BROJ 1 / GODINA 1. - Alphachrom

BROJ 1 / GODINA 1.

BROJ 1 / GODINA 1.

alphasolutions

2

Drage kolegice i kolege,živimo u doba u kojem je komunikacija važnija no ikad. Kako je ve-ćina nas, AlphaChromovih djelatnika, provela dobar dio svog radnog vijeka u laboratoriju, znamo koliko je važno pratiti novosti i biti u kon-tinuiranom kontaktu s kolegama iz struke.Upravo iz želje za boljom komunikacijom, AlphaChrom već gotovo deset godina organizira seminare i radionice, događanja na kojima se stvaraju prilike za druženje i razmjenu iskustava među kolegama, na kojima u prosjeku godišnje sudjeluje više od 600 sudionika. U tim nastojanjima, od kraja 2014. godine, sudjeluje i Asolutic. Osim toga, AlphaChrom i Asolutic su prisutni na gotovo svim većim događanji-ma organiziranima za domaću stručnu javnost.Tijekom 2016. godine organizirali smo 17 seminara na kojima je pre-zentacije održalo 17 kolega s različitih institucija i tvrtki koje koriste instrumente iz portfelja kojeg zastupamo, 23 specijalista iz inozemnih partnerskih tvrtki, a svoja smo rješenja predstavili u čak 5 zemalja. Osim toga, te smo godine organizirali 19 treninga i mini-seminara u našem demo laboratoriju. Kako bismo češće mogli organizirati semi-nare za manje grupe, 2017. godine smo, uz demo laboratorij, osigurali

i predavaonicu te nastavili podjednakim tempom organizirajući 24 seminara, treninga i edukacija. Pritom bismo izdvojili GC/MS seminar i radio-nicu o eteričnim uljima koji smo organizirali na Zavodu za farmakognoziju, Farmaceutsko-bio-kemijskog fakulteta na kojem su gostovali pre-davači s čak tri visokoškolske institucije. Zbog iznimnog interesa za navedeni seminar, morali smo ga ponoviti, odn. organizirati dodatni dan. Na takve smo situacije iznimno ponosni. U jesen 2016. godine predstavili smo i Honeywell Rese-arch Chemicals, tada novost u našem portfelju, a kao logičan nastavak ove smo godine organizirali seminar s temom Karl Fisher titracije. ICP-MS users meeting organiziran u lipnju 2017., na ko-jem su predavači bili isključivo naši korisnici, bio je samo prvi u slijedu users meetinga koje plani-ramo redovito organizirati.No, kao i svaki pravi zaljubljenici u svoj posao, i mi uvijek želimo pružiti više. Osim prilika za druženje, za vas smo pripremili dodatni kanal komunikacije u kojem se prezentiraju ideje i pri-stupi, realizirani projekti i rješenja.Pred vama je prvi broj časopisa AlphaSolutions.Članke koji vas očekuju u nastavku pisali su vaši kolege iz HVI-a, IRB-a, IMI-a, Instituta IGH, Medicinskog fakulteta, Odjela za biotehnologiju u Rijeci, FBF-a, PMF-a, Agronomskog fakulteta u Zagrebu, Fakulteta agrobiotehničkih znanosti Osijek, iz Plive i Euroinspekt Croatiakontrole, ali i naši kolege iz servisa ili prodaje koje ste zasigur-no imali priliku upoznati. Pozivamo vas da nam se sa svojim iskustvima pridružite u sljedećim iz-danjima AlphaSolutionsa.Ovaj, prvi broj obuhvaća širok raspon tema, od analiza polutanata u prehrambenim proizvodima i utjecaja dodataka prehrani na zdravlje, analiza bioaktivnih supstanci u vinima i eteričnim ulji-ma, analizama u farmaceutskoj industriji, do iskustava specifičnih laboratorija i tehnika koji-ma se bave. Ovisno o željama i potrebama, teme ćemo prilagođavati iz broja u broj. Sve vaše suge-stije i kritike su dobrodošle jer želimo da priča o ovom časopisu raste i bude sve bolja i bolja.Sada vam prepuštamo da uživate u vašem i našem prvom broju.

S poštovanjem,Siniša Stipaničić

alphasolutions

3

04 Određivanje zaostataka antibiotika u mlijeku i mesu korištenjem Q-TOF vremenskog spektrometra masa

I. Varenina

10 Utjecaj dodataka prehrani obogaćenih n-3 višestruko nezasićenim masnim kiselinama na poboljšanje funkcije beta-stanica kod trudnica koje boluju od dijabetesa tipa 1

M. Horvatiček, J. Đelmiš, M. Ivanišević, I. Delaš

14 Analiza žive ICP-MS metodom i primjena u procjeni izloženosti ljudi J. Jurasović

18 Analiza polifenola u vinima Belica pomoću LC-QQQ L. Saftić, Ž. Peršurić, T. Pavlešić, S. Kraljević Pavelić

20 Analiza eteričnih ulja lavandina i smilja u spregnutom sustavu plinske kromatografije sa spektrometrijom masa

S. Vladimir-Knežević

24 Supramolekulski receptori kationa i aniona N. Bregović

28 Višedimenzionalna tekućinska kromatografija proteina i peptida primjenom robotskog sustava AssayMAP Bravo

L. Dončević, A. Hozić, M. Cindrić

32 Primjena spektrometrije masa u razvoju i rutinskim analizama aktivnih farmaceutskih supstancija M. Runje

35 Direktna analiza žive u vašem laboratoriju S. Pajurin

36 Patvorenje pčelinjeg voska: aspekti kontaminacije i rezultati analiza pčelinjeg voska s tržišta L. Svečnjak

38 Utjecaj rane defolijacije na koncentracije hlapljivih spojeva u vinima sorte Cabernet sauvignon iz vinogorja Srijem

M. Drenjančević, V. Rastija, V. Jukić, K. Zmaić, T. Kujundžić, A. Rebekić, F. Schwander

42 Laboratorij na granici mikro i makro svijeta – problematika metala u građevinskom materijalu M. Đuroković

44 Plinska kromatografija u farmaceutskoj industriji I. Černava

47 Male molekule i molekularni biljezi I. Crnolatac, I. Piantanida

48 Iskustvo u provođenju laboratorijskih ispitivanja, kontrole kakvoće hrane J. Trbušić

50 Alphachrom servis svakodnevno osigurava optimalan rad više od 1000 instrumenata u tri zemlje N. Sakić

52 Otkrijte savršenu formulu uz Honeywell Research Chemicals S. Berglez Jarc

54 Sve što ste željeli znati o pivu... saznajte uz Skalar analizatore S. Pajurin

56 Autoklavi - validacija i postupci pravilnog autoklaviranja M. Volarić

SADRŽAJ

alphasolutions

4

Sveopća primjena antibiotika u uzgoju životinja terapeutske, preventivne svhe ili kao promotora rasta ima za direktnu posljedicu pojavu i širenje antibiotičke rezistencije, odnosno njihovih štet-nih toksikoloških učinaka.Ova činjenica čini analize rezidua antibiotika u hrani životinjskog podrijekla važnim područjem sigurnosti hrane.Veliki broj komercijalno dostupnih veterinarskih lijekova izazvao je stalni porast broja analita koji se prate kako bi se osigurala sigurnost hrane u hra-ni životinjskog podrijetla. Analitičke metode koje se koriste za otkrivanje rezidua veterinarskih lijekova tradicionalno se temelje na tandem spektrometriji masa zbog svo-je velike selektivnosti i osjetljivosti. Tehnikama masene spektrometrije s trostrukim kvadropo-lom mogu se provoditi orijentacijske i potvrdne analize, ali su takve metode razvijene za određenu grupu analita i mogu se koristiti samo za analizu poznatih spojeva. Tehnike masene spektrometrije s visokom rezo-lucijom razvijene su kako bi se omogućile analize poznatih i nepoznatih supstancija. To je omogu-ćio razvoj multimetoda za širok raspon antibioti-ka. Također, njezina primjena je od iznimne važ-nosti u otkrivanju nepoznatih metabolita lijekova.

Institucija / Hrvatski veterinarski institut, Laboratorij za određivanje rezidua

Autor / dr. sc. Ivana Varenina

OdređIvAnje zAOstAtAkA

u mlIjeku I mesu kOrIštenjem Q-tOF vremenskOg spektrOmetrA mAsA

Slika 1. Kruženje zaostataka antimikrobnih supstancija u okolišu (preuzeto iz disertacije Varenina, 2015.)

AntIbIOtIkA

alphasolutions

5

RegulativaZakonodavni okvir za određivanje rezidua antibiotika u hrani životinj-skog podrijekla definiran je Uredbom komisije (EZ) br. 37/2010 - o farmakološki aktivnim supstancama i njihovoj klasifikaciji u vezi s mak-simalnim granicama rezidua (MRL) u hrani životinjskog podrijetla. Istom se propisuju MRL vrijednosti za sljedeće grupe antibiotika: pe-nicilini, cefalosporini, kinoloni, makrolidi sulfonamidi, tetraciklini, fe-nikoli, ortosomicin, polipeptidi, streptogramini i pleuromutilini, koje

Penicillins Cefalopsorins Quinolones Macrolides Lincosamides Sulfonamides

Amoxicillin Cefacetrile Danofloxacin Erythromycin Clindamycin Sulfachloropyridazine

Ampicillin Cefalexin Difloxacin Gamithromycin Lincomycin Sulfadiazine

Benzylpenicillin Cefalonium Enrofloxacin Josamycin Pirlimycin Sulfadimethoxine

Cloxacillin Cefapirin Flumequin Oleandomycin Sulfadoxin

Dicloxacillin Cefazolin Lomefloxacin Rifaximin Sulfaguanidine

Naphcillin Cefoperazone Marbofloxacin Roxythromycin Sulfamerazine

Oxacillin Cefquinome Nalidixic acid Spiramycin Sulfameter

Penethamate Ceftiofur Norfloxacin Tildipirosin Sulfamethazine

Phenoxymethylpenicillin Ofloxacin Tilmicosin Sulfamethoxazole

Orbifloxacin Tulathromycin Sulfamethoxypyridazine

Oxolinic acid Tylosin Sulfamonomethoxine

Pefloxacin Tylvalosin Sulfaquinoxaline

Sarafloxacin Sulfathiazole

Sulfisoxazole

Trimethoprim

Dapsone

Tetracyclines Fenicols Orthosomycin Polipeptide Streptogramin Pleuromutilins

Chlortetracycline Epi-chlortetracycline

Florfenicol Avilamycin Bacitracin Virginiamycin M1 Tiamulin

Demeclocyclin Thiamphenicol Novobiocin Virginiamycin S1 Valnemulin

Doxycycline

Oxytetracycline Epi-oxytetracycline

Tetracycline Epi-tetracycline

Tablica 1. Popis antibiotika uvrštenih u multimetodu prema zahtjevima Uredbe komisije (EZ) br. 37/2010

su uključene u Nacionalni plan monitoringa pred-metnih analita.Na osnovi zakonodavnog okvira unutar Labora-torija za određivanje rezidua Hrvatskog veterinar-skog instituta provode se analize svih definiranih grupa antiobitka dok je cjelokupni popis analita prikazan u tablici 1.

alphasolutions

alphasolutions

6

Postupci razvoja metodePrilikom razvoja metode koja će biti uvrštena u službenu kontrolu uzoraka animalnog podrijetla potrebno je provesti određene korake kako bi se osigurala zavoljavajuća osjetljivost uređaja i utvrdili para-metri specifičnosti, unutar-laboratorijske reproducibilnosti, limita detekcije (CCα) i sposobnosti dokazivanja metode (CCβ), te ro-busnost. Koraci pri razvoju metode prikazani su u Tablici 2.

Tablica 2. Postupci razvoja orijentacijske i potvrdne metode s Q-TOF tehnikom

Slika 2. Kromatogram amoksicilina Targeted MS/MS načinom snimanja i FIA analizom bez LC kolone (engl. Flow injection analysis)

Slika 3. Put fragmentacije amoksicilina (preuzeto iz Szultka i sur., 2014)

IZGRADNJA BAZE PODATAKA MASENIH SPEKTARA (PCDL, engl. Personal Compound Database and Library )

OPTIMIZACIJA PARAMETARA MASENOG SEPKTROMETRA S VREMENOM PRELETA (QTOF)

OPTIMIZACIJA PARAMETARA TEKUĆINSKE KROMATOGRAFIJE

VALIDACIJA METODE U SKLADU S DIREKTIVOM 2002/657/EC

Kako bi se snimili maseni spektri spojeva pri razli-čitim kolizijskim energijama potrebno je injektirati standardne otopine svakog pojedinog analita te na-kon fragmentacije u kolizijskoj ćeliji snimiti masene spektre. Koristeći računalni program za kvalitativno određivanje spojeva (Agilent MassHunter Qualitati-ve software) moguće je generirati formule dobive-nog spoja te ih povezati sa snimljenim spektrom. Nakon identifikacije specifičnih fragmenata za ispi-tivani analit, spektri se spremaju u PCDL bazu po-dataka. Na primjerima prikazanim na Slikama 2, 3 i 4 pokazan je postupak snimanja amoksicilina. Na-kon generiranja formula iz dobivenih masenih spek-tara detektirani su produkt ioni s najvećim odzivom. Najintenzivniji produkt ion m/z 349,0846 dobiven je gubitkom amonij iona.

alphasolutions

7

Slika 4. Maseni spektar amoksicilina prikazan kao cijeloviti snimak masa (Full Scan) te spektri produkt iona dobivenih pri različitim kolizijskim energijama (0, 10, 20, 40 eV)

Nakon izrade formula, na temelju dobivenih spektara raču-nalni program računa i predlaže formulu spoja s najboljom točnosti masa (engl. Mass Accuracy) te najboljom raspo-djelom masa izotopa tog spoja (engl. Isotope score).

Slika 5. Distribucija izotopa doksiciklina uz zadovoljavajuću točnost masa (<5ppm) i visoku ocjenu određivanja (Score =83,44)

alphasolutions

8

Rad s Q-TOF tehnikom omogućava rad s tri na-čina snimanja: MS-TOF mode, Auto MS/MS i Targeted MS/MS. MS-TOF način rada najčešće je korišten način snimanja pri kojem kvadropol propušta sve ione te se u četiri različita eksperi-menta primjenjuju 4 različite kolizijske energije. Svi generirani ioni ulaze u Q-TOF detektor te se kao takvi detektiraju na masenom spektru. Mje-renje se vrši pri rezoluciji od 2 GHz, pri rasponu masa < 1700 Da.Kako bi se postigla najbolja osjetljivost bilo je potrebno provesti optimizaciju parametara Q-TOF detektora (Tablica 3). Jedan od značaj-nih parametara ionizacijskog izvora (ESI, engl. electrospray ionisation) je Fragmentor, tj. napon koji se primjenjuje na izlazu kapilare kako bi ionizirao spojeve. Za nestabilne molekule frag -mentor je niži kako bi se izbjegla fragmentacija prije ulaska u kolizijsku ćeliju. Sljedeći važan pa-rametar je napon kapilare koji se primjenjuje na ulazu u kapilaru i utječe na prijenos iona.

Parameter Value

Fragmentor V 350

Capillary voltage V 3500

Nozzle voltage V 0

Octopole RF Peak V 750

Skimmer V 45

Gas temp. °C 150

Gas Flow l/min 18

Nebulizer (psig) 30

Sheath Gas Temp. 400

Sheath Gas Flow 12

Funnel Exit DC 50

Funnel RF HP 150

Funnel RF LP 60

Tablica 3. Optimizirani parametri ionskog izvora

S obzirom na širok raspon spojeva s različitom polarnošću koji su zastupljeni u metodi, koristi se kromatografska kolona kompatibilna s 100% vodenom mobilnom fazom.

Tablica 4. Gradijentna elucija uz mobilnu fazu A (0,1% mravlja kiselina) i mobilnu fazu B (MeOH, MS grade)

Slika 5. EIC kromatogram analita multi-metode za određivanje antibiotika

alphasolutions

alphasolutions

9

Implementacija metodeValidacija metode je pokazala zadovoljavajuće kriterije specifičnosti, preciznosti, unutarlaboratorijske reproducibilnosti i osjetljivosti s obzirom na propisane maksimalne dozvoljene količine veterinarskih lijekova u hrani animalnog podrijetla.Redovni postupci kontrole rezidua antibiotika sastoji se od pripreme slijepih kontrola i obogaćenih kontrola pri čemu se priprema matriks kalibracijska krivulja. Uz kontrolne uzorke pripremaju se redovni uzorci u kojima se pretražuje prisutnost analita (Slika 6). Složena predpriprema tekućinskog kromatografa i Q-TOF detektora uključuje čišćenje UHPLC uređaja, čišćenje nebulizacijske igle, ESI izvora iona i masenog spektrometra. Prije analize određenog seta uzoraka uređaj je potrebno kalibrirati kalibracijskom otopinom. Za vrijeme analiza primjenjuju se referentne mase 121,0508 i 922,0098 za ionizaciju pozitivnih iona te 112,9856 i 1033,9881 za ionizaciju ne-gativnih iona, koje služe za korekciju greške određivanje točne mase.Obrada podataka dobivenih analizom masenim spektrometrom s Q-TOF detektorom provodi se računalnim programom Agilent Mass-Hunter Quantitative Software. Parametri koji kod kontrolnih uzoraka potvrđuju prisutnost analita su: retencijsko vrijeme (RT, min), odgo-vor instrumenta s obzirom na šum (Response), točnost masa (ppm), odgovor produkt iona, odnos prekursora i produkt iona, točnost masa produkt iona (ppm).

Slika 6. Prikaz kalibracijske krivulje gamitromicina na mišiću, prekursor iona i tri produkt iona sa zadovoljava-jućim ionskim odnosima.

ZaključakMetoda određivanja rezidua antimikrobnih sup-stancija tehnikom tekućinske kromatografije s Q-TOF detekcijom primjenjeniva je u analizi redovnih uzoraka mišića i mlijeka. Prednosti korištenja ove tehnike su mogućnost uvođenja neograničenog broja analita i retrospektivno pre-traživanje spektara. Mogućnost snimanja cijelog spektra te pretraživanje nepoznatih spojeva čini ovu tehniku prikladnom i za eksperimentalne svrhe.

9

alphasolutions

10

Institucija / 1Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavodu za kemiju i biokemiju 2Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Katedra za ginekologiju i opstetriciju

3Institut Ruđer Bošković

Autori / dr. sc. Marina Horvatiček3, prof. dr. sc. Ivančica Delaš1, prof. emeritus Josip Đelmiš2, prof. dr. sc. Marina Ivanišević2

Dijabetes tipa 1 (Diabetes mellitus, DM-1) je autoimuna bolest usmje-rena protiv beta-stanica gušterače. Posljedica je gubitak funkcije be-ta-stanica i nemogućnost (nesposobnost) proizvodnje inzulina do razine koja je potrebna za održavanje normalne koncentracije glukoze u krvi. Kao jedan od najčešćih metaboličkih poremećaja, DM-1 odra-žava se na cijelu trudnoću. Trudnoća je jedinstveni događaj u kojem genetski i imunološki strani fetus preživi do punog termina bez odbacivanja od strane imunološ-kog sustava majke [1]. Povezana je s djelomičnom supresijom imuno-loškog upalnog sustava zbog čega autoimune bolesti poput dijabetesa često idu u remisiju tijekom trudnoće [2]. Te se promjene kod dijabe-tičnih trudnoća odražavaju na povećanje rasta beta-stanica gušterače i na njihovu poboljšanu funkciju, u usporedbi sa stanjem prije trudno-će. Najpouzdaniji pokazatelj izlučivanja endogenog inzulina i očuva-nja funkcije beta-stanica je koncentracija C-peptida u krvi. C-peptid i inzulin nastaju iz molekule preteče proinzulina te se zajedno izlučuju u ekvimolarnoj količini u portalnu cirkulaciju. Za razliku od inzuli-na, C-peptid se ne apsorbira u jetrima i ima duže vrijeme poluživota od inzulina, stoga je pogodan za mjerenje koncentracije endogenog inzulina u perifernoj cirkulaciji (Nussey i Whitehead, 2001; Faber i sur., 1978).Osim genetičkih čimbenika, važnu ulogu u patogenezi DM-1 imaju i okolišni čimbenici, poput prehrane [5]. U ranijim istraživanjima po-kazana je važnost prehrane u sprječavanju pogoršanja bolesti. Primje-rice, vitamini D i E, nikotinamid i n-3 višestruko nezasićene masne kiseline (engl. polyunsaturated fatty acids, PUFA) mogu imati zaštitni utjecaj kod djece i odraslih oboljelih od DM-1 [5,6]. Također, ranija istraživanja pokazala su da n-3 PUFA mogu imati povoljan utjecaj na očuvanje funkcije beta-stanica [6] i na smanjenje upalnih procesa [7].Višestruko nezasićene masne kiseline, linolna kiselina (LA, C18:2n-6) i α-linolenska kiselina (ALA, C18:3n-3), ne mogu se „de

betA-stAnIcA kOd trudnIcA

novo“ sintetizirati u ljudskom organizmu jer nisu prisutni odgovarajući enzimi i moraju se unijeti u organizam putem hrane. Nazivamo ih esenci-jalnim masnim kiselinama i preteče su u sintezi drugih PUFA u tijelu. Iz LA i ALA naizmjenič-nim nizom djelovanja enzima elongaza i desatu-raza izvode se druge nezasićene masne kiseline. LA je preteča n-6 skupine masnih kiselina: di-homo-γ-linolenske (DGLA, C20:3n-6) i arahi-donske kiseline (AA, 20:4n-6). Kao preteča n-3 skupine masnih kiselina služi ALA od koje kre-će sinteza eikozapentaenske (EPA, C20:5n-3) i dokozaheksaenske kiseline (DHA, C20:6n-3). S obzirom da učinkovitost endogene pretvorbe ALA iz hrane u EPA i DHA u organizmu odra-slog čovjeka nije velika, EPA i DHA danas se ta-kođer smatraju esencijalnim masnim kiselinama.

