obvio que las células

del músculo soleo se fatigaron menos que las de EDL y que el índice de fatiga en

células de ratones viejos es similar al de células de ratones jóvenes, en ambos

músculos. El curso temporal del índice de fatiga para fibras de EDL (A) y soleo (B)

usando el protocolo IC se muestra en la figura 12. Como puede observarse, el índice

de fatiga producido por el protocolo IC fue marcadamente superior al obtenido con el

protocolo IL (Figs. 1-3). También puede observarse que la resistencia muscular de

fibras de ratones jóvenes y viejos no mostró diferencias significativas. En conclusión,

estos experimentos muestran que ni el cociente entre el primer y último estímulo

tetánico (índice de fatiga) ni la evolución temporal de este difieren en fibras de los

músculos EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos.

52



Resultados

a A

B

0,2

0.0

1.0

^ 0,8 -j bu

<^ 0.6

S 0.4 ía

^ 0.2

0.0

EDL Protocolo de Intervalo largo

O Joven A Viejo

Joven l^jo

2 4 6 8

Soleo Protocolo de Intervalo largo

10

2 4 6 8

Tiempo (min) 10

Figura 11. Evolución temporal del índice de fatiga registrado en fibras únicas intactas de los músculos EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos. índice de fatiga (media ± ESÍVI) registrado cada minuto, como respuesta al protocolo de intervalo largo, en fibras de EDL (A) y soleo (B). No se detectaron diferencias significativas entre fibras de ratones viejos y jóvenes de ninguno de estos dos músculos.

53



Resultados

EDL Protocolo de Intervalo Corto

O Joven A Viejo

Joven Viejo

' " ^ T ^ ^ = -'y = '~- ffl •

B 1,0

^ 0.6 m

ni

0.2

0.0

\ V

Soleo Protocolo de Intervalo Corto

4 L 4- zf—4:3

2 3 4

Tiempo (min)

Figura 12. Evolución temporal del índice de fatiga registrado en fibras únicas intactas de ios músculos EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos. índice de fatiga (media + ESM) registrado cada minuto como respuesta al protocolo de intervalo corto en fibras de EDL (A) y soleo (B). No se detectaron diferencias significativas entre fibras de ratones viejos y jóvenes de ninguno de estos dos músculos.

54



CAPITULO III:

EL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA-I PREVIENE LA

DISMINUCIÓN DE Ca^* INTRACELULAR Y FUERZA ESPECÍFICA EN FIBRAS

ÚNICAS E INTACTAS DE MÚSCULOS DE RATONES TRANSGÉNICOS



Resultados

4.3.1. La expresión de IGF-1 en músculos FDB de ratones transgénícos

Diversos grupos han demostrado que la expresión de hlGF-1 en ratones

transgénicos S1S2 es sostenida (Coleman y cois., 1995; Renganathan y cois., 1998).

El alto nivel de expresión transgénica resulto en concentraciones de IGF-1 en músculo

esquelético de por lo menos 47 la de músculos normales (Coleman y cois., 1995). Sin

embargo, la expresión de IGF-1 en músculos específicos no se conoce. Existen

evidencias de que el nivel de expresión de IGF-1 en animales transgénicos varia de

músculo a músculo (Musaro y cois., 2001). Por todo esto, determinamos la

concentración de hlGF-1 en el músculo FDB y la comparamos con la del EDL (otro

músculo rápido de la pata trasera) de ratones jóvenes y viejos controles y transgénicos.

Las medidas se tomaron en músculos diferentes a los usados en los experimentos de

contracción y fluorescencia. Para hacer estas determinaciones, cuatro o cinco

músculos de dos o tres ratones se utilizaron simultáneamente y los resultados se

normalizaron a la cantidad de proteína muscular. La concentración de hlGF-1 en los

músculos FDB y EDL de ratones jóvenes y viejos normales estuvo por debajo del nivel

de detección. En ratones transgénicos, el valor medio de tres determinaciones de la

concentración de hlGF-1 en ratones jóvenes y viejos fueron, para los músculos FDB:

255 + 18 and 58 ± 4, y en músculos EDL : 250 ± 22 y 144 ± 16 ng (mg proteína) para

los músculos FDB y EDL, respectivamente. En conclusión, la expresión de hlGF-1 en

ratones transgénicos jóvenes es similar en los músculos FDB y EDL y que, en ambos

músculos, disminuye con la edad.

56



Resultados

4.3.2. La fuerza específica de músculo FDB entero de ratones normales y

IGF-1 -transgénicos

La fuerza específica se midió en músculos FDB de ratones jóvenes (n=6) y

viejos (n=10) control y jóvenes (n=8) y viejos (n=8) transgénicos. Ambas fuerzas, de

contracción aislada y tétano, se normalizaron con respecto al área de la sección

transversal (AST) de la fibra. Los valores de fuerza especifica tetánica registrados en

estos experimentos son similares a los descritos previamente para los músculos EDL y

cuadríceps (Fitts y cois., 1984) (Eddinger y cois., 1986), pero inferiores a los referidos

para los músculos EDL y soleo (Brooks y cois., 1988, Barton-Davis y cois., 1998). Una

posible explicación podría ser que un número significativo de fibras no desarrolla la

fuerza máxima debido a la compleja orientación e inserción del tendón del músculo

FDB.

C5

160

140

120

J 100 S 80 'é 60 es N 40

É 20 ^

o

Contracción aislada Tétano

1 Jo\'en Joven Viejo Viejo

üansgéiüco taansgénico

Figura 13. Fuerza específica máxima de músculos FDB de ratones controles e IGF-1-transgénicos jóvenes y viejos. La fuerza de contracción tetánica disminuyó significativamente en músculos de ratones viejos control comparado con ratones jóvenes control e IGF-1 jóvenes y viejos transgénicos (P<0.05). No se detectaron diferencias significativas entre jóvenes control o transgénicos y viejos transgénicos. La fuerza específica de contracción aislada no fue significativamente diferente entre grupos. *, significativamente diferente. Los valores representan la media + E.S.M.

57



Resultados

FDB. La figura 13 muestra los valores correspondientes a estos cuatro grupos

experimentales. La fuerza específica de la contracción aislada en músculos FDB no

mostró diferencias significativas entre los cuatro grupos. La fuerza específica tetánica

disminuyó significativamente en los ratones viejos (92 ± 6 kPa) comparada con la de

ratones jóvenes control (135 ± 17 kPa) y transgénicos (126 ± 8 kPa) (P < 0.05). El

porcentaje de disminución de fuerza específica con la edad fue del 32 % y es

consistente con el de publicaciones previas en músculo rápido EDL de ratones y ratas

(ver debajo). Los valores de fuerza especifica obtenidos para ratones jóvenes control y

transgénicos no fueron significativamente distintos. La fuerza específica registrada en

ratones viejos transgénicos (114 ± 7 kPa) no fue significativamente distinta a la

registrada en ratones jóvenes control o transgénicos, pero fue significativamente mayor

que la registrada en ratones viejos control. Estos resultados indican que la expresión

transgénica de IGF-1 en músculo esquelético previene la disminución de la fuerza

específica máxima del músculo entero que ocurre con el envejecimiento.

Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado que el pico intracelular

de Ca "" disminuye en fibras musculares de ratones viejos medido con la técnica de

fijación de voltaje (Wang y cois., 2000). Para examinar si la edad y/o el IGF-1 modifican

el pico intracelular de [Ca ""]; en fibras contráctiles, registramos simultáneamente la

contracción y la concentración de Ca "" intracelular en fibras únicas intactas del músculo

FDB de ratones jóvenes y viejos controles e IGF-1-transgénicos.

4.3.3. Área de la sección transversal v fuerza especifica máxima registrada

en células únicas intactas del músculo FDB

El análisis del área de la sección transversal de las fibras del músculo FDB

58



Resultados

mostró la existencia de atrofia con el envejecimiento, proceso que fue prevenido con la

expresión transgénica de IGF-1. El diámetro y el AST de las fibras de ratones viejos

control fue: 23 ± 0.9 ^m y 436 ± 55 )Lim , respectivamente (n = 20). Estos valores fueron

significativamente menores que los registrados en fibras de ratones jóvenes control ( 29

+ 1.2 y 671 ± 41 i m , n = 17), jóvenes transgénicos ( 36 ± 2.3 y 1054 fam , n= 9) y

viejos transgénicos (31 ± 1.8 ^m y 781 ± 82 |u.m , n= 14). También, el diámetro y el AST

de las fibras de ratones transgénicos jóvenes fueron significativamente mayores

comparados con los de ratones jóvenes control, pero no los valores de ratones viejos

transgénicos.

La curva frecuencia-fuerza fue representada con los datos de la fuerza

desarrollada a diferentes frecuencias, de menor a mayor. La curva frecuencia-fuerza se

registró para la mayoría de las fibras usando trenes de 350 ms de duración y frecuencia

variable. Esta curva nos permitió encontrar la frecuencia a la que se alcanzó la fuerza

máxima de cada fibra. La secuencia de frecuencias utilizadas fue 5, 10, 20, 50, 75 y

100 Hz. La estimulación de la fibras se interrumpió cuando la fuerza específica

desarrollada a dos frecuencias consecutivas fue la misma. La mayoría de las fibras

alcanzó la fuerza máxima a 75 o 100 Hz. En algunos casos se necesitó una

estimulación mas prolongada (400 ms) para alcanzar la fuerza máxima. La figura 14A

muestra la curva fuerza-frecuencia de fibras de FDB de ratones jóvenes y viejos,

controles y transgénicos. Los valores se han normalizado a la fuerza máxima de cada

célula. No se encontraron diferencias significativas en la fuerza específica de la

contracción aislada entre los cuatro grupos experimentales. Estos resultados indican

que ni la edad ni la expresión de IGF-1 ejercen un efecto significativo en la frecuencia

necesaria para desarrollar la fuerza máxima. La figura 15 muestra registros

representativos de la fuerza de contracción aislada (Aa) y tetánica (Ba) de fibras únicas

de FDB. La fuerza especifica de la contracción aislada no se modificó

59



Resultados

significativamente con la edad o la expresión transgénica de IGF-1; sin embargo, la

disminución de la fuerza específica máxima tetánica registrada en fibras de ratones

viejos control no se observó en ratones viejos transgénicos. La figura 16A compara la

A

o

e

o fe

+

U

1.0

'S 0.8

0.6

0.4

0.2

1,0

Joven Joven Tg Viejo Viejo Tg Joven Joven Tg Viejo Viejo Tg

20 40 60 80 100

- I 0.8

0.6 T / ;

0,4

0,2

i

20 40 60 80

Frecuencia (Hz)

100

Figura 14. Relación fuerza-frecuencia y [Ca *]i-frecuencia en células únicas intactas de músculos FDB de ratones controles e IGF-1 transgénicos, Jóvenes y viejos. La fuerza (A) y concentración mioplásmica de Ca "" (B) han sido normalizados por el valor máximo de cada fibra. Los datos representan la media ± E.S.M. Los resultados han sido ajustados a una función exponencial simple. No existen diferencias significativas entre los diferentes grupos.

