Dokumen.tips Makalah Teknik Kloning Sederhana Gen Apoptin Menggunakan Vektor Plasmid Dan

8/16/2019 Dokumen.tips Makalah Teknik Kloning Sederhana Gen Apoptin Menggunakan Vektor Plasmid Dan

http://slidepdf.com/reader/full/dokumentips-makalah-teknik-kloning-sederhana-gen-apoptin-menggunakan-vektor 1/31

1

jBAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Kloning merupakan teknik terobosan baru untuk mendapatkan sebuah gen yang sangat

dibutuhkan keberadannya bagi kehidupan manusia. Dalam beberapa kasus penyakit yang menimpa

manusia, hewan, dan tumbuhan, pengobatan biasa tidak dapat memberikan hasil kesembuhan yang

maksimal. Setelah dikenalnya teknik kloning, pintu pengobatan penyakit pada mahluk hidup mulai

lebih terbuka. Sekarang ini, teknik kloning sudah dipakai untuk membuat vaksin dan hormon.Kita

sudah bisa, dengan menggabungkan dua jenis sel (seperti sel tikus dan sel kanker manusia) untuk

menghasilkan sejumlah besar antibodi tertentu, lewat sistem kekebalan, untuk memerangi penyakit.

Saat disuntikkan kedalam aliran darah, antibodi klon ini mencari dan menyerang sel penyebab

penyakit dimanapun ditubuh kita. Dengan menempelkan antibodi klon pada unsur pelacak, para

ilmuan dapat menemukan kanker tersembunyi, dan dengan menempelkan obat penghancur kanker,

dosis perawatan dapat dikirim langsung ke sel kanker.

Sumber D ! penyembuh tadi bisa darimana saja, salah satu contohnya adalah dari D !

Chicken Anemia Virus ("!#) yang memiliki jenis protein #$% yang disebut dengan !poptin.

!poptin adalah protein yang mampu menginduksi kematian sel spesi&ik pada sel tumor secara

terprogram. !poptin mengakibatkan terjadinya apoptosis pada sel tumor. !poptosis adalah

mekanisme biologi yang merupakan salah satu jenis kematian sel yang terprogram. !poptosis pada

umumnya berlangsung seumur hidup dan bersi&at menguntungkan bagi tubuh.

Karena kelebihan yang dimiliki oleh !poptin dan peluangnya yang besar untuk

menghilangkan sel tumor secara permanen, para peneliti memiliki gagasan untuk

mengembangbiakkan !poptin ini untuk diproduksi lebih banyak lagi. Dengan menggunakan

teknologi kloning, hal ini sangat mudah dilakukan. 'rganisme yang dipilih untuk menjadi sel inang

atau host adalah E. Coli . Dalam makalah ini, akan dijelaskan lebih lanjut mengenai strategi

strategi yang akan dipakai dalam mengkloning apoptin pada E. coli , dimulai dari tahap

pengisolasian apoptin hingga replikasinya, serta kelebihan dan kekurangannya.

1.2. Tujuan

ujuan dari penelitian ini ialah untuk meng*kloning gen apoptin dengan menambahkan 1+

histidin pada * erminal dan !rginin pada "* erminal, menggunakan plasmid p-"1 pada

E.coli /0 1(D2%).



sel inang dengan plasmid rsel inang dengan DNA rekoombinan tanpagen apoptin

sel inang dengan DNA rekoombinan tanpa & dengan gen apopt

seleksi untuk memilih sel inang dengan DNA rekombinan yang membawa gen apoptin

reisolasi DNA rekombinan

harvesting danpemurnian

1.3. Strategi Kloning Gen A o tin

Bagan 1. Ske!a Kloning Gen A o tin



%

BAB II

ST"ATEGI KL#NING GEN AP#PTIN $ENGGUNAKAN PLAS$ID PU%1&

DAN SEL INANG E.COLI BL21'DE3(

2.1. Strategi I)ola)i Gen A o tin

Chicken Anemia Virus (CAV)

!poptin adalah protein yang mampu menginduksi kematian sel spesi&ik pada sel tumor.

Karena itu banyak usaha untuk mengkulturkan apoptin agar mampu menjadi alternati& untuk obat

sel tumor.

Salah satu metode untuk mengkultur protein apoptin adalah dengan kultur sel yang sudah di

trans&ormasi. -ntuk melakukan trans&ormasi sel yang akan di kultur perlu dilakukan isolasi dari genyang mengkodekan apoptin untuk disisipkan di sel.

3en apoptin dikodekan oleh Chicken Anemia Virus ("!#) yang termasuk 4amili Gyrovirus .

"!# adalah virus D ! yang menyebabkan anemia dan atropi organ pada ayam. "!# mampu

mengkodekan % macam protein virus yaitu 5 #$1, #$ , dan #$%. $rotein #$1 berperan dalam

menyusun kapsid (0ampiran 1). $rotein #$1 memiliki massa 61 Kda. $rotein #$ adalah protein

yang memiliki spesi&itas terhadap &os&atase dan memiliki masa %+ Kda. Sementara protein #$%

adalah protein apoptin, yang mampu menginduksis apoptosis pada sel limosit pada ayam dan beberapa jalur sel pada sel tumor. etapi tidak menginduksi lisis pada sel normal. $rotein apoptin

memiliki massa 1% KDa. 7ekanisme spesi&itas dari apoptin hingga saat ini belum diketahui.

-ntuk mendapatkan gen apoptin bisa didapatkan dari isolasi dari virus "!# yang

mengin&eksi ayam atau embrio atau sel yang dikulturkan.

VP3 (Apoptin)

#$% atau selanjutnya akan disebut dengan nama apoptin adalah protein yang terdiri dari 1 1

asam amino terdiri terutama dari prolin, serin, threonin dan asam amino dasar lainnya. !poptin

menganding sinyal Bipartite-type nuclear (atau 0S1 dan 0S ) pada posisi * dan 111*1 1

atau pada ujung c*terminalnya. Dan nuclear export signal ( 2S) yang menunjukkan adanya

potensi perpindahan dari nukleus ke sitoplasma dan sebaliknya.

!poptin memiliki kemampuan untuk menginduksi terjadinya apoptosis pada sel kanker

manusia namun tidak pada sel normal. Sel memicu apoptosis dengan cara intrinsik mitokondrial

yang memerlukan caspase *% dancaspase * . /elum ada mekanisme yang jelas mengapa apoptin

dapat spesi&ik membunuh lini sel dari sel kanker. etapi salah satu sebabnya adalah karena pada sel



8

kanker apoptin berlokalisasi di nukleus sementara pada sel normal umumnya diekspresikan di

sitoplasma.

/entuk apoptin sangat stabil, multimerik akti& biologis terdiri dari %+*8+ monomer dan

nukleoprotein kompleks tingkat tinggi.

Ga!*ar 1. Struktur )ekuen) a)a! a!ino +ari a o tin

(Sumber. 0os 7, S , $aniraghi ++ )

Tahapan purifikasi DNA Chicken anemia irus !ari ku"tur

D ! "!# memiliki ukuran sekitar ,% kb. -ntuk mendapatkan D ! "!# dan

memisahkannya dari komponen virus yang lain. 9ang pertama harus dilakukan adalah mengambil

virus "!# yang ingin di kultur. #irus "!# dapat ditemukan pada hati ayam broiler yang terin&eksi

virus.

Sampel dari jaringan hati kemudian dipanaskan pada suhu :6 +" selama + menit untuk

mengurai jaringan*jaringan yang kompeks. Kemudian menggunakan bu&&er phenol jenuh dengan

volume yang sama seperti sampel untuk ditambahkan pada sampel dan mengocok sampel selama %

menit kemudian melakukan sentri&ugasi pada 18+++ ;$7 selama 6 menit. 4enol akan berada

dibagian bawah tabung. Kemudian lapisan atas dari lisat dipisahkan dan dicampurkan dengan

kloro&orm pada volume yang sama dengan sampel. Dan disentri&ugasi pada 18+++ ;$7 selama 6

menit. /agian atas dari hasil sentri&ugat dipisahkan.

7etode tersebut dikenal dengan ekstraksi &enol*kloro&orm. $enambahan &enol ber&ungsi

untuk memisahkan &asa*&asa pada virus. 4asa organik akan terikat pada &enol dan kloro&orm. 4asa

organik akan lebih berat dan mengikat protein*protein berat seperti kapsid yang menyusun virus.

Kemudian komponen D ! akan terikat pada &asa cair yang lebih ringan. 4enol dipilih karena

memiliki kelarutan yang buruk sehingga protein yang larut dalam &enol akan terpisah dari cairan.