Tijekom trudnoće prehrambene potrebe majke povećane su zbog potreba rastućeg fetusa i pla-cente. Uravnotežena i raznolika prehrana osigu-rava potrebne prehrambene tvari. Današnjim stilom prehrane to nije jednostavno izvedivo i trudnicama se često preporučuje uzimanje doda-taka prehrani koji sadrže optimalan sastav vitami-na i mineralnih tvari potrebnih za razvoj fetusa. U sklopu ovog istraživanja trudnice su koristile dodatak prehrani koji, pored vitamina i mineral-nih tvari, sadrži n-3 PUFA (EPA i DHA). Takva suplementacija može osigurati dodatne zalihe n-3 PUFA potrebnih za normalan rast i razvoj djeteta, kao i za metabolizam majke.

utjecAj dOdAtAkA prehrAnI ObOgAćenIh n-3 vIšestrukO nezAsIćenIm mAsnIm kIselInAmA nA pObOljšAnje FunkcIje

kOje bOluju Od dIjAbetesA tIpA 1

alphasolutions

11

Cilj istraživanja bio je utvrditi utjecaj dodatka prehrani obogaćenog n-3 PUFA na očuvanje beta-stanica/koncentraciju C-peptida kod trudnica koje boluju od DM-1.

Sudionice i metode istraživanjaIstraživanje je provedeno u Referentnom centru Ministarstva zdrav-stva i socijalne skrbi za dijabetes u trudnoći, u sklopu Klinike za žen-ske bolesti i porođaje Kliničkog bolničkog centra Zagreb. U razdoblju od 2013. do 2017. godine u istraživanje je bilo uključeno 100 trudnica koje boluju od DM-1. Kontrolna je skupina (n=50) bila samo na uobi-čajenoj dijabetičkoj prehrani, dok je istraživana skupina (n=50), pored uobičajene dijabetičke dijete, uzimala dodatak prehrani obogaćen n-3 PUFA. Dodatak prehrani obogaćen n-3 PUFA osiguran je donacijom kapsula Pregnazon Complete (HealthAid LTD), ljubaznošću tvrtke Kormedix d.o.o. iz Zagreba. Kapsule osim ostalih optimalnih/potreb-nih vitamina i mineralnih tvari za trudnice sadrže i 195 mg n-3 PUFA, od toga 30 mg eikozapentaenske kiseline (EPA, C20:5n-3) i 154 mg dokozaheksaenske kiseline (DHA, C22:6n-3). Trudnice u ispitivanoj

skupini uzimale su kapsulu Pregnazon Com-plete dvaput dnevno uz obrok.U studiju su uključene dijabetične trudnice koje nisu imale komplikacija dijabetesa, a ti-jek trudnoće je protekao uredno i rodile su zdravu novorođenčad. Uzorci krvi uzeti su ujutro natašte u epruvete s gelom za razdvajanje seruma, centrifugirani na 1400×g 10 minuta, nakon čega je serum odvojen i pohranjen u zamrzivač na -65 °C do daljnje analize. Uzorci krvi uzimani su prilikom prvog dolaska u Kliniku (1. tromje-sečje), zatim u 2. i u 3. tromjesečju.

Ekstrakcija ukupnih lipida i prevođenje masnih kiselina u metilne este-re provedena je na Zavodu za kemiju i biokemiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu.Ukupni lipidi su iz uzoraka seruma izdvojeni modificiranom metodom po Folchu, ekstrakcijom organskim otapalima [8]. Prevođenje masnih kiselina u hlapljive derivate provedeno je postupkom transesterifikaci-je uz metanolnu HCl, pri čemu nastaju metilni esteri masnih kiselina (engl. Fatty Acid Methyl Ester, FAME), prema međunarodnom standar-dnom postupku ISO 5509 (ISO, 2000). Analiza sastava metilnih estera masnih kiselina provedena je plinskom kromatografijom na kromatografu Agilent 7890B (Agilent Techno-logies, CA, SAD), opremljenom plameno-ionizacijskim detektorom (FID). Analiza je omogućena ljubaznošću tvrtke Sample Control d.o.o. Za razdvajanje metilnih estera korištena je kapilarna kolona HP 88, dulji-ne 100 m, unutarnjeg promjera 0,25 mm te debljine aktivnog sloja 0,20 µm (Agilent J&W, SAD). Instrument je opremljen uređajem za automat-sko injektiranje uzorka („autosampler“) istog proizvođača, uz mogućnost aplikacije smanjenog volumena uzorka („split/splitless“ sustav). Tempera-tura injektora iznosila je 200 °C, a temperatura detektora 250 °C.

kOje bOluju Od dIjAbetesA tIpA 1

Cilj istraživanja bio je utvrditi utjeCaj dodatka prehrani obogaćenog n-3 puFa na očuvanje beta-staniCa/konCentraCiju C-peptida kod trudniCa koje boluju od dM-1.

alphasolutions

12

Početna temperatura kolone iznosila je 140 °C prvih 5 minuta, a po-tom slijedi porast od 4 °C/min do 240 °C, koja se zadržava 15 minuta. Uzorak (0,5 µL) je injektiran u split modu omjera 1:100. Kao plin no-sač korišten je helij čistoće 6.0, uz protok od 0,8 mL/min.Identifikacija pojedinih masnih kiselina provedena je na temelju vre-mena retencije usporedbom s vremenom retencije poznatih standarda (PUFA No. 1, PUFA No. 3, C8-C20, Supelco 37 Component FAME mix, sve Supelco, SAD).Sadržaj masnih kiselina izražen je kao relativni maseni udio (%) i mase-na koncentracija (mg/L). Kvantitativno određivanje pojedinih masnih kiselina provedeno je usporedbom površine vrška internog standarda (heptadekanska kiselina, C 17:0, Sigma Aldrich, Njemačka) s površi-nom vrška pojedine masne kiseline. Obrada kromatograma provedena je integriranim računalnim programom Agilent 7890B GC (Agilent Technologies, CA, SAD).

RezultatiAnalizom masnokiselinskog sastava ukupnih lipida seruma identificira-ne su 23 različite masne kiseline (Slika 1). Zbog primarnog cilja istraži-vanja o utjecaju dodatka prehrani obogaćenog n-3 PUFA na koncentra-ciju C-peptida i poboljšanje funkcije beta-stanica, rezultati su sažeti na karakteristične omjere masnih kiselina. Prikazani su omjeri suma n-6 i n-3 PUFA (n-6/n-3) te omjeri arahidonske i dokozaheksaenske kiseline (AA/DHA).Kontinuirana suplementacija očekivano je utjecala na porast masenih koncentracija arahidonske (AA) i dokozaheksaenske kiseline (DHA), dok je samo masena koncentracija DHA bila značajno veća u istraživa-

Slika 1. Analizom sastava metilnih estera masnih kiselina u serumu sudionica identificirane su 23 različite masne kiseline. Analiza je provedena plinskom kromatografijom uz plameno-ionizacijski detektor.

alphasolutions

13

1. Poole, J. A.; Claman, H. N. (2004) Immunology of

Pregnancy: Implications for the Mother, Clinical Reviews in

Allergy & Immunology, 26:161–170.

2. Wilder, R. L. (1998) Hormones, pregnancy, and autoimmune

diseases, Annals of the New York Academy of Sciences,

840:45–50.

3. Nussey, S., Whitehead, S. (2001) Endocrinology: An

Integrated Approach.

4. Faber, O. K.; Hagen, C.; Binder, C.; Markussen, J.; Naithani,

V. K.; Blix, P. M.; Kuzuya, H.; Horwitz, D. L.; Rubenstein, A. H.;

Rossing, N. (1978) Kinetics of human connecting peptide in

normal and diabetic subjects, Journal of Clinical Investigation,

62:197–203.

5. Stene, L. C.; Ulriksen, J.; Magnus, P.; Joner, G. (2000) Use of

cod liver oil during pregnancy associated with lower risk of Type

I diabetes in the offspring, Diabetologia, 43:1093–1098.

6. Mayer-Davis, E. J.; Dabelea, D.; Crandell, J. L., Crume, T.,

D’Agostino, R. B., Dolan, L., King, I. B., Lawrence, J. M.; Norris,

J. M.; Pihoker, C. and The, N. (2013) ‘Nutritional factors and

preservation of C-peptide in youth with recently diagnosed type

1 diabetes: SEARCH Nutrition Ancillary Study.’, Diabetes care,

36:1842–50.

7. Simopoulos, A. P. (2002) Omega-3 fatty acids in

inflammation and autoimmune diseases, Journal of the

American College of Nutrition, 21:495–505.

8. Folch, J.; Lees, M.; Sloane–Stanley, G. H. (1957) A simple

method for the isolation and purification of total lipids from

animal tissues. J Biol Chem., 226:497-509.

9. Horvatiček, M. (2017) Utjecaj suplementacije n-3

polinezasićenim masnim kiselinama na koncentraciju

C-peptida kod trudnica koje boluju od dijabetesa tipa 1.

Doktorska disertacija, Molekularne bioznanosti, Sveučilište u

Osijeku.

10. De Caterina, R.; Zampolli,A. (2004) From Asthma to

Atherosclerosis — 5-Lipoxygenase, Leukotrienes, and

Inflammation. N Engl J Med, 350:4-7.

noj skupini [9]. Porast masenih koncentracija odrazio se na značajno smanjenje omjera AA/DHA i n-6/n-3 u drugom i trećem tromjesečju trudnoće u istraživanoj skupini u odnosu na kontrolnu skupinu (Slika 2) [9]. Omjeri AA/DHA i n-6/n-3 koriste se kao pokazatelji upalnog stanja u organizmu, a temelje se na antagonističkom djelovanju eikoza-noida sintetiziranih iz skupina n-3 i n-6 PUFA. Eikozanoidi čine skupi-nu fiziološki aktivnih spojeva koji djeluju kao lokalni hormoni. Nastaju pregradnjom iz masnih kiselina s 20 C-atoma, prvenstveno iz AA i EPA. Eikozanoidi sintetizirani iz skupine n-6 i n-3 PUFA međusobno djelu-ju antagonistički što znači da će se iz AA koja je n-6 reda sintetizirati proupalni eikozanoidi, dok je EPA iz n-3 serije preteča protuupalnih eikozanoida [10].Na stvaranje i aktivnost eikozanoida može se utjecati promjenom koli-čine i vrste masnih kiselina u prehrani. Tako će, primjerice, zamjena ulja u kojima prevladavaju n-6 PUFA hranom i uljima u kojima prevladavaju n-3 PUFA, smanjiti proizvodnju proupalnih eikozanoida i omogućiti prednost proizvodnji protuupalnih eikozanoida. U ovom istraživanju prikazano je da je povećan unos n-3 PUFA, u obliku dodatka prehrani, u istraživanoj skupini značajno smanjio masni udio AA i posljedično omjere AA/DHA i n-6/n-3 PUFA, pokazatelje upalnog stanja u orga-nizmu (Slika 2) [9]. Sudionice koje su uzimale dodatak prehrani obogaćen n-3 PUFA imale su i značajno veću koncentraciju C-peptida u trećem tromje-sečju trudnoće, u odnosu na prvo tromjesečje. Također, koncentracija C-peptida bila je značajno veća u trećem tromjesečju trudnoće istra-živane skupine u usporedbi s trudnicama kontrolne skupine [9]. Do-biveni rezultati pokazuju da je povećan unos n-3 PUFA, u kombinaciji s remisijom upalnog imunološkog sustava tijekom trudnoće, povoljno utjecao na poboljšanje funkcije beta-stanica kod trudnica koje boluju od dijabetesa tipa 1.

Slika 2. Povećan unos n-3 PUFA značajno je smanjio omjer n-6/n-3 PUFA (pokazatelj upalnog stanja u organizmu) u istraživanoj skupini u 2. i 3. tromjesečju trudnoće.

Literatura

alphasolutions

14

Institucija / Institut za medicinska istraživanja i medicinu rada, Jedinica za analitičku toksikologiju i mineralni metabolizam

Autor / dr. sc. Jasna Jurasović

AnAlIzA ŽIve Icp-ms metOdOm I prImjenA

u prOcjenI IzlOŽenOstI ljudI

Zašto se živa spominje kao osobito interesantan metal? Više je razloga.Ponajprije, živa je srebrnastobijel metal, jedini metal koji se pri sobnoj temperaturi nalazi u te-kućem stanju. Tekuća živa vrlo je fluidna i ima veliku površinsku napetost pa se lako formira u kuglaste kapi koje ne moče stijenke posude ili podloge pa na površini stvara konveksni rub.Zato s toksikološkog gledišta, živu dijelimo na anorgansku i njene spojeve te organsku i njene spojeve. Kod anorganske, toksikološki su nam zanimljive živine pare (”živina para” koja nastaje iz tekuće Hg puno je opasnija od teku-će forme) te elementarna Hg i divalentne soli. Vjerojatno je da merkuro-ion ne postoji u toj formi (dugo) u organizmu (možda je intermedi-jer) jer je nestabilan oblik u prisutnosti bioloških molekula (nastaje merkuri i atom HgO).Živa je dugo vremena korištena kao „lijek”, sve do početka 20. st.: dugovječnost, „vječni” život (Kina), liječenje sifilisa u 15. st. (Saracenska mast), diuretik (kalomel), protiv ušiju i drugih kožnih nametnika. Radi antiseptičkog, bakteri-cidnog i bakteriostatskog djelovanja, živini pre-parati se od davnina upotrebljavaju u medicini (danas su se ponegdje zadržali kao antiseptici). Osim toga, postupak izdvajanja zlata i srebra ži-vom koristi se od davnina, sve do današnjih dana.

Zakonska regulativaRegulirane su maksimalne dopuštene koncen-tracije žive u hrani i piću. Kontrola prisutnosti u: vodi za piće, morskoj hrani, farmaceutskim proizvodima i igračkama za djecu i ostalim pred-metima opće uporabe.

Europska unija (EU) privremeno je dogovorila da se amalgamski is-puni od 1. srpnja 2018. zabrane za djecu mlađu od 15 godina, trudni-ce i žene koje doje. Međutim, generalno ukidanje zubnih ispuna koji sadržavaju živu još uvijek nije došlo na dnevni red. Do 2020. odlučit će se hoće li se upotreba tih materijala u potpunosti ukinuti do 2030. godine.Procjenjuje se da amalgam godišnje otpušta do 75 tona vrlo toksičnog teškog metala u EU. Premda Europska komisija smatra da su amal-gamski ispuni sigurni za pacijente, pogotovo kada su inkapsulirani u ustima, istraživanja su pokazala da dentalni amalgam može izazvati trovanje živom u genetski osjetljivih populacija.Osim toga, kritičari su izrazili zabrinutost zbog zdravstvenih rizika koje sa sobom donosi taj materijal tijekom obrade i zbrinjavanja, kao i kod spaljivanja umrlih osoba u krematoriju. Istraživanja koja uklju-čuju dentalno zdravstveno osoblje dodatno su pokazala da izloženost živi iz dentalnog amalgama tijekom postavljanja i uklanjanja može uzrokovati ili pridonijeti mnogim kroničnim bolestima i može dovesti do depresije, anksioznosti i samoubojstva.Premda je upotreba amalgama u opadanju u mnogim zemljama s viso-kim dohotkom, trenutačno ne postoje široko dostupne alternative u zemljama s niskim i srednjim primanjima. Prihvatljivi tjedni unos (TWI) za MeHg je 1.3 µg Hg / kg tjelesne mase. Procjena je da tri do 15 milijuna osoba diljem Europe ima vrijednosti žive veće ili jednake preporučenim sigurnim razinama za živu (Europe-an Food Safety Authority (EFSA), radna skupina za onečišćivače u hra-nidbenom lancu, 2012. godine).

europska unija (eu) privreMeno je dogovorila da se aMalgaMski ispuni od 1. srpnja 2018. Zabrane Za djeCu MlaĐu od 15 godina, trudniCe i žene koje doje.

alphasolutions

Eksperimentalni dioU laboratoriju u kojemu se analiziraju i pripremaju uzorci osigurani su uvjeti pozitivnoga tlaka i filtriranja zraka HEPA filterima (HVAC sustav Heating , Ventilating and Air Conditioning). U sklopu analize žive ICP MS tehnikom, unutar našeg laboratorija analiziraju se biološki uzorci čovjeka (puna krv/ eritrociti, serum/plazma, urin, majčino mlijeko, krv i serum pupkovine, tkivo posteljice, sjemena tekućina, cerebrospinalna tekućina, zglobna tekućina, slina, kosa, mišićno tkivo (nakon artroplastike kuka); uzorci iz okoliša (voda: riječna i mor-ska), povrće (salata, matovilec, kupus), tlo i sediment; eksperimen-talne životinje.

Priprema uzoraka

Za pripremu uzoraka koristimo dva ispod navedena načina pripreme uzorka.1. Mikrovalna digestija koristeći uređaj UltraClave IV, Milestone Srl Italy• 0.5 ml WB/ 0.1-0.5 g tkiva + 3 ml HNO3 + 2 ml H2O / 10 ml; • razrjeđenje digestiranog uzorka

(0.1% HNO3 / 2-5 ppb IS) prije analize• Tmax=300°C; Pmax=200 bar• No of samplesmax=40

- potrebno vrijeme za 40 uzoraka: ~2.5 h na 250°C

2. Direktno razrjeđenje u lužnatoj otopini NH3/EDTA• krv/serum/CF/SF/ (0.05/0.15 ml)

+ 0.7mM NH3 0.001 mM EDTA3-5 ml otopine uzorka za analizu 0.07% TX-100 2 ppb IS (Ge, Rh, Tb, Lu, Ir)

*3-5 ml otopine uzorka za analizu

t (min:s) E (W) T1 (°C) T2 (°C) p (bar)

1. 3:30 70 70 60 100

2. 15:00 1000 180 60 100

3. 10:00 1000 220 60 120

4. 30:00 1000 220 60 120

5. 40:00 0 30 25 20

alphasolutions

15

alphasolutions

Instrumentalni dioAnalitički izazov kod analize žive:• Hg ima vrlo visok prvi ionizacijski potencijal

(10.44 eV), samo oko 4% je ionizirano u plaz-mi pa je relativno niska osjetljivost mjerenja budući da se ICP-MS tehnikom detektiraju samo ioni (ne atomi),

• Hg ima veliki broj prirodnih izotopa (7); naj-viša zastupljenost < 30% osjetljivost,

• u vodenim/razrijeđenim uzorcima Hg se „gubi”, dolazi do adsorpcije na stijenke po-sude s uzorkom (osobito plastika!!!) i na sve cjevčice koje su dio sustava za uvođenje uzo-raka, što znači loše iskorištenje (recovery) i dulje vrijeme ispiranja,

• moguć je znatan gubitak analita pri digestira-nju uzorka u otvorenim posudama zbog hla-pljivosti Hg.

Uspješna analiza niske razine Hg ICP-MS me-todom:• visoka temperatura plazme (postići čim niži

CeO+/Ce+ omjer) radi maksimalne ionizaci-ja Hg atoma,

• visoka osjetljivost ICP-MS sustava (kako bi se kompenzirao niski stupanj ionizacije i niska količina mjerenog izotopa),

• odgovarajuća priprema i „konzerviranje” uzo-raka radi osiguranja stabilnosti Hg u otopini.

*U vodenim se otopinama Hg u različitim omjerima

raspodjeljuje između tri oksidacijska stanja: Hg(II) Hg(I) i

Hg(0) što znači postupni gubitak Hg(0) iz otopina, osobito u

poroznom plastičnom laboratorijskom posuđu, čija površina

dodatno djeluje kao reaktivno mjesto za redukciju adsorbirane

ionske Hg u Hg(0).