60



Resultados

Joven Joven transgénico

Viejo

^JV_

Viejo transgénico

Figura 15. Registros de fuerza de contracción y [Ca^ ]¡ en fibras únicas intactas de músculo FDB. Registros representativos de fuerza generada y [Ca ""]! de contracción aislada (A) y tétano (fí). Los trazados en a y ib corresponden a la contracción y transitorio de [Ca ""]!, respectivamente, registrados en la misma fibra única intacta de FDB en ratones jóvenes y viejos controles y transgénicos. Ambos parámetros, la fuerza específica máxima y el pico de la [Ca ""]! fueron significativamente menores en ratones viejos control que en ratones jóvenes control o ratones transgénicos jóvenes y viejos. La fuerza, expresada en kilopascales (kPa), se ha normalizado con respecto al área de sección transversal de la fibra. La [Ca ""]! está expresada en valores absolutos, como se ha explicado en IVIateriales y Métodos. Los registros de contracción y [Ca ^ ji se han representado en la misma escala temporal. La línea discontinua indica los valores de fuerza y [Ca^ ji en reposo.

fuerza específica de contracción aislada y tétano registrada en ratones jóvenes control,

jóvenes transgénicos, viejos control y transgénicos. Hubo una diferencia significativa en

la fuerza específica máxima registrada en fibras de ratones viejos con respecto a la de

ratones jóvenes control y jóvenes y viejos transgénicos. La fuerza específica máxima

registrada en fibras de ratones jóvenes control, jóvenes transgénicos, viejos control y

viejos transgénicos fue: 455 ± 28 (n = 14), 423 ± 43 (n = 11), 286 + 22 (n = 13) y 385 ±

61



Resultados

15 kPa (n =9), respectivamente (P < 0.05). Los valores obtenidos para los grupos

jóvenes control y jóvenes y viejos

f^

B S- 2,0

+

o

>

1.5

•« 1.0 o

I tí

0,5

0.0

• • • • Contiacción ai,slada I : ::J Tétano

ouu -

400

300

100

n

J -] _ í t

j.lilJU

lili Joven Joven Viejo Viejo

tian.s£émco ti an-sgénico

Figura 16. Fuerza específica máxima y pico de [Ca^ ]¡ inducidos por la contracción aislada y tétano de fibras únicas intactas del músculo FDB de ratones control e IGF-1-transgénícos, jóvenes y viejos,. A, la fuerza de la contracción tetánica disminuyó significativamente en células de ratones viejos control, comparada con la de jóvenes control y transgénico y viejo transgénico. No se detectaron diferencias significativas en la fuerza específica de contracción aislada entre los cuatro grupos. B, concentración máxima de [Ca ""], registrada en respuesta a pulsos aislado y tetánico en fibras intactas de FDB. #, Indica diferencias significativas entre el grupo viejo control y los otros tres grupos. No se encontraron diferencias significativas entre los grupos joven control, joven transgénico y viejo transgénico.

transgénicos no fueron significativamente diferentes (P > 0.05). Para determinar si la

población de fibras analizadas de ratones jóvenes y viejos, controles y transgénicos era

62



Resultados

diferente, analizamos la velocidad de generación de fuerza (dP/df) normalizada por la

fuerza máxima, el tiempo al pico y el tiempo medio de relajación de la contracción

aislada (Tabla 7). El análisis estadístico no mostró ninguna diferencia significativa entre

los cuatro grupos para ninguno de los tres parámetros medidos. Para determinar el

fenotipo de las fibras estudiadas, investigamos la expresión de cadena pesada de

miosina (CPM) (ver debajo).

Tabla Vil

Cinética del Ca ^ intracelular y la contracción twitch en fibras únicas e

intactas del músculo FOB

Joven Joven Viejo Viejo control transgénico control transgénico

dP/dt(ms-') Normalizado

Tiempo al pico (ms)

Tiempo de relajación

media (ms)

dCa^Vdt (pM/ms)

0.035 ± 0.004

38 ±2

68 ± 6

0.05 ±0.01

0.033 ± 0.004

43 ± 1

71 ± 5

0.06 ± 0.01

0.038 ± 0.007

45 ± 3

87 ± 7

0.06 ±0.01

0.037 ± 0.006

42 ± 4.5

81 ±11

0.07 ± 0.02

Los valores se han expresado como la media ± EEM de 14-17 fibras por grupo. El análisis estadístico entre grupos no mostró diferencias significativas (P > 0.05). dP/dt es la velocidad de desarrollo de fuerza y se ha normalizado a la fuerza de contracción aislada. dCa^Vdt es la velocidad de liberación de Ca "".

63



Resultados

4.3.4. Valores máximos de fCa ""!! en fibras únicas intactas del músculo

FPB

Los incrementos transitorios de la [Ca^ ]¡ se midieron simultáneamente con la

contracción usando el indicador de Ca "" fluorescente fluo 3-AM. La figura 15Ab y Bb

muestra transitorios de Ca "" intracelular en respuesta a estimulaciones breves y

prolongadas, respectivamente, en fibras intactas de músculo FDB de ratones jóvenes y

viejos control y transgénicos. Los valores pico de la [Ca^""]! registrada en ratones

transgénicos viejos no fue significativamente diferente a la registrada en ratones

jóvenes y viejos control y jóvenes transgénicos en respuesta a estimulaciones aisladas.

El valor de pico de la [Ca^^Ji fue significativamente menor en fibras de ratones viejos

control comparado con ratones jóvenes control y transgénicos, en respuesta a

estimulaciones prolongadas (tétano), y que esta disminución se pudo prevenir con la

expresión transgénica de IGF-1.

Para determinar si la edad y/o IGF-1 modifican la curva frecuencia-íCa^""], ,se

midió la [Ca^""]! en respuesta a diferentes frecuencias de estimulación en fibras de FDB

de ratones jóvenes y viejos, controles y transgénicos (Fig. 28). Los valores de [Ca^^Ji

son inferiores al 100% porque la concentración de Ca " ha sido normalizada por el

valor máximo alcanzado en cada fibra, que no siempre se obtuvo a 100Hz (en algunas

células se alcanzó a 75 Hz). Los valores normalizados de [Ca^*] no mostraron

diferencias en la frecuencia de estímulo necesaria para alcanzar el pico intracelular de

Ca^* para ninguno de los grupos experimentales, en correspondencia con la curva

frecuencia-fuerza mostrada en la figura 14A. No se detectaron diferencias significativas

en los valores de pico de [Ca^*]; de fibras de ratones jóvenes control y transgénicos en

respuesta a la estimulación tetánica (Fig. 43). Sin embargo, los valores obtenidos en

64



Resultados

fibras de ratones viejos controles en respuesta a la estimulación tetánica fueron

significativamente menores que los registrados en los otros tres grupos. Entre los

grupos joven control y transgénico y viejo transgénico no se encontraron diferencias

significativas en este parámetro (P>0.05). Los valores de pico intracelular de [Ca^*]¡ en

respuesta a un estímulo prolongado fueron 1.47 ± 0.15, 1.70 ± 0.29, 0.97 ± 0.13 y 1.7 ±

0.22 |a.M, para fibras de ratón joven control, joven transgénico, viejo control y viejo

transgénico, respectivamente. Los valores de los transitorios de [Ca^*]¡ evocados por

una a estimulación aislada fueron: 0.50 ± 0.04, 0.54 ± 0.07, 0.38 ± 0.06 y 0.57 + 0.07

laM, para fibras de ratón joven control, joven transgénico, viejo control y viejo

transgénico, respectivamente. Estos valores no son significativamente diferentes. La

velocidad de cambio de la [Ca^^Ji fue calculada en experimentos individuales como la

primera derivada de la señal del transitorio de Ca^* en respuesta a una estimulación

aislada. Este parámetro, d[Ca^*]i, representa la liberación de Ca "" del RS por pulsos

breves (Melzer y cois., 1987). La velocidad de aumento en [Ca^""]! (díCa^""]! /dt) no fue

significativamente diferente entre los cuatro grupos (P > 0.05, Tabla 7). La velocidad

de disminución de [Ca^^Ji no se midió debido a la cinética lenta de la disociación del

complejo fluo 3-03 "*".

4.3,5. Efecto de la cafeína en la disminución de la fuerza específica y en el

pico de rCa^ liCon el envejecimiento

La figura 17A muestra el efecto potenciador de la cafeína sobre la fuerza

tetánica máxima de fibras de ratones jóvenes control (n = 8), jóvenes transgénicos (n =

8), viejos control (n = 15) y viejos transgénico (n = 7). La fuerza especifica máxima y los

valores de pico de [Ca^""]! fueron medidos simultáneamente en 7-8 fibras. La diferencia

65



Resultados

en el número de experimentos refleja la inclusión en los análisis de fibras en las que

sólo uno de los dos parámetros fue medido, o la exclusión de aquellas en las que la

medida no fue precisa debido a razones técnicas. La potenciación inducida por cafeína

es consistente con el aumento de liberación de Ca "" inducido por ella, en células únicas

observado con la técnica de fijación de voltaje (Delbono y cois., 1995). Los valores de

fuerza específica obtenidos en fibras de ratones jóvenes y viejos control expuestas a

cafeína fue significativamente diferente (P < 0.05).

, _ K

w (J

a> P<

« y a>

| i (

700 1

600

500

400 •

3ÜÜ

200 •

100

D

B

a

3.0

2.5

2.0

^ 1.5

I -° S 0.5

« 0.0

Contiol Cafeína

Joven Joven Viejo Viejo

tianssémco tiansgéiuco

Figura 17. Efecto de la cafeína en la fuerza específica máxima y en la [Ca ]¡ de fibras únicas intactas de ratones controles y transgénicos, jóvenes y viejos. La fuerza específica (A) y el pico de Y^^^\ (B) antes y después de la aplicación de cafeína 5 mM (efecto máximo tras 30 min de incubación). * y # , indican diferencias significativas en el mismo grupo antes y después de cafeína y entre ratones viejos control y el resto de los grupos antes de cafeína, respectivamente. **, indica diferencias significativas entre fibras de ratones jóvenes y viejos tratados con cafeína.

66



Resultados

Sin embargo, no se detectaron diferencias significativas en las fibras de ratones

jóvenes antes de la exposición a cafeína y las fibras de ratones viejos después del

tratamiento con cafeína. Además, no se encontraron diferencias significativas entre

fibras de los grupos joven control y transgénico y viejo transgénico después de la

exposición a cafeína. En resumen, estos resultados muestran que la cafeína puede

restaurar la fuerza especifica de células de FDB de ratones viejos al nivel de las fibras

de ratones jóvenes antes de la exposición a cafeína; sin embargo, persiste un deficit

cuando las fibras de ambos grupos son comparadas después del tratamiento con

cafeína.

La relación fuerza-frecuencia de fibras de ratones jóvenes y viejos, control y

transgénicos alcanzó la meseta durante el tétano, lo que sugiere que se alcanzó la

activación máxima. Para determinar si una disminución de la liberación de Ca "" es la

causa responsable de la pérdida de fuerza observada en células de ratones viejos, se

estudió el efecto de la cafeína sobre los valores máximos de [Ca^*]i . La figura 17B

representa el efecto de la cafeína sobre la [Ca^""]!, medido en fibras únicas intactas de

FDB de ratones jóvenes control (n = 9), jóvenes transgénicos (n = 7), viejos control (n =

8) y viejos transgénico (n = 7). El efecto máximo de la cafeína se obtuvo siempre en los

primeros 30 minutos. Como se puede observar, la cafeína aumentó significativamente

los valores de pico de [Ca^""]! en los cuatro grupos experimentales, aunque el efecto

fue más notorio en fibras de ratones viejos control que en el resto de los grupos. Las

diferencias no fueron estadísticamente significativas.

4.3.6. Tipo de fibras que componen el músculo FDB a distintas edades en

ratones control y transgénicos (IGF-1)

Para determinar si la disminución de fuerza específica registrada en músculo

67



Resultados

entero y fibras únicas de FDB está causada por cambios en la composición del tipo de

fibra, se analizó la composición de la cadena pesada de miosina (CPM), usando la

técnica de inmunohistoquímica descrita anteriormente (ver Material y Métodos). La

figura 18 muestra secciones discontinuas en serie del músculo FDB analizado

mediante inmunohistoquímica con anticuerpos en contra de los tipos de fibra I, lia y lib.

