BAB VIII VEKTOR KLONING

Bab ini akan membahas pengertian dan macam-macam vektor kloning, baik yang

digunakan pada sel inang prokariot maupun eukariot. Setelah mempelajari pokok bahasan

di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan:

1. pengertian vektor kloning,

2. ciri-ciri plasmid,

3. ciri-ciri kosmid,

4. ciri-ciri bakteriofag, dan

5. ciri-ciri vektor kloning pada khamir dan eukariot tingkat tinggi.

Pengertian dan Macam-macam Vektor Kloning

Pada Bab IX antara lain telah dibicarakan bahwa transformasi sel inang dilakukan

menggunakan perantara vektor. Jadi, vektor adalah molekul DNA yang berfungsi sebagai

wahana atau kendaraan yang akan membawa suatu fragmen DNA masuk ke dalam sel

inang dan memungkinkan terjadinya replikasi dan ekspresi fragmen DNA asing tersebut.

Vektor yang dapat digunakan pada sel inang prokariot, khususnya E. coli, adalah

plasmid, bakteriofag, kosmid, dan fasmid. Sementara itu, vektor YACs dan YEps dapat

digunakan pada khamir. Plasmid Ti, baculovirus, SV40, dan retrovirus merupakan

vektor-vektor yang dapat digunakan pada sel eukariot tingkat tinggi.

Plasmid

Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai

ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas di

antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih

dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).

Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-

syarat berikut ini:

1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang

sehingga dapat dengan mudah melintasinya,

2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk

tidaknya plasmid ke dalam sel inang,

3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu

marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan

4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel

inang.

Salah satu contoh plasmid buatan yang banyak digunakan dalam kloning gen

adalah pBR322. Plasmid ini dikonstruksi oleh F. Bolivar dan kawan-kawanya pada tahun

1977. Urutan basa lengkapnya telah ditentukan sehingga baik tempat marker maupun

pengenalan restriksinya juga telah diketahui. Sayangnya, tempat pengenalan EcoR I,

salah satu enzim restriksi yang sangat umum digunakan, terletak di luar marker. Oleh

karena salah satu marker akan menjadi tempat penyisipan fragmen DNA asing, maka

EcoR I tidak dapat digunakan untuk memotong pBR322 di tempat penyisipan tersebut.

Namun, saat ini telah dikonstruksi derivat-derivat pBR322 yang mempunyai tempat

pengenalan EcoR I di dalam marker, misalnya plasmid pBR324 dan pBR325 yang

masing-masing mempunyai tempat pengenalan EcoR I di dalam gen struktural kolisin

dan di dalam gen resisten kloramfenikol.

EcoR I ampR tetR

3.147 (ori)

Gambar 11.1. Plasmid pBR322 ampR = marker resisten ampisilin tetR = marker resisten tetrasiklin

Misalnya saja kita menyisipkan suatu fragmen DNA pada daerah marker resisten

ampisilin dengan memotong daerah ini menggunakan enzim restriksi tertentu selain EcoR

I (mengapa harus selain EcoR I?). Plasmid pBR322 yang tersisipi oleh fragmen DNA

akan kehilangan sifat resistensinya terhadap ampisilin, tetapi masih mempunyai sifat

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 2

4.363 kb

resistensi terhadap tetrasiklin. Oleh karena itu, ketika plasmid pBR322 rekombinan ini

dimasukkan ke dalam sel inangnya, yakni E. coli, bakteri transforman ini tidak mampu

tumbuh pada medium yang mengandung ampisilin, tetapi tumbuh pada medium

tetrasiklin. Secara alami E. coli tidak mampu tumbuh baik pada medium ampisilin

maupun tetrasiklin sehingga sel transforman dapat dengan mudah dibedakan dengan sel

nontransforman yang tidak mengandung pBR322 sama sekali. Sementara itu, E. coli

transforman yang membawa plasmid pBR322 utuh (religasi) mampu tumbuh pada kedua

medium antibiotik tersebut. Jadi, untuk memperoleh sel E. coli transforman yang

membawa DNA rekombinan dicari koloni yang hidup di tetrasiklin tetapi mati di

ampisilin. Secara teknis pekerjaan ini dilakukan menggunakan transfer koloni atau

replica plating.

Bakteriofag

Bakteriofag atau fag merupakan virus kompleks yang menginfeksi bakteri E.

coli. Berkat pengetahuan yang memadai tentang fag ini, kita dapat memanfaatkannya

sebagai vektor kloning semenjak masa-masa awal perkembangan rekayasa genetika.

DNA yang diisolasi dari partikel fag ini mempunyai konformasi linier untai ganda

dengan panjang 48,5 kb. Namun, masing-masing ujung fosfatnya berupa untai tunggal

sepanjang 12 pb yang komplementer satu sama lain sehingga memungkinkan DNA

untuk berubah konformasinya menjadi sirkuler. Dalam bentuk sirkuler, tempat

bergabungnya kedua untai tunggal sepanjang 12 pb tersebut dinamakan kos.