ICP MS 7500cx Agilent Technologies opremljen integriranim automatskim uzorkivačem (I-AS), MicroMist raspršivačem, komorom za rasprši-vanje tipa Scott, kvarcnim plamenikom, nikal konovima i oktopolnom kolizijsko-reakcijskom ćelijom.

alphasolutions

16

alphasolutions

Preporuke Prilikom analize Hg tehnikom ICP MS, potrebno je obratiti pozornost na pripremu i pohranu uzorka za ICP-MS analizu - otopina HNO3 (bez HCl) radi izbjegavanja problema uzrokovanih poliatomskim in-terferencijama na V, Cr, As i Se uzrokovanih kloridima.Međutim, isključivanje HCl može uzrokovati probleme sa stabilnosti mnogih elemenata, uključujući Hg, As, Se, Mo, Tl i Ag.Kako bi se izbjegli gore navedeni problemi, rješenje predstavlja ko-lizijsko-reakcijska ćelija unutar ICP-MS-a, koja omogućuje efikasno uklanjanje poliatomskih interferencija nastalih dodatkom HCl-a. *Moguće je dodati 0.5 do 1.0% HCl za stabilizaciju uzorka za ICP-MS analizu i pouzdanu

istodobnu analizu drugih metala (V, Cr, As i Se).

Potrebno je također, obratiti pozornost na stabilnost standardnih oto-pina Hg za analizu niskih koncentracija Hg metodom ICP-MS, u sta-klenim i polietilenskim (low-density polyethylene, LDPE) posudama u sljedećim vodenim otopinama: - 5% HNO3 (v/v) - 5% HNO3 i 0.5% HCl (v/v) - 5% HNO3 i 1% HCl (v/v)

Slika: Poliatomske interferencije koristeći He mode i No gas mode

Vrijeme stajanja 30 dana 60 dana 90 dana

5% HNO3,plastika >60% >65% >70%

5% HNO3,staklo ≤30% ≤30% ≤40%

5% HNO3 + 0,5% HCl,plastika

≤6% ≤15% ≤20%

5% HNO3 + 0,5% HCl,

staklo≤6% ≤15% ≤20%

5% HNO3 + 1% HCl,plastika

≤6% ≤10% ≤20%

5% HNO3 + 1% HCl,staklo

≤6% ≤10% ≤20%

Slika: Kalibracijski pravci standardnih otopina Hg pripravljeni iz među-standarda pohranjenim u stakle-nim i polietilenskim (LDPE) posudama 60 dana

Stabilizacija iona Hg2+ i washout/memory pro-blem

alphasolutions

17

alphasolutions

18

Hrvatsku odlikuje veliko bogatstvo autohtonog sortimenta vinove loze. Danas su, nažalost, mno-ge vinove loze u opasnosti od izumiranja. Odjel za biotehnologiju proveo je projekt karakteriza-cije autohtonih sorta vinove loze koja se koristi za proizvodnju vina Belica na uskom području i okolici Grada Kastva, uz podršku proizvođača autohtonog vina Belica. Važno je napomenuti kako ne postoji sorta grožđa Belica već se radi o kupaži (cuvee – mješavini) nekoliko sorti grož-đa. Uz standardne fizikalno-kemijske analize vina provedena je i kvantifikacija polifenola kao bitan element karakterizacije vina. Polifenoli su biološki aktivne komponente koje nalazimo u velikom broju prirodnih proizvoda. Značajno su zastupljeni u vinima pa se upravo zato vino smatra kao jedan od njihovih boljih izvora u svakodnevnoj prehrani. U bijelom vinu najče-šći polifenoli su flavnoidi skupine flavan-3-oli (katehin, epikatehin...) koji doprinose antiok-sidativnoj aktivnosti vina i općenito, pozitiv-nom djelovanju na ljudsko zdravlje. Za detaljno određivanje fenolnog sastava hrane razvijena je metoda na LC-ESI-MS/MS sustav (tekućinska kromatografija s tandem masenim detektorom i elektrosprej-ionizacijom).

Eksperimentalni dioZa analizu fenolnih komponenti u vinima, uzor-ci su razrijeđeni 10%-tnom otopinom MeOH u omjeru 1:2. Za analizu kaftarinske kiseline, uzor-ci su razrijeđeni10 %-tnom otopinom MeOH u omjeru 1:9. Svaka ekstrakcija ponovljena je dva puta, a uzorci su injektirani u duplikatu.

Instrumentalni dioZa profiliranje polifenola u prirodnim uzorcima kao što je vino, unu-tar predmetne studije, korištene su tehnike tekućinske kromatografije spregnute sa spektrometrijom masa. Kako bi se odredio sastav polife-nola razvijene su metode s točnim fragmentacijskim obrascem. Kvan-tifikacija poznatih fenolnih spojeva provodila se korištenjem komerci-jalno dostupnih standarda, dok su se analize provodile na Agilent LC QQQ spektru masa. Standardi korišteni u analizi su 2,5-DHBA, 3,4-DHBA, pHBA, galna kiselina, siringinska kiselina, elagična kiselina, kavena kiselina, ferulična kiselina, izoferulična kiselina, p-kumarinska kiselina, 3-hidroksitirosol, luteolin, naringenin, kvercetin, resveratrol, katehin, diosmetin, epikatehin, luteolin-7-O-glukozid i pinobanksin. Dobiveni rezultati i instrumentalni parametri prikazani su u nastavku.

Institucija / Odjel za biotehnologiju, Centar za visokopropusne tehnologije, Sveučilište u Rijeci

Autori / Lara Saftić, Željka Peršurić, Tomislav Pavlešić, Sandra Kraljević Pavelić

poliFenoli su biološki aktivne koMponente koje nalaZiMo u velikoM broju prirodnih proiZvoda. posebno su Zastupljeni u viniMa Zbog čega se vino sMatra jedniM od boljih iZvora poliFenola u svakodnevnoj prehrani.

AnAlIzA pOlIFenOlA u vInImA belIcA pOmOću lc-QQQ

alphasolutions

19

Rezultati i diskusijaRezultati su pokazali kako su najzastupljenije grupe polifenola u uzor-cima Kastavske Belice hidroksicimetne kiseline i flavan-3-oli, što je i u skladu s prijašnjim istraživanjima bijelih vina. U većini uzorka do-minantno prevladava kaftarinska kiselina. Njena koncentracija dosiže i vrijednosti od 54 mg/L, ali uz velike varijacije među uzorcima (3-54 mg/L). Količina kaftarinske kiseline u vinima je relevantan parametar u analizama vina jer utječe na boju i indikator je oksidativnog statusa bijelog vina. Kaftarinska kiselina je kemijski spoj koji pripada skupini hidroksicimetnih fenolnih kiselina, a nastaje esterifikacijom kavene i vinske kiseline. Međutim, ako dođe do oksidacije, raspada se na svoje osnovne komponente. Analiza kaftarinske kiseline u bijelim vinima od velike je važnosti jer utječe na boju bijelih vina i smatra se da je upravo ona odgovorna za žuto-zlatnu boju nekih vina, međutim potvrđeno je da ne utječe na gorčinu vina (budući da se neutralizira s ostalim pro-duktima kemijskih reakcija u bobicama grožđa). Sposobnost kaftarin-ske kiseline u sinergiji s ostalim produktima kemijskih reakcija grožđa u smanjenju osjećaja „paljenja“ i suhoće vina bez uzrokovanja gorčine, sugerira da oni mogu potencijalno pozitivno pridonijeti teksturi bije-log vina i da se pravilnim rukovanjem oksidativnog statusa soka grožđa može doprinijeti „uljnom“ okusu vina u ustima što je naposljetku i spe-cifičnost nekih vina.Nadalje, koncentracija kaftarinske kiseline dobar je pokazatelj oksi-dativnog statusa vina. Primjerice, ukoliko je vino oksidiralo tijekom procesa proizvodnje, u svom sadržaju neće imati kaftarinsku kiselinu (ali posljedično može imati povećanu koncentraciju kavene i vinske kiseline). Međutim, količina kaftarinske kiseline može biti vezana i za pojedinu sortu te ne mora nužno postojati povezanost između oksidi-ranosti vina i niske koncentracije kaftarinske kiseline u uzorcima.

INSTRUMENTALNI PARAMETRI

UHPLC Uvjeti Vrijednost

Kolona Zorbax SB-C18, Rapid Resolution HT koloni (2,1 mm x 50 mm I.D, 1,8 μm, Agilent Technologies).

Mobilna faza (A) 0,1% mravlje kiseline u ultra čistoj vodi (B) 0,1% mravlje kiseline u ACN

Temperatura kolone 30 °C

Protok 0,33 ml/min

LC QQQ uvjeti Vrijednost

Kapilarni napon 3,5 kV (u pozitivnom i negativnom načinu rada)

Napon mlaznice 0,5 kV

Temperatura ionskog izvora

300 °C

Protok plina 5 L/min

Tlak 45 psi

Temperatura plina za sušenje

250 °C

Protok plina 11 L/min

Plin u kolizijskoj ćeliji N2

Kolizijske energije 0-40 V (ovisno o analiziranom fenolu)

Uz navedene prednosti analize kaftarinske kiseli-ne u proizvodnji vina, mnogobrojna istraživanja su potvrdila i njeno pozitivno djelovanje na ljud-sko zdravlje. Naime, istražen je utjecaj klorogene i kaftarinske kiseline na oksidativni stres i toksič-nost jetre izazvanu metamfetaminom. Rezultati su pokazali pozitivan utjecaj navedenih kompo-nenti na poboljšanje funkcije jetre i otklanjanje oksidativnog stresa. Uz navedeno, kaftarinska ki-selina je pokazala antidiuretsku, antioksidativnu i antiapoptotsku ulogu u nefrotoksičnim promje-nama izazvanima trovanjem olovom. Prijašnja istraživanja su pokazala da LC-MS/MS sustav trenutno daje najbolja rješenja za analizu kaftarinske kiseline i da je metoda izbora za brzu kvantifikaciju. Iz tog je razloga LC-MS/MS sustav odabran za analizu kaftarinske kiseline. Od ostalih polifenola u analiziranim uzorcima prevladavaju: kavena kiselina, p-kumarinska ki-selina, katehin, epikatehin, 3,4-DHBA (3,4-dihi-droksibenzojeva kiselina), galna kiselina i 3-hi-droksitirosol. Upravo su katehini odgovorni za gorak okus i osjet trpkosti u vinu. Osim navede-nog utjecaja na senzorna svojstva, također su važ-ni i kao antioksidansi tj. čimbenici očuvanja vina od oksidacije tijekom dozrijevanja. U manjim količinama su još prisutni 2,5-DHBA, pHBA, siringinska kiselina, elagična kiselina, fe-rulična i izoferulična kiselina, naringenin, kver-cetin, resveratrol, luteolin-7-O-glukozid i pino-banksin. Od analiziranih fenolnih komponenti, luteolin i diosmetin su prisutni u koncentracijama ispod limita kvantifikacije.Ovim se istraživanjem po prvi put karakterizirao sastav polifenola u vinima Belice što je bitan ko-rak u opisivanju ovog neprepoznatog dragulja Ka-stavštine. Uz navedeno, rezultati su pokazali širok spektar prisutnih fenolnih komponenti, ali i neke različitosti između uzoraka. Budući da je Kastav-ska Belica autohtono vino koje još uvijek nije u fazi masovne proizvodnje te se može naći samo kod lokalnih proizvođača, ovakvim analizama cilj je unaprijediti i unificirati tehnološki proces pro-izvodnje, ali i pomoći malim proizvođačima kako bi maksimalno iskoristili mogućnosti ovog vina. Analiza fenolnih komponenti može dati mnoge odgovore i biti važan parametar za praćenje pro-cesa nastanka vina s ciljem podizanja kvalitete za-vršnog proizvoda.

alphasolutions

alphasolutions

20

Institucija / Zavod za farmakognoziju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta u Zagrebu

Autor / prof. dr. sc. Sanda Vladimir-Knežević

Istraživanje sastava i biomedicinskog potencijala eteričnih ulja sastav-ni je dio farmakognozije kao jedne od najstarijih farmacijskih znan-stvenih disciplina unutar koje se proučavaju ljekovite tvari prirodnog porijekla. Naziv farmakognozija potječe od grčkih riječi farmakon (li-jek) i gnosis (znanje). Od utemeljenja studija farmacije 1882. godine, važan je dio izobrazbe ljekarnika na Sveučilištu u Zagrebu. Zavod za farmakognoziju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta (tada Farmako-gnostički zavod) osnovan je 1896. godine kao četvrti samostalni znan-stveni institut Sveučilišta u Zagrebu i prvi takve vrste u svijetu. Duga povijest i tradicija nastavnog i znanstvenog rada ovog Zavoda ogleda se u jednoj od najstarijih knjižnica na Sveučilištu u Zagrebu s vrijed-nom zbirkom starih i rijetkih knjiga i rukopisa iz 17. i 18. stoljeća te kroz Farmakognošku zbirku u kojoj je izloženo tisuću ljekovitih droga biljnog i životinjskog podrijetla. Veliki dio te zbirke čine rijetki i veo-ma stari primjerci iz gotovo svih dijelova svijeta, uključujući i uzorke eteričnih ulja.Današnja istraživanja na Zavodu za farmakognoziju usmjerena su na različite biološki aktivne prirodne tvari koje bi mogle naći primjenu u prevenciji i terapiji različitih oboljenja ili kao vodeći spojevi u otkri-vanju novih lijekova. Identifikacija i kontrola kakvoće ljekovitog bilja, biljnih lijekova i dodataka prehrani je također važno ekspertno pod-ručje ovog Zavoda. Istraživačka skupina koju vodi prof. dr. sc. Sanda Vladimir-Knežević trenutačno provodi fitokemijska i biološka istraži-vanja eteričnih ulja biljnih vrsta hrvatske flore. Eterična ulja su hlapljivi i mirisni sekundarni biljni produkti. Stvaraju ih aromatične biljne vrste iz određenih porodica kao što su Apiaceae, Brassicaceae, Lamiaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Pinaceae, Piperaceae, Rutaceae i Zingiberaceae. Biljke pohranjuju eterična ulja u posebnim stanicama, intracelularnim prostorima ili kanalima te u žljezdanim dla-kama na površini biljnih organa. Njihova izolacija iz biljnog materija-la provodi se različitim destilacijskim i ekstrakcijskim postupcima ili mehaničkim putem. Eterična ulja su najvećim dijelom bistre, bezbojne do svijetložute tekućine, a samo je manji broj jače obojen. Dobro se miješaju s lipofilnim otapalima, dok je njihova topljivost u vodi vrlo

slaba. Smjese su velikog broja kemijskih spojeva od kojih su najzastupljeniji terpeni (90%). Osta-le sastavnice su fenilpropanski derivati, lančani ugljikovodici te spojevi s dušikom i sumporom. Općenito pripadaju različitim skupinama or-ganskih spojeva, primjerice, ugljikovodicima, alkoholima, fenolima, aldehidima, ketonima, oksidima, esterima i eterima. Uglavnom je samo nekoliko sastavnica značajnije zastupljeno u po-jedinom eteričnom ulju pa one određuju njegova mirisna, fizikalno-kemijska i biološka svojstva. Identifikacija sastavnica eteričnih ulja provodi se u spregnutom sustavu plinske kromatografije sa spektrometrijom masa (GC-MS). Eterična ulja se široko primjenjuju u farmaceutskoj, prehrambe-noj, kozmetičkoj i parfemskoj industriji. Sve veća potreba za prirodnim eteričnim uljima utječe na povećanje uzgoja aromatičnih biljnih vrsta i pro-izvodnje eteričnih ulja. Naša zemlja posjeduje veliki potencijal za dobivanje eteričnih ulja viso-ke kakvoće, a među njima se ističu eterično ulje lavandina i smilja.Lavandula x intermedia ‘Budrovka’ je autohtoni kultivar lavandina s otoka Hvara koji se na hr-vatskim otocima i u priobalju uzgaja od sredine prošlog stoljeća, a danas se njegov uzgoj proširio i u kontinentalna područja. Nastao je križanjem vrsta L. angustifolia (lavanda) i L. latifolia (širo-kolisna lavanda). Mnogo je veća i snažnija bilj-ka nego obje roditeljske pa taj bujni grm doseže 1-1,5 m u visinu i širinu (Slika 1). Klasasti cvatovi su osobito bogati eteričnim uljem i mogu sadrža-vati trostruko više eteričnog ulja, u odnosu na „pravu“ lavandu. Poznata je primjena lavandinog

AnAlIzA eterIčnIh uljA

lAvAndInA I smIljA u spregnutOm sustAvu plInske krOmAtOgrAFIje sA spektrOmetrIjOm mAsA

alphasolutions

21

eteričnog ulja u kozmetici, međutim, važno je istaknuti da se u suvre-menoj fitoterapiji koristi za ublažavanje blagih simptoma mentalnog stresa i iscrpljenosti te teškoća pri usnivanju. Tablica 1 donosi izvorne podatke o sastavu eteričnog ulja lavandina uzgojenog u okolici Zagreba. GC-MS analizom identificirano je 38 sa-stavnica (99,2%) eteričnog ulja. Ustanovljeno je da osnovu eteričnog ulja čine monoterpeni s kisikom (87,0%), među kojima prevladavaju alkoholi (47,0%) i esteri (20,5%), dok je udio seskviterpenskih spo-jeva svega 3,0%. Linalol (44,6%), linalil-acetat (20,1%) i 1,8-cineol (16,8%) najzastupljenije su sastavnice. Uz velik udio linalil-acetata kao pokazatelja visoke kakvoće, vidljivo je da lavandin ‘Budrovka’ u uvje-tima kontinentalnog uzgoja stvara i vrlo malo kamfora (0,6%), što mu daje dodanu vrijednost te otvara mogućnost primjene i u medicinske svrhe. Sastav eteričnog ulja ispitanog uzorka vrlo je sličan lavandinom eteričnom ulju te udovoljava zahtjevima Europske farmakopeje, među kojima i glavni zahtjev o udjelu kamfora najviše 1,2%.

Smilje (Helichrysum italicom) je mali aromatični po-lugrm mediteranskog područja (Slika 2) koji raste na suhim mjestima, stijenama i pješčanom tlu u blizini mora. Eterično ulje stvara u karakterističnim žutim cvatovima. Tradicionalno se primjenjuje u izradi lje-kovitih i kozmetičkih pripravaka, a već dugo se vje-ruje u njegovu moć brisanja tragova vremena na licu, zbog čega je nazvan immortelle (besmrtnost). Smilje se u nas široko uzgaja u svrhu dobivanja eteričnog ulja, vrlo cijenjenog u kozmetici budući da pouzdano smanjuje bore i regenerira zrelu kožu.

MetodaEterična ulja izolirana parnom destilacijom podvrgnuta su analizi u spregnutom sustavu plinske kromatografije sa spektrometrijom masa (Agilent 7890B/5977A). Uzorci za analizu pripremljeni su otapanjem eteričnog ulja u heksanu (1:100) te je po 1 mL uzorka injektirano u split modu (1:50). Kao plin nositelj korišten je helij, uz protok 1 mL/min. Sastavnice eteričnog ulja odijeljene su u kapilarnoj koloni HP-5ms (5% fenil-metilpolisiloksan) duljine 30 m, unutarnjeg promjera 0,25 mm i debljine filma 0,25 mm, uz sljedeći temperaturni program: početna temperatura kolone 60 °C (1 min), zagrijavanje 3 °C/min do 200 °C te zadržavanje temperature kolone 10 min na 200 °C. Odije-ljene sastavnice analizirane su na masenom spektrometru (EI 70 eV,

eterična ulja se široko priMjenjuju u FarMaCeutskoj, prehraMbenoj, koZMetičkoj i parFeMskoj industriji.

Slika 1. Lavandula x intermedia Emeric ex Loisel. (Lamiaceae)

Slika 2. Helichrysum italicum (Roth) G. Don (Asteraceae)

alphasolutions

22

Tablica 1. Sastav eteričnog ulja lavandina ‘Budrovka’Sastavnica RI Udio (%)α-pinen 932 0,62kamfen 947 0,11sabinen 972 0,32β-pinen 976 1,123-oktanon 986 1,56mircen 991 0,463-oktanol 996 0,28heksil-acetat 1014 0,20p-cimen 1024 0,16β-felandren 1028 0,601,8-cineol 1030 16,81cis-β-ocimen 1036 1,45trans-β-ocimen 1047 0,47γ-terpinen 1057 0,11cis-sabinen hidrat 1067 0,19cis-linalol oksid 1072 1,01trans-linalol oksid 1089 0,94linalol 1101 44,553-acetoksi-okten 1113 0,16kamfor 1144 0,55heksil-izobutanoat 1149 0,16borneol 1165 0,31terpinen-4-ol 1177 0,97kripton 1187 0,18α-terpineol 1191 0,95oktil-izobutanoat 1193 0,79heksil-2-metil-butanoat 1238 0,33heksil-3-metil-butanoat 1243 0,23linalil-acetat 1257 20,12lavandulil-acetat 1292 0,16heksil-tiglat 1332 0,18neril-acetat 1366 0,11geranil-acetat 1385 0,11β-kariofilen 1418 1,27

Slika 3. Plinski kromatogrami eteričnih ulja lavandina i smilja

alphasolutions

alphasolutions

23

m/z 40-400). Smjesa n-alkana od C-8 do C-20 analizirana je pod istim uvjetima. Obrada rezultata provedena je korištenjem računalnog pake-ta Agilent GC/MSD ChemStation verzija F.01.03. Sastavnice eterič-nog ulja identificirane su usporedbom spektara masa u bazi NIST 14, Wiley 9 i HPCH 2205. Identifikacija je također provedena na temelju linearnog retencijskog indeksa (RI) koji je izračunat za svaku odijelje-nu sastavnicu prema sljedećem izrazu:

gdje je C broj C atoma n-alkana, tR retencijsko vrijeme za pojedinu sastavnicu, a X je komponenta za koju se računa retencijski indeks.