Esta técnica nos permitió cuantificar el porcentaje relativo de los subtipos de fibra en el

músculo FDB. La tabla 8 muestra el análisis estadístico de la caracterización del tipo de

fibra de 4-5 músculos de los usados para los experimentos de contracción

Jo\'en Jo"ven

ti í»ii?; fféiüí o ^ lej o tiniis^éiuío

Tipo I

Tipo n b

Tipo Ha

Figura 18. Composición del músculo FDB en tipo de fibras con la edad y la expresión transgénica de IGF-1. Secciones en serie representativas de músculos FDB marcados inmunohistoquímicamente con los anticuerpos de fibras de tipo I, lia, lib de ratones jóvenes y viejos control y IGF-1-transgénicos. La cuantificación de los porcentajes relativo de cada tipo de fibras se muestra en la Tabla 8.

en este trabajo. El número total de fibras por músculo no fue significativamente

diferente entre los grupos, por lo que la determinación de la proporción relativa de

subtipos de fibras fue hecha en base a un número comparable, independientemente de

la edad o el genotipo considerado. Las fibras que expresan CPM del tipo lib no se

detectaron en ninguno de los cuatro grupos. La isoforma o tipo de MHC predominante

68



Resultados

fue la llx seguida de lia y I. El análisis estadístico no mostró diferencias significativas

entre los grupos, lo que sugiere que la disminución de fuerza específica y [Ca ""]]

descritos anteriormente no son el resultado de cambios en el tipo de fibra muscular.

Tabla VIII

Composición del tipo de fibra del músculo FDB

Número de fibras/músculo

1

lia

lib

llx

Joven control

209 ±16

17.0 ±3.9

12.5 ±2.9

0

70.5 ±4.2

Joven transgénico

199 ±10

16.3 ±3.2

14.2 ±3.6

0

69.5 ± 6.5

Viejo control

210±19

12.7 ±1.8

11.5 ±0.7

0

75.8 ±1.1

Viejo transgénico

208 ± 11

17.6 ±0.25

9.2 ±1.3

73.2 ±1.2

La composición del tipo de fibra en el músculo FDB se ha estudiado por inmunohistoquímica. Los valores (media ± EEM), de 4-5 músculos por grupo, se han expresado como porcentaje del número total de fibras por músculo. El análisis estadístico entre grupos no mostró diferencias significativas (P > 0.05)

69



CAPITULO IV:

EVENTOS ELEMENTALES DE LIBERACIÓN DE Ca^\ " CHISPAS" Y "ASCUAS",

EN FIBRAS DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RA TONES VIEJOS



Resultados

RESULTADOS

En este estudio hemos investigado si el envejecimiento produce cambios en la

frecuencia, cinética y/o morfología de un gran número de EELC registrados en fibras

peladas químicamente de músculo EDL de ratones jóvenes y viejos. Para ello, hemos

registrado EELC en los modos x-y y escan de línea, hemos analizado la composición

de CPM de las fibras utilizadas en los registros de fluorescencia, y hemos analizado la

expresión de RyR1 y RyR3 en músculo EDL con immunoblots. Además, hemos

investigado la influencia de la función mitocondrial en la generación de EELC en fibras

de EDL de ratones jóvenes y viejos.

.2+ 4.4.1. Eventos de liberación de Ca en imágenes XY y de escan de línea

Para analizar los EELC en el modo x-y hemos escaneado sistemáticamente varios

lugares (3-5 de acuerdo con la longitud de la fibra) de fibras de EDL orientadas

paralelamente a la dirección de escaneo x, y hemos registrado series de 50 imágenes

con un intervalo de 1.2 o 3.2 s por imagen. La figura 1A y B muestra imágenes x-y

registradas en fibras de EDL de un ratón joven y viejo, respectivamente, adquiridas en

una secuencia de 50 imágenes a intervalo de 3.2 s por imagen. Se detectó un menor

número de eventos en fibras de ratones viejos comparados con ratones jóvenes (ver

debajo para los estadísticos). También estudiamos fibras de EDL de grupos de la

misma edad en el modo de escan de línea. Las fibras se escanearon a lo largo de todo

el diámetro, a intervalos de 20 píxeles.

71



Resultados

JOVíl l Vifjo

Figura 19. Chispas y "ascuas" de Ca " espontáneas de fibras permeabilizadas químicamente de EDL de ratones jóvenes y viejos. Ay B corresponden a imágenes XY de fluorescencia normalizada de una serie xyt de 50 imágenes (intervalo 3.2 s), que muestran chispas de Ca " de un ratón joven y uno viejo, respectivamente. C y D ilustran eventos representativos de liberación de Ca "" (resolución de escan de 2 ms/línea) en una imagen xí y el curso temporal correspondiente de fluorescencia. E y F muestran estelas (DTMM > 30 ms) registradas en el modo xt. La barra de calibración AF/Fo indica 1 para todos los eventos excepto para el evento de la fila superior del panel C, donde AF/Fo es 2.

La figura 19C y D nnuestra imágenes de AF/Fo de fluorescencia, y el correspondiente

curso temporal de las chispas de Ca^"" registradas en las imágenes de escan de línea

en una fibra de ratón viejo y joven. Los eventos denominados "ascuas", definidos como

aquellos que muestran una DTMM > 30 ms (Chun y cois, 2003) también en se

observaron en fibras de ratones de ambas edades. La figura 19 E y F muestra

imágenes de escan de línea representativas y el curso temporal de la intensidad

72



Resultados

fluorescente de Ca " registrado en el centro del evento, en ratones jóvenes y viejos,

respectivamente.

El número total de eventos (EELC) analizado fue de 455 y 587 en el modo x-y y

64 y 49 en el modo de escan de línea en 14 y 22 fibras de EDL de ratones jóvenes y

viejos, respectivamente. El número tan bajo de eventos caracterizados en el modo de

escan de línea se debe a la escasa ocurrencia de eventos y, por tanto, a la baja

probabilidad de poner la línea de escan a través de un evento antes de que ocurra

(Chun y cois., 2003).

4.4.2. Efecto de los moduladores de RyRs en la frecuencia de las chispas

de Ca^*

Para definir la fuente de los EELC en nuestra preparación y en las condiciones

de nuestros registros, hemos analizado los efectos de agentes farmacológicos bien

caracterizados, como la rianodina, imperatoxina-A y cafeína, en la frecuencia de los

EELC en series xyt. Rianodina e imperatoxina-A inducen estados de subconductancia

prolongada de los RyR (Rousseau y cois, 1987; Tripathy y cois, 1998). La figura 20A

ilustra imágenes de dos fibras musculares de ratón joven (arriba) y viejo (debajo)

mostrando un aumento significativo de la frecuencia de EELC (panel del medio)

después de la aplicación de rianodina 500 nM. El aumento de frecuencia fue de 11, 9 y

13.5 veces con respecto al control en tres fibras de ratones jóvenes y 11 y 4 veces en

dos fibras de ratones viejos. Registramos el aumento máximo en la frecuencia entre 5-

30 segundos después de la aplicación de rianodina (Fig. 2A, b). El típico efecto dual de

la rianodina sobre el RyR se manifestó entre 30-60 s después de la aplicación (fig. 2A,

c), cuando toda la actividad de los RyR fue completamente bloqueada en cada una de

73



Resultados

J o \ e i i

C'oiihol Kiiiuodiitii í5-50s)

B

Rimt04liiiii yiQ-6Qff)

O 2

•i \r/F

Jo\ei i

YUjo

(•'oiiliol Iinpernroxiiiii-A íLOs-4 iniíi)

Jo'veii

Mejo

C'oiifiol Cirfeüiii (5-60fi)

Figura 20. Efecto de la rianodina (500 nM), Imperatoxina-A (20 nM) y cafeína (0.5 mM) en la frecuencia de las chispas de Ca^*. Efecto de 500 nM de rianodina (A), 20 nM de Imperatoxina-A (6) y 0.5 mM de cafeína (C) en la frecuencia de los EELC. Se observó un aumento significativo en la frecuencia de eventos en fibras de ratones jóvenes y viejos con los tres fármacos. La actividad de las chispas desapareció completamente después de 20-40 s de la aplicación de rianodina en todas las células registradas {A.c). Las imágenes representan un área de 45 x 23 ^m.

74



Resultados

las células registradas. La figura 20B Ilustra fibras representativas de un ratón joven y

otro viejo en las que la frecuencia de los EELC aumento en respuesta a la aplicación de

imperatoxina-A 20 nM. El aumento en la frecuencia después de la aplicación de

imperatoxJna-A 20 nM fue de 22, 2 y 3 veces, con respecto al control, en tres fibras de

ratones jóvenes y de 11.5 y 4 en 2 fibras de ratones viejos. Estos datos indican que los

RyRs median la generación de los EELC en nuestra preparación. En algunas otras

células de ambos grupos, joven y viejo, observamos una liberación de Ca^* masiva,

demostrada por el aumento repentino de la fluorescencia global después de la

aplicación de rianodina 500 nM o imperatoxina-A 20 nM. De forma similar, cafeína 0.5

mM aumento la frecuencia de los eventos en 3.6 y 3.5 veces, con respecto al control,

en dos fibras de ratones jóvenes y en 4, 2.3, 3.5 y 10 veces en dos fibras de ratones

viejos. Concentraciones de cafeína de 1 mM o mayores indujeron una aumento de la

fluorescencia global que no permitió la identificación de los EELC en fibras de ratones

jóvenes y viejos.

4.4.3. Propiedades de los EELC identificados en imágenes X-Y o de escan

de línea en fibras de ratones [óvenes y viejos

El análisis de la amplitud y AMM de los ELLC, en el modo x-y y de los eventos

que duraron menos de 30 ms en el modo de escan de línea, están incluidos en la figura

21 y la tabla 9. La figura 21 muestra los histogramas de la distribución de la amplitud y

AMM de todos los eventos registrados en imágenes x-y en fibras de ratones jóvenes y

viejos. La amplitud (media y DS) en fibras de ratones jóvenes fue de 1.2 ± 0.9 y 1.0 ±

0.5 en fibras de ratones viejos (Tabla 9). Se puede observar en la distribución de los

valores de amplitud un rango más amplio en el grupo joven comparado con el grupo

75



Resultados

Tabla IX

Propiedades espaciales de las chispas de Ca ^ identificadas en imágenes XY y

escan de línea

Amplitud AMM (AF/Fo) (Mm)

DMM Tiempo de Velocidad de (ms) ascenso ascenso

10%-Pico (ms"") íms)

N

Imágenes de escan de línea

Joven 1.2 ±0.9 1.8 ±1.2 18 ±7 15±7 0.14±0.11 30

Viejo 1.0 ±0.6 1.6 ±0.7 19 ±6 23 ±10* 0.07 ± 0.04* 19

Amplitud AMM (AF/Fo) (pm)

DMM Tiempo de Velocidad de (ms) ascenso ascenso

10%-Pico (ms"") (ms)

Imágenes XY

N

Joven 1.2 ±0.9 1.6 ±0.8 455

Viejo 1.0 ±0.5* 1.7 ±0.7 587

Eventos de DMM < 30 ms. Los parámetros se han definido en la sección de Material y Métodos. Los valores expresan la media ± DE, siendo N el número de eventos. El asterisco indica diferencias significativamente diferentes (P <0.05).

viejo. El rango de valores fue de 0.20-6.74 AF/Fo y una mediana de 1.0 AF/Fo y de

0.24-3.39 AF/Fo y con una mediana de 0.88 AF/Fo para jóvenes y viejos,

respectivamente. Aunque las fibras de ratones viejos exhibieron un mayor número de

eventos centrados en 0.9 AF/Fo comparado con los de ratones jóvenes, estas últimas

76



Resultados

tuvieron mas EELC en ambos lados del espectro de amplitud. El análisis estadístico de

estos resultados mostró una diferencia significativa entre fibras de ratones jóvenes y

viejos (P< 0.01).

