KLONIN + GItsDanicaPutrys’

 Kloning: usaha/upaya untuk memproduksi sejumlah individu yang secara genetic sama persis (identik).

Prinsip: bahwa setiap makhluk hidup mempunyai kemampuan totipotensi yang artinya setiap sel mempunyai kemampuan untuk menjadi individu.

klon : sekelompok organisme hewan maupun tumbuh-tumbuhan yang dihasilkan melalui reproduksi aseksual dan berasal dari satu induk yang sama.

Apa itu Kloning?

Kloning pada tanaman melalui kultur sel mula-mula dilakukan pada tanaman wortel. Sel akar wortel dikultur, dan tiap selnya dapat tumbuh menjadi tanaman lengkap.

Kloning pada hewan dilakukan mula-mula pada amfibi (kodok), dengan mengadakan transplantasi nukleus ke dalam telur kodok yang dienukleasi.

Sejak Wilmut et al. berhasil membuat klon anak domba yang donor nukleusnya diambil dari sel kelenjar susu domba dewasa, terbukti bahwa pada mammalia pun klon dapat dibuat. Karena itu, kesimpulan mereka manusia pun secara teknis klon dapat dibuat.

Awal Praktek Kloning

Teknik KloningTransfer Nukleus

membutuhkan dua sel :1. suatu sel donor.

2. suatu oosit atau sel telur. Telur matur sebelum dibuahi dibuang intinya atau

nukleusnya.

sel telur akan berfungsi terbaik bila hanya dalam anfertilisasi.

inti sel donor bertindak sebagai inti sel zigot dan membelah serta berkembang

menjadi blastosit.

Blastosit selanjutnya ditransfer ke dalam uterus induk pengganti (surrogate mother).

Teknik Roslin

Suatu nukleus dewasa ternyata mampu memproduksi suatu

hewan yang komplit

Kasus kloning domba dolly

Tanpa sinkronosasi siklus sel, maka inti tidak akan berada

pada suatu keadaan yang optimum untuk dapat diterima

oleh embrio.

Sel donor harus berjuang untuk

dapat masuk ke Gap Zero, atau stadium

sel GO, atau stadium sel dorman.

Teknik Honolulu

Juli 1998, tim ilmuwan dari Universitas Hawai mengumumkan bahwa mereka telah

menghasilkan tiga generasi tikus kloning yang secara genetik identik.

Tikus susah untuk dikloning, karena segera setelah suatu

sel telur tikus mengalami fertilisasi ia akan segera

membelah.

Awalnya menggunakan tiga tipe sel yakni, sel Sertoli, sel otak dan sel kumulus. Sel Sertoli dan sel otak keduanya tinggal dalam stadia GO secara alamiah dan sel kumulus hampir selalu hadir pada stadia G0 ataupun G1.

Enzim yang dapat memotong ikatan fosfodiester untai DNA asing pada sekuen pengenalan yang

spesifik. Isolasi dari bakteri

Komponen-komponen KloningEnzim endonuklease

restriksi

Berupa DNA kromosom yang diisolasi dari inti sel ataupun DNA komplementer yang diperoleh dari penyalinan mRNA dengan

bantuan enzim reverse transcriptase, disebut complementary DNA (cDNA) .

Sumber DNA

Wahana pembawa fragmen gen target ke dalam suatu sel inang. Persyaratan: harus mampu disisipi DNA asing, dapat diintroduksi ke dalam sel inang, dapat bereplikasi secara independen di dalam sel

inang, dan memiliki penanda seleksi

Vektor

mudah dimanipulasi, mampu tumbuh dengan cepat dan stabil pada medium kultur biasa, non-patogen,

serta dapat ditransformasi DNA asing.Contoh : Escherichia coli, Bacillus subtilis

Enzim yang mengkatalisis reaksi pembentukan kembali ikatan fosfodiester antara potongan fragmen DNA atau RNA berujung kohesif yang saling berkomplemen hasil pemotongan dengan

enzim restriksi .

Sel inang

Enzim ligase

Tahap Kloning1. Amplifikasi

fragmen gen target

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan teknik amplifikasi sekuen DNA spesifik secara in vitro dengan proses pemanjangan primer pada untai DNA

komplementer .