RezultatiRezultati GC-MS analize eteričnog ulja izoliranog iz biljnog uzorka s otoka Paga prikazani su u Tablici 2. Identificirano je 57 sastavnica koje čine 93,7% eteričnog ulja. Za razliku od lavandina, eterično ulje smilja bogato je seskviterpenima (58,4%) s dominantnom ugljikovodičnom frakcijom (53,9%) u kojoj su najzastupljeniji γ-kurkumen (14,3%) te α- i β-selinen (15,3%). Udio seskviterpena s kisikom iznosi 4,5%. Među monoterpenskim sastavnicama (28,0%) ističe se neril-acetat za-stupljen s 13,0%, zbog čega se ovaj uzorak svrstava u visoko kvalitetna eterična ulja smilja. Toj kvaliteti značajno doprinose i prisutni italidio-ni (6,8%), jedinstvene bioaktivne sastavnice smilja koje ne nalazimo u drugim eteričnim uljima.

Tablica 2. Sastav eteričnog ulja smiljaSastavnica RI Udio (%)α-pinen 932 6,05α-fenhen 945 0,16kamfen 947 0,07β-pinen 976 0,16α-terpinen 1016 0,06p-cimen 1024 0,15limonen 1028 1,461,8-cineol 1031 0,36izobutil-angelat 1051 0,10γ-terpinen 1057 0,20terpinolen 1088 0,082,4-dimetil-heptan-3,5-dion 1099 0,03linalol 1101 0,442-metilbutil 2-metilbutanoat 1105 0,082-metilbutil-angelat 1154 0,40terpinen-4-ol 1177 0,224,6-dimetiloktan-3,5-dion 1188 0,34α-terpineol 1191 0,40nerol 1229 0,80neril-acetat 1366 13,01α-ilangen 1370 0,42α-kopaen 1375 2,49izoitalicen 1397 0,12 italicen 1402 3,68cis-α-bergamoten 1415 0,95β-kariofilen 1418 3,24trans-α-bergamoten 1435 1,034,6,9-trimetildec-8-en-3,5-dion 1442 3,48α-humulen 1452 0,29neril-propionat 1456 3,88α-akoradien 1463 0,42β-akoradien 1466 0,434,5-di-epi-aristolohen 1468 0,16selin-4-11-dien 1475 2,39γ-kurkumen 1480 14,26α-kurkumen 1484 3,25β-selinen 1485 9,752,4,6,9-tetrametildec-8-en-3,5-dion 1490 1,92α-selinen 1494 5,51α-murolen 1499 0,66δ-amorfen 1506 1,00γ-kadinen 1513 2,03δ-kadinen 1523 1,41italicen eter 1533 0,40α-kadinen 1537 0,10α-kalakoren 1543 0,323,5,7,10-tetrametilundec-9-en-4,6-dion 1582 1,02neril-izovalerat 1585 0,44gvajol 1597 0,52rosifoliol 1606 1,95α-epikadinol 1640 0,18β-eudesmol 1649 0,25neointermedeol 1653 0,77α-eudesmol 1656 0,11bulnesol 1667 0,07β-epibisabolol 1670 0,18α-bisabolol 1684 0,08

Literatura Antunes Viegas D, Palmeira de Oliveira A, Salgueiro L,

Martinez de Oliveira J, Palmeira de Oliveira R. Helichrysum

italicum: from traditional use to scientific data. J.

Ethnopharmacol 2014;151:54-65.

Baser HC, Buchbauer G (ur.) Handbook of essential oils:

Science, technology, and applications, CRC Press, 2016.

Blažeković B, Stabentheiner E, Brantner A, Vladimir-

Knežević S. A comparative study on glandular trichomes

of Lavandula x intermedia ‘Budrovka’ and L. angustifolia.

Phyton 2012;52:227-244.

Committee on Herbal Medicinal Products. Community

herbal monograph on Lavandula angustifolia Mill.,

aetheroleum. European Medicines Agency, 2011.

European Directorate for the Quality of Medicines and

Health Care. European Pharmacopoeia, 9. ed., Council of

Europe, 2018.

alphasolutions

alphasolutions

24

kAtIOnA I AnIOnAInstitucija / Zavod za fizikalnu kemiju, Kemijski odsjek, Prirodoslovno-matematički fakultet

Autor / Nikola Bregović, doc. dr. sc.

Znanstveni rad naše grupe usmjeren je najvećim dijelom na razvoj supramolekulskih receptora, molekula koje mogu selektivno vezati katione, anione ili neutralne molekule. Supramolekulski receptori zadržavaju vezno mjesto koje se sastoji od funkcionalnih skupina koje ostvaruju povoljne interakcije s odabranom kemijskom vrstom, a njihov prostorni razmještaj omogućava diskriminaciju različitih specija na temelju njihove veličine i oblika. Uvođenjem većeg broja veznih skupina povećava se afinitet receptora za stvaranje komplek-sa, čime se omogućava efikasno vezanje u kompetitivnom mediju poput vode. Moguća uporaba receptora iona i neutralnih moleku-la vrlo je raznolika te uključuje primjenu u analitičke svrhe, bilo za kvantitativnu ili kvalitativnu analizu sastava otopina, korištenje pri razvoju modernih farmakoloških pripravaka i dijagnostičkih teh-nologija te u kontekstu biomemetike. Prikladno dizajnirano vezno mjesto jednostavnog receptora može, barem djelomično, oponaša-ti vezna mjesta složenih makromolekula. Proučavanjem svojstava takvih receptora može se doći do važnih spoznaja o energijskim i strukturnim aspektima važnih biokemijskih procesa koje često nije moguće direktno istražiti, bilo zbog nedostatne dostupnosti bioma-terijala ili pak zbog njegove nestabilnosti. Osnovni cilj naših istraživanja jest dobiti što detaljniji uvid u čimbe-nike koji definiraju kompleksacijska svojstva receptora. U tu svrhu detaljno se proučava termodinamika reakcija nastajanja kompleksa niza strukturnih analoga nekoliko klasa liganada, čime se razjašnjava utjecaj kemijske strukture, odn. broja, tipa i prostornog razmještaja veznih skupina receptora na njihovu reaktivnost. Također, značajna pozornost posvećena je istraživanju utjecaja otapala na ravnoteže nastajanja kompleksa zbog čega se te reakcije proučavaju u otapali-ma različitih svojstava (polarnost, protičnost, viskoznost).Veličina kojom se kvantitativno iskazuje afinitet receptora za stvara-nje kompleksa s određenom vrstom jest konstanta stabilnosti, odno-sno konstanta ravnoteže nastajanja kompleksa. Ta veličina povezana je sa standardnom reakcijskom Gibbsovom energijom te daje uvid u distribuciju reagirajućih vrsta pri različitim uvjetima. Eksperi-mentalno određivanje konstante stabilnosti kompleksa najčešće uk-ljučuje titracijske eksperimente, odn. mjerenja određenog svojstva otopine receptora koje ovisi o ravnotežnim koncentracijama slobod-

nog liganda i kompleksa pri različitom sastavu otopine. Najčešće se postupno dodaje sol iona s kojim receptor tvori kompleks, a nakon svakog dodatka mjeri se, primjerice UV-Vis ili emisijski spektar. Naime, vrlo često se spektri slobodnog liganda i kompleksa značajno razlikuju pa po-micanjem ravnoteže prema vezanom obliku do-lazi do značajnih spektralnih promjena. Anali-zom ovisnosti spektara o koncentraciji dodanog gosta (iona ili molekule) moguće je odrediti stehiometriju nastalog kompleksa, odgovaraju-ću konstantu ravnoteže i karakteristične spektre kompleksa.

Primjeri istraživanja

Ureidni, tioureidni i amidni derivati dehidracetne kiseline (Slika 1) čine klasu anionskih receptora koja je detaljno istražena u okviru našeg projek-ta.4,5

suprAmOlekulskIreceptOrI

supraMolekulski reCeptori Zadržavaju veZno Mjesto koje se sastoji od FunkCionalnih skupina koje ostvaruju povoljne interakCije s odabranoM keMijskoM vrstoM, a njihov prostorni raZMještaj oMogućava diskriMinaCiju raZličitih speCija na teMelju njihove veličine i oblika.

alphasolutions

25

Ti su se spojevi pokazali selektivnim ligandima za acetat i dihidrogenfosfat u nekoliko organskih ota-pala. Tioureidna skupina pokazala se najefikasnijom veznom skupinom za navedene anione što je poslje-dica njenog najvećeg afiniteta za stvaranje vodikovih veza. U slučaju dihidrogenfosfata primijećeno je na-stajanje kompleksa stehiometrije 2:1 (anion : recep-tor), što je velikim dijelom posljedica nastajanja vo-dikovih veza između dva aniona u kompleksu. Uloga dehidracetnih skupina u stabilizaciji kompleksa po-bliže je razjašnjena računalno-kemijskim metodama. U okviru ovih istraživanja po prvi puta je kvantita-tivno opisan i proces dimerizacije dihidrogenfosfata u acetonitrilu i dimetilsulfoksidu. U cijelokupnom istraživanju ove klase spojeva spektrofotometrija se pokazala iznimno korisnom metodom, pri čemu su sve titracije provedene uz pomoć Agilent Technolo-gies Cary spektrofotometara. Rezultati ovog dijela projekta objavljeni su u dvije znanstvene publikacije u časopisu Chemistry A - European Journal.

Kaliksareni, makrociklički oligomeri koji se sastoje od fenolnih po-djedinica međusobno povezanih metilenskim mostovima (Slika 2), predstavljaju vrlo važnu skupinu supramolekulskih receptora. Ovisno o supstituentima na gornjem i donjem obodu kaliksarenske okosnice, ti su ligandi selektivni za najrazličitije vrste. Poznato je da derivati ka-liksarena koji sadrže elektronima bogate atome, primjerice kisikove atome karbonilnih i eterskih skupina, dobro vežu katione alkalijskih i zemnoalkalijskih metala. Značajan doprinos naših istraživanja razu-mijevanju kemije ketonskih i amidnih derivata kaliksarena kao kati-onskih receptora proizlazi iz detaljnog proučavanja termodinamike kompleksiranja kationa alkalijskih metala u brojnim organskim ota-palima te karakterizaciji ravnoteža inkluzije molekule acetonitrila u kaliksarensku „košaru“.Usprkos velikom broju istraženih kaliksarenskih derivata, neutralni receptori koji pripadaju ovoj klasi spojeva vrlo su slabo topljivi u vodi. U sklopu SupraCAR projekta sintetizirani su amidni glikokonjugati kaliksarena (Slika 3) koji su se pokazali dobro topljivima u vodi za-hvaljujući glukoznim podjedinicama. Ispitan je njihov potencijal za kompleksiranje kationa pomoću UV-Vis titracija provedenih na Agilent Technologies Cary 60 spektrofotome-tru. Utvrđeno je da sintetizirani glikokonjugati u vodi relativno efika-sno vežu alkalijske katione, s obzirom na kompeticijska svojstva tog otapala te je primijećena značajna selektivnost jednog od derivata za natrijev kation. Konstante ravnoteže kompleksiranja kationa osim u vodi određene su i u metanolu. Time se stekao uvid u utjecaj otapa-la na odgovarajuće ravnoteže te je omogućena usporedba komplek-sacijskih svojstava glikokonjugata i njihovih analoga bez glukoznih podjedinica. Na temelju sakupljenih podataka donesen je zaključak da glukozne podjedinice nemaju direktnu ulogu u kompleksiranju kationa već primarno služe poboljšanju topljivosti u vodi. Rezultati istraživanja objavljeni su u uglednom časopisu Organic and Biomolecu-lar Chemistry te je, s obzirom na prepoznatu važnost rada u kontekstu kaliksarenskih derivata, rad istaknut na naslovnici časopisa.6

Slika 1. Strukture istraženih receptora aniona, amidnih i (tio)ureidnih derivata dehidracetne kiseline.

Slika 2. Struktura derivata kaliks[4]arena

25

alphasolutions

26

Slika 3. Kemijske strukture glikokonjugata kaliksarena – receptora alkalijskih kationa topljivih u vodi.

Slika 4. Shematski prikaz ravnotežna istraženih u slučaju triptofanskog derivata kaliks[4]arena.

Slika 5. Strukture sintetiziranih fluorescentnih kaliksarena s fenantridinskom podjedinicom.

alphasolutions

26

alphasolutions

27

S obzirom da je donja granica detekcije fluorescentnih kemosenzora redovito znatno niža od primjerice kolorimetrijskih, fluorescentni re-ceptori predstavljaju posebno zanimljivu klasu spojeva zbog visokog potencijala primjene u analitičke svrhe. Fluorescentni senzori sadr-že ionofor (mjesto za selektivno prepoznavanje i vezanje supstrata) i fluorofor, dio molekule odgovoran za fluorescenciju spoja i signa-lizaciju vezanja kationa. Naime, prilikom vezanja dolazi do steričkih promjena i preraspodjele elektronske gustoće, zbog čega se i svojstva fluorofora mijenjaju, što dovodi do gašenja ili pojačavanja fluorescen-cije. Dio našeg istraživana posvećen je kaliksarenima koji kao fluoro-fore sadrže triptofanske i fenantridinske podjedinice. Sprektofluori-metrijske titracije provedene su u velikoj većini slučajeva na Agilent Technologies Cary Eclipse instrumentima.Triprofanski derivat kaliks[4]arena (Slika 4) pokazao se dobrim re-ceptorom fluorida i njegovih ionskih parova s alkalijskim kationima u acetonitrilu, a odgovarajući sustavi ravnoteže istraženi su spektrofluo-rimetrijskim, spektrofotometrijskim i 1H NMR titracijama. U slučaju fenantridinskih derivata (Slika 5) svojstva vezanja kationa alkalijskih metala istražena su brojnim eksperimentalnim tehnikama u nekoliko miješanih organskih otapala. Uvid u strukturne karakteristike receptora i kompleksa te čimbenika koji definiraju stabilnost komplek-sa, dobiven je pomoću računalnih tehnika tj. molekulske dinamike i Monte Carlo konformacijskih pretraga.8

ZaključakIstraživanja provedena u okviru projekta SupraCAR doprinijela su bo-ljem razumijevanju termodinamike kompleksiranja različitih kemij-skih vrsta, omogućila dizajn i razvoj različitih receptora poboljšanih svojstava (selektivnost, visok afinitet, topljivost u vodi) i doprinijela su općenitom znanju u domeni supramolekulske kemije. Pritom je važno spomenuti da je pouzdana i kvalitetna instrumentacija, poput Agilent Technologies Cary spektrofotometara i spektrofluorimetra, neophodna za gore opisani znanstveni rad.

Literatura1. J.K.W. Chui, T.M. Fyles, Chem. Soc. Rev. 41 (2012) 148–175.

2. R. V. Rodik, V. I. Boyko, V. I. Kalchenko, Curr. Med. Chem. 16

(2009) 1630–1655.

3. R. M. J. Liskamp, D. T. S. Rijkers, and S. E. Bakker in:

F. Diederich, P. J. Stang, R. R. Tykwinski, (Eds.), Modern

Supramolecular Chemistry: Strategies for Macrocycle

Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, 2008.

4. N. Bregović, N. Cindro, L. Frkanec, K. Užarević, V. Tomišić,

Chem. Eur. J. 20 (2014), 15863–15871.

5. N. Bregović, N. Cindro, B. Bertoša, D. Barišić, L. Frkanec, K.

Užarević, V. Tomišić, Chem. Eur. J. 23 (2017), 10396–10406.

6. N. Cindro, J. Požar, D. Barišić, N. Bregović, K. Pičuljan, R.

Tomaš, L. Frkanec, V. Tomišić, J Org. Biomol. Chem. 16 (2017)

904-912.

7. N. Bregović, N. Cindro, L. Frkanec, V. Tomišić, Supramol.

Chem. 28, (2016) 608-615.

8. M. Tranfić Bakić, D. Jadreško, T. Hrenar, G. Horvat, J. Požar,

N. Galić, V. Sokol, R. Tomaš, S. Alihodžić, M. Žinić, L. Frkanec, V.

Tomišić, RSC Adv., 5 (2015) 23900–23914.

alphasolutions

alphasolutions

Proteine sadržane u jednostavnim smjesama mo-guće je razdvojiti nekom od jednodimenzionalnih razdjelnih tehnika tekućinske kromatografije (npr. farmaceutske proteine ili peptide). Međutim, slo-ženost smjese proteina kao što je proteom stanice, tkiva ili organizma obično nadmašuju mogućnosti razdvajanja bilo koje tehnike tekućinske kroma-tografije [1,2] pa se proteini složenih proteinskih smjesa najčešće razdvajaju dvodimenzionalnim razdjelnim tehnikama tekućinske kromatografije, koje utječu na povećanje kromatografske razlučlji-vosti i separacijskog faktora [3-7].

Izradom kromatografskih kolona s miješanim stacionarnim fazama, prvenstveno s miješanom stacionarnom fazom za kromatografiju ionske izmjene-IE (engl. Ion Exchange, IE) i kromato-grafiju obrnutih faza-RP (engl. Reversed Phase, RP), omogućen je razvoj višedimenzionalne teh-nike identifikacije proteina (MudPIT, engl. Mul-tidimensional Protein Identification Tehnology) [8,9]. Osim ovakvom direktnom spregom, dvodi-menzionalno kromatografsko razdvajanje često se provodi indirektnom spregom kromatografije IE kao prve dimenzije i kromatografije RP kao druge dimenzije. Proteini razdvojeni prema pI točkama kromatografijom IE sakupljaju se u frakcije, a po-tom se proteini svake frakcije dodatno razdvajaju prema hidrofobnosti kromatografijom RP, koja je obično automatski spregnuta sa spektrometrom masa. Navedeno razdvajanje i analiza proteina se u svom proteomskom pristupu naziva odozgor-na-dolje (engl. Top-down). No, znatno češći pristup

Institucija / 1 Zavod za molekularnu medicine, Institut Ruđer Bošković, Zagreb, Hrvatska 2 Kemijski odsjek, Prirodoslovno-matematički fakultet, Zagreb, Hrvatska

Autori / Lucija Dončević 1, Amela Hozić 2, Mario Cindrić 2

vIšedImenzIOnAlnA tekućInskA krOmAtOgrAFIjA

identifikaciji proteina MudPIT tehnikom je onaj odozdol-nagore (engl. Bottom-up), koji se provodi na način da se kompleksne smjese proteina pocijepaju proteazama na peptide te nakon toga razdvoje kromatografi-jom IE. Tako dobivene frakcije peptidnih smjesa razdvajaju se kromato-grafijom RP uz direktnu ili indirektnu spregu sa spektrometrom masa.

Danas se kod većine pristupa odozdol-nagore koristi tzv. engl. shot-gun pristup, koji se provodi cijepanjem ukupnog proteomskog uzorka specifičnom proteazom, nakon čega slijedi razdvajanje nastalih peptida višedimenzionalnom tehnikom tekućinske kromatografije uz direktnu spregu sa spektrometrom masa [9,10]. Navedeni postupak kvalitativ-ne ili kvantitativne proteomske priprave uzorka, biokemijske analize i obrade podataka opisan je na Slici 1.

prOteInA I peptIdA prImjenOm rObOtskOg sustAvA AssaymAp bravo

Slika 1. Shematski prikaz proteomskog pristupa analize proteina odozdol-nagore (engl. Bottom-up). Crvenom strelicom je označen kritičan kromatografski korak u kojem primjenjuje dvodimenzionalna kromatografija.

alphasolutions

28

alphasolutions

Potreba za kromatografskom separacijom je tim više naglašena jer su biološki uzorci najčešće oto-pine peptida ili proteina uz pripadajući anorgan-ski matriks (kaotropne ili sveprisutne soli, odn. nehlapljivi kemijski spojevi), koji mogu smanjiti ili u potpunosti prigušiti ionizaciju peptidnih ili proteinskih iona u spektrometru masa. Najčešći problem vezan uz nedostatnu kromatografsku separaciju, pojavljuje se ako u spektru masa ja-sno uočimo adukte peptida i kationa alkalijskih

i zemnoalkalijskih iona ili npr. amonijevih iona. Navedeni nepoželjni adukti analita i protuiona utječu na osjetljivost i točnost metode analize. Smjese jednog ili nekoliko proteina ili peptida, kao i već opisane neželjene adukte u smjesi po-četnog uzorka, moguće je razdvojiti nekom od razdijelnih tehnika jednodimenzionalne tekućin-ske kromatografije primjenjujući adsorpcijsku (npr. aktivni ugljen), IE ili RP kromatografiju. Međutim, kako je već bilo prethodno naglaše-no, složene smjese proteina kao što je proteom

stanice, tkiva ili organizma zahtijevaju primjenu višedimenzionalnog kromatografskog razdvajanja. Uređaj AssayMAP Bravo omogućuje nam da u kratkom vremenu u potpuno automatiziranom načinu rada primijenimo jednodimenzionalnu kromatografsku separaciju u svrhu izmjene soli ili ukoncentriravanja analita (u konačnici jedna frakcija u 45 minuta rada robota) ili frakcioniranja analita za potrebe daljnje separacije (u konačnici šest frakcija u 60 minuta rada robota). U za-dnjem slučaju na eluiranih šest frakcija prve dimenzije, primjenjuje se kromatografsko razdvajanje drugom dimenzijom promjenom ne-pokretne faze (npr. prva dimenzija IE, druga dimenzija RP), što u ko-

načnici rezultira kromatografskim razdvajanjem trideset i šest frakcija u 2x60 minuta minuta rada robota. Pročišćavanje ili razdvajanje frak-cija vrši se na potpuno automatiziran način, rad robotiziranih pipeta može se validirati, a razdvajanje koje se postiže primjenom visokotlač-ne kromatografije izdvaja AssayMAP BRAVO od robotiziranih uređa-ja slične namjene. U prednapisanim programskim rutinama moguća je primjena već opisane jedno- ili dvodimenzionalne kromatografije, analize glikana [11], afinitetne kromatografije ili zahtjevnijih tehnič-kih operacija manipulacije mikrolitarskim količinama uzorka, npr. digestija proteina ili izdvajanje RNA, DNA [12]. U konačnici, svaki zamoran i dugotrajan proces vezan uz manipulaciju tekućinama s veli-

AssaymAp bravo

alphasolutions

29

alphasolutions

30

kim brojem uzoraka olakšan je automatiziranim rutinama i modulima koji se mogu prilagoditi potrebama izolacije, separacije, priprave i analize uzoraka. Iako je u ovom članku naglasak na sepa-racijama peptida i proteina, AssayMAP BRAVO se počesto koristi u pročiščavanju, separaciji i analizi „malih molekula“.