Joven Viejo

160 1

140

120 •

100 •

80 •

60 -

40

20

O Ittn 0.3 0.9 1.5 2.1 2-7

Amplitud (ATTo)

160 1

c >

uu

E

3.3 3.9

0.5 1.1 1.7 2.3 2.9

ATIMM (íun) 3.5 4.1

IbU •

140

120

100 •

80 •

60 •

40 •

20

T~

r-

r 0.3 0.9

- 1

1 rTT—»—ta. _

1.5 2.1 2 7 3 3 3.9

Amplitud (AT To)

160 1 ___

140 •

120 •

100 T

80 H

60 '

40 -

20 -

—1

"h^ 0.5 11 1.7 2.3 2.9 3.5 4 1

ATM M (pm)

Figura 21. Distribución de amplitudes AF/Fo y AlVIlVI de las chispas de Ca ^ identificadas en imágenes xy de fibras musculares de EDL de ratones jóvenes y viejos. Los histogramas incluyen tocios los eventos de las imágenes xy de la tabla 9.

Los valores de AMM fueron: 1.6 ± 0.8 y 1.7 ± 0.7 jxm para fibras de ratones jóvenes y

viejos, respectivamente (Tabla 9). El rango de los valores de AMM fue de 0.38-7.7 ¡am

77



Resultados

I mediana 1.57 i m, y de 0.54-6.2 nm y mediana 1.60 ^im, para el grupo joven y viejo,

espectivamente. No se detectaron diferencias significativas entres fibras de ratones

jóvenes y viejos en este parámetro.

En la modalidad de escan de línea se registraron 64 y 49 eventos en fibras de

ratones jóvenes y viejos, respectivamente. De estos, 30 y 19 EELC exhibieron una

duración de < 30 ms, en viejos y jóvenes, respectivamente, y se consideraron, por ello,

chispas de Ca " . La amplitud y cinética de los eventos considerados como "ascuas" se

describen en el próximo apartado. La amplitud y la AMM, medidas en los EELC

registrados en el modo de escan de línea, no fueron significativamente diferentes a los

registrados en imágenes x-y (Tabla 9). Aunque la amplitud de las chispas de Ca ""

medidas en el modo escan de línea fue menor en el grupo viejo comparado con el

joven, la diferencia no fue significativa. Esto se debe probablemente al bajo número de

eventos, comparado con los analizados para AF/Fo en imágenes x-y, que no permitió

una potencia suficiente para el análisis estadístico. También se midió la DMM, el

tiempo de ascenso (10%-pico) y la velocidad de ascenso en los eventos de escan de

línea. Los valores de DMM para fibras de ratones jóvenes y viejos fue: 18 ± 7 ms

(rango de 5-28) y 19 + 6 ms (rango de 10-30), respectivamente. El tiempo de ascenso

fue de 15 + 7 (rango 5-28 ms) y 23 ± 10 (7-40 ms), para fibras de ratones jóvenes y

viejos, respectivamente (P < 0.05). Las

medidas de la velocidad de elevación fueron de (en ms"^): 0.14 ± 0.11 (rango 0.04-0.4)

y 0.07 ± 0.04 (rango: 0.03-0.14), respectivamente (Tabla 9), la diferencia entre los dos

grupos en este parámetro también fue significativamente diferente (P < 0.05). En

resumen, las chispas registradas en fibras de EDL de ratones jóvenes y viejos

exhibieron diferencias significativas en amplitud, tiempo de elevación y velocidad de

elevación, pero no en el resto de parámetros.

78



Resultados

En general, fibras de EDL de ratones jóvenes y viejos exliiben niveles muy bajos

Je EELC espontáneos. Para el análisis de la frecuencia, se incluyeron en los

estadísticos todos los experimentos de fibras que exhibieron alguna actividad

espontánea (n= 14, jóvenes y n=22, viejos). Adicionalmente, se estudiaron 6 y 8 fibras

de ratones jóvenes y

0.25 1

-C 0.20 -• I

.5S 0.15 -

r ^ fe SI > fe

0.10 -

0.05 -

0.00 Joven Viejo

Figura 22. La frecuencia de los eventos espontáneos de liberación de Ca ^ disminuye con la edad. La frecuencia de los eventos de Ca * se calculó como el número de eventos normalizados por el tiempo y el área de la fibra. El asterisco indica diferencias significativas (P < 0.05). Catorce y 22 fibras de EDL de ratones jóvenes y viejos, respectivamente, fueron incluidas en los cálculos de los EELC.

viejos, respectivamente, que no exhibieron actividad de chispas de Ca " , pero que

exhibieron un aumento difuso de fluorescencia basal en respuesta a la perfusión de

cafeína 1 mM. Este aumento global de Ca^* sugiere que estas fibras eran viables

aunque no manifestaran actividad en forma de chispas de Ca^*. Para calcular y

expresar la frecuencia de las chispas de Ca "" se han utilizado varios métodos en la

literatura (ver debajo). En este estudio, hemos normalizado los EELC con respecto al

79



Resultados

espacio (área de la fibra, en nm^) y tiempo (s). Como media, se detecto sólo un evento

cada cinco o diez imágenes en el modo de adquisición x-y, en fibras de ratones jóvenes

y viejos, respectivamente. La frecuencia de EELC de todas las fibras de ratones viejos

y jóvenes analizadas fue (media ± DE, ESM): 0.17 + 0.17 (0.02) chispas/(s*10Vm^) y

0.10 ± 0.10 (0.01) (rango: 0.01 a 0.57) para el grupo joven y viejo, respectivamente (ver

debajo). El tiempo total de registro en fibras de ratones jóvenes y viejos fue de 142 y

243 min, respectivamente. La figura 22 muestra la media y el ES de los eventos

registrados en fibras de ratones jóvenes y viejos.

También se calculo la frecuencia como eventos / imagen para comparar

nuestros resultados con publicaciones previas. Registros en fibras de ratones viejos

exhibieron una frecuencia de 0.12 + 0.12 (media ± DE) rango: 0.02-0.73;

aproximadamente 1 chispa/8 imágenes) que es significativamente menor que en fibras

de EDL de ratones de 14 días de edad (P14) (1 chispa / imagen) (Chun y cois., 2003) y

en fibras de ratones jóvenes registradas en este trabajo (0.19 ± 0.19; rango 0.02 -1.14,

aproximadamente 1 chispa/5 imágenes). En conclusión, las fibras de EDL de ratones

viejos exhibieron una frecuencia de EELC menor que la de ratones jóvenes, diferencia

que fue estadísticamente significativa (P < 0.05).

4.4.4. Eventos tipo "ascua" en imágenes de escan de línea en fibras de EDL

de ratones jóvenes v viejos

La figura 19E y F ilustra eventos de tipo "ascua", de duraciones de 148 ms y 83

ms para el grupo joven y viejo, respectivamente. Las "ascuas" constituyeron 53 y 61 %

del número total de eventos registrados en células de ratones jóvenes y viejos,

respectivamente, en imágenes de escan de línea. El análisis de la amplitud, AMM,

80



Resultados

DMMyelt iempo de elevación de estos eventos se presenta en la Tabla 10. La

Tabla X

Propiedades espaciales de los eventos tipo "ascua" de Ca^^ identificados en imágenes de escan de línea

Amplitud ATMM DTMM Tiempo de N ascenso

(AF/Fo) (pm) (ms) 10%-Pico (ms)

Joven 1.04 ±0.59 1.95 ±0.63 83 ± 62 49 ± 66 34

Viejo 0.77 ±0.50* 2.05 ± 0.63 115 ±84 56 ±48 30

Las "ascuas" de Ca " se han definido como aquellos eventos con DTMM > 30 ms. Los parámetros se han definido en Material y Métodos. Los valores se han expresado como la media ± DE, siendo N el número de eventos. Las "ascuas" constituyeron 57 y 63% del número total de eventos registrados en imágenes de escan de línea.

distribución de los parámetros morfológicos fue muy similar para ambos grupos. La

amplitud de las ascuas tuvo un rango de 0.29-2.59 AF/Fo. en células de ratones

jóvenes, y de 0.21-2.15 AF/Fo en células de ratones viejos. El rango para AMM fue de

0.80-3.4 |um y 0.94-3.2 )am en fibras de ratones jóvenes y viejos, respectivamente.

DMM fue de 31 a 312 ms en células del grupo joven y de 35 a 360 ms en células del

grupo viejo. La amplitud media de las chispas registradas en células de ratones viejos

fue significativamente menor que la registrada en ratones jóvenes. Aunque se

observaron eventos de una duración más larga y de velocidad de ascenso menor mas

frecuentemente en fibras de ratones viejos, no se detectaron diferencias significativas

para estos parámetros entre ambos grupos.

81



Resultados

4.4.5. Subtipos de fibras musculares y frecuencia de las chispas de Ca ^

Estudios en varios tipos celulares sugieren que las mitocondrias son importantes

reguladores fisiológicos de las señales de Ca^* intracelular (Babcock y cois., 1997) y

que pueden jugar un papel en el secuestro de Ca^* (Ramesh y cois., 1998; Gunter y

cois, 2004), modificando asi la frecuencia de las chispas de Ca "" (Isaeva y Shirokova,

2003a). Un cambio con la edad en la composición del tipo de fibras musculares en

músculo EDL hacia isoformas más lentas (Messi y Delbono, 2003), que presentan un

mayor contenido de mitocondrias, llevaría a una disminución de la frecuencia de las

chispas de Ca^*. Para determinar si la reducción en la frecuencia y amplitud de las

chispas de Ca " , en fibras de ratones viejos, resulta de cambios en tipos de fibras

musculares se analizó la composición de un subgrupo de fibras del EDL usadas para la

detección de chispas de Ca "". Se analizaron 9 y 10 fibras de ratones jóvenes y viejos,

respectivamente. La figura 23 ilustra la composición de las isoformas de MPC de un

subgrupo de 3 fibras de cada grupo. Los números en las bandas indican la frecuencia

de las chispas expresada como número de chispas/ (s*10'*|im^) específicamente para

cada fibra. Las demás fibras también expresaron solamente la isoforma de CPM lib y

exhibieron una frecuencia de eventos muy dispar, aunque dentro del rango de

frecuencias mostrado en la figura 22. Estos resultados muestran que una diferencia del

doble en la frecuencia de los EELC no está asociada con cambios en subtipos de fibra

muscular. Se desconoce si el contenido de mitocondrias cambia con la edad dentro de

un subtipo de fibra específico.

82



Resultados

0.05 0.14 0.08 0.07 0.04 0.04

m k Á m

lia =^ l lx — lib

V V V

Figura 23. Separación de las isoformas de cadena pesada de miosina (CPIVI) de las fibras de EDL registradas para los eventos de liberación de Ca^*. Gel de electroforesis de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrando las isoformas de CPM en fibras de EDL de ratones jóvenes (J) y viejos (V). Los números indican la frecuencia de las chispas (chispas / s-IO" |jm^) como se describe en la fig. 22. La línea de la derecha es el patrón de referencia.

