Puyuh FMO3 gen kloning, Jaringan ekspresi profil,

Polimorfisme Deteksi dan analisis asosiasi dengan amis noda di telurFengtao Mo, antara Zheng, Peng Wang, Ling Lian, Guoqiang Yi, Guiyun Xu Ning Yang*Laboratorium Nasional teknik untuk Pemuliaan hewan, MOA kunci laboratorium genetika hewan dan peternakan, College hewan ilmu pengetahuan dan teknologi, China Agricultural University, Beijing, CinaAbstrakTelur puyuh terdiri dari bagian yang signifikan dan menguntungkan meja telur di negara tertentu. Beberapa telur puyuh, namun, hadir amis off-rasa yang secara langsung mempengaruhi kualitas mereka. Hal ini melaporkan bahwa monooxygenase yang mengandung flavin 3 (FMO3) dikaitkan dengan sifat bau ikan dalam produk manusia dan hewan. FMO3 degradasi trimethylamine (TMA) di vivo. Kerugian dari fungsi mutasi pada gen FMO3 dapat mengakibatkan TMA N-oksigenasi rusak, menimbulkan kekacauan dikenal sebagai "sindrom ikan-bau" pada manusia, serta amis off-rasa di sapi susu dan ayam telur. Untuk mengungkapkan faktor genetik amis noda di telur puyuh, kami kloning urutan cDNA puyuh FMO3 gen, menyelidiki tingkat ekspresi FMO3 mRNA di berbagai jaringan, terdeteksi SNP di daerah gen dan dilakukan analisis Asosiasi antara mutasi dan konten TMA kuning telur puyuh. Urutan cDNA bp 1888 puyuh gen FMO3 pengkodean 532 asam amino diperoleh dan ditandai. Analisis filogenetik mengungkapkan puyuh FMO3 memiliki hubungan dekat dengan ayam FMO3. FMO3 mRNA sangat dinyatakan dalam hati dan ginjal puyuh. SNP sembilan yang terdeteksi dalam urutan pengkodean gen FMO3 puyuh, termasuk mutasi omong kosong (Q319X) yang secara signifikan terkait dengan kandungan TMA ditinggikan kuning telur puyuh. Genotipe TT di Q319X mutasi lokus adalah sensitif terhadap Kolin. Dengan penambahan Kolin dalam pakan, burung puyuh dengan Homozigot TT di Q319X mutasi lokus meletakkan telur ikan-bau, menunjukkan interaksi antara genotipe dan diet. Hasilnya menunjukkan bahwa mutasi Q319X dikaitkan dengan amis off-rasa di telur puyuh. Identifikasi alel tidak menguntungkan yang T puyuh FMO3 gen dapat diterapkan di masa depan quail berkembang biak untuk menghilangkan sifat dari rasa amis di telur puyuh.Kutipan: Mo F, Zheng J, Wang P, Lian L, Yi G, et al. (2013) puyuh FMO3 gen kloning, Jaringan ekspresi profil, polimorfisme Deteksi dan analisis asosiasi dengan amis noda di telur. PLoS ONE 8(11): e81416. Doi:10.1371/Journal.pone.0081416Editor: Gayle E. Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Amerika SerikatMenerima Tanggal 18 Juni 2013; Diterima 13 Oktober 2013; Diterbitkan November 25, 2013Hak cipta: 2013 Mo et al. Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah persyaratan lisensi Creative Commons atribusi, yang memungkinkan penggunaan tak terbatas, distribusi, dan reproduksi di media, disediakan penulis dan sumber asli yang dikreditkan.Dana: Studi ini didukung sebagian oleh dana dari program sarjana Changjiang dan inovatif penelitian di Universitas (IRT0945 dan IRT1191). Para Penyandang Dana tidak memiliki peran dalam rancangan penelitian, pengumpulan data dan analisis, keputusan untuk menerbitkan, atau penyusunan naskah. Tidak ada tambahan pendanaan eksternal menerima untuk studi ini.Kepentingan peserta: Penulis telah menyatakan bahwa kepentingan yang saling bersaing tidak ada.