7etode pemisahan ini lebih baik dibandingkan metode pemisahan dengan kolom adsorpsikarena meskipun memakan waktu lebih lama, dapat mendapatkan D ! yang lebih murni. <al ini



6

dikarenakan kemampuan &enol untuk memisahkan &asa lebih baik dibandingkan pengikatan kovalen

pada proses adsorpsi.

Kemudian menambahkan a!c %7 pada sampel sebanyak 1=1+ dari volume sampel. Dan

kemudian menambahkan juga 1++> 2t'< sebanyak kali volum sampel. Setelah mengocok

sampel selama beberapa detik, sampel didinginkan pada suhu * + +" selama %+ menit.

Setelah waktu pendinginan selesai, melakukan sentri&ugasi lagi pada 18+++ ;$7 selama 6

menit. Setelah 6 menit jika tidak terbentuk pelet pada sampel lakukan ulang sentri&ugasi selama 6

menit.

Kemudian memisahkan pelet dari supernatan dengan pipet secara perlahan*lahan.

$enambahan etanol ditujukan untuk mengendapkan D !. Karena D ! memiliki si&at yang sangat

polar akibat muatan yang dimiliki struktur &os&atnya. -ntuk itu, etanol yang memiliki si&at tidak

polar dapat menyebabkan adanya atraksi elektrik antara gugus &os&at dan ion positi& yang ada dalamlarutan sampel sehingga membentuk ikatan ion dan mengendapkan D !. ?on yang nantinya

berikatan dengan D ! untuk diendapkan adalah ion natrium yang berasal dari atrium asetat.

Setelah itu pelet dibiarkan kering sehingga tidak ada cairan lagi didalam sampel. $elet

kemudian disuspensikan didalam air. Sampel tersebut seharusnya mengandung D ! virus "!#

yang murni untuk kemudian dilakukan tahapan berikutnya.

#enentukan posisi $en apoptinSetelah mendapatkan D ! dari "!#, langkah selanjutnya adalah mencari gen yang

mengkodekan apoptin. Seperti telah dibahas pada bagian sebelumnya, apoptin atau #$% adalah

protein yang dikodekan oleh 1 1 basa nitrogen. Sementara pada "!# terdapat % macam protein

yang dapat dikodekan dengan D ! "!# memiliki panjang ,1 K/.

-ntuk menggandakan gen apoptin kita akan menggunakan metode $"; ($olymerase "hain

;eaction). 7etode $"; dapat mengampli&ikasi atau menggandakan bagian tertentu dari suatu

D !. !gar dapat mengampli&ikasi sampel, $"; menggunakan sebuah oligonukleotida yang

dinamakan primer. $rimer adalah rantai D ! yang bersi&at komplementer dengan &ragmen yang

ingin digandakan. Sehingga untuk dapat mengampli&ikasi rantai D ! di "!# yang mengkodekan

#$% perlu diketahui sekuens D !.

7engetahui sekuens D ! dilakukan dengan metode sanger atau sekuensing dengan

dideoksi. 7etode sanger dipilih dibanding metode lainnya karena metode sanger mudah dilakukan

dan tidak menggunakan bahan yang merusak sampel seperti metode maxam-gilbert (0ampiran ).

Kemudian setelah dipetakan sekuens dari D ! "!#, kita dapat membuat primer yang sesuai

dengan kode gen yang mengkodekan #$%.



:

#o!ifikasi $en apoptin !en$an penam%ahan histi!in pa!a u&un$ N'termina"

$enambahan histidin pada D ! rekombinan umum dilakukan. <al tersebut bertujuan

memudahkan pada saat panen protein. <al tersebut karena histidin cenderung bersi&at lengket.

7etode ini atau dinamakan Histidine tagging. 7eman&aatkan a&initas histidin terhadap

beberapa media yang mengandung logam bermuatan seperti kobalt atau nikel. $rotein rekombinan

yang mengandung histidin akan cenderung berinteraksi ionik dengan logam*logam tadi. Sementara

protein yang lain tidak mempunyai a&initas yang sama. Kemudian didalam media tersebut, dibilas

dengan bu&&er. 7isalnya bu&&er &os&at sehingga protein lain akan terbilas sementara protein

rekombinan yang mengandung histidin akan tetap menempel pada media.

7etode ini biasanya menggunakan minimal 6 buah rantai histidin. -ntuk menambahkan

histidin pada D ! rekombinan umumnya dilakukan pada saat mengampli&ikasi D ! yang akan

menjadi insert. <al ini disebabkan cara penambahan yang mudah dilakukan. Karena hal yang perludilakukan adalah melakukan modi&ikasi pada pemesanan primer D ! yang akan digunakan untuk

$";.

<istidin akan ditempelkan pada ujung * erminal dari apoptin. D ! ditranslasikan dari

ujun 6@ ke ujung %@. Dimana ujung 6@ berarti mengkodekan ujung * erminal dan ujung %@ tempat

dimana berada "* erminal.

Ta*el 1. Ko+e A)a! A!ino

Sumber. akamoto, . ++

-ntuk itu jika ingin menambahkan histidin pada * erminal maka penambahan histidin

dilakukan pada ujung 6@ primer. $enambahan histidin dilakukan dengan menambahkan basa

nitrogen yang mengkodekan histidin setelah kodon start pada primer.



A

/erdasarkan tabel diatas, berarti dibutuhkan penambahan 1+ kodon "! atau "!" setelah

kodon !-3 sebagai kodon start untuk menambahkan 1+ rantai histidin pada * erminal apoptin.

/aru kemudian primer yang komplementer dengan gen #$% yang diketahui melalui sekuensing.

Ga!*ar 2. De)ain ri!er ,ang tela- +ita!*a-kan Hi)ti+in

Sehingga hasil D ! yang didapatkan sebagai hasil $"; adalah rantai D ! yang mengkodekan

apoptin beserta 1+ rantai histidin pada * erminalnya

#o!ifikasi $en apoptin !en$an penam%ahan ar$inin pa!a ua&un$ C'termina"

7enambahkan arginin pada "* erminal tidak sesederhana seperti menambahkan histidin.

$ada penambahan di * erminal, pemanjangan D ! oleh D ! polimerase akan dilakukan dari

arah 6@ ke ujung %@ dan urutan basa nitrogen di ujung 6@ tidak akan terpengaruh. Sementara pada

modi&ikasi di ujung %@ jika dilakukan sebelum terjadi pemanjangan D ! maka ketika pemanjangan

terjadi, basa nitrogen yang tadinya terletak paling ujung tidak akan terletak di ujung %@ lagi

melainkan ditengah*tengah rantai yang baru mengalami pemanjangan.-ntuk mengatasi hal berikut metode lain selain modi&ikasi primer perlu dilakukan. !da

pilihan cara untuk menambahkan arginin pada ujung "*terminal. "ara pertama adalah dengan

meligasikan gen yang mengkodekan arginin pada plasmid yang disiapkan sebagai vektor.

Sementara cara kedua adalah melakukan ligasi pada insert hasil $"; yang akan disisipkan.

"ara yang dilakukan adalah cara yang kedua karena gen hasil $"; ada dalam jumlah

banyak dan dapat digandakan dengan mudah. Selain itu panjang dari gen tidak terlalu besar

sehingga lebih mudah dilakukan modi&ikasi.

-ntuk menempelkan dengan cara yang kedua yang perlu disiapkan adalah gen hasil $";,

enBim ligase, ! $ dan kodon yang mengkodekan arginin (!33 atau !3!). Kodon yang

mengkodekan arginin akan menempel pada "*terminal dibandingkan pada * erminal karena

gugus '< lebih mudah diserang oleh &os&at yang dibawa oleh ! $.

Setelah proses tersebut selesai akan didapatkan banyak D ! yang mengkodekan apoptin

yang memiliki histidin di ujung *terminal dan arginin di ujung "* erminal. Kemudian gen

tersebut siap untuk dimasukkan kedalam vektor untuk proses trans&ormasi.



2.2. Strategi I)ola)i Pla)!i+ U%1&

onsep !asar ektor !a"am teknik k"onin$

Seperti yang telah kita ketahui bahwa trans&ormasi sel inang dilakukan menggunakan

perantara vector. Cadi, vektor adalah molekul D ! yang ber&ungsi sebagai wahana atau kendaraan

yang akan membawa suatu &ragmen D ! masuk ke dalam sel inang dan memungkinkan terjadinya

replikasi dan ekspresi &ragmen D ! asing tersebut. #ektor yang dapat digunakan pada sel inang

prokariot, khususnya E. coli , adalah plasmid, bakterio&ag, kosmid, dan &asmid. -ntuk dapat

dikatakan vector yang tergolong baik, maka harus memenuhi beberapa syarat penting sebagai

berikut 5

(1) 7empunyai ukuran relative kecil dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga

dapat dengan mudah melintasinya,( ) 7empunyai sekurang kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya

plasmid ke dalam sel inang,(%) 7empunyai tempat pengenalan restriksi sekurang kurangnya didalam salah satu marker

yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan &ragmen D !, dan(8) 7emiliki titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi didalam sel inangnya.