4.4.6. Función mitocondrial y frecuencia de las chispas de Ca " en fibras

musculares de ratones jóvenes v viejos

Un estudio reciente en fibras de EDL de ratas jóvenes sugiere que la frecuencia

de EELC en células permeabilizadas depende en gran manera del nivel de actividad de

las mitocondrias, ya que la supresión de la actividad mitocondrial aumenta, de forma

reversible, la frecuencia de las chispas de Ca " (Isaeva y Shirokova, 2003b). En el

siguiente grupo de experimentos, hemos analizado si la reducción en la frecuencia y

amplitud de las chispas de Ca^"" registradas en células de ratones viejos es

consecuencia de un aumento de la actividad de las mitocondrias, probablemente

asociado con un aumento en la cantidad de mitocondria s en las fibras musculares con

el envejecimiento. Para ello, hemos usado un desacoplador de mitocondrias, el

carbonil-cianuro de p (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP, 25. |am), y oligomicina (2.5

l^m), un inhibidor de la ATP sintasa (Isaeva y cois., 2003a). El efecto de FCCP y

83



Resultados

oligomicina fue analizado en 10 y 8 células de ratones jóvenes y viejos,

respectivamente. La combinación de FCCP y oligomicina aumentó la frecuencia de las

chispas de Ca^* en 6 y 3 células de las fibras de los grupos jóvenes y viejos,

respectivamente. El efecto de FCCP y oligomicina sobre las chispas de Ca^* fue muy

breve y transitorio, desapareciendo después de 1-4 min de incubación. El aumento en

la frecuencia de las chispas de Ca " fue de 2.4 + 0.42 y 2.6 ± 0.70 veces para fibras de

ratones jóvenes y viejos, respectivamente. No se detectaron diferencias significativas

entre el efecto en fibras de ratones viejos comparados con jóvenes (P < 0.05). Cuatro

de las 10 y 5 de las 8 fibras, de ratones jóvenes y viejos, respectivamente, no

mostraron ningún aumento en la frecuencia de las chispas de Ca " , en repuesta al

envenenamiento de las mitocondrias. Estos resultados indican que la diferencia en la

amplitud y frecuencia de las chispas de Ca "" registrada en este estudio no se explica

debido a cambios en la actividad mitocondrial en fibras de EDL de ratones viejos.

4.4.7. La expresión del receptor de la rianodina tipo 1 (RyRD en músculos

EDL de ratones viejos

El número de RyRI puede influenciar la frecuencia y amplitud de los EELC. Por

ello, el análisis de la expresión de RyR1 en el músculo EDL de ratón es relevante.

Hemos investigado la expresión de esta proteína en músculos de ratones jóvenes y

viejos utilizando inmunoblots. La figura 24 muestra un experimento típico con la banda

específica para RyRI en ausencia de inmunoreactividad para RyR3 en ambos, ratones

jóvenes y viejos. Subsecuentemente, las membranas se incubaron con el anticuerpo

específica anti-SERCAl, el control interno de cargado. El cociente joven/viejo para la

84



Resultados

expresión de SERCA-1 fue de 0.96 para el experimento de la fig. 24 y el rango de todos

los experimentos conducidos fue de 0.94-1.1. Los niveles de RyRI se normalizaron con

la señal de RyRI y RyR3 de rana expresada como cociente. La media y el EEM se

estos cocientes se han representado en la figura 24. La diferencia en la expresión del

RyRI entre los músculos EDL de ratones jóvenes y viejos fue significativamente

diferente (P < 0.05).

^ RyRI RyR3 SERCA-1

>. OH

(O

>

C O

« i _ Q. X m

1 .\J

0.8

0.6

0.4

0.2

n n .

T *

T

Joven Viejo

Figura 24. Análisis de la expresión de RyRI y RyR3 en músculos de ratones jóvenes y viejos mediante Western blots. Los inmunoblots de RyRI y RyR3 en músculos EDL de ratones jóvenes (n= 6 músculos, 3 ratones) y viejos (n= 6 músculos, 3 ratones) se expresaron de forma relativa a las RyR1 y RyR3 de rana. La proteína SERCA1 se utilizó como positivo de cargado. Los valores Indican la media y EEM. El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas (P < 0.05)

85



5. Discusión



CAPÍTULO I

EFECTO DEL ENVEJECIMIENTO SOBRE LA FUERZA ESPECÍFICA DE CÉLULAS

ÚNICAS E INTACTAS DE LOS MÚSCULOS EXTENSOR COMÚN DE LOS DEDOS

(EDL) Y SOLEO DE RATÓN



Discusión

En el capítulo I de este trabajo se determina, por primera vez, la fuerza

específica generada por fibras de músculo esquelético EDL y soleo y los cambios que

se producen con la edad. El análisis de la fuerza isométrica máxima de contracción nos

permite concluir que la fuerza específica máxima registrada en fibras únicas intactas de

FDB, EDL y soleo de ratones de la misma edad no es significativamente diferente.

También encontramos que la fuerza máxima específica generada por fibras de EDL y

soleo disminuye significativamente con la edad.

5.1.1. La fuerza específica de fibras intactas de los músculos esqueléticos

EDL V soleo de ratón disminuye con la edad

Nuestros resultados indican que la fuerza máxima desarrollada por fibras

intactas de EDL y soleo disminuye con la edad. La fuerza específica registrada en

fibras de los músculos EDL y soleo de ratones de edad joven y mediana es similar a la

registrada en fibras de FDB de ratones jóvenes en este trabajo (418 + 28 kPa) y a la

publicada para fibras de FDB de ratón en la literatura (391 + 59 kPa; rango: 300-480

kPa) (Lannergren y Westerbiad, 1987). La fuerza específica de fibras intactas en este

trabajo es mayor que la registrada en músculo entero o en un pequeño grupo (banda)

de fibras. La discrepancia se podría explicar por la sobrestimación del área de la

sección transversal o por la contribución heterogénea de las fibras musculares al

desarrollo de fuerza en preparaciones multifibrilares. La falta de una contribución

homogénea al desarrollo de fuerza podría deberse a diferencias en la orientación de las

fibras y/o de la longitud óptima (Sugi y Tsuchiya, 1998). Hasta la fecha, no se ha

publicado ningún estudio sobre la fuerza específica de células intactas de músculo

esquelético FDB, EDL o soleo de ratón viejo; por eso, la discusión estará centrada en la

comparación de nuestros resultados con aquellos registrados en preparaciones de

88



Discusión

multifibra publicados en la literatura. La fuerza específica registrada aquí en fibras de

EDL y soleo mostró una disminución significativa en ratones viejos comparados con

ratones jóvenes y de mediana edad. Estos resultados son similares a los publicados

para músculo entero por diversos grupos (Larsson y Edstróm, 1986; Brooks y cois.,

1988). Existen, sin embargo, otros estudios que contradicen nuestros resultados. Por

ejemplo, se ha descrito, utilizando dos técnicas diferentes (bandas de fibras y fibras

peladas-sin membrana externa) que la fuerza específica de soleo es mayor en

animales viejos que en jóvenes, mientras que ninguna diferencia fue observada en

EDL (Eddinger y cois., 1986).

No se encontraron cambios significativos entre la relación fuerza especifica-

frecuencia de estimulación cuando se compararon fibras de EDL de animales de

mediana edad y viejos. Aunque esta diferencia fue significativa para fibras de soleo

debería notarse que existe una tendencia a desarrollar más fuerza a frecuencias

submáximas en fibras de ratones de mediana edad comparado con ratones jóvenes

(Brooks y cois., 1988).

5.1.2. Mecanismos responsables de la disminución de fuerza específica en

músculo esquelético con el envejecimiento

Factores primariamente neurogénicos, miogénicos y otros factores descritos

previamente pueden contribuir a la disminución de fuerza específica con el

envejecimiento (Looser y Delbono, 2003). En este trabajo registramos las alteraciones

en la capacidad de generar fuerza específica en fibras musculares aisladas en las que

la contracción ha sido generada mediante la despolarización del sarcolema o

membrana externa. Nuestro laboratorio ha propuesto que alteraciones en el

mecanismo de EC son responsables, en parte, de la disminución de fuerza específica

89



Discusión

con la edad (Delbono y cois., 1995; Delbono y cois., 1997). Las siguientes evidencias

experimentales apoyan este concepto: i) El número de receptores de DHPR y RyR

disminuye con el envejecimiento en músculo de rata (Renganathan y cois., 1997a) y de

ratón (Renganathan y cois., 1998); ii) la reducción del número de receptores está

asociada con la reducción del movimiento de carga y el pico máximo de Ca ""

intracelular en fibras rápidas de músculo humano (Delbono y cois., 1995) y iii) más

recientemente, con la técnica de fijación de voltaje, hemos demostrado que el

movimiento de carga y el Ca^* intracelular disminuyen en fibras únicas de músculo FDB

de ratones viejos comparado con fibras de ratones jóvenes (Wang y cois., 2000).

Aparte de estos mecanismos, no se descarta que una disminución en la densidad de

proteínas contráctiles de las fibras musculares contribuya a la disminución de fuerza

con el envejecimiento. También se ha propuesto que cambios en tipos de fibra

muscular contribuyen al debilitamiento del músculo con la edad en roedores (Cácela y

cois., 1979) y humanos (Lexell, 1995). Algunos de estos estudios se han llevado a cabo

en voluntarios con varios estados nutricionales y en roedores endogámicos que

muestran una muy baja prevalencia de patologías causadas por el envejecimiento.

Estudios en ratas Fisher 344 y ratones C57BL/6 no muestran cambios en tipos de fibra

asociados al envejecimiento (Florini y cois., 1989; Phillips y cois., 1993). El hecho de

que fibras de los músculos FDB, EDL y soleo de ratones jóvenes y de mediana edad

desarrollen la misma fuerza específica no apoya la posibilidad de que cambios en tipos

de fibra y composición de miosina sean responsables de la disminución de fuerza

específica registrada en este trabajo. No obstante, se ha demostrado que existe una

disminución de fibras de tipo II, la isoforma de miosina de cadena pesada, o un cambio

de fibras de tipo IIB a IIX (Larsson y cois., 1993; Barton-Davis y cois., 1998). Este

fenómeno puede ser relevante para la cinética de contracción pero no en términos de

generación de fuerza máxima.

90



Discusión

La relación fuerza isométrica-pCa medida en fibras peladas no muestra

diferencias significativas entre ratones viejos y jóvenes (Brooks y cois., 1994a), lo cual

sugiere que la sensitividad al Ca^* de las miofibrillas no juega un papel importante en el

envejecimiento. Sin embargo, hay datos que sugieren la existencia de alteraciones con

el envejecimiento a nivel de los puentes cruzados (Phillips y cois., 1993). Estudios en

humanos también muestran inconsistencias en términos de fuerza específica

desarrollada por grupos diferentes de músculos en los ancianos (Hakkinen y cois.,

1996; Kent-Braun y Ng., 1999; Lynch y cois., 1999). La dificultad en la medida del área

de la sección transversal en estos experimentos "in situ" podría explicar las

discrepancias.

5.1.3. Cinética de contracción en fibras de EDL y soleo de ratones jóvenes,

de mediana edad y viejos

La cinética de la contracción única (twitch) registrada en fibras de EDL es similar

a la registrada en células únicas intactas de FDB (Lannergren y Westerbiad, 1987),

después de corregir por el cambio de temperatura. En fibras de FDB, se obtuvieron

valores de 14 y 15 ms como tiempos de contracción y 7-8 y 6-7 ms de tiempos de

relajación media, ambos a 35 C (Lannergren y Westerbiad, 1987). Considerando

valores de Q10 de 3.2 y 4 ms para la contracción y relajación media, respectivamente,

los valores que hemos obtenido en nuestros experimentos están en concordancia con

los publicados en la literatura (Lannergren y Westerbiad, 1987).