Automatiziran, programibilan i modularan ure-đaj AssayMAP BRAVO kao analitički uređaj za pripremu uzoraka proteina i peptida, „malih“ molekula, DNA i RNA, dizajniran je za ubrzanu i visokofrekventnu kvantifikaciju i karakterizaciju analita te ima osnovnu namjenu automatizacije odn. pročišćavanja (ekstrakcija) uzoraka na čvr-stom nosaču. Dodatni benefit uređaja predstav-lja visokotlačno kromatografsko razdvajanje do 96 uzoraka, koje se vrši preciznom kontrolom protoka kroz nastavke napunjene nepokretnom fazom (engl. Cartridge). Staklena glava uređaja se sastoji od 96 šprica na koje se u automatskom načinu rada stavljaju plastični nastavci punjeni nepokretnom fazom i na kojima se vrši kromato-grafsko razdvajanje, izmjena pufera, pročiščava-nje ili vezanje analita. Zbog svoje točnosti uzor-kovanja (pipetiranja), paralelnog procesuiranja velikog broja uzoraka koje daje iznimno ponov-ljive rezultate (<5% CV) te standardiziranog su-

čelja kojim korisnik jednostavno kontrolira sve ključne parametare u izvedbi postupka, uređaj ima široku primjenu u raznim područjima poput farmaceutskih, biokemijskih, genomskih, proteomskih, okoliš-nih ili organosintetskih eksperimenata (Slika 2.).

Vlastitim razvitkom RapidCell metode [13] za ubrzanu identifikaciju patogenih stanica iz kompleksnih uzoraka (krv, stolica, kultura stani-ca, urin itd.), pojavila se potreba za brzim pročišćavanjem i frakcioni-ranjem velikog broja uzoraka.

Ustanovljeni redoslijed frakcioniranja kod kromatografije u jednoj dimenziji (Tablica 1.) producira šest frakcija razdvojenih ionskom kromatografijom SCX (engl. Strong Cation Exchange). Njihovom daljnjom analizom na spektrometru masa MALDI-TOF/TOF i pre-tragom rezultata upotrebom ProteinReader programskog paketa, ra-zvijenog u suradnji s Prehrambeno-Biotehnološkim fakultetom, može se ustanoviti patogena vrsta u roku od jednog 8-satnog radnog dana (npr. Escherichia coli direktno iz uzorka urina). S obzirom na kapaci-tete spektrometra masa i AssayMAP BRAVO platforme, ukupni broj analiziranih uzoraka tijekom spomenutih osam sati je šesnaest. Ako se kromatografija izvodi u dvije dimenzije, odnosno ako se nakon pr-vog frakcioniranja primjeni kromatografsko razdvajanje kromatogra-fijom obrnutih faza (Tablica 2.), dobiva se trideset i šest frakcija, što nam omogućava ustanovljavanje patogene podvrste (npr. Escherichia coli podvrste UTI89 direktno iz uzorka urina). Posljedica dugotraj-nije kromatografske analize i većeg broja frakcija utječe na smanjenje broja analiziranih uzoraka u jednom danu, točnije do osam uzoraka ustanovljene vrste i podvrste, od zaprimanja uzorka, do izdavanja re-zultata.

Slika 2. Primjena AssayMAP BRAVO sustava u različitim područjima separacija i analiza.

alphasolutions

30

alphasolutions

31

Tablica 1. Program kromatografskog kondicioniranja i elucije šest frakcija ionskom izmjenom na SCX nastavcima.

Kondicioniranje, frakcioniranje i ispiranje Stupnjevito ispiranje povećanjem pH (SCX nastavci)

Kondicioniranje puferom 400 mM amonijev formijat, 1% mravlja kis./25% ACN

Ekvilibracijski pufer 1% mravlja kis./25% ACN

Elucijski pufer 1 40 mM amonijev formijat, pH 3,5/25% ACN

Elucijski pufer 2 40 mM amonijev formijat, pH 4,0/25% ACN

Elucijski pufer 3 40 mM amonijev acetat, pH 4,5/25% ACN



Elucijski pufer 6 100 mM amonijev hidroksid, pH 9,5/25% ACN

Ispiranje deionizirana voda

Tablica 2. Program kromatografskog kondicioniranja i elucije šest frakcija kromatografijom obrnutih faza na C18 nastavcima (razdvajanje šest frakcija od početnih šest frakcija u konačnici daje trideset i šest frakcija).

Kondicioniranje, frakcioniranje i ispiranje Stupnjevito ispiranje povećanjem udjela acetonitrila

Kondicioniranje puferom 80% ACN:20% H20:0.1% TFA

Ekvilibracijski pufer 0.1% TFA

Elucijski pufer 1 10% ACN:90% H20:0.1% TFA






Ispiranje Milli Q voda ili voda ekvival. kvalitete

Slika 3. Određivanje vrste i podvrste putem obrade podataka dobivenih spektrometrijom masa nakon taloženja, digestije, dvodimenzionalne kromatografske separacije (IE/RP) i analize MALDI-spektrometrijom masa iz uzorka urina.

Analizom frakcija ESI- ili MALDI-spektrome-trijom masa i nakon toga analizom podataka ek-spertnim programskim paketom ProteinReader, moguće je iz iščitanih sljedova aminokiselina (tzv. reverzno iščitavanje translacije) odrediti vrstu ili podvrstu bilo kojeg bića, kojem je u pot-punosti sekvenciran genom (oko 15 000 vrsta). Sama analiza spektara podrazumijeva sekvenci-ranje peptida i pretragu podataka kroz iščitavanje baze svih poznatih proteina bića objedinjenih u taksonomskom stablu. Rezultat takve analize je prikazan na Slici 3. U konačnici, vrsta ili podvr-sta mogu biti određene u izuzetno kratkom vre-menu u odnosu na klasične analize, a primjenom automatizacije i kromatografske separacije kroz sustav AssayMAP BRAVO, dobivena je željena komponenta brzog, efikasnog, točnog i automa-tiziranog postupka primjene RapidCell metode u identifikaciji vrsta, odnosno podvrsta [13].

alphasolutions

31

1. J. K. Eng, A. L. McCormack i J. R. Yates, J. Amer. Soc. Mass.

Spectrom. 5 (1994) 976- 989.

2. A. J. Link, E. Carmack i J. R. Yates, Int. J. Mass. Spectrom. Ion

Proc. 160 (1997) 303- 316.

3. P. H. O’Farrell, J. Biol. Chem. 250 (1975) 4007-4021.

4. J. C. Goiddings, High Pesol. Chromatogr. Commun. 10 (1987)

319-323.

5. N. Lundell I K. Markides, Chromatographia 34 (1992) 369-375.

6. N. Takahashi, N. Ishioka, Y. Takahashi i F. W. Putnam, J.

Chromatogr. 326 (1985) 407-418.

7. G. J. Opiteck, K. C. Lewis I J. W. Jorgenson, Anal. Chem. 69

(1997) 1518-1524.

8. A. J. Link, J. Eng, D. M. Schieltz, E. Caramasc, G. J. Mize, D. R.

Moris, B. M. Garvik i J. R. Yates, Nat. Biotchnol. 17 (1999) 676-682.

9. M. P. Washburn, D. Wolters, J. R. Yates, Nat. Biotchnol. 19

(2001) 242-247.

10. D. A. Wolters, M. P. Washburn, J. R. Yates, Anal. Chem. 73

(2001) 5683-5690.

11. https://www.youtube.com/watch?v=TzakdXGhyIU

12. https://www.selectscience.net/SelectScience-TV/Videos/

how-agilents-assaymap-platform-works/?videoID=2913

13. http://rapidcell.proteinreader.com/

Literatura

alphasolutions

32

prImjenA

spektrOmetrIje mAsA

u rAzvOju I rutInskIm AnAlIzAmA

AktIvnIh FArmAceutskIh supstAncIjA

Institucija / PLIVA HRVATSKA d.o.o., TAPI Hrvatska

Autor / Mislav Runje, Associate Director, Pliva Croatia / TAPI Hrvatska

Područje rutinske i razvojne analitike primjenom spektrometrije masa značajno se promjenilo tijekom zadnjeg desetljeća. To je direktna po-sljedica sve složenijih farmaceutskih aktivnih molekula te sve strožih regulativnih zahtjeva. Posebice je to vidljivo u području onečišćenja koje svojim djelovanjem ima potencijalno mutagena, kancerogena, te-ratogena te toksična svojstva. Poznavanje njihovih svojstava od kruci-jalnog je značaja za budućnost pojedinog lijeka, odnosno mogućnost njegove primjene u liječenju bolesti. Zbog navedenog, prilikom razvo-ja novih lijekova/aktivnih farmaceutskih supstanci od strane regula-tornih agencija uvedeni su pojmovi kao što „Threshold for Toxicolo-gical Concern” s izrazito niskim vrijednostima od svega 1.5 μg/dan.

Zbog svojih nedvojbenih prednosti i nedostataka klasičnih uv detekCija (osjetljivost i identiFikaCija), lCQQQ Metode sve više nalaZe svoje Mjesto i u Metoda propisanih regulativoM.

alphasolutions

Kako bi se mogla provesti kvalifikacija i kvantifi-kacija predmetnih spojeva pri tako niskim kon-centracijama, nužna je primjena kromatografskih tehnika u tandemu sa spektrometrijom masa.Neke od najznačanijih instrumentanih tehnika korištenih u suvremenoj analitici pri razvoju i rutinskim analizama aktivnih farmaceutskih sup-stancija su:• UHPLC spregnut s LCQQQ spektrometrom

masa: kvalifikacija i kvantifikacija potencijal-no genotoksičnih onečišćenja aktivnih farma-ceutskih supstanci

• 2D-LC spregnut s QTOF spektrometrom masa: određivanje „peak purity“ te kvalifika-cije onečišćenja

• SFC: određivanje onečišćenja unutar aktivnih farmaceutskih supstanci (ortogonalnom teh-nikom)

Unutar ovog broja časopisa više ćemo se posve-titi temi kvalifikacije i kvantifikacije potencijalno genotoksičnih onečišćenja aktivnih farmaceut-skih supstanci korištenjem UHPLC-a spregnu-tog s LCQQQ spektrometrom masa.

alphasolutions

33

AktIvnIh FArmAceutskIh supstAncIjA

Primjeri iz prakse: kvantifikacija i kvalifikacija potencijalno genotoksičnih onečišćenja aktivne farmaceutske supstance za gastritisAPI je prolijek. To znači da se u organizmu metabolizira i prelazi u aktivnu formu. Naime, u kiselom mediju pretvara se u ciklični sulfo-namid koji reagira s protonskom pumpom, enzimom H+-K+-ATP-aze koji je završni čimbenik u procesu izlučivanja želučane kiseline i ire-verzibilno se veže preko disulfidnog mosta te je trajno inhibira. Na taj način dugotrajno i gotovo potpuno sprečava izlučivanje kiseline.Maksimalna dnevna doza lijeka iznosi 360 mg dok „Threshold for Toxicological Concern” iznosi 4,2 ppm i sadrži potencijalno genotok-sična onečišćenja:

33

4

PlausibleCarcinogenicity

4-methoxy-2-nitroaniline

4-methoxybenzene-1,2-diamine

2,3,5-trimethyl-4-nitropyridine 1-oxide

3,5-dimethyl-4-nitropyridine 1-oxide

Aromatic nitro compound




Alkylatingagent

Aromatic amine

CarcinogenicityChromosome

damage

CarcinogenicityChromosome

damage

Carcinogenicity

Chromosomedamage Plausible

Plausible

Plausible

Plausible

5

9

14

OH2N

H2N

OH2N

O2N


Compound

Precursor Ion

Q(1)

169.1

139.1

183.1

169.1

151.1

121.9

120.0

123.1

106.1

95.0

137.0

77.0

Q(3)a Q(3)b

Product Ion




Osim UHPLC metodom sa detekcijom na UV detektoru predmetna molekula analizirana je i LC-QQQ tehnikom korištenjem Agilent 1290 Infinity UHPLC instrumenta i Agilent 6490 LC-QQQ sa postavkama:

Dobiveni rezultati i usporedba konvencionalne UV metode s MRM metodom prikazani su:

alphasolutions

34





Quantitation limit / ng/mL

UV

MS/MS

Difference

10

0.01

1000

10

0.025

400

10

0.01

1000

10

0.01

1000

Znatno veća osjetljivost, u nekim slučajevima i do 1000 puta, jasno govori u prilog činjenici kako je upotreba LCQQQ pri razvojnim i rutinskim analizama od krucijal-nog značaja za postizanje propisanih LOQ i LOD vrijed-nosti.

ZaključakKorištenjem naprednih analitičkih tehnika izravno se utje-če na sigurnost i ispravnost API i lijekova koji se primjenju-ju u poboljšanju ljudskog zdravlja. Tako se se omogućuje pouzdano kvalificiranje i kvantifici-ranje potencijalno toksičnih onečišćenja te zadovoljavanje propisanih specifikacijskih limita za svaki pojedini parame-tar.

alphasolutions

alphasolutions

35

dIrektnA AnAlIzA ŽIve u vAšem lAbOrAtOrIju

Uključite direktnu analizu žive u svoj laboratorij! DMA-80 direktni analizator žive uklanja probleme pri prepoznavanju, pamćenju uzo-raka i donosi točne, reproducibilne rezultate za manje od šest minu-ta, čime se povećava produktivnost laboratorija i drastično smanjuju troškovi. DMA-80 može analizirati čvrste, tekuće i plinovite uzorke s jednakom preciznošću u širokom dinamičkm rasponu. Analiza traje samo 5 minuta po uzorku i ne zahtijeva pripremu uzorka tako da is-ključuje rukovanje kiselinama ili tretman uzoraka mokrom kemijom.

To podrazumijeva jednostavnije korištenje, niske operativne troško-ve i eliminira potrebu za kupnju, rukovanje i zbrinjavanje opasnih kemikalija. Štoviše, uklanja se karakteristično usko grlo analitičkog laboratorija, kao i troškovi koji se obično povezuju s tradicionalnim tehnikama za analizu žive, kao što su CV-AAS, ICP-AES ili ICP-MS.DMA-80 koristi princip toplinske razgradnje, amalgamiranja žive i detekciju atomske apsorpcije. Izuzetno je jednostavan za korištenje: jednostavno izvažite svoj uzorak, prenesite na ugrađeni auto-uzorki-vač i pritisnite ‘start’. Kombiniranjem inovativnog sustava mjerenja žive s jedinstvenim optičkim spektrofotometrom, DMA-80 postiže granicu detekcije od 0,001 nanograma žive i može mjeriti do koncen-tracije od 300 mg/kg (300 ppm). DMA-80 je korišten za razvoj US EPA metode 7473 (termičkom raz-gradnjom žive u krutinama i otopinama, amalgamacijom i atomskom apsorpcijskom spektrofotometrijom).

Autor / Sandra Pajurin, Sales Advisor, Asolutic d.o.o., prodajni predstavnik za Milestone Srl

Nadalje, u skladu je s ASTM metodom D-6722-01 (ukupna živa u ugljenu i ostatcima izgaranja ugljena) i ASTM metodom D-7623-10 (ukupna živa u sirovosirovoj nafti).

TočnostDMA-80 daje reproduciblne rezultate za širok ras-pon uzorak kao što su polimeri, prehrambeni pro-izvodi i stočna hrana, biološki uzorci i ostalo npr.

Tunaaverage=253sd=5

RSD=2,2%

UzorciInstrument je kalibriran vodenim standardima te analizira organske i anorganske čvrste uzorke. Za analizu različitih matriksa koristi se samo jedna metoda što čini DMA-80 izuzetno jednostavnim za uporabu. 10 ng žive iz vodenog standarda žive, NIST 2709 tla ili NIST 1632c ugljena, svi gene-riraju iste apsorpcijske maksimume.

alphasolutions

35

alphasolutions

36

Iako je patvorenje jedno od glavnih pitanja kak- voće pčelinjeg voska te predstavlja dugo prisutan i rastući problem u svijetu, još uvijek ne postoje međunarodno propisane analitičke metode i/ili zakonska regulativa za rutinsku kontrolu njegove autentičnosti. Taj se problem ne odnosi samo na aspekte nekontrolirane kontaminacije pčelinjeg voska patvorinama (jeftinije supstance biljnog, životinjskog ili mineralnog podrijetla, derivati petroleja) putem trgovine satnih osnova, već i na činjenicu da se patvorine akumuliraju u sektoru pčelarstva upravo kroz proces proizvodnje sat-nih osnova (glavnina se proizvedenog pčelinjeg voska koristi za proizvodnju satnih osnova koje se ponovo unose u košnice). Nakon uspostave analitičke procedure za rutinsko otkrivanje pa-tvorenja pčelinjeg voska metodom FTIR-ATR spektroskopije, odnosno spektroskopije u sred-njem infracrvenom dijelu spektra s Fouriero-vom transformacijom (FTIR) s ATR (attenua-ted total reflectance; prigušena totalna refleksija) tehnikom snimanja (Svečnjak i sur., 2015a), na Agronomskom fakultetu Sveučilišta u Zagrebu sustavno se prati stanje na međunarodnom trži-štu satnih osnova. U tu je svrhu u razdoblju od 2014. do 2016. godine analizirano 236 uzoraka satnih osnova prikupljenih iz 19 zemalja. Anali-ze su provedene FTIR spektrometrom Cary 660 FTIR MIR System (Agilent Technologies) opre-mljenim Golden Gate ATR instrumentalnim do-datkom (Specac). Rezultati su pokazali kako je više od 70% analiziranih uzoraka satnih osnova bilo patvoreno parafinom (udio se parafina kre-

Institucija / Agronomski fakultet Sveučilišta u Zagrebu, Zavod za ribarstvo, pčelarstvo, lovstvo i specijalnu zoologiju,

Laboratorij za analizu pčelinjih proizvoda i biologiju pčela

Autor / doc. dr. sc. Lidija Svečnjak

tao od 5% do preko 90%), dok je prisutnost drugih patvorina (ste-arinske kiseline i/ili stearina), zabilježena sporadično. Nadalje, naša smo istraživanja usmjerili i na utvrđivanje udjela parafina koji ostaje u saću izgrađenom na satnim osnovama patvorenim parafinom (90%) nakon njegove potpune izgradnje i topljenja, kako bi se utvrdila rezi-dualna količina parafina. Spektralnom je analizom utvrđeno kako u novoizgrađenoj i pretopljenoj sirovini voska zaostaje >50% parafina (Svečnjak i sur., 2015b; 2016). Takav materijal se komercijalno koristi za daljnju proizvodnju satnih osnova i tako ponovno ulazi u tehnolo-giju pčelarenja umetanjem satnih osnova u košnice. Time kontami-nirani materijal neizravno ulazi i u prehrambeni lanac budući da saće predstavlja prvu prirodnu ambalažu meda (hrana), odnosno medij u kojem med dozrijeva. Rezultati ovog istraživanja upućuju na “kronič-nu” cirkulaciju i akumulaciju patvorina (primarno parafina) u procesu proizvodnje satnih osnova i na posljedičnu kontinuiranu kontamina-ciju pčelinjeg voska u sektoru pčelarstva.

pAtvOrenjepčelInjeg vOskA:

AspektI kOntAmInAcIje I rezultAtI AnAlIzA pčelInjeg vOskA s trŽIštA

reZultati su pokaZali kako je više od 70% analiZiranih uZoraka satnih osnova bilo patvoreno paraFinoM, dok je prisutnost drugih patvorina, priMjeriCe stearinske kiseline, Zabilježena sporadično.

alphasolutions

37

Svečnjak, L., Baranović, G., Vinceković, M., Prđun, S.,

Bubalo, D., Tlak Gajger, I. (2015a). An approach for routine

analytical detection of beeswax adulteration using FTIR-ATR

spectroscopy. Journal of Apicultural Science 59 (2): 37-49. DOI:

10.1515/JAS-2015-0018.