Selain itu terdapat syarat tambahan yang dapat digunakan untuk memperhitungkan vector

mana yang dianggap baik, walaupun syarat ini tidak terlalu penting 5

(a) 7emiliki ukuran yang cocok.4aktor ini berpengaruh pada aktivitas pemotongan dan penyambungan. empat pemotongan

enBim restriksi yang meliputi : nukleotida akan terjadi pada sekali pada setiap 8 : bp. 'leh

karena itu, vector yang memiliki ukurang lebih dari 8 kbp mungkin akan memiliki beberapa

lokasi untuk enBim yang diberikan dan pemotongan vector akan menguranginya menjadi

beberapa pieces yang akan memberikan hasil yang tepat pada proses ligasinya. Selain itu,

apabila ukuran terlalu besar maka akan sulit meng handle nya,.(b) 7emiliki penanda untuk insersi D !

7isalkan, insersi D ! kedalam vector dapat dideteksi dengan inaktivasi gene lac .(c) 7emiliki kemampuan tinggi untuk meng copy

-ntuk memaksimalkan hasil plasmid dari trans&ormasi sel, jumlah copy di setiap selnya

sebaiknya setinggi mungkin./agian bagian penting didalam vector beserta &ungsi dari bagian tersebut adalah sebagai

berikut 5!rigin o" replication 5 merupakan sekuen D ! yang mana replikasi dapat diinsiasi. -ntuk

D !s kecil termasuk plasmid bakteri cukup memiliki satu single origin saja. api lebih

besar D !s memiliki lebih banyak origins dan replikasi D ! diinsiasi pada setiap daerah

tersebut.



$romoter 5 untuk mengontrol ekspresi gen. 2kspresi vektor memiliki tujuan untuk

mengendalikan ekspresi gen tertentu didalam organsime inang (misalkan E.coli#. kontrol

tersebut dapat menjadi sangat penting. <al ini biasanya dengan memasukkan D ! target

kedalam sebuah tempat dibawah kontrol promoter tertentu. 9ang biasa digunakan ialah

promoter A,dan ?ac.!daptor 5 molekul tambahan yang dapat digunakan untuk menyambungkan ujung tumpul

&ragment D ! hasil pemotongan enBim restriksi. $ultiple clone site 5 disebut juga dengan polylinker , merupakan segment pendek dari D !

yang terdapat beberapa restriction site sampai lebih dari + tempat. 7"S mengiBinkan untuk

insersi D ! kedalam vector yang ditargetkan dan memungkinkan mengarahkan dalam

orientasi yang dipilih.

Pemi"ihan p"asmi! p C*+ se%a$ai ektor !a"am teknik k"onin$ $en apoptin

$ada kasus kali ini dipilih vector yang akan digunakan ialah p-"1 ' 3ambar % ( yang

diambil dari bakteri E.Coli. $emilihan vektor yang digunakan didasarkan pada

pertimbanganpanjang gen yang akan diligasi serta host yang akan digunakan. Dari beberapa

laporanpenelitian vektor plasmid pu"1 memberikanhasil yang memuaskan pada

pembuatanpustaka D ! dengan panjang gen +++bpsserta menggunakan host E coli (<anahan,

1 %E9anisch*$erron et al.%1 6E 0iu dan iu, ++ ).$lasmid ini sangat mudahditrans&eksikan

kedalam E coli dengan metodeyang sederhana dan relati& murah seperti heatshock serta dapat

dengan cepat bereplikasi danamat mudah diseleksi dengan metode &hite'blue color selection

(9anisch*$erron, 1 6E"hung, et al ., 1 ).

Ga!*ar 3. ektor U% 1&

(Sumber. http5==www.&ermentas.com=en=products=all=molecular*cloning=vectors*phage=sd++6*puc1 *puc1 *dna)



1+

p-"1 merupakan vektor yang memiki circular double stranded D ! dan mempunyai

: : pasang basa. pu"1 adalah salah satu molekul vektor yang paling banyak digunakan sebagai

rekombinan atau pengenalan D ! asing, dapat dengan mudah dibedakan dari non rekombinannya

berdasarkan perbedaan warna koloni pada media pertumbuhan. p-"1 hampir mirip dengan

p-"1 namun wilayah 7"S nya dibalik (0ampiran%).

7irip dengan plasmid plasmid yang lain, pu" 1 memiliki ori#, gen bla yang terdapat

ampicilin resistance dan memiliki &ragmen D ! special dengan beberapa perbedaan recognition

sites untuk restriksi endonuklease. Sekuen 7ultiple cloning site berada pada bagian 6@ dari lacF

gene yang mengkodekan untuk amino, bagian terminal dari beta*galactosidase (0acF) dari 2.coli.

Daerah 7"S berada dalam lacF gene (kodon : A lac F digantikan oleh 7"S), dimana bermacam

jenis sisi restriksi untuk beberapa restriksi endonuklease itu ada. Strain bakteri yang cocok untuk

sistem seleksi ini seharusnya memiliki bagian %@ dari gen lacF yang menyandikan bagian terminalcarboksi utuh.

Iso"asi p"asmi! pC *+ !ari %akteri E.co"i ,#*-+

Secara umum, isolasi D ! plasmid menghasilkan D ! plasmid yang diinginkan. ?solasi

D ! plasmid dilakukan dengan cara isolasi D ! plasmid p-"1 yang terdapat dalam 2.coli C7

1+ . /akteri inang pembawa p-" 1 ini ditumbuhkan dalam kompleks 5 0uria /ertani sebagai

sumber D !. Dalam medium 0/ pada suhu %A o" dengan pengocokan pada kecepatan 16+ 6+r=menit, sel 2.coli akan membelah sekali setiap + menit sampai kultur mencapai densitas

maksimum kira kira + % G 1+ sel=ml. E. coli C71+ dipanen, diambil % ml dan disentri&ugasi pada

kecepatan 6A++ G gselama 6 menit. ujuan dari sentri&ugasi ini adalah untuk mengendapkan bakteri

padadasar tabung karena untuk penyiapan ekstrak sel bakteri harus diperoleh dalam volumeyang sekecil

mungkin.

-ntuk isolasi dan puri&ikasi plasmid terdapat metode yang terkenal yaitu denaturasi

dengan alkali atau metode sentri&uge isopiknat. amun dalam pembahasan kali ini akan digunakanmetoda denaturasi dengan alkali karena metode ini merupakan metode yang popular saat ini. -ntuk

isolasi dan puri&ikasi D ! memiliki 8 bagian pentingyang meliputi (1) $emecahan sel, ( )

$enghilangan protein dan kromosom D !, (%) $engambilan plasmid dan (8) $emurnian lebih

lanjut apabila dibutuhkan

$ada langkah awal isolasi D ! yaitu lisis sel, dimana dapat digunakan bu&&er $1 dan $ .

Dimana bu&&er $1 telah ditambah dengan enBim ; !se ! dan deterjen Sodium Dodesil Sul&at

(SDS) dan indicator (yseBlue . Kombinasi ; !se dan SDS inilah yang dapat merusak dinding dan

lisis sel. 7enurut /irnboim dan Doly (1 A ) dengan hasil pengamatan terdapat rentang p< 1 *1 ,6

ikatan hydrogen dari D ! kromosom non supercoiled akan terdenaturasi, heliks ganda terurai dan



11

kedua rantai polipeptida memisah. $endenaturasian ini perlu dicek apakah telah berhasil atau belum

yaitu dengan penambahan bu&&er $ yang dapat memperjelas proses ini. Cika denaturasi telah

terjadi, maka suspense pelet sel akan berwarna biru karena adanya reaksi dengan indicator 0yse

/lue.

$roses renaturasi selanjutnya dilakukan dengan cara mengembalikan D ! pada kondisi

asam dengan penambahan bu&&er % yang mengandung asam asetat. $emberian asam akan

menyebabkan D ! bakteri yang sebelumnya terdenaturasi mengelompok dalam massa D ! linier

yang kusut. Sentri&ugasi selanjutnya pada kecepatan 1%+++ selama 1+ menit akan mengendapkan

massa D ! ini didasar tabung sentri&ugasi dan meninggalkan plasmid murni dalam supernatant.

$enambahan ; !se ! (ribonuklease) dan SDS di bu&&er pertama ($1) menyebabkan

sebagian besar protein dan ; ! menjadi tidak larut dan dapat dihilangkan pada tahap sentri&ugasi

(ikut mengendap bersama massa D !, dinding serta debris sel lainnya). Karena metode inimenggunakan metode denaturasi alkali maka keuntungannya ialah tidak diperlukan presipitasi

menggunakan &enol atau pelarut organic seperti kloro&orm untuk menghilangkan sisa protein.