No encontramos cambios significativos con la edad en los tiempos de pico y

relajación media de contracción aislada de las fibras de EDL y soleo, a pesar de los

cambios registrados en este parámetro para músculos enteros de soleo y gastrocnemio

(Klitgaard y cois., 1989; Larsson y Salviati, 1989; Narayanan y cois., 1996). Otros

91



Discusión

grupos tampoco detectaron una relajación más lenta en fibras de los músculos EDL,

tibial anterior, soleo y vasto lateral superficial del cuadríceps (Fitts y cois., 1984;

Larsson y Edstróm, 1986; Brooks y cois., 1988). Estas discrepancias se pueden

explicar debido a diferencias entre las preparaciones y condiciones experimentales. A

partir de los resultados obtenidos en estos experimentos podemos concluir: (i) las fibras

únicas e intactas, deprivadas de influencia nerviosa, desarrollan menos fuerza en

edades tardías; (ii) la disminución de la fuerza del músculo entero con la edad puede

ser el resultado de diferentes factores, siendo uno de ellos la alteración de la capacidad

de generar fuerza de las fibras únicas; (iii) alteraciones en la capacidad mecánica de

animales senescentes son consecuencia de una disminución de la fuerza específica

desarrollada por fibras rápidas y lentas; (iv) aunque no hemos examinado los efectos

de la composición muscular durante el envejecimiento, los resultados de fibras únicas

intactas coinciden con muchos de los estudios en músculo entero sugiriendo que las

alteraciones en las mismas fibras contribuyen de forma significativa al cambio

registrado en músculo entero.

92



CAPITULO II:

ÍNDICE DE FATIGA EN FIBRAS MUSCULARES DEL EDL Y SOLEO DE RATONES

JÓVENES Y VIEJOS



Discusión

Las principales conclusiones de este estudio son: a) la resistencia isométrica de

fibras intactas de los músculos EDL y soleo no cambia de forma significativa con la

edad; b) el acortamiento del intervalo inter-tetánico produjo más fatiga que con

intervalos largos; sin embargo, no se detectaron cambios con la edad ni en fibras de

EDL ni de soleo, utilizando el mismo protocolo; c) el análisis de la fatiga, basado en dos

criterios diferentes, no mostró diferencia significativas con la edad en fibras de EDL o

soleo; y d) la evolución temporal del índice de fatiga, estudiado en un periodo de 5-10

min, no mostró diferencias en fibras de EDL o soleo disecadas de ratones jóvenes o

viejos.

5.2.1. Fatiga muscular en ratón y otras especies

El índice de fatiga y la evolución temporal de la resistencia isométrica en fibras

musculares de ratón de contracción rápida o lenta no cambiaron significativamente con

la edad. Datos previos obtenidos en músculo entero no han mostrado resultados

consistentes. Mientras que algunos trabajos en mamíferos viejos indican que no hay

cambios o disminuye en la resistencia muscular (Fitts y cois., 1984; Carlsen y Walsh,

1987; McCarter y McGee, 1987; Zhang y Kelsen, 1990; Lawler y cois., 1997), otros

estudios refieren ausencia de cambios (Larsson y Karisson, 1978) o incluso, aumentos

(Petrofsky y Lind, 1975). Los resultados de Págala y cois. (1998) muestran que la fatiga

del músculo entero no cambia o aumenta en EDL y soleo, respectivamente, con la

edad. La discrepancia de los datos en soleo se puede explicar debido al cambio en

tipos de fibras muscular que ocurre con el envejecimiento en el músculo entero.

94



Discusión

5.2.2. Fatiga en fibras de los músculos EDL y soleo

Todas las fibras de los músculos EDL y soleo incluidas en este estudio fueron

rápidas o lentas, respectivamente, de acuerdo con los criterios definidos anteriormente

(ver Material y Métodos).

Los experimentos de fatiga en fibras de EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos

mostraron un rango de valores muy amplio. La heterogeneidad de las fibras musculares

(de tipo I, HA, IIB y IIX) podría explicar, al menos en parte, la variabilidad de los

resultados, dado que en este estudio no hemos distinguido los diferentes tipos de fibras

rápidas. Estudios previos realizados en unidades motoras muestran una variabilidad

similar en la resistencia muscular a la fatiga de fibras rápidas (Burke y cois., 1973;

Kadhiresan y cois., 1996).

5.2.3. Mecanismos responsables de la alteración del funcionamiento

neuromuscular con el envejecimiento

Los mecanismos responsables de la disminución en la capacidad motora en

animales viejos no se conocen de forma clara. Se ha sugerido que alteraciones en la

excitabilidad de la vía corticoespinai, en la velocidad de conducción de motoneuronas y

en la eficacia de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular o en la

contractilidad del músculo esquelético podrían ser responsables (véase Ross y cois.,

1997; Loeser y Delbono, 2003). La atrofia muscular asociada al desuso es un

condicionante mayor de la disminución de fuerza con la edad, sin embargo, esto no

parece explicar del todo la disminución de la capacidad motora asociada al

envejecimiento en mamíferos (Loeser y Delbono, 2003). Se ha publicado que la fuerza

específica máxima desarrollada por células únicas de EDL y soleo disminuye con la

95



Discusión

edad (González y cois., 2000). Este estudio apoya el concepto de que la disminución

de la fuerza específica con la edad y la fatiga no están relacionados. Los mecanismos

intrínsecos responsables de la disminución de la capacidad generadora de fuerza con

el envejecimiento se conocen sólo parcialmente. Se han mencionado varios factores,

siendo el desacoplamiento de excitación-contracción (DEC) uno de ellos (Delbono y

cois., 1997). DEC ha sido demostrado en humanos y en modelos animales de

envejecimiento (Wang y cois., 2000). No obstante, nuestros resultados no descartan la

posibilidad de que existan, adicionalmente, alteraciones en el mecanismo de

transmisión sináptica que afecten la activación post-sináptica.

Los experimentos de este estudio fueron realizados a temperatura ambiente.

Wineinger y cois. (1998) en un estudio realizado en ratones de dos (joven) y 15

("adultos") meses de edad mostraron que músculos enteros de ratones de la cepa

C10BL/10SnJ "adultos" se fatigan más que los músculos de ratones jóvenes a

temperaturas más altas (35 C comparado con 20 C). La dependencia de la

temperatura en estos cambios es un efecto de la maduración, no del envejecimiento,

en la fatigabilidad muscular. Se desconoce si la temperatura afecta de forma diferente a

la resistencia muscular durante el envejecimiento. Si esto se confirmara, podría indicar

la existencia de diferencias metabólicas entre músculos de ratones jóvenes y viejos.

En este estudio hemos usado dos protocolos de alta frecuencia de estimulación.

La aplicación de bajas frecuencias podría haber ayudado a determinar si existen

cambios de otro tipo. Sin embargo, hemos concentrado este trabajo en si las fibras

musculares rápidas o lentas de ratones jóvenes y viejos desarrollan un nivel de fatiga

diferente aplicando dos protocolos de estimulación previamente utilizados. Queda

pendiente el estudio del efecto de varias frecuencias de estimulación (Edwards y cois.,

1977; Westerbiad y cois., 1993) en diferentes sub-tipos de fibras de mamíferos de

distintas edades, determinando las tensiones generadas y los cambios en la [Ca " ];.

96



CAPITULO III:

EL FACTOR DE CRECIMIENTO SIMILAR A LA INSULINA-I PREVIENE LA

DISMINUCIÓN DE CA^* INTRACELULAR Y FUERZA ESPECÍFICA EN FIBRAS

ÚNICAS E INTACTAS DE MÚSCULO DE RATONES TRANSGÉNICOS



Discusión

Los resultados del presente estudio apoyan la hipótesis de que la expresión

transgénica de IGF-1 en músculo esquelético previene la disminución de [Ca^""]; que

ocurre durante la contracción con el envejecimiento y, subsecuentemente, la

disminución de la fuerza específica. El efecto del IGF-1 no esta asociado a un cambio

en el subtipo de fibra del músculo de ratón.

5.3.1. IGF-1 previene la disminución de fuerza específica con el

envejecimiento

En este trabajo hemos investigado el efecto de la expresión transgénica

sostenida de IGF-1 en músculo esquelético sobre la fuerza específica y la [Ca^*]¡ en

fibras únicas intactas. Nuestra hipótesis predecía que la expresión transgénica de IGF-

1 previene la disminución de fuerza específica secundariamente a aumentar el pico de

incremento de [Ca " ]¡ y corrige otras posibles alteraciones (por ejemplo, la disminución

de fuerza por puente cruzado). Los efectos de la expresión transgénica de IGF-1 sobre

la masa de músculo esquelético han sido publicados previamente en ratón y rata. La

expresión de IGF-1 en células previene la disminución de masa y fuerza muscular

asociada al envejecimiento. Este efecto se asume que ocurre mediante un mecanismo

de estimulación de la regeneración del músculo y la preservación de las fibras de tipo

IIB a través de la activación, mediante IGF-1, de células satélite (Barton-Davis y cois.,

1998). Se ha descrito que ratones transgénicos que expresan IGF-1 en músculo

esquelético exhiben hipertrofia muscular; sin embargo, no existe ningún dato publicado

en relación con la fuerza muscular que desarrollan a edades tardías (Musaro y cois.,

2001).

Nuestros resultados muestran que la disminución de fuerza específica que

ocurre con el envejecimiento en ratones FVB (la cepa usada para crear la cepa S1S2-

98



Discusión

IGF-1); González y cois., 2000) se puede prevenir con la expresión transgénica de

hlGF-1, y que esto no parece ser el resultado de un cambio en la composición

muscular del tipo de fibra. Aunque la composición muscular de tipos de fibras fue

analizado en músculo entero, no es probable que las diferencias en los valores de

[Ca^*]j y fuerza específica se deban a cambios en el fenotipo de las fibras. Prueba de

ello es la ausencia de cambios significativos en la velocidad de contracción y relajación

y en la liberación de Ca "" intracelular con la expresión transgénica de IGF-1.

La disminución observada en la sección transversal de la fibra en ausencia de

cambios en el tipo de fibra, sugiere que el cambio de tipo de fibras y/o la denervación

de fibras, observada en músculos rápidos de rata (Larsson y cois., 1991), ocurre más

tarde en el músculo FDB del ratón que en músculos de otras especies. Se debe tener

en cuenta que el músculo FDB es comparativamente más lento que el EDL, debido a la

carencia de fibras de tipo lib (Allen y cols., 1993). El efecto significativo del IGF-1 sobre

el área transversal del músculo es consistente con datos previos (Coleman y cois.,

1995; Musaro y cois., 2001). La atrofia muscular registrada en músculos de animales

viejos control junto con la ausencia de diferencias significativas en el área de la sección

transversal entre ratones jóvenes control y viejos transgénicos sugiere que IGF-1

preserva el trofismo muscular y favorece la regeneración en todas las edades,

probablemente a través de un efecto en la activación de las células satélite (Barton-

Davis y cois., 1998). En nuestro estudio, el fenómeno de apoptosis no parece ser muy

marcado dado que el número de fibras por músculo fue similar en los cuatro grupos

considerados.

En este trabajo hemos observado una disminución en la fuerza específica del

músculo FDB del 32 % con el envejecimiento. Este valor es similar al registrado en

músculo FDB de rata (Carlsen y Waisfi, 1987) y EDL de ratón (Brooks y cois., 1988). El

grado de disminución de la fuerza específica obtenido en este trabajo es consistente

99



Discusión

con estudios previos realizados en fibras únicas e intactas de los músculos EDL y

soleo, que mostraron disminuciones del 26 % y 20 %, respectivamente (González y

cois., 2000). No encontramos diferencias significativas en la fuerza específica de

músculo entero de ratones jóvenes control y ratones viejos transgénicos. Estos

resultados están en acuerdo con los registrados previamente en ratones en los que se

expreso IGF-1 por medio de un adenovirus (Barton-Davis y cols., 1998), o mediante un

mecanismo transgénico (Renganathan y cois., 1998), y sugieren que altas

concentraciones de IGF-1 en el músculo mejora el desarrollo de fuerza de los puentes

cruzados además de incrementar la masa muscular.

