misc09.files.wordpress.com · Web viewSebuah fragmen DNA harus dimasukkan ke dalam vektor kloning....

Block 7 Genetic and Molecular Biology | softfile edition | Editor : wiki

Synthetic Medicine with Microorganism

Kuliah terakhir, rekamannya gak bunyi, inilah derita saya….

PART A

Rekayasa genetika memainkan peran yang sangat penting, tidak hanya dalam penelitian ilmiah, tetapi juga dalam diagnosis dan pengobatan penyakit. Dalam upaya melakukan rekayasa genetika, manusia menggunakan DNA rekombinan.

DNA rekombinan adalah alat dalam memahami struktur, fungsi, regulasi gen dan produk nya. Jadi DNA rekombinan merupakan kumpulan metode untuk mengkombinasikan gen-gen.

Tujuan dari teknologi DNA rekombinan meliputi:- Mengidentifikasi gen- Mengisolasi gen- Memodifikasi gen- Mengekspresikan kembali gen di host lain

Langkah-langkah ini memungkinkan para ilmuwan dan dokter untuk:- Mengidentifikasi gen baru dan protein yang disandi- Untuk memperbaiki endogenous genetic defects- Untuk memproduksi sejumlah besar produk-produk gen tertentu seperti hormon,

vaksin, dan agen biologis lainnya yang kepentingan medis

Contoh proses:

BERPIKIR TENTANG INI?

DNA ligase digunakan untuk apa? Digunakan menyambung DNA

Apakah enzim retriksi? Enzim yang digunakan untuk memotong DNA

Mengapa Plasmid 'digunakan sebagai vektor kloning’? Untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA, atau mengubah sifat bakteri.

Produksi Insulin Manusia pada E.coli

PART B

1

Senin, 04 oktober 2010Prof. Dr. Sudjadi

. KesSYNTHETIC MEDICINE

WITH MICROORGANISM



Prinsip Kloning

Enzim restriksi alias ‘gunting’ DNA hanya akan memotong DNA pada tempat tertentu saja, yaitu jika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang jika dibaca dari kedua utas DNA akan tetap sama. Perhatikan contoh sekuen berikut ini:

5'-GATATC-3'

::::::

3'-CTATAG-5'

Baik di atas maupun bawah memiliki sekuen yang sama bukan (dibaca dari 5′ ke 3′)? Nah, di sekuen palindrom seperti itulah enzim restriksi akan bekerja.

Setiap enzim restriksi hanya dapat memotong pada susunan palindrom tertentu. Misalnya enzim EcoRI akan bekerja jika menemukan urutan GAATTC.

PEMOTONGAN HpaI

1



Pemotongan EcoRI

Vektor digunakan untuk memperkuat satu molekul DNA ke dalam banyak salinan. Sebuah fragmen DNA harus dimasukkan ke dalam vektor kloning. Sebuah vektor kloning adalah molekul DNA yang memiliki asal replikasi dan mampu bereplikasi dalam sel bakteri.

Kebanyakan vektor adalah plasmid rekayasa genetika atau fag. Ada juga vektor kosmid, kromosom bakteri buatan, dan kromosom ragi buatan.

1



Plasmid merupakan molekul DNA yang berantai ganda, berbentuk lingkaran yang tertutup, dapat bereplikasi sendiri diluar kromosom dan tidak mengandung gen-gen esensial. Jumlah plasmid di dalam sel berbeda-beda, tergantung spesies organismenya.

Plasmid pBR322 merupakan contoh plasmid yang digunakan sebagai vektor kloning.

Plasmid pBR322 mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang di dalamnya mengandung situs enzim restriksi yang akan memudahan dalam menyeleksi plasmid rekombinan, dengan adanya enzim yang hanya memotong bagian gen yang resistens terhadap antibiotik. Misalnya, enzim BamHI yang akan memotong plasmid pBR322 pada bagian gen yang resistensi terhadap tetrasiklin (gen TetR). Proses pemotongan plasmid bukanlah sesuatu yang mudah. Ada dua kemungkinan setelah pemotongan, yaitu:

1). Plasmid pBR322 yang tersambung kembali membentuk lingkaran seperti semula, dan

2). Plasmid rekombinan yaitu plasmid pBR322 yang telah disisipi dengan DNA asing.