* E-mail: nyang@cau.edu.cn Penulis ini berkontribusi sama karya ini.PengenalanMonooxygenases (FMOs, EC 1.14.13.8) yang mengandung Flavin bertanggung jawab oksidasi xenobiotik banyak mengandung nukleofilik nitrogen, belerang, fosfor, atau selenium heteroatom [1,2]. Akibatnya, FMOs yang terlibat dalam metabolisme aktivasi atau detoxication dari berbagai xenobiotik termasuk pestisida, obat-obatan dan makanan yang diturunkan senyawa [3,4]. Enzim FMO3 ini dianggap sebagai anggota penting dari keluarga FMO sehubungan dengan metabolisme bahan kimia asing [5] dan itu isoform FMO dominan yang hadir dalam hati manusia dewasa yang terlibat dalam degradasi trimethylamine (TMA) [6]. TMA dianggap substrat endogen utama untuk FMO3 dan produk rincian Diet kimia seperti trimethylamine Noksida (TMAO), Kolin, Lesitin dan betaine oleh tindakan reduktif bakteri usus [7]. Pada manusia, meskipun isoforms lain dapat mengoksidasi TMA kondisi non-fisiologis, TMA dimetabolisme secara eksklusif untuk para non-yg berbau baik N-oksida terutama oleh FMO3 [8], dan kemudian secara efektif membersihkan dan diekskresikan dalam urin [9]. Individu dengan Penyandang Cacat FMO3 tidak dapat mengoksidasi TMA untuk TMAO di dalam hati, dan yang akan mengakibatkan sejumlah besar TMA diekskresikan dalam urin, keringat, dan napas dan mempersembahkan tubuh bau seperti ikan membusuk yang disebut trimethylaminuria (TMAU) atau ikan-bau sindrom [10,11]. Penyakit gangguan metabolik ini diwariskan secara resesif.Sindrom bau ikan dalam manusia adalah karena kehilangan-offunction mutasi pada gen FMO3 pengkodean FMO3 enzim.Mutasi gen FMO3 dapat menghapuskan atau mengurangi aktivitas enzim. Sejak pertama P153L mutasi pada gen FMO3 manusia itu diverifikasi dikaitkan dengan TMAU [12], lebih dari 30 berbeda penyebab mutasi pada gen FMO3 manusia telah diidentifikasi dalam kajian-kajian berikutnya [13-16].Beberapa produk binatang seperti sapi susu dan ayam telur juga hadir amis mati rasa atau bau ikan karena tingkat tinggi TMA di dalamnya [17,18]. FMO3 gen telah diidentifikasi sebagai penyebab gen dari sifat bau ikan di sapi susu dan ayam telur. Dalam sapi, omong kosong mutasi pada ekson 6 FMO3 gen disebabkan terminasi dini dari protein. Tampaknya bahwa sapi dengan mutasi R238X homozygous di FMO3 ortholog menunjukkan kurangnya aktivitas FMO3 dan TMA tidak teroksidasi dan terakumulasi dalam susu sapi yang dipimpin untuk amis off-rasa di susu jenis Swedia merah dan putih susu [19]. Ayam, mutasi nonsynonymous (T329S) adalah dikaitkan dengan peningkatan kadar TMA dan mencurigakan noda kuning telur dalam beberapa baris ayam. Itu perubahan asam amino evolusioner sangat dilestarikan di pentapeptide motif FATGY dan dapat menyebabkan disfungsi enzim FMO3 dan akumulasi TMA kuning telur [20].Telur puyuh merupakan sumber penting nutrisi dan terdiri dari bagian yang signifikan dan menguntungkan meja telur di negara tertentu. Ikan-bau terjadi kadang-kadang dalam beberapa telur puyuh, dan burung puyuh FMO3 gen seharusnya gen calon sifat ini. Dalam studi ini, kami kloning urutan cDNA fulllength gen FMO3 puyuh dan diselidiki mRNA profil ekspresi gen FMO3 puyuh. Kami juga dijelaskan variasi dalam gen FMO3 puyuh pengkodean urutan dan menemukan mutasi omong kosong (Q319X) di ekson 7 adalah sangat terkait dengan konten TMA ditinggikan kuning telur puyuh, yang dapat digunakan sebagai penanda penting untuk menghilangkan noda yang mencurigakan dalam telur puyuh di masa depan puyuh molekul penangkaran.HasilKarakterisasi urutan gen FMO3 puyuhSetelah penyambungan daerah parsial (673 bp), cepat amplifikasi cDNA berakhir (ras) produk urutan (3' ras dan 5'-ras), 1888 bp full-length cDNA puyuh FMO3 gen diperoleh dengan 37bp 5' diterjemahkan wilayah (5' UTR) dan 253bp 3' diterjemahkan wilayah (3' UTR). Itu telah disetorkan ke dalam GenBank database (GenBank: JQ955622). Puyuh FMO3 cDNA berisi frame terbuka membaca 1599bp (ORF) yang dikodekan asam amino 532 residu (gambar 1). Titik isoelektrik teoritis (pI) dan berat molekul (Mw) puyuh FMO3 protein adalah KDa 8.53 dan 60.77, masing-masing. 3' diterjemahkan daerah termasuk urutan sinyal polyadenylation AATAAA (gambar 1). Urutan cDNA puyuh bersama identitas tertinggi (92%) bahwa gen FMO3 ayam (GenBank: NM_204579.1).Urutan asam amino yang disimpulkan puyuh FMO3 berbagi identitas 93% dengan Gallus gallus (GenBank: NP_989910.1) dan 81% dengan Anas platyrhynchos (GenBank: AGC00818.1), dan relatif rendah identitas dengan spesies lain, misalnya63% dengan Rattus norvegicus (GenBank: NP_445885.2), 60% dari Mus musculus (GenBank: NP_032056.1), 61% Canis lupus familiaris (GenBank: NP_001003060.1), 62% dari cuniculus cuniculus (GenBank: NP_001075715.1), 62% dari Macaca mulatta (GenBank: NP_001028065.1), 63% dari Bos Taurus (GenBank: NP_776482.1), 61% Pan troglodytes (GenBank: NP_001009092.1), 61% Pongo abelii (GenBank: NP_001124820.1) dan 61% Homo sapiens (GenBank : NP_001002294.1). Keberpihakan beberapa bebek FMO3 protein dengan spesies lain dipresentasikan pada gambar 2. Hasil dari beberapa urutan aligment mengungkapkan puyuh FMO3 protein urutan termasuk motif FMO-tanda tangan (FXGXXXHXXXY), motif FAD mengikat (GXGXXG), NADPHbinding motif (GXGXXG) dan motif FATGY dilestarikan. Hasil ini diverifikasi bahwa urutan cDNA ini cDNA puyuh FMO3 gen.Hubungan filogenetik FMO3 protein antara spesiesPohon filogenetik urutan protein FMO3 dari 14 spesies bisa menelaah hubungan genetik puyuh FMO3 protein dengan spesies lain. Berdasarkan nilai Bootstrap (gambar 3), semua spesies bisa tersusun ke tiga subgrup. Sementara tiga spesies burung dikelompokkan ke dalam satu cluster, puyuh adalah lebih dekat ke ayam daripada untuk bebek (gambar 3). Hasilnya adalah konsisten dengan hasil evolusi molekuler sebelumnya, yang mengindikasikan bahwa ayam dapat menjadi model yang baik untuk mempelajari fungsi gen FMO3 puyuh dan protein.FMO3 mRNA ekspresi profil dalam jaringan puyuh Real-time PCR hasil menunjukkan bahwa burung puyuh FMO3 mRNA adalah sangat dinyatakan dalam hati dan ginjal, dan segera dinyatakan dalam paru-paru dan kulit, sedangkan tingkat ekspresi cukup rendah yang ditemukan dalam jaringan 10 lainnya termasuk hati, limpa, pankreas, usus kosong, usus buntu, tuba falopi, indung telur, vas deferens, testis, dan otot payudara (Tabel 1 dan gambar 4). Hasil analisis ANOVA mengungkapkan bahwa tingkat mRNA quail FMO3 hati dan ginjal yang signifikan (P < 0,05) lebih tinggi daripada yang lain 12 jenis jaringan (gambar 4). Tingkat ekspresi di paru-paru secara signifikan (P < 0,05) lebih tinggi dari hati, limpa, pankreas, usus kosong, usus buntu, tuba falopi, indung telur, vas deferens, testis, dan otot payudara.SNP ditemukan di gen FMO3 puyuhTotal sembilan polimorfisme diidentifikasi di daerah puyuh FMO3 gen (Tabel 2), termasuk satu mutasi omong kosong, satu missense mutasi dan 7 identik mutasi. Hanya omong kosong mutasi (SNP 3) dan missense mutasi (SNP 6) menyebabkan perubahan asam amino. SNP3 adalah satu dasar perubahan (C ke T) di posisi nt992 di ekson 7 cDNA urutan (GenBank: JQ955622), yang menyebabkan perubahan kodon dari CAG TAG dan Q sesuai (glutamin) untuk X (berhenti kodon) di posisi 319 dalam urutan asam amino (GenBank: AFY98079.1). Dengan demikian mutasi omong kosong yang telah denoted Q319X.Mutasi missense (SNP6) perubahan kodon dari T (Treonina) di posisi 329 untuk saya (isoleusin), tetapi kami menemukan hanya tiga orang yang heterozigot untuk ini missense mutasi pada