Supernatan yang berisi plasmid murni kemudian dicuci dua kali menggunakan bu&&er $/

yang isinya mengandung isopropanol dan bu&&er $2 yang mengandung : 1++> ethanol.

Kemudian supernatant plasmid kemudian dipindahkan ke tabung mikrosentri&uge baru dan dielusi

sebanyak kali dengan bu&&er 2/ )Elution Bu""er# dimana masing masing melewati sentri&ugasi

pada 1%+++ rpm selama satu menit. <asil elusi inilah D ! plasmid p-"1 yang telah berhasildiisolasikan dari E.coli C71+

2.3. Startegi Pen,i)i an In)ert Gen A o tin ke +ala! ektor Pla!i+ U%1&

$enambahan alkalin &os&atase pada larutan vektor penambahan insert penambahan bu&&er penambahan air (pelarut) penambahan D ! ligase inkubasi campuran larutan

Penam%ahan a"ka"ine phosphatase ke !a"am "arutan ektor

$enambahan alkalin &os&atase pada larutan vektor (sebelum dicampur dengan insert ) untuk

menghilangkan gugus $ pada 6@$ sehingga menjadi 6@'< (de&os&orilasi) sehingga dapat

meminimalisasi terjadinya kemungkinan vektor menyambung pada vektor itu sendiri atau vektor

menyambung dengan vektor lain (terjadi ligasi antar vektor) (0ampiran 8). Dengan berubahnya 6@$

menjadi 6@'< maka yang diharapkan terjadi yaitu vektor hanya berikatan dengan insert , %@'< pada

vektor akan menyambung pada 6@$ insert , akan tetapi %@'< insert tidak dapat menyambung ke

vektor karena 6@$ vektor telah berubah menjadi 6@'< sehingga terjadi nick atau celah. 7eskipun



1

terjadi celah, insert dan vektor tetap berikatan dan dapat ditrans&ormasikan dimana celah ini nanti

akan diperbaiki di dalam sel apabila berhasil ditrans&ormasikan (3ambar 8).

Ga!*ar /. $ekani)!e E0i)ien)i Liga)i

(Sumber. !nam, Khairul. ++ . 0aporan $raktikum 3enetika 7olekular5 D ! ;ekombinasi. Sekolah $ascasarjana

/ioteknologi, ?nstitut $ertanian /ogor)

Penam%ahan %uffer

4ungsi bu&&er adalah untuk mempertahankan p< pada nilai tertentu agar D ! tidak

terdegradasi dengan penambahan bahan lainnya. -mumnya digunakan bu&&er yang mengandung

! $ karena sebagian besar enBim restriksi bu&&er akan bekerja jika dilengkapi dengan ! $. /u&&er

biasanya diberikan atau disiapkan sebagai konsentrat 1+H yang, setelah pengenceran, konsentrasi! $ menghasilkan sekitar +, 6*1 m7. <al ini juga disesuaikan dengan penggunaan pelarut dan

enBim yang akan ditambahkan pada langkah selanjutnya sehingga tercipta kondisi yang sesuai

untuk proses ligasi &ragmen D ! )insert# dengan vektor.

Penam%ahan air (pe"arut)

-mumnya pelarut yang digunakan adalah dd< ' )double-distilled &ater# karena dapat

melarutkan D ! atau ; ! dengan baik. dd< ' atau disebut juga a*ua bidestillata atau ultrapure&ater , adalah air yang sangat murni, lebih murni dari aIuadest atau pun air reverse osmosis karena

telah melalui berbagai macam cara pemurnian. Secara umum dd< ' dibuat dengan melewatkan

aIuadest ke dalam suatu cartridge berisi resin*resin &ilter dan deionisasi untuk menghilangkan ion*

ion dari air, hingga diperoleh nilai hantaran listrik yang sangat kecil (sekitar 6.6 J 1+ : SLm 1 atau

1 7M cm), terakhir air tersebut dilewatkan melalui &ilter membran dengan pori*pori +. Nl.

/iasanya dd< ' tidak perlu disterilkan lagi menggunakan autoclave.

$enambahan dd< ' adalah untuk pemurnian dan proses vakum. Selain itu penambahan

dd< ' juga memiliki e&ek positi&, yaitu tidak mengandung 2D ! seperti pelarut 2 /u&&er

(campuran antara larutan ris*<"l dengan 2D !). 2D ! merupakan chelating agent yang dapat



1%

membentuk senyawaan kompleks dengan ion logam seperti 7g O dan menghambat aplikasi

enBimatis. amun penambahan dd< ' memiliki e&ek negati& yakni timbul peluang untuk

berubahnya p<. ?ni dapat terjadi karena D ! dan ; ! memiliki si&at asam lemah. yang dalam

waktu lama dapat menyebabkan degradasi D !=; !, apalagi D ase juga bekerja pada p< yang

sedikit asam. 'leh karena itu dilakukan penambahan bu&&er di awal.

Penam%ahan DNA Li$ase

D ! ligase ditambahkan paling akhir karena kondisi larutan telah disesuaikan terlebih

dahulu agar ligasi dapat berjalan e&ekti&. D ! ligase merupakan enBim yang mengkatalisis

pembentukan ikatan &os&odiester antara ujung 6@*&os&at dan %@*hidroksil pada D ! yang mengalami

nick. +ick pada D ! dapat terjadi pada saat replikasi D !, rekombinasi dan kerusakan.

Cenis D ! ligase yang digunakan pada kloning umumnya adalah 8 D ! 0igase yaituenBim ligase yang dihasilkan oleh bakteri E. coli yang telah terin&eksi virus 8. 2nBim ini akan

meligasi &ragmen D ! yang menggantung, memiliki ujung kohesi& (lengket) maupun ujung

tumpul. -ntuk meligasi &ragmen D ! yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enBim

yang lebih besar. Ko&aktor 8 D ! 0igase adalah ! $ sehingga proses ligasi D ! 8 memerlukan

larutan penyangga )bu""er# yang mengandung ! $ dengan konsentrasi +. 6*1 m7 seperti yang

telah ditambahkan sebelumnya.

7ekanisme D ! ligase dimulai darihidrolisis ko&aktor, yaitu ! $. $eristiwa ini

menghasilkan kompleks enBim*adenylate !7$

yang berikatan kovalen dengan grup P*amino

residu lysin pada sisi akti& dengan melepaskan

pyro"os"at inorganik ($$i). Kemudian sebagian

!7$ akan berpindah dari sisi akti& lysin ke ujung

bebas 6@*&os&at yang berada pada nick utas D !.

$ada akhirnya, ikatan &os&odiester akan terbentuk

antara ujung %@*'< yang berada di ujung nick

dengan 6@*&os&at dan melepaskan !7$ dan enBim

adenylate.

Inku%asi campuran "arutan

Suhu optimum aktivitas D ! ligase adalah pada suhu %AQ", tetapi pada suhu tersebut ikatan

hidrogen yang terbentuk di antara ujung lancip (lengket) menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat

panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut dan mengakibatkan denaturasi. 7aka, alternati& yang

Ga!*ar . $ekani)!e DNA Liga)e

(Sumber. http5==id.wikipedia.org=wiki=D !Rligase)



18

baik dilakukan dalam proses ini adalah inkubasi pada suhu yang diturunkan dengan waktu inkubasi

yang diperpanjang.

Suhu inkubasi optimal untuk 8 D ! ligase 1: +". amun hal ini biasanya dilakukan jika

diinginginkan e&isiensi yang tinggi dalam ligasi (contohnya dalam membuat pustaka genom), tetapi

jika ligasi bertujuan untuk kloning umumnya ligasi dilakukan pada suhu 8 " semalaman, atau pada

suhu ruang selama %+ menit hingga beberapa jam. $ada akhirnya terjadi trans&ormasi dan &ragmen

D ! yang diinginkan )insert# dapat disisipkan ke dalam molekul D ! (vektor).

2./. Strategi Pe!a)ukan Gen A o tin "eko!*inan ke +ala! E.co"i L*/(DE3)

Pemi"ihan %akteri Escherichia Co"i se%a$ai se" inan$ !a"am proses k"onin$ $en apoptin

Escherichia coli merupakan bakteri berbentuk batang dengan panjang sekitar micrometer dan diameter +.6 micrometer. /akteri ini umumnya hidup pada rentang +* 8+ +", optimum pada

%A+. E. coli ditemukan pertama kali oleh ,heodore Eschetrch pada tahun 1 6, dan hingga kini

bakteri ini menjadi salah satu tulang punggung dunia bioteknologi. <apir semua rekayasa genetika

di dunia bioteknologi selalu melibatkan E.coli , termasuk dalam proses kloning.