5.3.2. Mecanismos responsables de la disminución de fuerza específica de

fibras musculares con el envejecimiento

Se ha propuesto que una alteración en el mecanismo de activación del

sarcolema y la liberación de Ca " del RS es la causa de la disminución de fuerza

específica asociada al envejecimiento (Delbono y cois., 1995; Delbono, y cois., 1997).

Para examinar esta hipótesis hemos investigado si las alteraciones en la elevación de

la [Ca ""]; inducida por estimulación eléctrica produce una reducción de fuerza

específica en fibras del músculo FDB de ratones viejos. El valor del pico de [Ca^^ji

registrado en fibras de FDB de ratones jóvenes control en respuesta a una estimulación

breve está en el rango previamente descrito (Westerbiad y Alien, 1991; Carrol! y cois.,

1995), aunque es algo menor que el referido por algunos grupos (Bakker y cois.,

1997b). La ausencia de diferencias significativas entre ratones jóvenes control y

transgénicos es consistente con los experimentos de fijación de voltaje en células de

FDB en los que la [Ca^ ji fue medida con un indicador de Ca " de afinidad relativamente

baja (Wang y cois., 2002). La [Ca^^ji máxima registrada en fibras de ratones viejos fue

100



Discusión

significativamente menor que la registrada en fibras de ratones jóvenes. La disminución

del pico intracelular de Ca^* (~ 34%) es similar a la disminución de fuerza específica en

fibras únicas (37%) y músculo entero (32%). Esta disminución fue menor que la

registrada anteriormente en células FDB con fijación de voltaje (~48%) (Wang y cois.,

2000). Para determinar si la alteración en la liberación de Ca " es responsable del

déficit de fuerza, se estudio el efecto de la cafeína sobre la fuerza máxima de fibras

musculares. La potenciación inducida por cafeína en la fuerza máxima de células

únicas es consistente con el aumento de la liberación de Ca^* inducido por cafeína en

células musculares registradas con la técnica de fijación de voltaje (Delbono, y cois.,

1995). Se podría argüir que el tétano no representa la condición de activación máxima

de la fibra, ya que cafeína aumenta la [Ca^ ]¡ y la fuerza específica en células intactas

del músculo FDB de ratón (Alien y Westerbiad, 1995). De acuerdo con esta evidencia

experimental, sería de esperar un mayor aumento en la [Ca ""]; después de alcanzar la

máxima liberación de Ca "* del RS evocada por estimulación eléctrica. Los

experimentos con cafeína en fibras de ratones jóvenes y viejos control y transgénicos

apoyan la conclusión de que existe una cantidad extra de Ca "" en el retículo

sarcoplasmático que está disponible en respuesta a estimulación eléctrica máxima.

Esto favorece la idea de que el agotamiento de Ca "" del retículo sarcoplasmático no

explica la disminución de la liberación de Ca "" que ocurre en fibras de ratones viejos.

Por el contrario, la disminución del número de DHPR y RyRI (Renganathan y cois.,

1997a), el aumento de RyRs desacoplados a DHPRs (Renganathan y cois., 1998), y la

posible alteración de la probabilidad de apertura del RyR asociada a alteraciones en la

regulación del canal (Damiani y cois., 1996), son algunas de las explicaciones que

justifican que fibras de ratones viejos no utilicen la cantidad de Ca "" extra para

compensar la disminución de la liberación de Ca "" dependiente de voltaje. Aunque el

valor máximo de la [Ca^*]¡ intracelular se recupera en su totalidad después de la

101



Discusión

aplicación de cafeína, todavía persiste un déficit en la fuerza específica en células de

ratones viejos. Por esto, la existencia de otros mecanismos que contribuyan a la

disminución de la fuerza con el envejecimiento deben ser considerados. Alteraciones

de la maquinaria contráctil pueden contribuir a la disminución de fuerza específica con

la edad. La disminución de la fuerza específica de fibras tipo I, Na y llb/llx de músculos

de rata y humano ha sido previamente publicada (Li y Larsson, 1996; Larsson y cois.,

1997; Lowe y cois., 2002). La observación de que células peladas de humanos de edad

avanzada activadas de forma máxima y células de mamíferos pequeños desarrollan

menos fuerza específica que células musculares de individuos jóvenes sugiere que la

capacidad intrínseca del aparato miofibrilar está alterada con el envejecimiento,

además de las alteraciones en el acoplamiento de excitación-contracción. Ambos, la

activación submáxima del aparato contráctil y la pérdida de capacidad intrínseca para

desarrollar fuerza podrían cooperar en la determinación de la pérdida de fuerza con el

envejecimiento.

5.3.3. Mecanismos del efecto de IGF-1 en ratones IGF-1-transqénicos

La expresión local sostenida de IGF-1 previene la disminución del pico de la

[Ca^^ji durante la contracción y la fuerza específica que ocurre con el envejecimiento en

células de FDB de ratones S1S2. Esto sugiere que IGF-1 previene alteraciones en el

mecanismo de acoplamiento de excitación-contracción, además de en otros posibles

mecanismos (como la disminución de fuerza de los puentes cruzados) involucrados en

la disminución de fuerza con el envejecimiento. El pico de la [Ca^*]¡ registrado en fibras

de ratones transgénicos fue significativamente mayor que el registrado en fibras

ratones viejos control, pero similar al de fibras de ratones jóvenes control. IGF-1

aumenta la expresión de la subunidad a lS del DHPR (DHPRais) en cultivo primario de

102



Discusión

músculo (Renganathan y cois., 1998; Wang y cois., 1999) y en músculos de ratones

adultos jóvenes y viejos, en concordancia con los datos previos sobreexpresando

durante toda la vida IGF-1 en músculo (10-15 veces mayor que los correspondientes

controles) (Renganathan y cois., 1998). El aumento de las subunidades a l del DHPR

es la consecuencia de un aumento de la trascripción genética (Zheng y cois., 2002a).

El mecanismo de acción de IGF-1 en el aumento del tamaño fibrilar parece involucrar la

acción de la calcineurina y el factor GATA (Musaro y cois., 1999; Semsarian y cois.,

1999). Estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado que el mecanismo

de la expresión de DHPRais es complejo (Zheng y cois., 2002a y b). Por esto, los

mecanismos por los cuales IGF-1 actúa para causar hipertrofia muscular y el control de

las moléculas involucradas en la dinámica de la [Ca^'*']\ no son completamente

idénticos. Se desconoce todavía si la isoforma muscular de IGF-1 (Owino y cois., 2001)

también contribuye en la prevención de la disminución de la expresión de estos canales

y la fuerza específica con la edad.

103



CAPITULO IV:

EVENTOS ELEMENTALES DE LIBERACIÓN DE Ca^* CHISPAS Y ASCUAS EN

FIBRAS DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE RATONES VIEJOS



Discusión

El hecho de que músculos de animales senescentes no alcance los niveles

intracelulares de Ca^* registrados en células de músculos de ratones jóvenes en

células registradas con la técnica de voltage-clamp (Wang y cois, 2000) y en células

contráctiles (González y cois, 2003) nos ha llevado a analizar la generación de EELC

espontáneos en fibras musculares de animales jóvenes y viejos. En este trabajo,

hemos encontrado una disminución en la amplitud y la frecuencia de los EELC en

células de ratones viejos comparadas con jóvenes. Estas alteraciones no parecen estar

asociadas a cambios de la función mitocondrial o el tipo de célula. Además, la

expresión de RyR1 disminuye en músculo EDL de ratón viejo.

5.4.1. EELC en músculo esquelético de ratón adultos

El análisis farmacológico inicial nos permitió determinar que la fuente de los

EELC registrados en este trabajo es la permeabilidad de Ca " a través del RyR1 en

fibras de ratones jóvenes y viejos. Tres agentes que han demostrado tener un efecto

específico sobre el RyR1 han sido probados (rianodina, imperatoxina-A y cafeína).

Estos tres compuestos aumentaron la frecuencia de los EELC.

Subsecuentemente, comparamos nuestros resultados con los registrados en

otros estudios de músculo esquelético de adulto (Conkiin y cois., 1999a; Kirsch y cois.,

2001; Uttenweiler y cois, 2002) o embriónico/neonatal (Conkiin y cois., 1999b; Kirsch y

cois, 2001; Chun y cois., 2003; Isaeva y Shirokova., 2003a; Zhou y cois, 2003 y

Szentesi y cois, 2004). Hasta ahora, que nosotros sepamos, no se han realizado

estudios de EELC en músculo esquelético de mamíferos viejos. Además, aunque las

propiedades funcionales de los RyRs de mamíferos jóvenes se han estudiado de forma

extensiva en canales reconstituidos en membranas lipídicas artificiales (Fill y Copello,

2002; Meissner, 2002), no existe información, en este respecto, de músculo esquelético

105



Discusión

de mamíferos viejos.

La amplitud, AMIVl, DMM y tiempo de ascenso de las chispas registradas aquí

son similares a los registrados en fibras intactas de FDB (Conckiin y cois., 1999a) y

fibras permeabilizadas de EDL (Kirsch y cois., 2001) de ratón. El tiempo de ascenso

más corto descrito para fibras de EDL de ratón neonato (P14) (Chun y cois, 2003),

comparado con los valores registrados en este trabajo, se podría explicar por la

existencia de la isoforma RyR3 en esta última preparación, ya que esta isoforma de

RyR no se ha detectado en ratón joven-adulto o viejo. La frecuencia, en nuestra

preparación, es similar a la registrada por Chun y cois (2003) en fibras durante el

periodo postnatal (1 chispa/ 5 imágenes). Sin embargo, hay algunas discrepancias con

otras publicaciones. Se han registrado 1-4 chispas / imagen o 455 eventos registrados

en 5 fibras permeabilizadas (Kirsch y col., 2001) o 220 eventos en 26 células intactas

(Conkiin y cois., 1999b). La frecuencia de las chispas en el presente estudio (0.19 ±

0.19 eventos / imagen; rango 0.02-1.14) es similar a la registrada en el periodo

postnatal temprano (Chun y cois., 2003) pero menor que en fibras de adulto (Kirsch y

col, 2001). Diferencias en los procedimientos empleados para la detección de los EELC

podrían explicar, al menos en parte, estas discrepancias. Además, en este estudio,

varias células no exhibieron ninguna actividad de EELC aunque se registró un aumento

global de fluorescencia con la aplicación de 1 mM de cafeína. Desafortunadamente,

estos resultados no se pueden comparar con los de otros grupos porque no se ha

publicado previamente el número de células viables funcionales que no exhiben EELC.

Las "ascuas", definidas como aquellos eventos de duración mayor de 30 ms,

constituyeron un 53 % de todos los eventos de escan de línea; si usamos el criterio de

50 ms, las "ascuas" representan el 38 %, valor que es similar al 33 % registrado en

experimentos previos (Kirsch y cois., 2001). Diferencias en la detección y análisis de

los eventos podría explicar estar diferencia ya que los procedimientos experimentales.

106



Discusión

incluida la composición de la solución interna, son similares.