Gambar 1. Urutan penuh cDNA puyuh FMO3 gen. Inisiator kodon dan berhenti kodon menunjukkan dalam kotak hitam, dan urutan sinyal polyadenylation digarisbawahi.Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.g001

Gambar 2. Beberapa urutan keberpihakan urutan protein FMO3 di 10 spesies. Dilestarikan residu yang hitam. Kotak residu semi dilestarikan. Motif tertentu penting disajikan.Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.g002Gambar 3. Filogenetik pohon FMO3 protein spesies 14. Cabang-cabang pohon filogenetik dicap dengan spesies

Nama.Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.g003140 terdeteksi individu. Frekuensi mutasi T329I adalah sangat rendah bahwa Asosiasi analisis tidak bisa dilakukan.Asosiasi Q319X mutasi dengan kandungan TMA di telur puyuhLokus Q319X pada keseimbangan Hardy-Weinbery (P > 0,05) dalam populasi eksperimental Quail (Tabel 3). Asosiasi analisis ini dilakukan untuk menilai apakah genotipe Q319X mutasi pada gen FMO3 puyuh dikaitkan dengan konten TMA kuning telur. Analisis statistik menunjukkan bahwa TMA konten dalam kuning telur dari TT genotipe pada Q319X mutasi pada periode percobaan secara signifikan lebih tinggi (P < 0.001) daripada yang lain kelompok (gambar 5). Isi TMA kuning telur yang diletakkan oleh individu dengan genotipe TT yang lebih 9.0 g/g kuning telur. T alel adalah mutasi penyebab untuk ikan-bau di telur puyuh. Namun, ada asosiasi tidak signifikan antara tiga genotipe dengan TMA konten dalam kuning telur puyuh pada periode adaptasi, dan konten TMA dalam kuning telur adalah rendah (kuning telur g/g < 3.0), menyarankan genotipe signifikan oleh interaksi diet.DiskusiDi masa sekarang belajar, strategi transkripsi terbalik PCR (RT-PCR) dan 5'-ras dan 3'-ras metode digunakan untuk mendapatkan burung puyuh FMO3 cDNA urutan. Urutan cDNA 1888bp menyandikan protein 532 asam amino yang diperoleh

Gambar 4. Relatif ekspresi puyuh mRNA FMO3 dalam jaringan 14. Total RNA dari jaringan 14 tiga puyuh yang digunakan untuk melakukan qPCR. qPCR berjalan di triplicates. Ekspresi puyuh FMO3 dinormalisasi dengan jumlah GAPDH mRNA. Data-data diatas yang disajikan sebagai berarti standar deviasi (SD). Kolom berbagi huruf yang berbeda (b, dan c) menunjukkan signifikan