Escherichia co"i

Kingdom 5 Bacteria

$hylum 5 roteobacteria"lass 5 Gamma proteobacteria

'rder 5 Enterobacteriales

4amily 5 Enterobactericeae

3enus 5

Escherichia coli

Species 5 Escherichia coli

Ga!*ar . Koloni E.co"i

(Sumber. http5==en.wikipedia.org=e*coli, diakses pada+ September +1 , pukul .+ )



16

$emilihan E.coli sebagai host cell adalah karena bakteri ini memiliki laju pertumbuhan yang

cenderung lebih cepat, dapat dikultivasi pada medium kultur biasa, berbagai gen asing yang

mengkode protein target dapat diterima dan diekspresikan dengan baik oleh E.coli. amun

penggunaan E.coli sebagai host cell juga memiliki kelemahan, salah satunya adalah sinyal

transkripsi dan translasi spesies lain tidak dikenali dengan baik oleh inang E.coli , sehingga ekspresi

gen*gen heterolog di E.coli lemah. Selain itu, masalah serius pada ekspresi protein rekombinan pada

E.coli , yaitu degradasi protein produk secara cepat dan seringkali protein rekombinan justru

terakumulasi dan membentuk agregat kompak,yang bersi&at inakti& tidak larut (sehingga

menghambat proses puri&ikasi), yang disebut dengan badan inklusi ( inclusion bodies ). 2&ek lebih

buruk dari &enomena ini adalah protein dapat menjadi tidak akti&. <al ini terjadi karena keterbatasan

E.coli dalam membentuk struktur tiga dimensi protein secara benar dalam proses pelipatan pasca

translasi./akteri Escherichia coli merupakan bakteri gram negati& yang tahan hidup dalam media

yang kekurangan BatgiBi. amun susunan dinding sel bakteri gram negati& lebih kompleks daripada

sel bakteri gram positi&. /akteri gram negati& mengandung sejumlah besar lapisan lipoprotein,

lipopolisakarida, dam lemak (9alun, ++ ) (0ampiran 6). !danya lapisan*lapisan tersebut

mempengaruhi aktivitas kerja D ! rekombinan saat memasuki sel inangnya, dan memperlambat

waktu proses kloning, serta potensi untuk terjadinya kegagalan proses trans&ormasi lebih besar jika

dibandingkan dengan bakteri gram positi&, seperti Bacillus subtillis. E.coli memiliki banyak strain yang dapat digunakan dalam tahapan rekayasa genetika.

Setiap strain memiliki tingkat e&isiensi trans&ormasi yang berbeda*beda dan kemampuan untuk

mengekspresikan gen pengkode yang terdapat pada p-"1 .

Ta*el 2. Protein E0pression 1train Properties



1:

(Sumber. !nonim. +++. Competent Cell Clining and rotein Expression. +e& England Biolabs nc.

http5==www.neb.com=nebecomm=techRre&erence=pd&=brochures="ompetent"ell.pd&=. Diakses pada September

+1 , pukul %.1 )

$ada proses kloning gen apoptin ini, hots cell yang digunakan adalah E.coli /0 1(D2%).

Selain memiliki tingkat e&isiensi trans&ormasi yang cenderung lebih tinggi, /train /0 1(D2%)

memiliki gen λ

D2% pengkode A ; ! polimerase yang dapat mengekspresikan gen target pada

vektor ekspresi dengan induksi ?$ 3 ) sopropil thiogalaktosida#. ?nduksi dari A ; ! polimerase

pada E.coli /0 1 (D2%) akan mensintesis m; ! dalam jumlah yang tinggi. Dan pada sebagian

besar penelitian, akumulasi protein heterologus dalam jumlah tinggi juga dapat diperoleh.

/train tersebut juga memiliki mutasi on dan !mp, protease sehingga dapat meminimalisir

degradasi protein rekombinan yang terekspresi.Selain itu, sel inang yang digunakan dalam hal ini E.coli /0 1(D2%), adalah bakteri yang

diperoleh pada tahap logaritmik )log phase# karena pada tahap ini masih ada kesempatan bagi sel

inang untuk membelah dan memperbanyak dirisehingga ada peluang bagi plasmid yang diperoleh

menjadi lebih banyak sebelum disebar pada media (0ampiran :).

Pem%uatan %akteri kompeten

Sebelum dilakukan proses trans&ormasi, terlebih dahulu E.coli /0 1(D2%) harus dibuat

kompeten. Keadaan kompeten adalah keadaan dimana bakteri )host cell# siap untuk dimasukin oleh

materi genetik asing. $embuatan bakteri kompeten dilakukan dengan penambahan larutan "a"l ,

sehingga mengingkatkan kemapuannya untuk mengambil D !. 0arutan "a"l dalam keadaan

dingin e&ekti& untuk memperlemah dindig sel dan meningkatkan permeabilitasnya sehingga mudah

mengikat D !. Dinding sel yang dilindungi oleh lipoproteindengan plasmid yang sama*sama

bermuatan negati& akan sulit untuk menempel. $enambahan larutan "a"l membantu mengubah

si&at permeabilitas sel.

/akteri yang tadinya terdapat pada bagian pelet kemudian diresuspensi kembali dengan

larutan 7g"l . 7g O dapat menurunkan kerapatan membran. <al ini dikarenakan adanya interaksi

antara mineral tersebut dengan bagian hidro&ilik membran. 7elalui hasil ini dapat diketahui bahwa

penamabahan 7g"l berperan dalam mengganggu kestabilan membran sel E.coli /0 1(D2%).

Transformasi $en apoptin rekom%inan ke !a"am E.co"i L/*(DE3)

ahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan trans&ormasi,

karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahansi&at tertentu setelah dimasuki molekul

D ! rekombinan.



1A

eknik trans&ormasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1 A+ oleh 7. 7andel dan !.

<iga, yang melakukan trans&ormasi bakteri E.coli . <al terpenting yang ditemukan oleh 7andel dan

<iga adalah perlakuan kalsium klorid ("a"l ) yang memungkinkan sel*sel E. coli untuk

mengambil D ! dari bakterio&ag λ

. $ada tahun 1 A S. . "ohen dan kawan*kawannya

menemukan bahwa sel*sel yang diperlakukan dengan "a"l dapat juga mengambil D ! plasmid.

4rekuensi trans&ormasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan D ! dicampur di dalam

larutan "a"l pada suhu + hingga 6Q". $erlakuan kejut panas antara %A dan 86Q" selama lebih

kurang satu menit yang diberikan setelah pencampuran D ! dengan larutan "a"l tersebut dapat

meningkatkan &rekuensi trans&ormasi tetapi tidak terlalu esensial. 7olekul D ! berukuran besar

lebih rendah e&isiensi trans&ormasinya daripada molekul D ! kecil.

7ekanisme trans&ormasi belum sepenuhnya dapat dijelaskan. amun, setidaktidaknyatrans&ormasi melibatkan tahap*tahap berikut ini. 7olekul "a"l akan menyebabkan sel*sel bakteri

membengkak dan membentuk s&eroplas yang kehilangan protein periplasmiknya sehingga dinding

sel menjadi bocor. D ! yang ditambahkan ke dalam campuran ini akan membentuk kompleks

resisten D ase dengan ion*ion "a Oyang terikat pada permukaan sel. Kompleks ini kemudian

diambil oleh sel selama perlakuan kejut panas diberikan. $emberian kerjutan panas )heat shock#

yang diikuti pendinginan akan menjadikan dinding sel kembali seperti semula.

Secara garis besar, sebenarnya ada dua teknik yang dapat digunakan untuk memasukkan

D ! rekombinan ke dalam sel inangnya, yakni chemical trans"ormation , menggunakan metode

heat shock (seperti yang telah dijelaskan sebelumnya) atau e lectroporation , menggunakan kejutan

listrik. Dalam teknik kloning gen apoptin menggunakan vektor plamid dan E.coli /0 1(D2%)

sebagai host cell , teknik trans&ormasi yang digunakan adalah chemical tran"ormation . /erikut

adalah protokol yang dilakukan dalam tahapan trans&ormasi gen apoptin rekombinan.



1

Ga!*ar . Ske!a ta-a an tran)0or!a)i

(Sumber. !nonim. +1+. ,rans"ormasi% Ekspresi Gen Asing dalam /el Bakteri. http5==sciencebio* tech.net=trans&ormasi*

ekspresi*gen*asing*dalam*sel*bakteri= diakses pada September +1 , pukul %.88)

Sebagai perbandingan, selain teknik Theat*shock@, sejak tahun 1 + telah digunakan teknik

Telektro&orasi@ yaitu dengan mengejutkan sel bakteri dengan medan listrik berkekuatan tinggi (1+* +

k#=cm). Saking terkejutnya, akan terbentuk lubang*lubang pada dinding sel yang bisa diterobos

D ! p-"1 berukuran besar dan kemudian lubang tersebut akan tertutup dengan sendirinya

(0ampiran A).