Plasmid pBR322 yang telah kehilangan bagian yang resistensi terhadap tetrasiklin kemudian disisipi dengan fragmen dari DNA asing. Plasmid pBR322 ini kemudian dimasukkan ke dalam sel inangnya yaitu E. coli. Pengujian lebih lanjut apakah plasmid ini telah tersisipi oleh fragmen DNA asing atau tidak adalah dengan mendedahkannya pada medium ampisilin, untuk kemudian memplatingnya ke dalam medium tetrasiklin dan ampisilin. Koloni E. coli yang telah kehilangan marker tetrasiklin akan sensitif tetrasiklin, sedangkan pada medium ampisilin, koloni ini tetap tumbuh karena masih resistensi ampisilin.

1



Rekayasa genetika telah diizinkanIsolasi jumlah besar protein murni:Insulin, hormon pertumbuhan, follicle-stimulating hormon, serta protein lainnya, kini tersedia sebagai produk rekombinan. Dokter tidak lagi harus bergantung pada produk-produk biologi kemurnian rendah dan aktivitas spesifik dari persiapan batch konsisten untuk mengobati pasien mereka.

1



PART C

Studi Kasus: Penggunaan DNA rekombinan untuk Menghasilkan Insulin Manusia

1



Mengapa mensintesis insulin manusia?

- Sistem kekebalan tubuh pasien 'tidak menghasilkan antibodi terhadap insulin manusia seperti yang mereka lakukan dengan insulin sapi atau babi

- Perlunya metode yang lebih handal dan berkelanjutan untuk memperoleh produk

Gen insulin terdapat di kromosom 11 dengan ukuran yang cukup kecil. Ada 2 rantai yaitu rantai A dengan 21 asam amino dan lainnya yaitu rantai B dengan 30 asam amino. Dua rantai terhububung oleh ikatan disulfida.

1



Gambar di atas adalah struktur pro insulin. Terjadi ikatan antara rantai A dan B oleh ikatan disulfide. Kemudian terjadilah proteolytic cleavage (pemotongan) sehingga menghasilkan insulin yang aktif.

mRNA insulin hanya terdapat di pancreas. Setelah mRNA yang terdapat di pancreas diambil, kemudian diubah menjadi DNA rantai ganda, kita masukkan DNA tersebut ke dalam suatu vektor yaitu plasmid. Lalu plasmid dimasukkan ke dalam E.Coli dan nantinya akan menghasilkan mRNA yang akan memproduksi insulin dalam jumlah banyak.

Penemuan Insulin manusia (Humulin) merupakan produk farmasi pertama untuk DNA rekombinan oleh Eli Lilly yaitu pada tahun 1986.

24 aaSignal peptide leader telah ditambahkan ke dalam ujung 5 '. Lalu sekresi insulin ke medium bukan retensi di dalamnya badan inklusi (Melepaskan pemimpin Sinyal sebagai insulin diangkut melintasi membran sel). Rantai Adisintesis di salah satu strain E. Coli. Rantai B disintesis dalam E. coli strain yang berbeda. Rantai yang dimurnikan secara terpisah kemudian bergabung bersama-sama. Menggunakan teknik Continuous culture.

Human Growth Hormone (HGH) (somatotropin)

HGH mendorong pertumbuhan tubuh secara keseluruhan dengan meningkatkan pengambilan asam amino oleh sel, sintesis protein dan lemak untuk energi pemanfaatan.Kurangnya produksi HGH oleh kelenjar pituitari = dwarfisme

- Wajah chubby

- "Baby fat" di sekitar pinggang

- Sifat tubuh yang tidak biasa sebagai orang dewasa, hanya 4 meter.

- IQ = Normal

HGH membantu anak-anak mencapai tinggi berukuran normal.

1



1

misc09.files.wordpress.com · Web viewSebuah fragmen DNA harus dimasukkan ke dalam vektor kloning....

Documents

Transcript of misc09.files.wordpress.com · Web viewSebuah fragmen DNA harus dimasukkan ke dalam vektor kloning....