dari hati puyuh. Panjang puyuh FMO3 asam amino urutan adalah sama seperti bebek, sementara asam amino ayam FMO3 urutan kurangnya 532th aa dibandingkan puyuh dan bebek FMO3 protein urutan (gambar 2). Perbedaan diperoleh (P < 0,05).Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.g004cDNA urutan adalah burung puyuh bernama FMO3 karena urutan protein disimpulkan puyuh pameran lebih dari 80% identitas dengan dikenal ayam dan itik FMO3 urutan asam amino. Thepenunjukan "puyuh FMO3"ke nama cDNA ini adalah sesuai dengan tata-nama sebenarnya berdasarkan perbandingan urutan asam amino FMOs mamalia [5]. Ini juga menunjukkan bahwa urutan cDNA kami memperoleh memang burung puyuh FMO3 cDNA urutan.Hasil beberapa urutan alignment urutan asam amino FMO3 di 10 spesies menunjukkan puyuh FMO3 diduga urutan protein terdapat beberapa motif yang dilestarikan, termasuk motif FMO-tanda tangan (FXGXXXHXXXY), motif FAD mengikat (GXGXXG), NAD (P) H-mengikat motif (GXGXXG), dan dua pentapeptides dilestarikan mutlak (EGLEP motif dan FATGY motif). Semua motif tersebut sangat penting untuk FMO3 protein fungsional. Motif FMO-tanda tangan, juga bernama motif FMO-mengidentifikasi dan terjadi sebelum motif NAD (P) H-mengikat (GXGXXG), memberikan kontribusi untuk mengikat NADPH dan tampaknya memiliki fungsi tambahan [3]. Fungsi mode mengikat motif (GXGXXG) dan motif NAD (P) H-mengikat (GXGXXG), dua kali lipat Rossmann [21] klasik dari DBMs, akan mengikat yang tidak ADP dan NAD (P) H [22], masing-masing. Motif FATGY dilestarikan telah diakui selama bertahun-tahun dan telah speculated menjadiTabel 2. Tempat-tempat polimorfik ditemukan pada gen FMO3 puyuh oleh Sekuensing.

SNP nomorPosisi nukleotida*KodonLokasi SNP perubahanAsam amino posisi* Asam amino perubahan

1nt76Ekson 2C > TBUFFON AGT13

2nt415Ekson 4G > AGAA GAG126

3nt992Ekson 7C > TCAG/TAG319QX

4nt1009Ekson 7A > GGCA GCG324

5nt1015Ekson 7C > AATC/ATA326

6nt1023Ekson 7C > TUNDANG-UNDANG ATT329TI

7nt1030Ekson 7C > TTAC TAT331

8nt1096Ekson 7C > ACTC CTA353

9nt1381Ekson 9G > AGTG GTA429

*. nukleotida posisi dan posisi asam amino yang referensi kepada urutan cDNA (GenBank: JQ955622) dan urutan asam amino (GenBank:AFY98079.1), masing-masing.Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.t002Gambar 5. The TMA isi dari kuning telur dari berbeda genotipe dalam dua periode pakan. Isi TMA dari kuning telur

disajikan sebagai berarti standar deviasi (SD).Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.g005Tabel 3. Genotipe dan alel frekuensi di Q319X dari penduduk diuji.