#en$i!entifikasi k"on 2an$ !iin$inkan

$ada saat proses trans&ormasi, D ! yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya D !

rekombinan, maka dari itu harus dilakukan seleksi untuk memilih sel inang trans&orman yang

membawa D ! rekombinan. Selanjutnya, diantara sel*sel trans&orman yang membawa D !

rekombinan, kita juga harus melakukan seleksi untuk mendapatkan sel D ! rekombinannya

membawa &ragmen sisipan atau gen yang dinginkan, dalam hal ini gen apoptin.

7enurut 7uladno ( ++ ) dalam proses trans&ormasiada tiga kemungkinan yang dapat

terjadi setelah tahapan trans&ormasi dilakukan, antara lain 5

a) sel inang tidak dimasuki D ! apa pun atau berarti trans&ormasi yang dilakukan gagal b) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagalc) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan atau tanpa &ragmen sisipan atau gen apoptin

yang diinginkan.

-ntuk membedakan antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan si&at yang

terjadi pada sel inang. Cika sel inang memperlihatkan dua si&at marker vektor, maka dapat

dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya, untuk membedakan antara

http://sciencebiotech.net/transformasi-ekspresi-gen-asing-dalam-sel-bakteri/







1

kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula perubahan si&at yang terjadi pada sel inang. Cika sel

inang hanya memperlihatkan salah satu si&at di antara kedua marker vektor, maka dapat dipastikan

bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

7enemukan sel yang mengandung hasil insersi yang diinginkan diantara semua sel

perpustakaan genomik merupakan kerja yang sulit. $roses tersebut melibatkan penelusuran semua

sel rekombinan atau &ag yang diperoleh dari trans&ormasi atau transduksi untuk menemukan klon

yang diinginkan. $roses ini dinamakan dengan proses screenin$ . Kemungkinan menemukan

&ragmen gen yang diinginkan dalam sebuh perpustakaan gen tertentu bisa diestimasi melalui rumus

berikut ini.

N = ln (1− P )

ln(1 − 1n )

… (1)

dimana adalah jumlah rekombinan yang perlu discreening, n adalah rasio ukuran genom

organisme relati& terhadap ukuran &ragmen rata*rata dalam perpustakaan gen, $ sama dengan

probabilitas (apabila p U +. 6 berarti ada 6> kemungkinan untuk menemukan klon tersebut).

Contoh.

Kelompok kami melakukan proses kloning gen apoptin yang diisolasi dari chicken anemia

virus , menggunakan plasmid sebagai vektornya. -kuran genom apoptin hasil trans&ormasi adalah1,8 G 1+% kb dan ukuran rata*rata &ragmen perpustkaan adalah ,% kb. $erpustakaan genomik

dibuat dalam vektor*vektor yang ditrans&ormasi ke dalam sel*sel bakteri E. coli /0 1(D2%).

Dengan propabilitas 6>, berapa banyak koloni bakteri rekombinan yang harus discreening untuk

menemukan &ragmen gen apoptin tersebutV

0angkah1 5 mencari nilai n (rasio ukuran genom organisme relati& terhadap ukuran &ragmen

rata*rata dalam perpustakaan gen)

n = 1,4 × 103

kb2,32 kb = 6,034 × 10 2

Kemudian, + (jumlah sel rekombinan yang perlu discreening guna menemukan setidaknya

satu sel yang mengandung gen apoptin) bisa dihitung.

0angkah 5

N = ln (1− 0,95 )

ln(1− 1

6,034 × 10 2)



+

N = ln (0,05 )ln (1 − 0,00165714 )

N = ln (0,05 )ln (0,998434 )

N =

− 2,995832− 0,001658517

= 1806

Cadi, sekitar1 ++ koloni bakteri yang diperoleh dari trans&ormasi yang harus discreening

guna menemukan &ragmen gen apoptin dengan tingkat propabilitas yang diharapkan sekitar 6>.

Cika ukuran rata*rata insersi perpustakaan gen lebih besar, maka jumlah yang harus di*screening

akan menurun. Sebaliknya, jika ukuran genom lebih besar, maka semakin banyk koloni yang harus

di*screening guna menperoleh keberhasilan. ;umus ini bisa bekerja sebagai panduan untuk mebuatestimasi jumlah klon yang harus di* screening.

7etode screening ynag digunakan pada teknik kloning apoptin ini adalah dengan blue*white

screening. !lasan penggunaan metode ini adalah karena vektor yang digunakan adalah plasmid

p-"1 yang memiliki semua elemen terkait metode ini.

$ada awalnya, yang harus dilakukan adalah memastikan apakah di dalam 2.coli

/0 11(D2%) hasil trans&ormasi benar*benar memiliki hasil rekombinan dari proses trans&ormasi.

Seperti yang kita ketahui, bahwa pada umumnya, bakteri tidak dapat hidup pada media yang

mengandung antibiotik. -ntuk itu pada D ! plasmid p-"1 yang ditran&ormasikan terdapat gen

panyandi antibiotik resisten, yakni gen ampicilin resisten (amp;) agar bakteri host W E.coli

/0 1(D2%)X menjadi tahan hidup di media yang mengandung antibiotik.Cadi bakteri yang tidak

disisipi plasmid akan mati dengan sendirinya. $ermasalahan berikutnya adalah bagaimana

menentukan host cell yang plasmidnya memiliki gen apoptin atau tidakV <arus selalu diingat bahwa

tahapan ligasi tidak 1++> berhasil menyambungkan vektor dan insertnya. /isa saja vektor tersebut

berligasi sendiri ( vector sel"-ligation ), atau justru insert yang berligasi sendiri ( insert sel"-ligation ).

$ada kasus ini, gen apoptin ( insert ) disisipkan di pertengahan gen lacF yang merupakan

penyandi lacF*Y subunit dari enBim *galaktosidase. 2nBim ini dapat memecah substrat seperti H*

gal (suatu galaktosa yang dimodi&ikasi) menjadi galaktosa dan pre*chromophore 6*bromo*8*chloro*

%*hydroGyindole, yang selanjutnya dioksidasi menjadi 6,6@*dibromo*8,8@*dichloro*indigo yang

berwarna biru (3ambar ).



1

Ga!*ar 4. $ekani)!e +egra+a)i 56gal ole- 6galakto)i+a)e(Sumber. http5==biochem.ariBona.edu, diakses pada September +1 , pukul ++.+A)

Cika gen 0acF masih utuh, maka koloni bakteri E.coli /0 1(D2%) akan berwarna biru akibat

pengaruh Bat warna indigo yang dihasilkan. etapi jika insert berhasil disisipkan (diligasikan)

dengan vektor, otomatis gen lacF*nya akan terdisrupsi alias rusak dan ujung*ujungnya tidak mampu

menghasilkan indigo yang berwarna biru, sehingga koloni akan berwarna putih. Cadi hanya koloni

putih yang timbuh pada media yang mengandung antibiotik dan H*3al saja yang kemungkinan

mengandung gen apoptin yang ditrans&ormasikan. ?nilah mengapa proses ini dinamakan blue*whitescreening (3ambar ).



Ga!*ar &. Pro)e) liga)i in)ert6 la)!i+

(Sumber. http5==biochem.ariBona.edu, diakses pada September +1 , pukul ++.1 )

7enurut 7angunwardoyo ( ++ ) trans&orman yang dihasilkan ada yang berwarna biru dan

putih atau putih berubah menjadi biru, adanya warna biru karena senyawa H*gal dalam medium.

<al ini terjadi karena adanya PP*komplementasi di mana vektor plasmid p-" 1 pada bagian poli*

lingkernya masing*masing mengkode 18: asam amino dari ZZ galaktosidase (ZZ*gal), sedangkan

inangnya mengkode bagian "*terminal dan merupakan komplemen dari ZZ*gal. Cika gen penyandi

amino terminal ZZ*gal dari vektor plasmid dirusak dengan adanya &ragmen D !, maka protein ZZ*

gal tidak terbentuk, hal ini menyebabkan koloni berwarna putih pada medium yang mengandung H*

gal, sedangkan koloni yang melakukan komplementasi berwarna biru. Davis et al. (1 8)

menyebutkan terjadinya perubahan koloni yang berwarna putih menjadi biru kembali, kemungkinan

disebabkan adanya pergeseran kerangka baca )"rameshi"t# dari protein, atau mungkin disebabkan

adanya aktivitas eksonuklease yang memotong &ragmen tersebut.