Seluruh urutan basa DNA telah diketahui. Secara alami terdapat lebih dari satu

tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi yang biasa digunakan. Oleh

karena itu, DNA tipe alami tidak cocok untuk digunakan sebagai vektor kloning. Akan

tetapi, saat ini telah banyak dikonstruksi derivat-derivat DNA yang memenuhi syarat

sebagai vektor kloning. Ada dua macam vektor kloning yang berasal dari DNA , yaitu

(1) vektor insersional, yang dengan mudah dapat disisipi oleh fragmen DNA asing,

(2) vektor substitusi, yang untuk membawa fragmen DNA asing harus membuang

sebagian atau seluruh urutan basanya yang terdapat di daerah nonesensial dan

menggantinya dengan urutan basa fragmen DNA asing tersebut.

Di antara kedua macam vektor tersebut, vektor substitusi lebih banyak

digunakan karena kemampuannya untuk membawa fragmen DNA asing hingga 23 kb.

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 3

Cara substitusi fragmen DNA asing pada daerah nonesensial membutuhkan dua

tempat pengenalan restriksi untuk setiap enzim restriksi. Jika suatu enzim restrisksi

memotong daerah nonesensial di dua tempat berbeda, maka segmen DNA di antara

kedua tempat tersebut akan dibuang untuk selanjutnya digantikan oleh fragmen DNA

asing. Jika pembuangan segmen DNA tidak diikuti oleh substitusi fragmen DNA asing,

maka akan terjadi religasi vektor DNA yang kehilangan sebagian segmen pada daerah

nonesensial. Vektor religasi semacam ini tidak akan mampu bertahan di dalam sel inang.

Dengan demikian, ada suatu mekanisme seleksi automatis yang dapat membedakan

antara sel inang dengan vektor rekombinan dan sel inang dengan vektor religasi.

Bakteriofag mempunyai dua fase daur hidup, yaitu fase litik dan fase lisogenik.

Pada fase litik, transfeksi sel inang (istilah transformasi untuk DNA fag) dimulai dengan

masuknya DNA yang berubah konformasinya menjadi sirkuler dan mengalami

replikasi secara independen atau tidak bergantung kepada kromosom sel inang. Setelah

replikasi menghasilkan sejumlah salinan DNA sirkuler, masing-masing DNA ini akan

melakukan transkripsi dan translasi membentuk protein kapsid (kepala). Selanjutnya, tiap

DNA akan dikemas (packaged) dalam kapsid sehingga dihasilkan partikel baru yang

akan keluar dari sel inang untuk menginfeksi sel inang lainnya. Sementara itu, pada fase

lisogenik DNA akan terintegrasi ke dalam kromosom sel inang sehingga replikasinya

bergantung kepada kromosom sel inang. Fase lisogenik tidak menimbulkan lisis pada sel

inang.

Di dalam medium kultur, sel inang yang mengalami lisis akan membentuk plak

(plaque) berupa daerah bening di antara koloni-koloni sel inang yang tumbuh. Oleh

karena itu, seleksi vektor rekombinan dapat dilakukan dengan melihat terbentuknya plak

tersebut.

% total molekul

12 pb 15 38 rekombinasi 70 80 85 95 100 5’ dan integrasi 3’

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 4

3’ daerah non esensial daerah sint fungsi lisis 5’ kepala ekor cI DNA lanjut inang 12 pb

a)

kos 12 pb lisis inang kepala ekor

fungsi lanjut

daerah sintesis DNA nonesensial

cI b)

Gambar 11.2. DNA bakteriofag a) konformasi linier (di luar sel inang)b) konformasi sirkuler (di dalam sel inang)

Kosmid

Kosmid merupakan vektor yang dikonstruksi dengan menggabungkan kos dari

DNA dengan plasmid. Kemampuannya untuk membawa fragmen DNA sepanjang 32

hingga 47 kb menjadikan kosmid lebih menguntungkan daripada fag dan plasmid.

Vektor YACs

Seperti halnya kosmid, YACs (yeast artifisial chromosomes atau kromosom

buatan dari khamir) dikonstruksi dengan menggabungkan antara DNA plasmid dan

segmen tertentu DNA kromosom khamir. Segmen kromosom khamir yang digunakan

terdiri atas sekuens telomir, sentromir, dan titik awal replikasi.

YACs dapat membawa fragmen DNA genomik sepanjang lebih dari 1 Mb. Oleh

karena itu, YACs dapat digunakan untuk mengklon gen utuh manusia, misalnya gen

penyandi cystic fibrosis yang panjangnya 250 kb. Dengan kemampuannya itu YACs

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 5

sangat berguna dalam pemetaan genom manusia seperti yang dilakukan pada Proyek

Genom Manusia.

Bahan ajar ini diambil dari Susanto (2000) Page 6