Baris NumberGenotype Frekuensi alel frekuensi 2 P nilai

CCCTTTCT

Bendungan810,690.270,040.830.170.20340.9033

Sire590,340.560,100.620.382.02780.3628

Gabungan1400.540.390,070,740,260.05120.9747

Doi: 10.1371/journal.pone.0081416.t003substrat pengakuan saku FMOs. Perubahan T329S motif ini ayam FMO3 gen membuat fungsi kerugian dari ayam FMO3 enzim [23].Profil jaringan-spesifik ekspresi puyuh FMO3 mRNA terdeteksi oleh kuantitatif RT-PCR dan hasilnya menunjukkan bahwa burung puyuh FMO3 mRNA berbeda dinyatakan dalam 14 jaringan. Pola burung puyuh FMO3 mRNA ekspresi adalah mirip dengan bahwa dalam bebek, untuk kedua burung puyuh dan bebek FMO3 mRNA diungkapkan sangat di hati, paru-paru dan ginjal [24].Hasilnya adalah juga konsisten dengan hasil dalam studi sebelumnya, yang FMO3 mRNA berlimpah dalam hati manusia dewasa [25], perempuan mouse hati, hati kelinci, hamster hati dan mousehati dan ginjal tikus, Marmot dan mouse [26]. Pada manusia, FMO3 mRNA terutama dideteksi pada dewasa hati dan jumlah mRNA FMO3 di paru-paru dan ginjal yang kira-kira 4,5%, 3,7% dari jumlah di dewasa hati, masing-masing [27]. Sementara dalam penelitian kami, jumlah puyuh mRNA FMO3 di paru-paru dan ginjal adalah 36,8% dan 85.8% dari yang di hati. Tingkat mRNA mapan jaringan-spesifik untuk burung puyuh FMO3 bisa mengatur dasar untuk masa depan penyelidikan kadar protein FMO3 tissuespecific di puyuh.Ada dua SNP nonsynonymous termasuk satu missense mutasi (SNP 6, T329I) dan satu omong kosong mutasi (SNP 3, Q319X) di ekson 7, yang mengakibatkan perubahan asam amino sesuai. Mutasi missense (T329I) di puyuh ditemukan di posisi yang sama mutasi missense (T329S) di ayam FMO3 protein urutan. T329S substitusi ayam FMO3 protein urutan tinggal dalam motif evolusioner sangat dilestarikan pentapeptide FATGY di mamalia adalah dikaitkan dengan peningkatan kadar TMA dan mencurigakan noda kuning telur ayam beberapa baris [28]. Burung puyuh substitusi T329I ditemukan di motif mutlak dilestarikan pentapeptide sama FATGY. Tetapi hanya tiga individu heterozigot terdeteksi in140 individu. Dengan demikian kita tidak melakukan analisis Asosiasi di situs ini.Dalam burung puyuh ikan-bau diamati hanya dalam kondisi tertentu. Pakan dapat mempengaruhi sifat dengan memberikan peningkatan Kolin, pelopor TMA, yang menjadi TMA di bawah metabolisme usus mikroba. Dalam studi ini, kami menemukan bahwa genotipe Q319X mutasi pada gen FMO3 adalah sangat terkait dengan konten TMA kuning telur. Q319X mutasi menyebabkan penghentian prematur, menghilangkan sekitar 40% dari FMO3 puyuh enzim yang mengandung asam amino 532, dan akan menyebabkan hilangnya fungsi enzim. Situasi yang serupa telah ditemukan pada ternak sapi perah [19], omong kosong R238X mutasi pada gen FMO3 juga dibuat terminasi dini dan menyebabkan amis off-rasa dalam susu. Pada manusia, dua omong kosong mutasi (E305X, E314X) telah diverifikasi menyebabkan hilangnya lengkap aktivitas enzim dan menyebabkan TMAU pada manusia [15]. Ketika burung puyuh yang feed dengan tingkat tinggi Kolin, TMA konten dalam telur puyuh yang diletakkan oleh individu dengan genotipe TT adalah jauh lebih banyak dibandingkan dengan CC atau CT genotipe. Semua telur yang diletakkan oleh individu dengan genotipe TT telah ditinggikan TMA konten (lebih dari 9.0 g/g telur) dan ikan-bau seperti telur ayam yang disajikan. Dengan prosedur molekul skrining didirikan dalam studi ini, alel tidak menguntungkan T dapat diidentifikasi dan dihapuskan sepenuhnya dalam saham penangkaran burung puyuh yang akan meletakkan telur tanpa bahkan bau ikan diberi pakan prekursor TMA cukup seperti Kolin.Bahan dan metodePernyataan etikaHewan percobaan disetujui oleh Animal Care dan penggunaan Komite dari China Agricultural University dan percobaan dilakukan sesuai dengan peraturan dan pedoman yang ditetapkan oleh Komite ini.Pengambilan sampelTiga laki-laki dan tiga perempuan Jepang puyuh (20 minggu usia), disediakan oleh Hubei Shendan sehat makanan Co, Ltd, yang digunakan untuk FMO3 gen kloning dan mRNA analisis ekspresi. Semua ini puyuh disembelih pada waktu yang sama, dan 14 jaringan yang berbeda, termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, pankreas, usus kosong, usus buntu, tuba falopi, indung telur, vas deferens, testis, otot payudara dan kulit yang dikumpulkan dan disimpan dalam nitrogen cair segera, dan kemudian disimpan pada-80 C untuk total ekstraksi RNA.SNP studi Deteksi dan Asosiasi, perempuan puyuh dari garis sire dan bendungan puyuh Jepang perkawinan silang paket dipelihara dalam satu kandang untuk meletakkan catatan. Percobaan makan dilakukan pada burung puyuh perempuan 81 (37 minggu usia dari garis sire) dan 59 perempuan puyuh (37 minggu usia) dari garis dam. Total 15 hari pemberian percobaan dibagi menjadi dua tahap, masa penyesuaian (lima hari pertama) dan periode percobaan (berikutnya 10 hari). Makanan konvensional yang dirumuskan standar makan petelur puyuh. Pada periode percobaan, Kolin tambahan klorida (4000 mg/kg) telah ditambahkan ke diet. Selama periode adaptasi dan lima hari terakhir masa percobaan, setidaknya tiga kuning dari setiap burung puyuh dikumpulkan dan disimpan pada 4 C untuk analisis TMA. Darah burung puyuh masing-masing dikumpulkan dan