Selain metode blue*white screening terdapat pula metode hibridisasi untuk menseleksi klon

rekombinan yang kita inginkan. $ada dasarnya metode ini menggunakan probe D ! berlabel untuk

menandai klon yang memiliki D ! target (0ampiran ). $robe ini sebelumnya dibuat melalui

teknik $"; untuk menghasilkan sebuh potongan D ! berantai tunggal yang tersusun atas sekuens

yang komplementer dengan sebagian gen yang dinginkan. Karena metode ini cenderung memakan

waktu lebih lama karena harus melalui teknik $"; terlebih dahulu, maka kelompok kami

menggunakan teknik blue-&hite screening sebagai strategi pen*seleksian.

2. . Strategi Panen ' ar est ( +an Pe!urnian Gen A o tin Ha)il Kloning

Seteleh berhasil menseleksi E.coli /0 1(D2%) yang mengandung plasmid rekombinan,maka dilakukanlah proses harvesting, dimana hasil dari blue*white screening disentri&ugasi. Dari



%

hasil sentrigugasi ini, kemudian diambil supernatannya untuk kemudian dimurnikan. eknik

pemurnian yang digunkan adalah ?7!" ) mmobili0ed $etal A""inity Chromatography#. eknik ini

cocok dengan strategi kloning yang sebelumnya digunakan karena teknik ini menggunakan

senyawaa pengkelat yang terikat secara kovalen pada Bat padat pendukung kromatogra&i dan Bat

padat ini mengikat ion logam. $rinsip ?7!" yaitu interaksi reversible anatara beberapa ranatai

samping asam amino dan immobiliBed ion metal.

3en apoptin yang direkayasa sebelumnya mengandung histidin pada ujung *terminalnya.

Kehadiran <is* ag ini menga&ilitasi proses pemurnian protein berdasarkan a&initas selekti& protein

dengan polihistinin tersebut terhadap adsorben yang dilengkapi pengkelat metal seperti i O atau

"o O. ?nteraksi anatra residu histidin dengan ion logam ini bersi&at reversibel dan protein yang

terikat dapat dielusi dengan imida0ole atau dengan merendahkan nilai p<. Karena imida0ole

indentik dengan rantai samping histidin, maka pada saat konsentrasi imida0ole ditingkatkan,imida0ole akan menggantikan posisi pilihistidin pada resin, dan polihistidin akan terleusi keluar.

Sehingga diperolehlah protein gen apoptin murni.

Ga!*ar 17. $ekani)!e er!urnian rotein +engan I$A%

(Sumber. http5==www.rsc.org=ej=! = ++ =b + %66g=b + %66g*s1.gi& , diakses pada %+ September +1 , pukul . )

Sebagai pembanding, teknik lain yang dapat digunakan dalam proses pemurnian adalah ion-

exchange chromatography dengan prinsip ikatan ionik antara asam amino dengan cation'anion

exchange atau gel "iltration chromatography dengan prinsip Ttrapping@ molekul protein di dalam

sebuah gel sebagai &ase stasioner dari kolom kromatogra&i.

http://www.rsc.org/ej/AN/2008/b802355g/b802355g-s1.gif

http://www.rsc.org/ej/AN/2008/b802355g/b802355g-s1.gif



8

BAB III

KELEBIHAN DAN KELE$AHAN ST"ATEGI 8ANG DIGUNAKAN

3.1. $eto+e I)ola)i

Dalam melakukan isolasi apoptin, kami memilih menggunakan metode pemisahan ekstraksi&enol kloro&orm. -mumnya &enol*kloro&orm disiapkan dalam bentuk campuran &enol*kloro&orm*

isoamil alkohol dengan perbandingan volume 65 851. "ampuran &enol*kloro&orm adalah campuran

yang homogen. 4enol*kloro&orm dan air tidak dapat bersatu sehingga akan terbentuk dua &ase yakni

&ase air (&ase aIueous) dan &ase &enol*kloro&orm.!ir adalah pelarut yang sangat polar, sedangkan &enol bersi&at kurang polar dibandingkan

dengan air. D ! adalah molekul polar yang disebabkan oleh adanya gugus*gugus &os&at dalam

kerangkanya. <al ini membuat D ! sangat larut dalam air dan kurang larut dalam &enol. Ketika

isolat D ! yang larut dalam air dicampurkan dengan &enol, D ! tidak akan larut dalam &enol,

namun tetap berada dalam &ase air.$rotein memiliki si&at yang berbeda dari D !. $rotein adalah polimer rantai panjang

polipeptida yang tersusun atas berbagai macam asam amino. !sam amino ada yang bersi&at polar

(seperti glutamat, lisin dan histidin) karena memiliki residu yang bermuatan, dan ada juga asam

amino yang non polar (seperti &enilalanin, leusin dan tripto&an) akibat residunya yang tak

bermuatan. Dalam lingkungan berpelarut air, rantai polipeptida melipat sedemikian rupa sehingga

residu*residu asam amino yang kurang polar daripada air akan berada di sisi dalam protein (jauhdari air), sedangkan rantai samping asam amino yang polar akan tertata pada sisi luar protein,

berikatan dengan air. Dengan kata lain residu*residu asam amino yang polar bersi&at hidro&ilik

([suka air\), dan yang non polar bersi&at hidro&obik ([takut air\). 7aka, ketika dicampurkan dengan

&enol, protein terekspos dengan pelarut yang kurang polar, sehingga pola pelipatannya protein

berubah. $ada dasarnya dalam kondisi tersebut residu*residu asam amino dari protein akan bertukar

tempat. ;esidu yang kurang polar yang tadinya tersembunyi di sisi dalam protein ketika berada

dalam pelarut air, kini mendesak menuju ke sisi luar untuk berinteraksi dengan pelarut &enol.

Sebaliknya, residu*residu asam amino yang polar akan terselip ke sisi dalam protein, berlindung

dari &enol. Dalam waktu singkat, protein mengalami denaturasi akibat perubahan pola pelipatannya.

;esidu non polar yang kini berada di sisi luar protein yang terdenaturasi membuat protein tersebut

lebih larut di dalam &enol daripada di dalam air. <al inilah yang mendasari proses pemisahan D !

dari protein dalam metode ekstraksi &enol. $rotein akan terpisah di &ase &enol, sedangkan molekul

D ! yang polar tetap berada pada &ase air.Kelebihan dan kekurangan yang ditawarkan bila dibandingkan dengan metode pemisahan

dengan kolom adsorpsi adalah 5

$eto+e Kele*i-an Kekurangan



6

$henol * chloro&ormD ! yang didapatkan

lebih murni

]aktu yang dibutuhkan lebih

lama.

Kolom adsorpsi]aktu yang dibutuhkan

lebih cepat

ada kemungkinan hasil isolasi

D ! masih terkontaminasi (polisakarida dan protein).

3.2. $eto+e Sekuen)ing DNADalam melakukan sekuensing atau pemetaan D !, digunakan metode sanger atau

Sekuensing dengan dideoksi. 7etode Sanger pada dasarnya meman&aatkan dua si&at salah satu

subunit enBim D ! polimerase yang disebut &ragmen klenow. Kedua si&at tersebut adalah

kemampuannya untuk menyintesis D ! dengan adanya d $ dan ketidakmampuannya untuk

membedakan d $ dengan dd $. Cika molekul d $ hanya kehilangan gugus hidroksil ('<)

pada atom " nomor gula pentosa, molekul dd $ atau dideoksi nukleotida juga mengalami

kehilangan gugus '< pada atom " nomor % sehingga tidak dapat membentuk ikatan &os&odiester.

!rtinya, jika dd $ disambungkan oleh &ragmen klenow dengan suatu molekul D !, maka

polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. /asa yang terdapat pada ujung molekul

D ! ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul dd $.Selain metode Sanger, dikenal juga metode 7aGim 3ilbert. $ada metode ini &ragmen*

&ragmen D ! yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan

&os&at radioakti& atau suatu nukleotida pada ujung %@. 7etode 7aGam*3ilbert dapat diterapkan baik

untuk D ! untai ganda maupun D ! untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesi&ik yang

dilakukan dalam dua tahap.Kelebihan metode Sanger bila dibandingkan dengan teknik sekuensing D ! 7aGim

3ilbert adalah 5

$eto+e Kele*i-an Kekurangan

7etode Sanger

• 7udah dilakukan• idak menggunakan bahan

yang mudah merusak sampel

hanya e&ekti& diterapkan pada D !

rantai tunggal.

7etode 7aGim

3ilbert

Dapat diterapkan pada D !

rantai tunggal maupun rantai

ganda.

7enggunakan reagen kimia dalam

menentukan pembelah spesi&ik D !.