Svečnjak, L., Prđun, S., Bubalo, D., Tlak Gajger, I., Baranović,

G. (2015b). Determination of residual paraffin in honeycomb

constructed on adulterated foundations. 44th Apimondia

International Apicultural Congress, Daejeon, South Korea, 15.-

20. September 2015. Scientific Program Abstracts, p. 436.

Svečnjak, L; Prđun, S; Bubalo, D; Matošević, M; Car, J (2016).

Beeswax adulteration issue: aspects of contamination and

outcome. 6th Apimedica & 5th Apiquality International

Symposium - 5th Apiquality, Rome, Italy, 22-25 November

2016. Abstracts Book, p 22-23.

Literatura

Slika 1. Karakteristični FTIR-ATR spektar autentičnog pčelinjeg voska s asignacijom pripadajućih molekulskih vibracija

Slika 2. Komparativni prikaz IR spektara pčelinjeg voska i odabranih patvorina (stearinska kiselina, karnauba vosak, parafin, goveđi loj)

alphasolutions

37

alphasolutions

38

Okus vina i aroma, važni aspekti kvalitete crnog vina, izvedeni su iz velikog raspona hlapljivih spojeva (npr. esteri, aldehidi, ketoni, alkoholi, terpeni, itd.) i njihovih interakcija. Neki od hla-pljivih spojeva potječu od grožđa, neki su proi-zvedeni od strane kvasaca tijekom fermentacije, a neki su formirani u procesu starenja (Rapp i Mandery, 1986.). Spojevi alkohola i aldehida su C6 spojevi koji su sintetizirani putem lipoksige-naze tijekom berbe, prijevoza, runjenja i mulja-

utjecAj rAne deFOlIjAcIje nA kOncentrAcIje hlApljIvIh spOjevA u vInImA sOrte

cAbernet sAuvIgnOn Iz vInOgOrjA srIjem

nja, prešanja i maceriranje grožđa. Linolenska i α-linolenska kiselina nastale su aktivnošću lipoksigenaze koja zahtijeva kisik. Dehidrogena-za alkohola reducira alkohole do odgovarajućih aldehida: 1-heksano-la, (Z)-3-heksenola i (E) -2-heksenola (Oliveira et al., 2006.).Varijacija spojeva okusa i aroma u zrelom grožđu ovisi o raznolikosti te uvjetima okoline tijekom vegetacije i uvriježenih kulturnih praksi (Dunlevy et al., 2009.). Mnogi su istraživači pokazali da se različitim vinogradarskim praksama može utjecati na sastav hlapivih spojeva u grožđu i vinu, kao što su: navodnjavanje (Chapman i sur., 2005.); zastiranje (Xi et al., 2011.); gustoća sklopa (Reynolds i sur., 1994.).

Institucija / 1 Fakultet agrobiotehničkih znanosti Osijek 2 Julius Kühn-Institut, Federal Research Centre of Cultivated Plants, Institute for Grapevine Breeding Geilweilerhof, Siebeldingen, Germany

Autori / Drenjančević, M.1, Rastija, V.1, Jukić, V.1, Zmaić, K.1, Kujundžić, T.1, Rebekić, A.1, Schwander, F.2

Cilj ovoga dvogodišnjeg istraživanja bio je procijeniti učinke uklanjanja lista od osnove mladice prije cvatnje na sadržaj hlapljivih spojeva u vinima kultivara Cabernet sauvignon (Vitis vinifera L.) na području vinogorja Srijem. Tijekom dviju uzastopnih godina (2013. i 2014.) primijenjena su dva različita tretmana uklanjanja listova: uklanjanje 3 lista i 6 listova od osnove mladice te kontrola bez uklanjanja listova. Hlapljivi spojevi dobivenih vina identificirani su i kvantificirani spregnutom tehnikom plinske kromatografije i spektrometrije masa.

Tretmani rane defolijacije nisu imali učinka na koncentraciju organskih kiselina i viših alkohola, osim na octenu kiselinu i 2-metil-6-hepten-1-ol.

Rana defolijacija utjecala je na koncentracije šest estera samo u vinima iz 2014. godine s različitim ishodom. Za spojeve na koje rana defolijacija nije imala učinka, berba je bila statistički značajan izvor varijabilnosti, kao što su rezultati multivarijantne analize potvrdili. Tretmane rane defolijacije u vinima sorte Cabernet sauvignon u vinogradarskoj regiji Istočna kontinentalna Hrvatska potrebno je prilagoditi vremenskim prilikama tijekom vegetacijske sezone.

alphasolutions

39

Rana defolijacija je vrlo inovativna vinogradarska tehnika koja se kori-sti za upravljanje prinosom. Glavni cilj uklanjanja listova u zoni ploda je poboljšanje mikroklime oko ploda kako bi se pojačala cirkulacija zraka, izloženost suncu, veličina i zdravlje grozdova (Tardaguila et al., 2010.).

Utjecaj postupka defolijacije na hlapljive komponente vina je povezan s mnogim čimbenicima. Zato su zapažene značajno veće koncentracije estera vina u skupini gdje je provedena rana defolijacija (Verzera i sur., 2016.). Vrijeme defolijacije ima veliki utjecaj na sastav grožđa. Ranije uklanjanje lišća inducira povećanje koncentracije C6-spojeva kod vina sorte Tempranillo (Moreno et al., 2017.). Šuklje i suradnici (2014.) su ukazali da defolijacija primijenjena u ranijem stupnju razvoja bobica, rezultira višom koncentracijom hlapljivih estera u vinu sorte Sauvi-gnon bijeli. Slično tome, druga studija kod sorte Tempranillo izvješta-va o mnogo većim ukupnim acetatima i nižim alkoholima u vinima u skupini kojoj je defolijacija učinjena u fazi prije cvatnje u usporedbi s defolijacijom u fazi šare (Vilanova et al., 2012).Određivanje odgovarajuće razine defolijacije za postizanje optimal-ne izloženosti sunčevoj svjetlosti, važna je za pojedina vinogradar-ska područja. Iako je jedan od učinaka rane defolijacije povećanje izloženosti lista i grozda sunčevoj svjetlosti, prekomjerno izlaganje može dovesti do opekotina i zaustavljanja rasta bobice (Mijowska i sur., 2016.). Uklanjanje listova u zoni grozda nije imalo utjecaj na koncentracije C6 alkohola i aldehida u vinima sorte Pinot crni (Feng et al., 2015.).

Materijal i metodeBiljni materijal i dizajn eksperimentaIstraživanje je provedeno tijekom 2013. i 2014. godine u Iloku, vino-gradarska regija Istočna kontinentalna Hrvatska, podregija Podunav-lje, vinogorje Srijem. Uzgojni oblik bio je Guyot s 12 pupova po trsu. Trsovi su imali razmak sadnje od 2,0 m između redova i 0,9 m unutar reda što čini sklop od 5555 trsova/ha. Dizajn eksperimenta podrazu-mijevao je slučajni blokni raspored s tri ponavljanja.

Učinjena su dva različita tretmana rane defolijacije: uklanjanje 3 (T1) i 6 listova (T2) od osnove mladice prije cvatnje i kontrola (bez ukla-njanja listova)(T3). Tretmani su uključivali 10 biljaka po parceli. Datum berbe određen je na temelju omjera sadržaja šećera i kiselina. Srednje dnevne temperature tijekom vegetacijskog razdoblja od trav-nja do rujna 2013. bile su više nego u 2014. godini, dok je kumulativna količina oborina bila veća u 2014.

MikrovinifikacijaFermentacije su provedene po svakom tretmanu u tri ponavljanja za obje promatrane godine. Od bobica su odvojene peteljke, izmuljano je, tretirano s 15 mg/L SO2 i inokulirano sa Saccharomyces cerevisiae (Uvaferm BDX). Fermentacije su provedene u staklenoj boci od 5 lita-ra na temperaturi od 25° C. Masulj je miješan dva puta dnevno. Nakon sedam dana fermentacije i maceracije, obavljeno je prešanje malom mehaničkom prešom. U vina je dodano 20 mg/L SO2.

alphasolutions

40

GS / MS analiza hlapljivih spojevaHlapljivi spojevi analizirani su pomoću Agi-lentovog 6890N plinskog kromatografa (GC) (Santa Clara, SAD) spregnutog s detektorom masenog spektrometra (MS) uz stir-bar-sorpti-ve ekstrakciju (SBSE) s polidimetilsiloksan-skom fazom (Gerstel, Mülheim an der Ruhr, Njemačka). Identifikacija izdvojenih spojeva izvršena je usporedbom retencijskih indeksa i MS spektara u usporedbi s Wiley 7 Nist 05 ba-zom podataka masenih spektara. Kvantifikacija je izvršena korištenjem 3-dekanola kao internog standarda. Kontrola softvera sustava, uprav-ljanje podacima i analize su izvršene pomoću poboljšanog ChemStation Software (Agilent Techonologies, Inc.). Svi uzorci su analizirani u triplikatu. Usporedba koncentracija hlapljivih spojeva između različitih tretmana i godina na-pravljena je analizom varijance (jednosmjerna ANOVA) s testiranjem najmanje značajnih ra-zlika (LSD) testom na razini p = 0,05. Statistič-ke analize provedene su pomoću SAS 9.3. Sof-tware for Windows, Copyright © 2012. by SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.

Rezultati i raspravaHlapljive komponente su bile klasificirane kao: organske kiseline, viši alkoholi i esteri. Dvije najučestalije hlapljive kiseline pronađene u vi-nima su dekanoična kiselina i oktanska kiseli-na čije koncentracije su ispod 0.20 mg/L. Iako oktanska kiselina pri niskim koncentracijama može uzrokovati aromu sira, a dekanoična kise-lina užegao okus, njihov utjecaj na aromu vina je zanemariv. Heptanoična kiselina je spoj u tra-govima karakterističan za vino sorte Cabernet sauvignon ( Jiang i Zhang, 2010.). Nisu opažene razlike između tretmana u koncentraciji identi-ficiranih hlapljivih spojeva, osim octene kiseli-ne u 2013. godini čija je koncentracija značajno smanjena postupkom rane defolijacije. Kon-centracije većine pojedinačnih kiselina variraju samo među godinama, a više razine su uočene 2013. u odnosu na 2014. godinu. Veća količina oborina tijekom vegetacijskog razdoblja 2014. i niže temperature izazvale su povećanu koncen-traciju jabučne kiseline. Niže temperature tije-kom berbe mogu rezultirati povećanjem sadr-žaja jabučne kiseline (Volschenk et al., 2006.).Veća ukupna kiselost, posebno u obliku jabuč-ne kiseline, može predstavljati veliki problem u područjima s hladnijom klimom (Smith et al.,

1988.). U skladu s prethodnim studijama (Vilanova et al., 2012.; Šuklje et al., 2014.), dobiveni rezultati upućuju da na sadržaj organ-skih kiselina rana defolijacija općenito nema utjecaja. To se može objasniti činjenicom da su organske kiseline uglavnom rezultat fer-mentacije i njihova proizvodnja najviše ovisi o sastavu mošta i uvje-tima fermentacije (Sánchez-Palomo i sur., 2012.). Prema kvantitativnim podacima, 2-feniletanol je najučestaliji alko-hol u analiziranim vinima. Rezultati koncentracija alkohola ne poka-zuju nikakve razlike između kontrolnog uzorka i uzoraka tretiranih uklanjanjem bazalnih listova, s iznimkom 2-metil-6-hepten-1-ola, na čiju je visoku koncentraciju utjecalo uklanjanje lišća, oba tretmana s 3 i 6 listova. Uočene su značajne razlike među godinama za osam od 12 alkohola. Koncentracije dvaju fenilnih alkohola (fenilmetanol i 3-fenil-1-propanol), kao i 3-heksen-1-ol, (Z)- i 2-metil-6-hepten-1-ol su više u 2013. godini. Visoka razina 2-nonanola iz 2013. godine otkrivena je samo u vinu tretiranom s uklanjanjem šest listova. Zna-čajno više razine druga tri alkohola (1-heksanol, 1-heptanol i 2-me-til-l-propanol) pronađene su u vinu iz 2014. godine. Na formiranje viših alkohola tijekom fermentacije najviše utječe vi-narska praksa (Antonelli et al. 1999.). Istraživanje Vilanove i surad-

40

alphasolutions

41

nika (2012.), pokazuje značajno opadanje sa-držaja C6 alkohola (heksanol, heksenol) kada je primijenjena defolijacija, ali ukupni alkoholi ostaju nepromijenjeni. Najučestaliji alkohol pronađen u vinima, 2-feniletanol, procjenjivan ovim istraživanjem, opisan je kao primarni hla-pljivi spoj vina sorte Cabernet sauvignon (Tao i Zhang, 2010.). Najčešći pronađeni esteri (kon-centracija > 100 ug / L) su: octena kiselina, 2-fe-niletil-ester; butandionska kiselina, dietil-ester; izoamil-acetat; vanilična kiselina, etil-ester. Ovi esteri imaju značajan utjecaj na percepciju arome vina kao voćne i cvjetne. U ovom radu, najznačajniji ester je butandionska kiselina, die-til-ester (ili dietil-sukcinat), spoj koji daje vinsku aromu tipičnu za Cabernet sauvignon (Sánc-hez-Palomo i sur., 2012.). Drugi je izoamil-ace-tat koji pridonosi banana aromi ( Jiang i Zhang, 2010.). Od ukupno 32 identificirana estera, rana defolijacija je utjecala na koncentracije samo šest njih. Pozitivan učinak uklanjanja 6 listova primi-jećen je samo kod etil-valerata u vinu iz 2014. godine. Iste godine, oba tretmana rane defolija-cije rezultirala su znatno većom koncentracijom izopentil-metoksiacetata u 2014. Reduciranje koncentracije estera zbog tretmana defolijacije zabilježeno je samo u vinu iz 2013. Koncentraci-ja izoamila-acetata je spuštena tretmanom ukla-njanja 3 lista; hidrocimetne kiseline, etil-estera i etil-laktata tretmanom uklanjanja 6 listova, dok su oba tretmana jednako smanjila koncen-tracije octene kiseline, heksil-estera. Prikazana berba bila je najveći i statistički značajan izvor varijabilnosti estera. Značajno veće koncentra-cije sedam estera primijećene su u vinu iz 2013. godine, 10 estera ima veće koncentracije u vini-ma iz 2014. U prezentiranoj studiji, nisu opaženi odnosi između određenih skupina estera čija je koncentracija rasla ili opadala tretmanom defo-lijacije. U skladu s time, Vilanova i et al. (2012.) izvijestili su da je rana defolijacija značajno sma-njila C6-spojeve i povećala koncentracije acetata u vinu. Smanjenje učinka defolijacije na estere je detektirano samo u 2013. godini dok je porast estera bio vidljiv u vinima iz berbe 2014. godi-ne. Vjerojatno, zajedno s višim temperaturama u vegetaciji u 2013. godini, defolijacija je dodatno povećala gubitke određenih hlapivih estera.

ZaključakNa hlapljive organske kiseline i alkohole uglavnom ne utječu tretma-ni rane defolijacije kod vina sorte Cabarnet sauvignon proizvedenih u uvjetima istočne kontinentalne Hrvatske. Rano uklanjanje listova ima-lo je utjecaj u jednoj godini eksperimenta na koncentraciju samo šest estera: izopentil-metoksiacetata, izoamil-acetata, hidrocimetna kiseline, etil-estera, etil-laktata i octene kiseline, heksil-estera. Nedostatak većih razlika između kontrolnih i tretiranih vina može se pripisati karakteristi-kama pojedine vegetacije. Utvrđeno je da je godina berbe najveći izvor varijabilnosti za većinu istraživanih hlapljivih spojeva.

ZahvaleOvo istraživanje podržala je Vukovarsko-srijemska županija, Hrvat-ska (broj projekta 369). Autori zahvaljuju tvrtki GERSTEL GmbH & Co.KG za podršku.

alphasolutions

4141

Cjelovita verzija rada objavljena je u časopisu Poljoprivreda/Agriculture 24:2018 (1) 10-17http://dx.doi.org/10.18047/poljo.24.1.2

alphasolutions

42

lAbOrAtOrIj nA grAnIcI

mIkrO I

svIjetA –

Institucija / Institut IGH, Laboratorij za veziva i ekologiju

Autor / Marija Đuroković, dipl. ing. kem.

Laboratorij za veziva i ekologiju, Zavoda za materijale i konstrukcije Instituta IGH d.d., specifičan je jer se bavi kemijom u području građe-vine. U Hrvatskoj i šire postoje mnogobrojni laboratoriji koji pružaju usluge ispitivanja iz područja građevine, no samo neki, usudila bih se reći najbolji, imaju laboratorije koji se bave kemijom u obimu u kojem se bavi naš laboratorij. Naša različitost možda se najbolje zrcali kroz iskazivanje rezultata koji kod drugih građevinskih laboratorija najčešće počinju prefiksima kilo, giga ili mega, dok su naši najčešće vezani za grame, miligrame ili mikrograme. Možemo reći da je laboratorij smješten na granici makro i mikro svijeta. Rad u laboratoriju zahtijeva vrlo visoku razinu znanja kako iz kemije tako i iz građevine. Multidisciplinarnost je nužan pre-duvjet za dobar rad laboratorija. Proizvodnja građevinskih materijala, izgradnja, upotreba i uklanjanje građevina može predstavljati znača-jan utjecaj na okoliš. Osnovna djelatnost laboratorija vezana je uz veziva, odnosno cement. U laboratoriju se provode analize i ispituju različita svojstva cementa i drugih građevinskih materijala te sirovina iz kojih se proizvode (va-pno, agregat, beton, dodatci betonu, proizvodi za zaštitu i popravak konstrukcija i drugi). Laboratorij također pruža usluge analize vode, tla i otpada za sve one parametre bitne za procjenu utjecaja okoliša na građevinske materijale i obratno. Mogućnost analize glavnih elemena-ta i elemenata u tragovima na istom mjestu i ocjene njihovog utjecaja na bitna svojstva građevnih materijala ono je što izdvaja naš laboratorij

od ostalih. Za nas su jednako ključni, tzv. glavni elementi, zastupljeni u većim postotcima, kao i elementi u tragovima čija je prisutnost izražena u ppm ili manje. Građevinski materijali kojima se bavimo većinom su anorganski. Stoga je po-znavanje prisutnosti pojedini metala u tragovima naš je osnovni cilj.

Slika 1. Agilent Technologies ICP MS 7800

mAkrOprOblemAtIkA metAlA u grAđevInskOm mAterIjAlu

alphasolutions

43

Za potrebe analize elemenata u tragovima u gore navedenim uzorcima, laboratorij je opremljen ICP MS 7800 ICP MS Agilent Technologies s automatskim uzorkivačem (SPS 4), MicroMist raspršivačem, komorom za raspršivanje tipa Scott, kvarcnim plamenikom, nikal konovima i oktopolnom kolizijsko-reakcijskom ćelijom.

održivost graĐevinarstva potaknula je i potrebu Za projektiranjeM i iZgradnjoM graĐevina čiji će vijek trajanja biti dulji i koje će tijekoM uporabe Zahtijevati Manju raZinu sanaCijskih aktivnosti.

Slika 2. Agilent Technologies GCMS 5977B s HSS i tekućim injektiranjem

Slika 3. Osoblje laboratorija za veziva i ekologiju, Institut IGH d.d.

alphasolutions

43

Prije same analize na ICP MS-u, potrebna je ade-kvatna priprema uzoraka, koja je u laboratoriju osigurana korištenjem ETHOS UP sustava za mikrovalnu digestiju Milestone Srl Italy.Mikrovalna razgradnja različitih uzoraka pred-stavlja jedan od najvećih izazova u našem radu. Često se moramo služiti protokolima za razgrad-nju koji su razvijeni posebno za naše svrhe u suradnji sa stručnjacima iz Milestonea. Primjer takve suradnje je razgradnja otpadnog materijala od asfaltnih cesta, složene mješavine organskih i anorganskih materijala. Drugi izazov predstavlja visoka koncentraci-ja osnovnih elemenata Ca, Mg, Fe, Al, Si, Na i K u uzorcima materijala s kojima obično radi-mo. Zbog toga se većina analiza ovog tipa mora provoditi u HMI (‘High Matrix Introducton’) modu. Potrebno je osigurati poseban par konova i vrlo često čistiti ključne dijelove uređaja.Raznolikost materijala predstavlja posebno važ-no iskustvo. Različitost porijekla i varijabilnost sastava pred nas stavljaju izazove manje rutin-skog, a više istraživačkog rada.