Reaksinya terdiri atas sejumlah komponen essensial(enzim DNA polimerase yang termostabil, sepasang oligonukleotida spesifik yang berperan sebagai primer, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), kation divalen, kation

monovalen, buffer, serta DNA cetakan).

Sekuen primer membatasi daerah fragmen DNA target yang akan diamplifikasi

Enzim DNA polimerase akan menginisiasi sintesis salinannya

Syarat untuk desain primer yang baik antara lain panjang primer sekitar 17--28 basa, memiliki kandungan basa GC 40--60%, pada ujung 3’

terdapat basa G atau C, temperature of melting sekitar 55--80° C, dan tidak terjadi self-

complementarity.

Reaksi PCR ditempatkan pada mesin thermal cycler yang dapat mengatur suhu sesuai dengan tiga tahapan dalam siklus PCR.

Tahap awal reaksi PCR merupakan pemisahan untai ganda DNA (denaturasi) yang dilakukan pada suhu 95° C, dilanjutkan dengan

pemasangan basa primer dengan untai tunggal DNA cetakan (annealing) pada suhu sekitar 50--65° C, kemudian pada suhu 72°

C, berlangsung sintesis untai DNA baru oleh enzim DNA polimerase (Fairbanks & Andersen 1999: 278). Setiap siklus pada

PCR menghasilkan 2 salinan untai ganda fragmen target

Kedua hasil salinan DNA target dari setiap siklus akan menjadi cetakan bagi siklus berikutnya sehingga reaksi

PCR dengan 30 siklus dapat menghasilkan jutaan fragmen DNA target

Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor

Penyisipan fragmen DNA atau gen target ke dalam DNA vektor untuk

membentuk molekul DNA rekombinan melibatkan tahap

digesti dan ligasi.

Vektor dan sisipan didigesti dengan enzim restriksi yang sama sehingga

keduanya memiliki potongan kohesif (sticky ends) serupa yang akan

saling berlekatan.

Enzim ligase mengkatalisis proses perlekatan basa-basa nukleotida yang

saling berkomplemen.

Introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang

Introduksi vektor rekombinan ke dalam sel inang

Introduksi DNA vektor plasmid yang mengandung gen sisipan ke dalam sel inang bakteri disebut transformasi,

sedangkan introduksi vektor virus dinamakan transfeksi). Sel inang terlebih dahulu dibuat menjadi

kompeten sebelum dilakukan proses transformasi sehingga menjadi permeabel terhadap DNA asing.

Sel kompeten dibuat dengan memberikan perlakuan fisik atau kimia yang akan meningkatkan

kemampuan sel untuk mengikat dan mengambil DNA.

Proses introduksi DNA ke dalam sel terjadi pada saat pemberian kejutan panas

terhadap sel kompeten dan DNA dengan menaikkan suhu inkubasi secara drastis dari

0° C menjadi 42° C selama sekitar 1--2 menit.Parameter keberhasilan proses transformasi

ditentukan dengan nilai efisiensi transformasi yang tinggi. Jumlah koloni transforman yang tumbuh pada permukaan medium seleksi dihitung, kemudian dimasukkan dalam perhitungan efisiensi transformasi. Nilai efisiensi transformasi optimal metode CaCl2 adalah 106 cfu/µg.

Seleksi hasil kloning

Melalui proses seleksi, koloni transforman yang membawa DNA rekombinan target (berhasil dikloning) dapat dibedakan dari koloni transforman yang tidak membawa

DNA target.

Dilakukan dengan sejumlah metode, seperti hibridisasi DNA probe, hibridisasi antibodi

monoklonal, dan seleksi nutrien

Manfaat KloningMenghasilkan bibit unggul

Bertujuan untuk terapi penyakit

Menolong pasangan infertil agar mempunyai

keturunan

Mencegah kepunahan spesies

Modifikasi Pangan

Tidak dibenarkan untuk-- Kloning untuk reproduksi manusia-- Membuat manusia duplikat-- Implantasi sel manusia-- Kecuali untuk terapi kloning

Etika Kloning