3.3. $eto+e I)ola)i Pla)!i+-ntuk mengisolasi plasmid, digunakan metode denaturasi dengan alkali. Secara singkatnya,

sel yang akan diambil bagian plasmidnya diambil dengan mengguanakan sentri&ugasi, diinkubasi

dengan menggunakan lysosim bu&&er, dan diperlakukan dengan menggunakan alcaline



:

detergent. $rotein yang terlarut dan membran dipresipitasi dengan menggunakan

presipitate lysat dibersihkan dengan &iltrasi dari presipitat melalui cheesecloth dan kemudian

disentri&ugasi. Dengan menggunakan metode denaturasi alkali, bakteri akan melisis sehingga dapat

diambil plasmidnya, dan tidak diperlukannya pemurnian lanjutan.

3./. Tran)0or!a)i Unit

-ntuk trans&ormasi unit, digunakan metode heat shock. rans&ormasi unit adalah ekspresi

materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel. $ada dasarnya dinding sel ber&ungsi

melindungi sel dari masuknya benda*benda asing termasuk D !, tapi dalam kondisi tertentu,

dinding sel ini bisa memiliki semacam celah atau lubang yang bisa dimasuki D !. Sebetulnya ada

lebih dari 1> spesies bakteri mampu melakukan trans&ormasi secara alami. Dimana mereka

memproduksi protein*protein tertentu yang dapat membawa D ! menyeberangi dinding

sel. Dengan melakukan teknik T heat-shock T ^ mendinginkan, memanaskan dan mendinginkan

kembali bakteri, maka D ! dapat masuk ke dalam sel. 7elakukan metode dikejutpanaskan ( heat

shock ) pada suhu 8 " selama 86 detik akan membuat membran sel akan tertutup kembali karena

terjadi perubahan suhu yang mendadak dari suhu rendah ke suhu tinggi. Dengan metode ini,

kesterilan kerja dan kontaminasi sel akan terminimalisir.

3. . Selek)i Klon "eko!*inan

-ntuk seleksi klon rekombinan, digunakan metode blue white screening. /lue whitescreening adalah teknik untuk mendeteksi ligasi yang sukses dilakukan dalam vektor gen kloning.

#ektor tersebut nantinya ditrans&ormasi dalam sel kompeten, pada kasus ini yaitu bakteri. Sel yang

kompeten tadi nantinya ditempatkan pada H * gal. bila ligasi yang dihasilkan sukses, koloni bakteri

akan berwarna putih dan bila tidak berhasil akan berwarna biru. Kelebihan yang ditawarkan oleh

teknik ini adalah metodenya mudah dilakukan dan cepat. Dalam kasus ini digunakan metode blue

white screening karena plasmid p-" 1 yang memiliki gen lacF.

DA9TA" PUSTAKA

!nam, Khairul. ++ . (aporan raktikum Genetika $olekular1 2+A 3ekombinasi . Sekolah

$ascasarjana /ioteknologi, ?nstitut $ertanian /ogor.

!nonim. p4C 56 dan p4C 57 .http5==www.&ermentas.com=en=products=all=molecular*cloning=vectors*

phage=sd++6*puc1 *puc1 *dna . diakses pada tanggal September +1 pukul 1+.++ ]?/

http://www.fermentas.com/en/products/all/molecular-cloning/vectors-phage/sd005-puc18-puc19-dna






A

!nonim."7# 2Gpression $lasmid with the p-"1 7"S * pS4*"7#*p-"1

7"S .http5==www.oG&ordgenetics.co.uk=polylinkers=ps&*cmv*puc1 mcs*detail.diakses pada

tanggal September +1 pukul 1A.++ ]?/

!nonim. lasmid 2+A puri"ication .http5==www.taI*dna.com=plasmid*dna*puri&ication*

R8++.html.diakses pada tanggal September +1 pukul 1A.++ ]?/

!nonim. 2+A puri"ication .

http5==www.promega.com=_=media=&iles=resources=paguide=letter=chap .pd&VlaUen. Diakses

pada tanggal september pukul 1+.++ ]?/.

!nonim. /ection G Gene $anipulation . Southwest -niversity.

3a&&ar S. ++A. Buku A8ar Bioteknologi $olekul . /andung5 -niversitas $adjajaran.

Cusu& 7. ++1. Genetika /truktur dan Ekspresi Gen . /ogor5 Sagung Seto.

7eng*Shiou 0ee, 4.*". S.*<.*9.*<.*<.*S.*C.*9. ( +1 ). 2&&icient $roduction o& an 2ngineered!poptin &rom "hicken !nemia #irus in a ;ecombinant 2. coli &or umor herapeutic

!pplications. B$C Biotecnology , 18A *18 :.

7uladno. ++ . /eputar ,eknologi 3ekayasa Genetika . /ogor 5 $ustaka ]irausaha 7uda. 1 % pp.

7uslih. (aporan praktikum Biologi $olekuler . http5==muslih.edublogs.org=&iles= +1+=+%=praktikum

*biomolRmuslih.pd&

eGt3en Sciences. ( ++6). Guide to hight e""iciency trans"ormation . http5==wol&son.huji.ac.il

=eGpression=procedures=bacterial=competentRcells> +RguideRv%.pd& . Diakses pada +September +1 , pukul %. .

Schaum. +1+. Genetika% Edisi 9eempat . Cakarta 5 2rlangga.

Stans&ield ]D, "olome CS, "ano ;C. ++%. ,heory and roblems o" $olecular and Cell Biology.

ew 9ork5 7c3raw*<ill "ompanies.

9alun. ( ++ ). $engenal bakteri Escherichia coli. http5==yalun.wordpress= ++ =1+=+A=Rmengenal*

bakteri*escherichia*coli=. Diakses pada + September +1 , pukul .+1.

http5==sil&iadahnia.blogspot.com= +11=1 =enBim*ligase.html

http5==www.neb.com=nebecomm=products=productb+ + .asp

http5==sciencebiotech.net=te*bu&&er*vs*ddh o=

http5==www.neb.com=nebecomm=productsRintl=protocol:6 .asp

http://www.oxfordgenetics.co.uk/polylinkers/psf-cmv-puc19mcs-detail



http://www.promega.com/~/media/files/resources/paguide/letter/chap9.pdf?la=en


http://wolfson.huji.ac.il/expression/procedures/bacterial/competent_cells%20_guide_v3.pdf








LA$PI"AN

La! iran 1. Ka )i+ Chicken Anemia Virus

(Sumber. ictvdb.bio*mirror.cn)

La! iran 2. $eto+e Sanger

(Sumber.scI.ubc.ca)



La! iran 3. Per*e+aan $%S U% 14 +an U% 1&

(Sumber. http5==www.&ermentas.com=en=products=all=molecular*cloning=vectors*phage=sd++6*puc1 *puc1 *dna)

La! iran /. Penggunaan a"ka"ine phosphatase untuk !eng-in+ari religa)i a+a !olekul :ektor

(Sumber.!nonim. /ection G Gene $anipulation . Southwest -niversity)



%+

La! iran . Per*e+aan +in+ing )el *akteri Gra! negati0 +an Gra! o)iti0

(Sumber. http5==microbewiki.kenyon.edu=indeG.php=2scherichiaRcoli , diakses pada September +1 , pukul %.+ )

La! iran . Kur:a ,ang !engga!*arkan 0a)e ‐ 0a)e ertu!*u-an *akteri; "a$ phase4 "o$ phase4

stationar2 phase +an !eath phase

(Sumber. !nam, Khairul. +1+. http5==khairulanam.&iles.wordpress.com= +1+=+ =laporan*%*rekgen. pd& diakses pada

September +1 , pukul %.1A)

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Escherichia_coli


http://khairulanam.files.wordpress.com/2010/08/laporan-3-rekgen.pdf


http://khairulanam.files.wordpress.com/2010/08/laporan-3-rekgen.pdf



La! iran . Ske!a ro)e) tran)0or!a)i +engan !enggunakan !eto+e elektro0ora)i

(Sumber. !nonim. +1+. ,rans"ormasi% Ekspresi Gen Asing dalam /el Bakteri. http5==sciencebio* tech.net=trans&ormasi*

ekspresi*gen*asing*dalam*sel*bakteri= diakses pada September +1 , pukul %.88)

La! iran 4. Teknik -i*ri+i)a)i kloni(Sumber. Schaum. +1+. Genetika% Edisi 9eempat . Cakarta 5 2rlangga.)






Dokumen.tips Makalah Teknik Kloning Sederhana Gen Apoptin Menggunakan Vektor Plasmid Dan

Documents

Transcript of Dokumen.tips Makalah Teknik Kloning Sederhana Gen Apoptin Menggunakan Vektor Plasmid Dan