disimpan pada 20 C untuk ekstraksi DNA.Sintesis RNA isolasi dan cDNATotal RNA diekstrak dari jaringan hati dengan menggunakan TRIZOL total RNA ekstraksi reagen (Invitrogen, AS) menurut produsen protokol. Kualitas RNA dinilai oleh 1% agarose Elektroforesis menggunakan 1 L RNA. Konsentrasi terdeteksi oleh Nanovue (GE Healthcare, AS).CDNA strand pertama disintesis dari RNA dimurnikan oleh transkripsi terbalik PCR (RT-PCR). Satu mikrogram total RNA terbalik ditranskripsi oleh transkriptase M-MLV (Promega, Madison, WI), oligodT primer (10 pmol/L) dan katalisis Inhibitor (RRI) di total volume 50 reaksi L sesuai instruksi dari pabriknya. Kondisi reaksi termasuk 25 C selama 10 menit, 37 C selama 60 menit, 95 C selama 5 menit, dan 20 C selama 5 menit.Kloning cDNA puyuh FMO3 genBerdasarkan daerah paling dilestarikan urutan dalam spesies yang berbeda, sepasang primers dirancang untuk memperkuat daerah parsial puyuh FMO3 gen. PCR amplifications dilakukan dalam volume akhir 15 L dengan 1.2 L pertama untai cDNA, 7.5 L 2 Taq PCR Master campuran dan 0,2 L setiap primer (10 pmol). PCR amplifikasi kondisi yang optimal yang diprogram as5 min pra-denaturasi 94 c, diikuti oleh siklus 35 denaturasi 94 c selama 30 detik, pelunakan 63 C selama 30 detik, ekstensi di 72 C selama 60 detik, kemudian akhir ekstensi di72 C selama 8 menit. PCR produk tersebut mengalami Elektroforesis pada 1% agarose gel. Produk utama (673 bp) adalah disucikan gel, subcloned ke vektor pMD-19T (TaKaRa, Dalian, Cina), dan diurutkan oleh GENEWIZ Co Ltd (Beijing, Cina).Selanjutnya, 3'-ras dan 5'-ras dilakukan untuk mendapatkan full-length puyuh FMO3 mRNA urutan. CERDAS 5'-ras dan 3'-ras cDNA amplifikasi kit (Clontech, USA) digunakan sesuai dengan rekomendasi pabrik. Dua gen-spesifik primers (GSP1 dan GSP2, Tabel 4) digunakan dirancang berdasarkan urutan diperoleh, kemudian 3' akhir cDNA urutan dan 5' akhir cDNA urutan yang disintesis oleh nested PCR, masing-masing. Reaksi PCR dilakukan di total volume 50 L dan gol berikut PCR amplifikasi dilakukan pada berikut: pertama dengan 5 siklus 94 c selama 30 detik dan 72 C selama 30 menit, kemudian 5 siklus dari pra-denaturasi 94 c selama 3 detik, pelunakan di 68 C selama 30 detik, dan ekstensi di 72 C selama 3 menit , akhirnya dengan 30 siklus 94 c selama 30 detik, 67 C selama 30 detik, 72 C selama 3 menit. RAS PCR produk yang disucikan gel, subcloned ke vektor pMD-19T (TaKaRa, Dalian, Cina), dan diurutkan oleh GENEWIZ Co Ltd (Beijing, Cina). Setidaknya lima independen klon yang diurutkan untuk setiap PCR produk untuk memastikan keakuratan Sekuensing. Setelah mendapat panjang penuh gen FMO3 oleh menyelaraskan dan splicing, sepasang primers untukUrutan analisisMenurut fragmen sequencing tiga, urutan penuh cDNA dirakit menggunakan perangkat lunak DNAMAN. Pembacaan terbuka frame (ORF) dan urutan asam amino yang disimpulkan menggunakan ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/). PI teoritis dan Mw protein dihitung menggunakan menghitung pI/Mw alat (http://web.expasy.org/compute_pi/). Nukleotida serta asam amino diturunkan urutan gen FMO3 bebek yang terkutuk dengan orang-orang melaporkan FMO3 urutan dari spesies yang berbeda di Pusat Nasional untuk Bioteknologi informasi (NCBI) server (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Beberapa aligment urutan menganalisis oleh Clustal X.Analisis filogenetikMenggunakan metode (NJ) bergabung dengan tetangga dengan molekul evolusi genetika analisis (MEGA) versi 5.0, pohon filogenetik ini dibangun berdasarkan urutan multi keberpihakan urutan protein FMO3 dari 14 spesies termasuk burung puyuh (Coturnix coturnix), ayam (Gallus gallus), bebek (Anas platyrhynchos), manusia (Homo sapiens), simpanse (Pan troglodytes), orangutan (Pongo abelii), kera (Macaca mulatta), anjing (Canis lupus familliaris), sapi (Bos taurus), kelinci (cuniculus cuniculus) , tikus (Rattus norvegicus), mouse (Mus musculus) dan dua jenis Xenopus (Xenopus tropicalis dan Xenopus laevis).FMO3 analisis ekspresi gen dalam jaringan berbeda puyuh Total mRNA dari 14 jaringan yang berbeda dari tiga burung puyuh, termasuk jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, pankreas, usus kosong, usus buntu, tuba falopi, indung telur, vas deferens, testis, otot payudara dan kulit, diekstraksi untuk menyelidiki mRNA profil ekspresi gen FMO3 puyuh menggunakan real-time PCR. Reaksi qPCR masing-masing berjalan di triplicates. Puyuh GAPHD gen ini digunakan sebagai referensi internal gen. Primers untuk FMO3 gen dan gen GAPDH dirancang oleh Primer 5.0 software (Tabel 4).Real-Time PCR dilakukan pada sistem ABI 7300 (Terapan Biosystems, USA) yang menggunakan kekuatan SYBR PCR Master campuran (Biosystems diterapkan, USA). Semua real-time PCR reaksi dijalankan dalam rangkap tiga. PCR reaksi yang dilakukan pada volume final 15 L dengan 1.2 L cDNA, 0.2 L primer genespecific masing-masing, 7.5 L 1 x PCR campuran dan 5.9 L dimurnikan air. Prosedur Bersepeda termal yang optimal adalah pada 50 C selama 2 menit, 95 C selama 10 menit, 40 siklus 95 c selama 15 detik, 60 C untuk 1 min, 95 C selama 15 detik, 60 C selama 30 detik, dan 95 C selama 15 detik. Ekspresi relatif bebek FMO3 mRNA dihitung relatif terhadap jumlah GAPDH hadir.