Los experimentos realizados en fibras de músculo esquelético de rata son más

numerosos y por tanto la caracterización de las propiedades de los EELC es más

completa. La amplitud media de las chispas en este estudio es similar a (Shirokova y

cois., 2003; Conkiin y cois., 1999a; Szentesi y cois., 2004) o más pequeña que (Kirsch

y cois., 2001; Uttenweiler y cois., 2002) la registrada en publicaciones previas, pero en

general dentro del rango de los valores de la literatura. Nuestros valores de AMM, DMM

y tiempo de ascenso son similares a los valores más pequeños registrados en rata; sin

embargo, existe una gran dispersión en los valores dados para estos parámetros

(Uttenweiler y cois., 2002; Zhou y cois., 2003; Csernoch y cois., 2004 y Szentesi y cois.,

2004), fenómeno que podría resultar de diferencias en las condiciones de registro. Si la

frecuencia se calculase en número de eventos / fibra, el valor registrado en este trabajo

es significativamente menor que el registrado en rata. Podría ser que la regulación del

DHPR en la liberación de Ca^* del RyR esté controlada de una forma más estricta en

ratón que en rata, lo cual podría llevar a una probabilidad más baja en la ocurrencia de

los eventos de Ca "". Sin embargo, estudios sobre la relación DHPR / RyR que registran

valores de 0.91 (Renganathan y col, 1998) y 0.95 (Renganathan y col, 1997a) en

músculo EDL de ratón y rata, respectivamente, apuntan en contra de esta posibilidad.

5.4.2. Efectos del envejecimiento en las propiedades de los EELC

El análisis de las amplitudes de los EELC de fibras de ratones jóvenes y viejos

reveló diferencias significativas en la liberación de Ca "". Las fibras de ratón viejo,

comparadas con las de ratones jóvenes, exhibieron un mayor número de eventos más

pequeños. El amplio rango de amplitudes indica que las chispas de Ca^^ son

polimórficas, como sucede en células de corazón (Shen y cois., 2004), más que

107



Discusión

estereotipadas o de fenómeno todo-o-nada. La disminución con la edad del RNAm

(Zheng y cois, 2002b) y la proteína (registrada aquí) en músculo EDL de ratón, sugiere

la existencia de alteraciones en la regulación del RyR1 (Damiani y cois., 1996). Estas

alteraciones podrían justificar las diferencias en la liberación de Ca "" mediante la

influencia en el número de unidades de liberación y en la probabilidad de apertura del

canal. Aunque la similitud del valor DMM encontrada entre ambos grupos contradice

esta posibilidad, el aumento en el tiempo de ascenso y la disminución de la frecuencia

de los EELC en fibras de ratones viejos es consistente con esta hipótesis.

Las diferencias con la edad en la frecuencia de los ELLC registrada en este

trabajo no se justifican por alteraciones en la regulación del Ca "", Mg "" o ATP del

RyR1, basado en las características de la preparación (célula permeabilizada o

químicamente pelada) y el ambiente controlado de iones y de nucleotides. En la

literatura hay datos que indican que existe un efecto del Ca^* luminal en la frecuencia y

tiempo de apertura de RyR2 en células de corazón (Lukyanenko y cois, 1996).

Además, se ha descrito que un lazo del RyRI del lumen esta involucrado en la

actividad del canal en músculo esquelético (Gao y cois, 2000). Se desconoce si el

contenido de Ca " del RS cambia con la edad. Información con respecto a este punto

podría aportar más información relevante sobre los mecanismos de regulación del

RyRI por el Ca "" del RS. En este estudio se muestra evidencia directa de que la

expresión del RyR1 disminuye con la edad. Sin embargo, se carece de datos

referentes a cambios en la regulación del RyRI; si bien los que existen son algo

controversiales. Nuestra hipótesis es que cambios en el nivel de expresión y/o función

de ciertas proteínas, presumiblemente involucradas en el proceso de acoplamiento de

EC, resultan en alteraciones en las propiedades de apertura del RyRI con el

envejecimiento. El estado metabólico y de oxidación-reducción del RyRI puede

modular la actividad (Sun y cois., 2003) y frecuencia de las chispas de Ca^* en ratas

108



Discusión

adultas-jóvenes. Sin embargo, el efecto en fibras musculares de mamíferos viejos se

desconoce. La interacción con calmodulina (Smith y cois. 1989), FKBP12, y/o

FKBP12.6 (Qi y cois, 1998) juega un papel relevante en la función de canal único, sin

embargo, no existe ninguna información sobre músculos de mamíferos viejos sobre

estos temas. La diferencia en la frecuencia de EELC con la edad no esta asociada a

cambios en la isoforma de los RyR de acuerdo con la ausencia de RyR3 en los análisis

de inmunoblot de músculos EDL de ratón joven y viejo que presentamos aquí.

La contribución de un menor número de RyRI en la generación de EELC se

reflejaría en la dimensión espacial de las chispas (AMM), pero esta variable no es

estadísticamente significativa entre fibras de ratones jóvenes y viejos. Se desconoce si

la reducción del número de RyRI ocurre de forma homogénea o en forma de "parche"

(no homogénea). Supuestamente, un déficit más homogéneo tendría influencias en la

amplitud y AMM. Un déficit en forma de "parche" podría tener un efecto más parcial en

la morfometría de los EELC permitiendo la ocurrencia de ciertos números de eventos

normales. Esto resultaría en un rango más amplio en la distribución de valores de AMM

en fibras de ratones viejos, fenómeno que no es aparente en el histograma de

frecuencias de AMM. Sobre la base de estos resultados, proponemos que un déficit de

forma homogéneo, durante la edad avanzada, determina una menor amplitud de los

EELC. La velocidad de ascenso de las chispas de Ca "", (parámetro que indica el flujo

de liberación de Ca ""), que se correlaciona con la amplitud de la chispa (Shen y cois.,

2004), fue significativamente diferente entre grupos, consistente con el descubrimiento

de que un menor número de RyRI contribuye a una menor amplitud de EELC en

animales viejos. Una correlación negativa entre el flujo de liberación de Ca "" (velocidad

de ascenso) y la duración de la liberación de Ca^* (tiempo de ascenso) se ha descrito

en células de corazón (r= -0.43), lo que da soporte a la idea de que una corriente de

liberación más fuerte termina la chispa más temprano (Shen y cois, 2004). El análisis

109



Discusión

Je la correlación de estas dos variables en este trabajo esta de acuerdo con estudios

previos y provee una correlación negativa para fibras de ambos grupos: joven (r =-0.53)

y viejo (r= -0.50). Estos datos indican la preservación del mecanismos de terminación

de liberación de Ca " de RS en fibras de ratones viejos.

Aunque las ascuas no se han generado mediante la despolarización de la

membrana en este estudio, el examen de los EELC en el modo escan de línea nos

permite concluir que la amplitud de estos eventos es significativamente menor en fibras

de ratones viejos comparados con jóvenes. El estudio de la activación por voltaje de los

EELC permitirá determinar de una forma más apropiada si alteraciones en la función

del RyR1 o la interacción DHPR-RyR1 contribuyen a la disminución del pico global de

la liberación de Ca "" que ocurre con el envejecimiento (Wang y cois., 2000; González y

cois, 2003). La disminución con la edad del cociente DHPR/RyR1 descrita previamente

(Renganathan cois., 1997; Renganathan y cois., 1998), podría dejar un mayor número

de RyRI desacoplados de los DHPR y por ello sin contribuir a la generación de

"ascuas" Aparentemente, las fibras de rata responden a la despolarización del

sarcolema con ascuas, y la suma de estos eventos permite la reconstrucción de la

señal global de fluorescencia de Ca " , jugando así un papel crítico en el acoplamiento

de excitación-contracción (Csernoch y cois., 2004). El aumento de RyRs desacoplados

en ratones viejos haría que el acoplamiento EC sea más dependiente de la liberación

de Ca^* inducida por Ca " calcio (mecanismo conocido como CICR), la cual resultaría

en un aumento de la frecuencia de las chispas de Ca ""; sin embargo, el efecto de la

disminución en la expresión de los RyRs podría contrarrestar e incluso sobrepasar este

efecto en músculos de ratones viejos.

La homogeneidad de la población de células de ratones jóvenes y viejos

utilizados en este trabajo contradice aparentemente la noción de que el número de

fibras tipo lib disminuye con el envejecimiento (Larsson y cois., 1991; Messi y Delbono,

110



Discusión

2003). Más del 80 % de las fibras de EDL de ratón son tipo lib y la disminución

registrada con el envejecimiento es aproximadamente del 20% (Messi y Delbono,

2003). Para nuestros experimentos hemos disociado fibras de la superficie del músculo

de forma sistemática, y como las fibras lib están distribuidas homogéneamente en todo

el músculo, aunque predominantemente localizadas en la periferia (datos no

mostrados), la probabilidad de disecar fibras de tipo lib en músculos de ratones viejos

es bastante alta.

Las fibras del músculo esquelético son ricas en mitocondrias y se ha demostrado

que estas organelas están localizadas en cercana proximidad al retículo

sarcoplasmático (Ogata y Yamasaki, 1985), actuando presumiblemente como

sumideros de Ca "" en el citoplasma cuando hay exceso de Ca^* (Ramesh y cois., 1998;

Gunter y cois., 2004). Estos estudios sugieren que cambios en la actividad de las

mitocondrias podrían causar cambios en la frecuencia y/o propiedades de los EELC.

Con el envejecimiento la función mitocondrial disminuye o no cambia (Trounce y cois.,

1989; Boffoli y cois., 1994; Rasmussen y cois., 2003). Con el objetivo de identificar los

mecanismos responsables de la disminución de la frecuencia de los EELC, estudiamos

la función de las mitocondrias en fibras de ratones jóvenes y viejos. Nuestros

experimentos de inhibición de la función mitocondrial, junto con la detección de una

variación considerable en la frecuencia de las chispas, dentro de un mismo tipo de

subtipo de fibra, no sugieren un papel relevante de las mitocondrias en las alteraciones

de la generación de los EELC y sus propiedades durante el envejecimiento.

111



6- Conclusiones



Conclusiones

6. CONCLUSIONES

1) La fuerza específica de células únicas e intactas de los músculos

extensor común de los dedos (EDL) y soleo de ratón disminuye con el

envejecimiento

2) La fuerza tetánica específica máxima desarrollada por fibras únicas

intactas de EDL (músculo rápido) y de soleo (músculo lento) no es

significativamente diferente.

3) El estudio de la relación frecuencia de estímulo-fuerza específica de

fibras únicas de ratones de diferentes edades no fue significativamente

diferente para ninguno de los dos músculos (EDL y soleo).

4) El análisis de los parámetros de la cinética de contracción considerados

(tiempo al pico y tiempo medio de relajación) no cambiaron significativamente

con la edad en los músculos EDL o soleo.

5) No se observaron diferencias significativas con la edad en el índice de

fatiga de las fibras de EDL y soleo.

6) El índice de fatiga no mostró correlación alguna con la fuerza específica

registrada en fibras de EDL o soleo.

7) El curso temporal del índice de fatiga fue similar en células de ratones de

diferentes edades tanto en el músculo EDL como en el soleo.

8) La disminución de la liberación de Ca ' del retículo sarcoplasmático está

asociada a la disminución de fuerza específica que ocurre con el

envejecimiento.

9) Un agotamiento de las reservas de Ca "" del retículo sarcoplasmático no

explica la disminución de la liberación de Ca "" que ocurre en fibras de ratones

viejos.

113



Conclusiones

10) El IGF-1 previene la disminución de fuerza específica con el

envejecimiento.

11) Las fibras de ratón viejo, comparadas con las de ratones jóvenes,

muestran un menor número de eventos elementales de liberación de Ca "" y,

además, de menor amplitud.

12) La reducción de la frecuencia y la amplitud de los eventos elementales

de liberación de Ca "" (EELC) con la edad está asociada a una disminución de

la expresión del receptor de la rianodina tipo 1 (RyRI).

13) Las alteraciones de los EELC de fibras de ratones viejos no parecen ser

mediadas por cambios en la función mitocondrial o en el tipo celular.

114



7. Bibliografía



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