Slika 4. Marija Đuroković (Institut IGH d.d.), Ivona Kaselj (Alphachrom d.o.o.)

alphasolutions

44

plInskAkrOmAtOgrAFIjA

u FArmAceutskOj IndustrIjI

Institucija / Pliva Hrvatska d.d.

Autor / Ivan Černava, Lead Researcher – Analyst

Plinska kromatografija postiže veće rezolucije između komponenti u odnosu na druge kromatografske tehnike. Korištenje plina kao pokretne faze ima prednost u brzom uravnoteže-nju između pokretne i nepokretne faze što dozvoljava primjenu većih brzina protoka plina nosioca. Veoma mali broj komponenti postiže isto retencijsko vrijeme.S optimalnim protokom plina nosioca i kontrolom temperature mo-guće je identificirati veliki broj komponenti u jednom prolazu.Osim toga, jedan od glavnih razloga još uvijek široke primjene plinske kromatografije je i osjetljivost. Od 0.1% kod TCD detektora, ppm ra-zine kod FID detektora, pa do ppb razine kod ECD ili NPD detektora. Prednost velikih osjetljivosti je potreba za malom količinom uzoraka što rezultira niskom cijenom u odnosu na dobivene rezultate.

Primjena plinske kromatografije u Farmaceutskoj industrijiUspješna i učestala primjena plinske kromatografije u farmaceutskoj industriji rezultat je prvenstveno visoke efikasnosti razdvajanja, zatim ekstremne osjetljivosti detekcije vrlo niskih koncentracija kompo-nenti i svakako preciznosti te točnosti podataka proizašlih iz kvantifi-kacije kompleksnih smjesa uzoraka. Svaka analiza općenito uključuje dva koraka, razdvajanje komponenti i njihovu kvantifikaciju. Bolje razdvajanje rezultira jednostavnijom i točnijom kvantifikacijom i tu plinska kromatografija ima svoje mjesto u svakodnevnim laboratorij-skim analizama unutar farmaceutske industrije, a najčešće za rutinske analize hlapljivih organskih onečišćenja u aktivnim farmaceutskim oblicima.

Određivanje hlapljivih organskih onečišćenja plinskom kromatografijomHlapljiva organska onečišćenja su ostatci organ-skih otapala korištenih ili proizvedenih tijekom sinteza aktivnih farmaceutskih oblika korištenih za proizvodnju gotovih lijekova. Mnoga od tih otapala nije moguće kompletno ukloniti tijekom proizvodnih procesa i zaostaju unutar aktivnih komponenti, uglavnom u niskim koncentracija-ma. Ugradnjom takvih aktivnih komponenti koje sadrže tragove organskih otapala u konačnici re-zultiraju sadržajem istih u konačnom proizvodu, lijeku. Primjeri podrijetla su etanol i aceton ko-rišteni u pripravljanju polimernih ovojnica table-ta, izopropanol alkohola u kristalizaciji aktivnih komponenti ili etil acetata u formiranju gel poli-

jedan od glavnih raZloga još uvijek široke priMjene plinske kroMatograFije je osjetljivost i potreba Za MaloM količinoM uZoraka, što reZultira niskoM CijenoM u odnosu na dobivene reZultate.

alphasolutions

45

mera. Prisutnost ovih organskih otapala utječe na fizikalno-kemijska svojstva lijeka, kao što su veličina čestica, stupanj otapanja i stabil-nost, ali isto tako mogu predstavljati i ozbiljan zdravstveni problem. S tih aspekata određivanje njihove prisutnosti bilo u aktivnim supstan-cijama ili gotovim oblicima od iznimnog je značaja. Tu veliku ulogu ima plinska kromatografija kao instrumentalna metoda u njihovom praćenju. Pruža vrlo dobro razdvajanje velikog broja komponenti, uz brzinu, točnost i preciznost.

Instrument: Agilent 6890N Network GC SystemSampler: G1888 Network Headspace SamplerColumn: DB-5, 60 m x 0.530 mm, 5.00 µmCarrier: Helium, constant flow 5 ml/minInlet: Split 5:1; 200°COven: 45°C (5 min) to 100°C (4°C/min), 25°C/min to 225°C, hold 8 minDetector: FID, 250°C

Slika 1. Primjer kromatograma standardne otopine ostatnih otapala (u analizi aktivnog farmaceutskog oblika)

Ostale primjeneOsim primjene plinske kromatografije u određivanju ostatnih otapala, svaka hlapljiva komponenta može se identificirati ili kvantificirati. To mogu biti različite dodatne komponente formulacije lijeka ili različita onečišćenja iz procesa proizvodnje ne nužno kemikalije, već spojevi ekstrahirani iz raznih materijala s kojima kemikalije dolaze u kontakt.Sprega plinskog kromatografa s detektorom masa povećava specifič-nost, a samim time i točnost asignacije komponente prema odgova-rajućem piku. Kada prisutnost komponente nije poznata unaprijed, tehnika omogućava njihovo prepoznavanje, što je uvjet za daljnju kvantifikaciju. Velika osjetljivost spektrometra masa također omogu-ćava detekciju i kvantifikaciju vrlo niskih koncentracija, što je u novije

alphasolutions

46

vrijeme interesantno sa stajališta različitih genotoksičnih supstancija prisutnih bilo u aktivnim oblicima ili gotovim proizvodima. Isto tako u novije vrijeme sa sve većom primjenom različitih peptida u razvo-ju lijekova, plinska kromatografija sa spektrometrom masa ima veliku ulogu i u karakterizaciji takvih lijekova i aktivnih supstancija.

Instrument: Agilent 7890B GC SystemDetector: Agilent 7000C GC/MS Triple QuadColumn: CP-Chirasil L-VAL, 15 m x 0.25 mm x 0.12 µmInstrument: Agilent 7890B GC SystemDetector: Agilent 7000C GC/MS Triple QuadColumn: CP-Chirasil L-VAL, 15 m x 0.25 mm x 0.12 µm

Slika 2. Kromatogram spektrometra masa – aminokiseline iz peptidne ak-tivne komponente lijeka

Slika 3. Spektar masa Izoleucina (derivat trifluoroacetil; ester)

Instrument: Agilent 7890B GC SystemDetector: Agilent 7000C GC/MS Triple QuadColumn: CP-Chirasil L-VAL, 15 m x 0.25 mm x 0.12 µm

Interesantna kombinacija plinske kromatografije s drugim tehnikama je ona s infracrvenom spek-troskopijom (GC/FT-IR). Infracrvena spektro-skopija ima veliku ulogu u rutinskim kontrolama kemijskih sinteza. U sprezi s plinskim kromato-gramom, uspješno se može koristiti u definiranju molekulskih struktura nepoznatih komponenti. Jedan od primjera je identifikacija parova izo-mera u plinovitim komponentama, npr. nekih metabolita. Razlike tog tipa teško je uočiti dru-gim tipovima detekcije zbog jake vodikove me-đumolekularne veze koja ne postoji u plinovitom stanju.

ZaključakNedostatak plinske kromatografije je prven-stveno u zahtjevu da komponenta uzorka koja se određuje bude hlapljiva na temperaturi na kojoj neće doći do razgradnje. Kako je u priro-di više nehlapljivih u odnosu na hlapljive tvari, to se odmah nameće kao ograničenje u primje-ni. Međutim, razuman izbor specifičnih sustava injektiranja i detekcije produljilo je korištenje plinske kromatografije u širokom spektru pri-mjena. Odluka treba li koristiti plinsku kromato-grafiju ili neku drugu (npr. tekućinsku – HPLC)s, uvelike može biti rezultat pažljivo sagledane cijele analitičke procedure, od pripreme uzorka do konačnog izračuna. Jednostavnost postupka, pouzdanost, robusnost metode, automatizacija, cijena plinova, otapala i reagensa, priprema uzor-ka i brzina analize, sve su to važni kriteriji u indu-strijskim analitičkim laboratorijima, a u mnogim slučajevima mogu presuditi u korist GC tehnike.

alphasolutions

alphasolutions

mAle mOlekule

I bIOmOlekulArnI bIljezI Institucija / Institut Ruđer Bošković, Zavod za organsku kemiju i biokemiju, Laboratorij za biomolekularne interakcije i spektroskopiju

Autori / Dr. sc. Ivo Crnolatac, Dr. sc. Ivo Piantanida

Ovim istraživanjem praćene su značajke malih molekula, koristeći se analitičkim tehnikama spektrofotometrije i fluorimetrije. Dvije male molekule, pokazuju zanimljive značajke višenamjenskih analitičkih molekularnih biljega, gdje jedan kromofor daje različite signale za ra-zličite DNA/RNA slijedove pri snimanju spektara različitih viskoko osjetljivih spektroskopskih metoda. Spojevi pokazuju ratiometrijsko razlučivanje dvolančanih AU-RNA, AT-DNA i GC-DNA u približ-nom omjeru 10:8:1. Posebno je interesantno što spojevi pokazuju fluorimetrijski odgovor (porast intenziteta fluorescencije) prilikom vezanja na poli rA iz smjese u kojoj ima i 10 puta više drugih jednolan-čanih RNA sekvenci s kojima navedeni spojevi ne reagiraju. S druge strane, spojevi omogućuju kiralno prepoznavanje poli rU sekvenci iz smjese drugih jednolančanih RNA, induciranjem signala cirkularnog dikroizma (ICD signal) u vidljivom dijelu spektra (400-500 nm). Si-gnal je pripisan vezanju bočnog lanca spojeva jer ICD signala nema prilikom interakcije poli rU s referentnim spojem koji nema bočnog lanca. Zanimljivo je i da relativno mala razlika u strukturi bočnog lan-ca na identičnom kromoforu rezultira suprotnim predznakom ICD si-gnala prilikom vezanja poli rU. Imajući u vidu razlike u NMR NOESY kontaktima i protonskim kemijskim pomacima između dvaju kom-pleksa boja/oligo rU, u kombinaciji s MD simulacijama i CD izraču-nima, uočeni bisignantni ICD odgovor možemo pripisati vezanjem dimernog agregata boje. Na taj način, ovi molekularni biljezi mogu u smjesi jednolančanih RNA molekula prepoznati prisutsvo duljih rA sekvenci, fluorescentnim odgovorom, a prisutstvo rU sekvenci ka-rakterističnim ICD signalom. Isto tako, u smjesi dvolančanih DNA molekula, pomoću ovih biljega može se fluorimetrijski utvrditi omjer AT prema GC parovima baza. Fluorimetrijska analiza napravljena je Agilent Technologies Cary Eclipse uređajem, a spektrofotometrijska analiza Agilent Technologies Cary 60 UV VIS sustavom.Spektri cirkularnog dikroizma snimani su na Jasco J-815 spektropola-rimetru, a 1D i 2D 1H/13C NMR spektri dobiveni su na 600, odnos-no 800 MHz Agilent Technologies spektrometrima.

Male Molekule, bioMolekularni biljeZipokaZuju raZličite FluoresCenCijske, Cdi nMr odZive prilikoM veZanja na raZličitedna i rna slijedove .

47

alphasolutions

alphasolutions

48

Institucija / Euroinspekt Croatiakontrola d.o.o.

Autor / Jelena Trbušić, mag. ing. bioproc.

IskustvO u prOvOđenju

Odjel za molekularnu dijagnostiku, Euroinspekt Croatiakontrola Jedan od novih i brzorastućih segmenata u kontroli hra-ne i hrane za životinje je i Molekularna dijagnostika. U Odjelu za molekularnu dijagnostiku Laboratorija Croa-tiakontrole, koristi se suvremena tehnologija lančane re-akcije polimerazom u stvarnom vremenu, poznatija pod nazivom „Real-Time PCR“. Osim u analizama GMO-a, koje ćemo u nastavku detaljnije opisati, koristimo Agi-lent Mx3005P Real-Time PCR sustav u analizama detekci-je patogenih mikroorganizama u hrani i hrani za životi-nje, kao i alergena i norovirusa. GMO legislativa za hranu i hranu za životinje propisa-na je uredbama EU 1829/2003 i 1830/2003 Europskog parlamenta i Europskog vijeća. Ako se u proizvodu nala-zi više od 0.9 % GMO-a, taj proizvod mora biti označen „Ovaj proizvod sadrži genetski modificirane organizme“ ili „Ovaj proizvod sadrži genetski modificirani (naziv or-ganizma)“. U našem Odjelu, koristimo preporučene metodama EURL-a, verificirane i akreditirane prema normi HRN EN ISO/IEC 17025:2007. Sâm proces analize sastoji se od izolacije i pročišćavanja DNA, „Real-Time PCR“ reakcije te obrade rezultata. U kvalitativnoj analizi pre-tražujemo specifične transgene, a na osnovu dobivenih rezultata provodi se daljnja analiza identifikacije i kvan-tifikacije GMO-a. U 2017. godini, rezultati su pokazali da je gotovo 90% uzoraka bilo negativno, dok je u ostat-ku pozitivnih najčešće detektirana pozitivna GTS 40-3-2 soja, poznatija pod komercijalnim imenom Roundup Ready.

Slika 1. Amplifikacijske krivulje za baždarni pravac (kvantifikacija), Agilent Technologies Mx3005P „Real-Time PCR“

Slika 2. Baždarni pravci, Agilent Technologies Mx3005P „Real-Time PCR“

lAbOrAtOrIjskIh IspItIvAnjA, kOntrOle hrAne

alphasolutions

49

Euroinspekt Croatiakontrola je kontrolna kuća s 26-godišnjim iskustvom u području laboratorijskih ispitivanja, kontrole kakvoće i količine roba, kontrole objekata te kontrole na liniji klanja. Našu kvalitetu potvrđuju akreditacije HRN EN ISO/IEC 17025:2007, HRN EN ISO 9001 i HRN EN ISO/IEC 17020:2012, a posebno smo ponosni na više od četiristo (400) razvijenih metoda, od čega je više od dvjesto (200) akreditiranih. Nastojeći pratiti izazove na tržištu, kontinuirano razvijamo i uvodimo nove metode, pri čemu posebno izdvajamo područje kromotografije te molekularnu dijagnostiku za što koristimo najsuvremeniju tehnologiju svjetskih proizvođača.

Slika 3. Kromatogram, Agilent Technologies 6460 LC/MS Triple Quad

Slika 4. Baždarni pravac za fenbukonazol, Agilent Technologies 6460 LC/MS Triple Quad

Odjel za hranu i vodu, Euroinspekt CroatiakontrolaSusljedno novim znanstvenim dostignućima, iz godine u godi-nu u legislative se uvode novi spojevi koje je u hrani potrebno kontrolirati. Budući da su količine nekih od tih spojeva u hrani izuzetno niske (do ng/kg), od laboratorija se zahtijeva primje-na najsuvremenijih analitičkih tehnika.

Kako bi se osigurala visoka razina sigurnosti hrane, upotreba pesticida mora biti strogo regulirana. Stoga su na razini Europ-ske unije propisane maksimalno dopuštene količine ostataka pesticida koje se smiju naći u hrani i hrani za životinje (Uredba (EZ) 396/2005).

Croatiakontrola koristi multirezidualnu metodu (HRN EN 15662:2008) kojom u jednom uzorku određuje više od pet-sto (500) pesticida. Priprema uzorka temelji se na tehnici disperzivne ekstrakcije čvrstom fazom (QuEChERS), nakon čega se pročišćeni ekstrakt analizira tehnikama tekućinske i plinske kromatografije vezanima na spektrometriju masa - 7000C GC/MS Triple Quad i 6460 LC/MS Triple Quad (GC-MS/MS i LC-MS/MS). Pesticide koje zbog specifičnih fizikalno-kemijskih svojstava nije moguće odrediti multirezi-dualnom metodom (glifosat, nikotin, ditiokarbamati, fosetil, klorotalonil, ditianon) određujemo tzv. metodama za pojedi-načne ostatke.

Također, sudjelujemo u monitorinzima Republike Hrvatske, pri čemu posebno valja istaknuti aktualne analize ekoloških (EKO, BIO, ORGANIC) proizvoda.

Nekad se pojava mikotoksina u hrani uglavnom povezivala s tropskim područjima, no zbog klimatskih promjena, mikotok-sini se posljednjih godina pojavljuju i u žitaricama uzgojenim u našim krajevima. Zbog pojave aflatoksina B1 u kukuruzu 2013. godine, te njegova metabolita aflatoksina M1 u mlijeku krava koje su hranjene zaraženim kukuruzom, razvili smo metodu određivanja aflatoksina B1 i ukupnih aflatoksina tehnikom LC-MS/MS, dok aflatoksin M1 određujemo tekućinskom kromatografijom nakon pročišćavanja na imunoafinitetnim kolonama.

U posljednje vrijeme postoji velik interes za analizu akrilamida u hrani, budući da se proizvođačke kompanije pripremaju za novu regulativu Europske komisije (EU) 2017/2158 o maksi-malno dopuštenim količinama tog kontaminanta u hrani, koja stupa na snagu u travnju 2018. godine. Akrilamid je spoj koji nastaje interakcijom asparagina i ugljikohidrata prilikom peče-nja ili prženja hrane te je svrstan u kancerogen II. kategorije, a analizu tog spoja provodimo LC-MS/MS tehnikom.

alphasolutions

50

Često se misli da posao servisera počinje u trenutku prodaje instrumen-ta. No, posao servisnog inženjera počinje puno ranije. Tjedni i tjedni treninga, svakodnevno praćenje regulativa i usavršavanje, suočavanje s novim zahtjevima i aplikacijama, naravno uz specifičnosti svakog novog instrumenta. Sve je to posao današnjeg servisera. I zato, nakon svojih 17 godina u servisu, odlučio sam za prvi broj na-šeg časopisa napraviti malu retrospektivu – nekoć i sada.Moram priznati da je tehnički dio posla gotovo isti, ali to je jedina poveznica! Dinamika i količina posla, raznovrsnost, težina materije, compliance, vrijeme odziva i uklanjanja kvarova, praćenje servisne statistike, organizacija i struktura, odgovornost, komunikacija s pro-izvođačem – to je danas sasvim nova dimenzija.U početcima je tempo bio znatno sporiji, a gotovo svaki laboratorij je imao aplikativnog inženjera. Generalno su djelatnici imali više vreme-na posvetiti se materiji i struci, koristio se puno manji broj tehnika i tipova instrumenta. Od servisa se očekivalo da ima brz i učinkovit od-ziv te dobro opremljeno skladište. Dokumentiranje problema i rješe-nja je bilo na osnovnom nivou, a s obzirom da su se uglavnom koristile LC i GC metode, velik broj inženjera je uspješno rješavao aplikativne poteškoće uključujući pripremu uzoraka.Ulaskom Hrvatske u EU, sustiže nas sve više promjena - promjene/optimizacije u koorporativnim postavkama, usklađivanje s EU nor-mama te masovni dolazak high-end tehnika (LCMS gama (QQQ, TOF, QTOF) / GCMSMS, GCMS QTOF / ICPMS, ICPMSQQQ / Micro Array).Nivo compliancea je jako napredovao, zahtjeva dodatne treninge, puno više vremena te dokumentacije, koriste se različiti napredni softveri. U velikom broju tvrtki jedan inženjer pokriva više instrumenata i dan mu je ispunjen operativnim zadatcima pa naš servis, sada u punom smislu riječi servisna podrška, često uključuje edukaciju korisnika, podešavanja metoda i rješavanje aplikativnih problema.

Autor / Nenad Sakić, Support Manager, AlphaChrom

AlphAchrOm servIs

Budući da su traženi rokovi odziva sada na nivou EU i uz sve navedeno, napravili smo organizacij-ske promjene, a proces napretka i usavršavanja traje i dalje.Trenutno naš servis broji 18 djelatnika. Održa-vamo 1000+ aktivnih instrumenata u Hrvatskoj, Bosni i Hercegovini te Kosovu.Tradicionalno zapošljavamo inženjere sljedećih struka: kemija/strojarstvo/elektrotehnika/infor-matika, a danas je obavezan inženjer kemije u sva-koj CMS grupi.Grupe su: LC (HPLC/UPLC/LCMS/DISSO-LUTION), GC (GC/GCMS gama/HSS/CTC), SPS (AAS/ FTIR/UV-VIS/ICP-OES/ICP-MS),

tjedni i tjedni treninga, svakodnevno praćenje regulativa i usavršavanje, suočavanje s noviM ZahtjeviMa i aplikaCijaMa, naravno uZ speCiFičnosti svakog novog instruMenta. sve je to posao današnjeg servisera.

svAkOdnevnO OsIgurAvA OptImAlAn rAd vIše Od 1000 InstrumenAtA u trI zemlje

alphasolutions

alphasolutions

51

DGG (PCR/QPCR/uARRAY/GEN/MOLDEV/OCD) i Non Agi-lent (generatori/ laboratorijska oprema).

Kompletno poslovanje servisa se prati kroz ERP i CRM. Svi kvarovi se vode kroz upite, raspored servisa je unutar CRM-a. Kontinuirano se osvježava baza korisnika, instrumenata i znanja. Iz softvera se kreira iz-vještavanje kako bismo pratili rokove odziva (48 sati), broja popravka pri prvom posjetu (94%), roka isporuke dijelova (2,7 dana) itd.