Real-time PCR data dianalisis menggunakan perbandingan Ct metode [29]. Nilai Ct yang berarti triplicate sampel yang diuji. Ekspresi gen dihitung sebagai 2-Ct (Ct = target Ct-pengendalian internal Ct) dan nilai ditunjukkan n-lipat perbedaan relatif terhadap ekspresi gen pengendalian internal. Diferensial ekspresi antara 14 jaringan dianalisis oleh ANOVA program versi SAS 9.2. Beberapa perbandingan analisis dilakukan menggunakan metode Duncan. Perbandingan dianggap signifikan di P < 0,05.SNP deteksi gen FMO3 puyuh oleh SekuensingSecara total, 140 puyuh yang digunakan untuk mendeteksi mutasi pada gen FMO3 puyuh. Yang primers (Tabel 5) meliputi daerah puyuh FMO3 gen dirancang berdasarkan burung puyuh diperoleh FMO3 cDNA urutan. PCR dilakukan di 20 L reaksi volume dengan DNA, Taq DNA polimerase, PCR buffer dengan MgCl2 dan primers. Maka reaksi adalah diinkubasi 94 c selama 5 menit, 35 siklus 94 c selama 30 detik, 62-65 C (Tabel 5) untuk 30 detik, dan 72 C untuk sec 45, diikuti oleh sebuah perpanjangan akhir pada 72 C selama 10 menit. Setelah Sekuensing, urutan sejalan dengan identitas polimorfisme pada burung puyuh FMO3 gen.TMA konten dalam kuning telurProsedur untuk penentuan TMA konsentrasi dalam kuning telur diikuti yang dalam ayam [20]. Secara singkat, TMA diambil dari kuning telur menggunakan asam trikloroasetat 10% (TCA, kuning telur 1ml/g), dan 2 ml ekstrak dibuat alkali dengan menambahkan 1.5 ml 50% kalium hidroksida untuk memisahkan amina dari garam nya. Untuk memperbaiki komponen lain yang mengandung nitrogen, 0.5 ml 10% formaldehida ditambahkan. TMA gratis dilarutkan dalam 5 ml toluena. 2,5 ml aliquot dari supernatant dicampur dengan volume sama 0.02% MD5 asam untuk membentuk kompleks TMA-N-picrate kuning. Itu kemudian diukur pada 410 nm menggunakan ultraviolet spectrophotometer. Kurva standar (R2= 0.9899) dihasilkan dari 14 TMA solusi standar (berkisar dari 0 hingga 20 g ml TMA-n) untuk menghitung konsentrasi TMA-N kuning telur. Konten TMA kemudian disajikan sebagai TMA-N kuning telur.Analisis genotipe dan AsosiasiSNP yang genotyped oleh PCR dan langsung sequencing. PCR reaksi prosedur adalah sama seperti program digambarkan dalam SNP deteksi. Asosiasi antara genotipe SNP pada FMO3 gen dan TMA konten dalam kuning telur dihitung dengan model linear umum (GLM) prosedur SAS 9.2 versi. Model: Yijk= + Gsaya + Lj + eijk, mana Yijk adalah pengamatan dari isi TMA kuning telur, adalah cara paling persegi, Gsaya adalah efek dari sayagenotipe th (= 1-3), Lj adalah efek dari jth line (garis sire dan bendungan) dan eijk adalah efek dari sisa acak. Kemudian beberapa perbandingan analisis dilakukan untuk membandingkan TMA konten dalam telur puyuh genotipe masing-masing dengan menggunakan sarana kuadrat.KesimpulanDalam studi ini, urutan penuh cDNA puyuh FMO3 gen berhasil kloning dan urutan nukleotida dan diduga di tengah urutan asam dianalisis. Burung puyuh FMO3 mRNA ekspresi profil dalam jaringan 14 juga terdeteksi. Sembilan SNP telah diidentifikasi dalam berbagai exons dan terdapat sebuah asosiasi yang sangat signifikan antara isi TMA puyuh kuning telur dan Q319X mutasi, yang menyebabkan bau ikan puyuh kuning telur. Di sini, kami menemukan penanda penting dan menyajikan metode yang efektif untuk mengidentifikasi potensi "ikan-bau" individu dengan menguji langsung dari FMO3 genotipe tanpa memandang usia, faktor lingkungan, atau jenis kelamin individu diuji, yang akan membantu dalam mengatasi faktor genetik di belakang ikan-bau di puyuh telur dan meletakkan dasar yang baik untuk studi lebih lanjut dan pembiakan molekuler untuk burung puyuh.Kontribusi penulisDisusun dan didisain dengan percobaan: NY JXZ. Dilakukan percobaan: FTM JXZ PW LL. menganalisis data: FTM PW. Berkontribusi alat-alat analisis/reagen/bahan: GQY GYX. Menulis naskah: LL PW NY.

Referensi1. Cashman JR, SB Park, Berkman CE, LE Cashman (1995) peran hepatik yang mengandung flavin monooxygenase 3 dalam metabolisme obat dan kimia pada manusia dewasa. Chem berbagai berinteraksi 96: 33-46. Doi: 10.1016/0009-2797 (94) 03581-R. PubMed: 7720103. 2. Ziegler D (1980) Microsomal yang mengandung flavin monooxygenase: oksigenasi nukleofilik nitrogen dan belerang senyawa. Enzimatik dasar Detoxication 1:201-227.3. SK Krueger, Williams DE (2005) mamalia yang mengandung flavin monooxygenases: struktur/fungsi, genetic polymorphism dan peranan dalam metabolisme obat. Ada Pharmacol 106:357-387. Doi:10.1016 / j.pharmthera.2005.01.001. PubMed: 15922018 .4. E Hodgson, Rose RL, Ryu DY, jatuh G, enzim metabolisme pestisida Blake BL et al. (1995). Toxicol Lett 82-83: 73-81. Doi: 10.1016/0378-4274 (95) 03469-2. PubMed: 8597134. 5. Ziegler DM (1993) terbaru studi tentang struktur dan fungsi dari multisubstrate yang mengandung flavin monooxygenases. LSM Rev Pharmacol Toxicol 33:179-199. Doi:10.1146/annurev.pa. 33.040193.001143. PubMed: 8494339. 6. Yeung CK, Adman ET, Rettie AE (2007) fungsional karakterisasi varian genetik manusia FMO3 terkait dengan trimethylaminuria. Lengkungan Biochem Biophys 464:251-259. Doi:10.1016/j.abb.2007.04.014. PubMed: 17531949. 7. Bain MD, Jones M, Samir SP, Reed PJ, kontribusi Tracey BM et al. (1988) usus bakteri metabolisme untuk Penyakit metabolik manusia. Lancet 1:1078-1079. PubMed: 2896913. 8. Lang DH, Yeung CK, Peter RM Ibarra C, spesifisitas Gasser R et al. (1998) Isoform trimethylamine N-oksigenasi oleh manusia flavincontaining monooxygenase (FMO) dan enzim P450: selektif katalis oleh FMO3. Biochem Pharmacol 56:1005-1012. Doi:10.1016 / S0006-2952 (98) 00218-4. PubMed: 9776311 .9. Al-Waiz M, Ayesh R, Mitchell SC, siaga JR, Smith RL (1987) A polimorfisme genetik dari N-oksidasi trimethylamine pada manusia. M.Farm(Klin) Pharmacol ada 42:588-594. Doi:10.1038/clpt.1987.201. PubMed: 3677545 .10. R Ayesh, Mitchell SC, Zhang A, RL Smith (1993) sindrom bau ikan: aspek biokimia, kekeluargaan, dan klinis. BMJ 307:655-657. Doi:10.1136/bmj.307.6905.655. PubMed: 8401051 .11. AQ Zhang, Mitchell S, Smith R (1995) ikan bau sindrom: verifikasi pembawa deteksi tes. J mewarisi Metab Dis 18:669-674. Doi:10.1007 BF02436755. PubMed: 8750603 .12. Dolphin CT, Janmohamed A, Smith RL, Shephard EA, Phillips IR (1997) Missense mutasi yang mengandung flavin mono-oxygenase 3 gen, FMO3, mendasari sindrom ikan-bau. NAT Genet 17:491-494. Doi: 10.1038/ng1297-491. PubMed: 9398858 .13. D Hernandez, Addou S, Lee D, Orengo C, Trimethylaminuria Shephard EA et al. (2003) dan database mutasi FMO3 manusia. Hum Mutat 22:209-213. Doi:10.1002/humu.10252. PubMed: 12938085 .14. IR Phillips, monooxygenases mengandung Flavin Shephard EA (2008): mutasi, respon penyakit dan obat-obatan. Tren Pharmacol Sci 29:294-301. Doi:10.1016/j.tips.2008.03.004. PubMed: 18423897 .15. Treacy EP, Akerman BR, Chow LM, Youil R, Bibeau C et al. (1998) mutasi yang mengandung flavin gen monooxygenase (FMO3) menyebabkan trimethylaminuria, Cacat detoxication. Hum Mol Genet 7:839-845. Doi:10.1093/hmg/7.5.839. PubMed: 9536088. 16. BR Akerman, Forrest S, Chow L, Youil R, Knight M et al. (1999) dua novel mutasi gen FMO3 dalam proband dengan trimethylaminuria. Hum Mutat 13:376-379. Doi:10.1002 / (SICI) 1098-1004 (1999) 13:5. PubMed: 10338091. 17. Lundn A, Gustafsson V, Imhof M, Gauch R, konsentrasi tinggi trimethylamine JO Bosset (2002) dalam susu dari sapi pada standar diet dinyatakan sebagai off-rasa amis. J susu Res 69:383-390. PubMed: 12369409 .18. Hobson-Frohock A, tanah DG, Griffiths NM, Surat Curtis RF (1973): telur noda: asosiasi dengan trimethylamine. Alam 243:304-305. Doi: 10.1038 243304a0. PubMed: 4743217 .19. Lundn A, Marklund S, Gustafsson V, Andersson L (2002) A omong kosong mutasi pada gen FMO3 mendasari amis mati rasa di susu sapi. Genom Res 12:1885-1888. Doi:10.1101/gr.240202. PubMed: 12466292 .20. Honkatukia M, Reese K, Preisinger R, Tuiskula-Haavisto M, Fishy Weigend S et al. (2005) noda di telur ayam adalah dikaitkan dengan substitusi dalam motif dilestarikan gen FMO3. Genomics 86:225-232. Doi:10.1016/j.ygeno.2005.04.005. PubMed: 15916878 .21. Rossmann MG, Moras D, Olsen KW (1974) kimia dan biologi evolusi dari protein pengikat nukleotida. Alam 250:194-199. Doi: 10.1038 250194a0. PubMed: 4368490. 22. Wierenga RK, De Maeyer KIA, interaksi Hol WGJ (1985) pirofosfat gugus dengan. alpha.-helixes mengikat dinukleotida protein. Biokimia 24: tahun 1346-1357. Doi:10.1021 bi00327a012. 23. Polimorfisme genetik Koukouritaki SB, monooxygenase mengandung Flavin Hines RN (2005): dampak pada pengembangan metabolisme dan obat kimia. Pharmacogenomics 6:807-822. Doi:10.2217/14622416.6.8.807 . PubMed: 16296944 .24. Wang P, Zheng J, Qu L, Lian L, Xu G et al. (2013) molekul kloning, urutan karakterisasi, Deteksi SNP, dan jaringan analisis ekspresi gen bebek FMO3. Mol sel Biochem, 379: 141-51. PubMed: 23625204. 25. TE dolphin CT, Cullingford, Shephard EA, RL Smith, Phillips IR (1996) diferensial perkembangan dan jaringan-spesifik regulasi ekspresi gen pengkodean tiga anggota keluarga monooxygenase yang mengandung flavin manusia, FMO1, FMO3 dan FM04. EUR J Biochem 235:683-689. Doi:10.1111/j.1432-1033.1996.00683.x. PubMed: 8654418 .26. Burnett VL, Lawton MP, Cloning RM Philpot (1994) dan sekuensing yang mengandung flavin monooxygenases FMO3 dan FMO4 dari kelinci dan karakterisasi dari FMO3. J berbagai Chem 269:14314-14322. PubMed: 8188717 .27. J Zhang, analisis kuantitatif Cashman JR (2006) FMO gen mRNA tingkat dalam jaringan manusia. Obat Metab Dispos 34:19-26. PubMed: 16183778 .28. Lattard V, Buronfosse T, Lachuer J, Longin-Sauvageon C, Moulin C et al. (2001) kloning, sekuensing, jaringan distribusi, dan heterologous ekspresi tikus yang mengandung flavin monooxygenase 3. Lengkungan Biochem Biophys 391:30-40. Doi:10.1006/abbi.2001.2317. PubMed: 11414682 .29. Schmittgen TD, Livak KJ (2008) menganalisis data real-time PCR oleh C(T) perbandingan. Metode - Nat Protoc 3:1101-1108. Doi:10.1038 / nprot.2008.73.

OriginalEach qPCR reaction was run in triplicates.