U anketi o zadovoljstvu korisnika našim servisom, koju smo proveli 2017. godine, više od 95% ispitanika potvrdilo je da bi preporučilo naš servis. Za takav rezultat, potrebno je prije svega nadograđivati svoja znanja. Ba-zične (npr. GC, LC) i nove (npr. 1290 II UPLC) platforme zahtjevaju trening u tvornici, dok se za osvježene platforme prolazi online trening i testiranje. Svi serviseri imaju završene edukacije za hardver i softver koji se održavaju u trening centrima proizvođača. Alphachrom ima u prosje-ku 100 dana treninga godišnje u centrima, uz brojne online treninge ko-jima se kontinuirano prisustvuje.Kako bi se u svakom trenutku moglo odgovoriti na zahtjeve korisnika, AlphaChrom za svaki tip instrumenta ima najmanje dva educirana inže-njera. Tako se smanjuje vrijeme odziva i može se jamčiti odziv kroz cijelu godinu, bez obzira na putovanja, treninge, bolovanja i godišnje odmore.Bitno je napomenuti da smo kao Autorizirani Distributer u svakodnev-noj vezi s Agilentom.

Servis ima izravan pristup trening centru, Europskom servisnom centru, Globalnoj grupi za servisnu podršku, proizvodnoj liniji (Service notes) kao i službenim Agilentovim internetskim portalima sa svim obavijesti-ma, materijalima (servisni priručnici, sheme), softverima i ostalim infor-macijama.Također, Alphachrom je dio Altium grupacije, zajedno s distributerima za Poljsku, Češku, Rumunjsku, Tursku i Azerbajdžan. Altium zapošljava 300-tinjak stručnjaka, a budući da smo organizacijski povezani imamo pristup svim kolegama, informacijama i skladištima.Ekipiranjem i koordiniranjem svih navedenih resursa složili smo tim koji je spreman za sve izazove i na koji smo jako ponosni.

Najčešće aktivnosti servisa su redovno održavanje i kvalifikacije te uklanjanje kvarova.Redovno održavanje - PM (Preventive Maintenance) – zamjena potrošnog materijala prema protokolu proizvođača kako bi se prevenirao zastoj ili kvar. Kvalifikacije – OQ/PV (Operational Qualification / Performance Validation) te instalacije kvalifikacija (IQ) za hardver i softver rade se u skladu s protokolima proizvođača.Agilent koristi ACE (Agilent Compliance Engine) kao SW platformu za kvalifikacije svojih kao i instrumenta drugih proizvođača. ACE te EQP (Enterprise Qualification Plan) se osvježavaju i upotpunjavaju konstantno, s obzirom na izlazak novih uređaja, mijenjanje operativnih sustava ili zahtjeva Pharmacopeia ili drugih regulatornih zahtjeva.Svaki servisni inženjer licenciran je za provođenje kvalifikacija te mora položiti treninge i posjedovati certifikate za: rad sa ACE-om, predmentim tipom hardvera, softvera te ACE protokola za predmetni tip opreme. General compliance treninzi obnavljaju se na godišnoj bazi.Za mjerenje raznih parametara – protoka, temperatura, napona i sl. koriste se mjerni instrumenti prema zahtjevu proizvođača koji moraju proći umjeravanje u ovlaštenom centru i imati certifikat koji potvrđuje ispravnost unutar godišnje traženih granica i tolerancija.

alphasolutions

ALPHACHROM Service Organization Chart

alphasolutions

52

OtkrIjte sAvršenu FOrmulu

uz hOneywell reseArch chemIcAls

Autor / Suzana Berglez Jarc, EMEA Export Account Manager, Honeywell Research Chemicals

Honeywell Research Chemicals započeo je svoju priču prije više od 200 godina kada su spojene dvije kemijske tvrtke u vlasništvu Johanna Daniela Riedela i Eugena de Haena. Njemački kemičar Johann Daniel Riedel iz Berlina, uspješno je proizveo niz lijekova 1814. godine. 47 godina kasnije, 1861. godine, znanstvenik Eugen de Haen, također kemičar, otvorio je svoj laboratorij za anorganske kemikalije u Hannoveru, a 1902. seli proizvodnju u Seelze. Nekoliko godina kasnije, točnije 1928. godine, došlo je do spajanja tvrtki. Ime Riedl-de-Haen nastalo je u Berlinu, ali 1948. tvrtka i pro-izvodnja preselili su se u Seelze, na istu lokaciju kao i 1902., na kojoj je i danas. Kroz navedena dva stoljeća, u svijetu su se događale razne akvizicije i spajanja tvrtki, a posljednja i najnovija je akvizicija Merckove tvrt-ke Sigma Aldrich 2015. godine. Kako bi se spajanje tih dviju tvrtki moglo dogoditi, Europska komi-sija naložila je da Sigma Aldrich mora prodati određeni dio portfelja kemikalija s ciljem zadržavanja konkurentnosti, odn. izbjegavanja monopola. Logičan potez bio je da je Honeywell preuzme dio por-tfelja tvrtke Sigma Aldrich, odnosno kemikalija koje je već godina-ma i proizvodio na istom mjestu budući da je Honeywell s tvrtkom Sigma Aldrich dijelio vlasništvo nad proizvodnom lokacijom Seelze.Od 2015. godine Honeywell je postao jedini vlasnik proizvodnog pogona, a također je u svoju domenu preuzeo distribuciju i prodaju. Danas, Honeywell Research Chemicals proizvodi većinu svojih pro-izvoda u njemačkom mjestu Seelze i Muskegonu u SAD-u. Obje su lokacije specijalizirane za proizvodnju kemikalija koje zadovoljavaju zahtjeve kupaca prema visokim standardima i kriterijima.

Danas, Honeywell s ponosom predstavlja brojne marke u pet različitih kategorija za različite primjene:

• Analitičkeprimjene;visokokvalitetni adsorbenti, puferi, volumetrijska rješenja, reagensi, standardi.• KarlFischertitracija;Hidranalnireagensi na ne-piridinskoj osnovi, i za volumetrijske i kulometrijske titracije za gotovo sve tipove uzoraka, nadopunjenih širokim rasponom standarda. • Otapala;najsnažnijaponudaotapalaraznih svojstava za uporabu u različitim primjenama od osnovnih do najzahtjevnijih kromatografskih primjena, kao što su UHPLC ili LC-MS. Honeywellova otapala dostupna su u različitim pakiranjima.• Osnovnelaboratorijskekemikalije;vrlo raznolik raspon osnovnih kemikalija za laboratorijsku upotrebu, uključujući različite kiseline, baze, organske tvari, reagense, soli i metale.• Oligoisintezapeptida;otapalai reagensi za upotrebu u sintezi bioloških molekula, oligonukleotida, peptida i organskih tvari. Honeywell proizvodi imaju vrlo nisku razinu nečistoća, sadržaj vlage i čestice koje osiguravaju najveći prinos željenog konačnog proizvoda.

alphasolutions

52

alphasolutions

53

Pod Honeywell imenom nalaze se sljedeće robne marke:

1. Honeywell Riedl de Haen

• Chromasolv™idrugaotapalavisokečistoćezanamjenske aplikacije, uključujući kromatografske tehnike kao što su LC-MS, UHPLC, Headspace i GC,• TraceSELECT™,otapalaprimjerenaanalizielemenatau tragovima, • bezvodnaotapalaprikladnazaanalizukodorganskesinteze osjetljive na vlagu, organometalnu kemiju, kombinacijsku kemiju i druge srodne primjene.

2. Honeywell Fluka

• Fluka™,anorganskekemikalijeireagensiprimjerenizaširoku paletu analitičkih aplikacija, kiseline, baze, soli, pH puferi i standardi,• Hydranal™reagenszaKarlFishertitracije.

3. Honeywell Burdick & Jackson

• BioSyn™otapalavisokečistoćezaDNA,RNAisintezupeptida.

4. Honeywell

• Otapalaianorgansketvarizaopćulaboratorijskuuporabu.

Rast poslovanja tvrtke Honeywell Research Chemicals u skladu je sa širenjem postojećih proizvodnih lokacija, tehničkih usluga, globalnih distribucijskih centara i jedinstvenih rješenja za kupce.

Honeywell s ponosom predstavlja Globalni centar izvrsnosti “Hydranal Centers of Excellence” osmišljen kako bi razvio nove aplikacije, metode, sigurnije, ekološkije i učinkovitije Hydranal Regense za Karl Fisher titraciju. Također, tu je predanost u pru-žanju pomoći i savjeta korisnicima i istraživačima koji rade s KF-om, pomažući u razjašnjavanju i odgovaranju na tehnička pitanja, pitanja vezana uz aplikaciju, odgovarajući izbor reagensa u vezi s uzorkom i još mnogo toga. Honeywellov profesionalni tim i znan-stvenici spremni su pomoći vam kad god vam je potrebno. Sva pitanja možete poslati na e-mail [email protected]

alphasolutions

53

alphasolutions

Osnova svakog dobrog piva je hmelj koji osigurava ravnotežu okusa i karakterističan „potpis“ piva. Gorčinu pivu daju spojevi poput humu-lona i/ili iso-α-kiselina iz hmelja koji se koristi tijekom proizvodnje piva. Nizozemska tvrtka Skalar, vođena između ostalog i tradicional-nom nizozemskom ljubavlju prema dobrom pivu, automatizirala je analizu spojeva koji mu daju gorčinu, primjerice iso-α-kiselina, prema međunarodnim metodama kao što su EBC, ASBC, Mebak i drugim standardima.

Jedan od najpoznatijih proizvođača piva na svijetu u nizozemskom gradu Zoeterwoudeu koristi Skalarov robot SP2000 za automatizira-nu analizu gorčine u različitim tipovima piva.

Skalarov robotski analizator automatizira sve potrebne korake za pot-punu analizu kojoj nije potreban nadzor. Nakon što operator ubaci uzorke piva i pokrene robota, analizator uklanja plin iz uzoraka i auto-

Autor / Sandra Pajurin, Sales Advisor, Asolutic d.o.o., prodajni predstavnik za Skalar

sve štO ste ŽeljelI znAtI

Slika 1. Skalar SP2000 Slika 2. San++ automatizirani analizator za mokru kemiju

O pIvu...sAznAjte uz

skAlAr AnAlIzAtOre

matski provodi analizu gorčine zakiseljavanjem piva i dodavanjem otopine za ekstrakciju izo-ok-tana. Nakon ekstrakcije, organska se faza mjeri na 275 nm u protočnoj spektrofotometrijskoj ćeliji, a vrijednost gorčine se automatski izračunava.

Robot ima 15 pozicija za uzorke, a sve se analize mogu provesti u duplikatu. Protočnost za gorči-nu je 8 analizirnih uzoraka po satu, uključujući prethodni postupak otplinjavanja. Također, osim analize gorčine u pivu, robot SP2000 može na istoj platformi automatizirano mjeriti i parame-tre boje, pH, slobodni amino dušik (FAN - Free Amino Nitrogen) te SO2.

Sumporov dioksid je važan parametar u procesu

alphasolutions

54

alphasolutions

proizvodnje piva jer djeluje kao antioksidans i utječe na vijek trajanja piva. Međutim, njegovu razinu u pivu treba strogo nadzirati, jer velike koncentracije SO2 u pivu mogu uzrokovati alergijske reakcije.Iako su za određivanje u pivu dostupne različite analitičke metode (primjerice pararosanilin metoda), danas sve više i više pivovara traži manje toksične alternative. Stoga je Skalar razvio novu automatiziranu metodu na San ++ analizatoru kontinuiranog protoka za određivanje ukupnog SO2 u pivu. Automatizirana metoda temelji se na poznatoj metodi 5’-dinitrobenzojeve kiseline (DTNB) za određivanje ukupnog SO2. U postupku automatizirane DTNB metode, uzorak piva raz-blažuje se u otopini sumporne kiseline i zagrijava na 90 °C kako bi se oslobodio vezani sumporov dioksid. Stvara se plinoviti SO2, koji se dijalizira u otopinu fosfatnog pufera. U nastavku reagira s DTNB otopinom te se dobije svijetložuti 2-nitro-5-tiobenzoat. Apsorpcija se mjeri na 410 nm.

Slika 3. Primjer dobivenih rezultata

Rezultati dobiveni na San++ automatiziranom analizatoru, usporedivi su s srezultatima do-bivenima klasičnom pararosanilin metodom. Analizator San ++ pruža potpuno automatske točne i reproducibilne rezultate za ukupni SO2 na velikim brojevima uzoraka. Osim toga, San++ analizator lako kombinira aplikaciju Total-SO2 s drugim parametrima piva poput gorčine, slobod-nog amino dušika (FAN - Free Amino Nitrogen), polifenola i mnogih drugih.

Za više informacija o Skalar analizatorima, obra-tite se na [email protected]

alphasolutions

55

alphasolutions

56

Potreba za kvalificiranjem autoklava i validacijom procesa sterilizaci-je proizlazi iz različitih zakona i propisa. Prema smjernicama EU-GxP (EU smjernice i regulative dobre prakse za određena područja) sustavi i procesi koji su izravno uključeni u proizvodni proces za skupine pro-izvoda kao što su lijekovi, aktivni sastojci, kozmetika, hrana, hrana za životinje i medicinski uređaji, koji time utječu na kvalitetu proizvoda, moraju biti kvalificirani i validirani. Kvalifikacije i validacije trebaju se provoditi uz pomoć odgovarajućeg, kvalificiranog servisera. Budući da samo korisnik može definirati zahtje-ve specifične za svoj proces, potrebna je uska suradnja stručnih odjela, mjeritelja i proizvođača autoklava.Premda se pojmovi kvalifikacije i validacije obično spominju u jednoj rečenici ili se čak koriste kao sinonimi, svaki od njih ima različito znače-nje i pristup. Zajedničko im je da moraju sadržavati pripremljene doku-mente koji su u skladu sa smjernicama, sadrže definiciju pojedinačnih testova i dokumentaciju rezultata ispitivanja. U mnogim slučajevima, pisani plan kvalifikacije/validacije također uključuje protokole koji se koriste za dokumentiranje rezultata ispitivanja tijekom implementacije.

Autor / Marko Volarić, Support Manager, Asolutic d.o.o., ovlašteni serviser za Systec autoklave

AutOklAvI

preMda se pojMovi kvaliFikaCije i validaCije obično spoMinju u jednoj rečeniCi ili se čak koriste kao sinoniMi, svaki od njih iMa raZličito Značenje i pristup.

vAlIdAcIjA I pOstupcI prAvIlnOgAutOklAvIrAnjA

alphasolutions

57

U kontekstu kvalifikacije sustava, mora se dokazati da je sustav koji koristi tehnologiju prikladan za namjeravanu zadaću, savršeno radi i daje rezultate koji zadovoljavaju zahtjeve. Glavni fokus je na sustav (autoklav) i njegovu ispravnu funkciju.

Cilj procesa validacije je u dokazivanju da je postupak učinkovit i može isporučiti proizvod (rezultat) koji je reproducibilan i koji ispu-njava tražene zahtjeve za kvalitetom. Glavni fokus je dakle sam proces i dokaz o usklađenosti s prihvatljivim kriterijima koje će odrediti ope-rater sustava.

Kvalifikacija procesa često je proces koji se odvija unutar sustava, što objašnjava povezivanje pojmova.

Ovisno o složenosti sustava i autoklavu, opseg provedenih postupa-ka može uvelike varirati. Također, prilikom svakog procesa potrebna je detaljna dokumentacija koja dokazuje da su sve provjere i testovi uspješno završeni.

PM (Preventive Maintenance) – preventivno održavanjePotrebno je pratiti preporuke proizvođača koje uključuju provjere elektromagnetnih ventila, filte-ra, temperaturnih sondi, sita i ostalog, ali uključuju i potrošni materijal.Zakonska direktiva propisuje ispitivanje sigurno-snih ventila (svake godine) i manometara (svake dvije godine).Potrebno je izvršiti i kalibraciju temperature i tlaka – referentnom opremom u stvarnim uvjetima.Provjerava se i digitalni pretvornik tlaka, a ako se umje-rava/ispituje samostalno, nakon montaže na komoru autoklava, mora se kalibrirati i sa jedinicom za prikazi-vanje (PID/Mikroprocesor autoklava „Display”).

Ovdje ćemo ukratko objasniti neke od najčešće korištenih postupaka uključenih u proces validacije autoklava (IQiliPM)+OQ+PQ:

IQ (Installation Qualification) – kvalifikacija mjesta instalacijeNizom testova se dokazuje kako lokacija intalacije odgovara potrebama za ispravan rad.Provjera uključuje sljedeće parametre:• Struja/napon• Demineralizirana voda (< 15 µS/cm )• Odvod• Kompresor/Omekšana voda• Dokumentacija koja je potrebna: • Tvornička dokumentacija – tehnička specifikacija, priručnici,

programi• Zakonska dokumentacija (PED Direktiva, prijava Agenciji za

posude pod tlakom) ako je umnožak ukupnog radnog tlaka (PS) i volumena komore (V) > 200 bara

OQ (Operational Qualification) – kvalifikacija uređajaOva kvalifikacija podrazumijeva skup testova koji dokazuju ispravan rad uređaja:

• Točan prikaz temperature/tlaka u komori• Testiranje rada svih komponenti uređaja• Testiranje sigurnosnih mehanizama (npr.

zatvarač vrata uređaja ili kontrola pristupa, simulacija grešaka)

• Testiranje programa uređaja • Provjera temperature i tlaka na praznoj

komori – ciklus sterilizacije tekućine i krutine/instrumenti

• Provjera vakuuma

Ovdje se mora napomenuti da OQ NIJE jamstvo da je punjenje unutar komore STERILNO.

alphasolutions

58

Slika prikazuje primjer loše sterilizacije pri kojoj OQ zado-voljava. • Podešena temperatura: +121,0 °C• Trajanje sterilizacije: 45 min

Preporuka za referentnu opremu: • Temperatura ± 0,5 °C (Data Loggeri – žičani/bežični),• Tlak odstupanje: bolje od ugrađenog pretvornika/

manometra ili barem 0,2% mjerne nesigurnostiPQ (Performance Qualification) – dokaz da je sterilizacija pu-njenja uspješna / Validacija procesa – Steam penetrationValidacija mora pokriti sve mogućnosti napunjenosti komore:• Uobičajno• Srednje• „Worst Case”Pozicija punjenja treba biti varijabilna i fiksna. Za svaku poziciju/punjenje potrebna su tri ciklusa s reproducibilnim rezultatima.Obavezno je korištenje bioindikatora – kod sterilizacije tekućina ampule, a kod sterilizacije krutina/otpada spore. Pozicioniranje senzora i bioindikatora mora biti na mjestima gdje para najteže dolazi, odn. u samom proizvodu. Verifikacija bioindikatora treba biti provedena od strane korisnika ili akreditiranog laboratorija.

Zbog svoje velike otpornosti na visoku temperaturu, Bacillus Stearothermophilus se smatra referentnim bioindikatorom za kvalifikaciju i validaciju procesa sterilizacije parom.Tablica prikazuje primjer najčešćih bioindikatora i njihove otpornosti na temperaturu sterilizacije:

Kao najčešće uzroke problema kod autoklaviranja može se izdvojiti:• Praćenje temperature na krivom mjestu (obično kod/

iznad grijača, uređaj bez referentne sonde)• Neadekvatno izbacivanje zraka iz komore – iako

manometar pokazuje tlak unutar komore iznad 1 bara• Uz sve navedeno, vrijeme ciklusa je nepotrebno

produljeno, zbog pretpostavke da će duže izlaganje materijala temperaturi doprinijeti prodiranju pare.

Neka od rješenja za navedene probleme autoklaviranja su:• Praćenje temperature u referentnoj boci ili izravno u

punjenju• Pravilno pozicioniranje punjenja• Pravilna izmjena zraka i pare (generator pare ili

vakuum jedinica, frakcijsko grijanje i sl.)• Redovna validacija, nakon kvalifikacije (PM/OQ)

impressum

Alpha Solutionsinterni časopis za analitičke laboratorije

broj 1 / godina 1.Nije u prodaji.

Izdavač:Alphachrom d.o.o.Kalovačka cesta 2410000 Zagreb

e-mail: [email protected].: +385 1 550 2200fax: +385 1 550 2299web: www.alphachrom.hr

urednikSiniša Stipaničić

redakcijaIvona Kaselj, Neven Bublić, Ingrid Stojko, Sandra Pajurin, Nenad Sakić, Marko Volarić, Nikola Pandurić

marketingLidija Čakanić

lekturaVjekoslav Bošković

dizajnStudio Imago, Samobor

FotografijeAutori članaka, Canva, Pexels, Pixabay, Unsplash

tisakEdok d.o.o.

naklada 200 komada

Godina izdavanja 2018. Fotografiju na naslovnici snimila Tatjana Arapinac, Office Manager, AlphaChrom d.o.o.

BROJ 1 / GODINA 1. - Alphachrom

Documents

Transcript of BROJ 1 / GODINA 1. - Alphachrom