Manipulasi DNA Dan Vektor

7/23/2019 Manipulasi DNA Dan Vektor

http://slidepdf.com/reader/full/manipulasi-dna-dan-vektor 1/45

http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2009/06/cloning.jpg

http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2010/07/cloning.gif



Gen insulin dari pankreas manusia yang denganManipulasi DNA dapat dimasukkan ke dalam selbakteri –seperti E. coli – atau tumbuhan –sepertisafflower – dan diekspresikan di dalamnya sehingga

saat ini kita dapat memperoleh insulin (obat diabetes)tanpa harus mengekstraknya langsung dari sapi ataubabi, cukup dengan menumbuhkan bakteri atautanaman hasil rekayasa genetika yang memiliki geninsulin dan memanen insulin



Bakteri dan archaea umumnya mereka memiliki ‘guntingberupa en!im yang dapat memotong"motong DNA secaraspesi#ik$

Enzim ini berguna sebagai bentuk pertahananbakteri terhadap DNA-DNA asing yang masuk kedalam sel bakteri.

DNA asing ini akan dipotong-potong agar tidakakan membahayakan bakteri lagi oleh enzim yang

disebut Restriction Endonuclease‘

DNA si bakteri sendiri sudah terlindungi denganmekanisme tertentu (metilasi) sehingga akanterhindar dari pemotongan.



%n!im restriksi hanya akan memotong

DNA pada tempat tertentu sa&a,yaitu &ika ia menemukan susunan palindrom, urutan basa yang &ika dibaca darikedua utas DNA akan tetap sama$

Setiap enzim restriksi hanyadapat memotong pada susunanpalindrom tertentu. Misalnyaenzim Eco! akan beker"apd

urutan GAATTC# enzim Sma! padaurutan CCCGGG# enzim Alu! padaurutan AGCT# dan seterusnya.

$%-&A'A'-%

* * * * * *

%-'A'A&-$%



Menggunakanenzimendonukleaserestriksi

Ujung “lengket”

(sticky ends)Ujung “tumpul”(blunt ends)

Penamaan enzim EcoRI

E = genus( Escherichia)co = species (coli)R = strainI = o! enzyme



Ujung “lengket” dan“tumpul”

("lunt # $ticky ends)

http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2010/07/ch4f3.jpg



http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2010/07/ch4f3.jpg



%n!im DNA ligase beker&a

dengan menyambungkanutas DNA yang memilikiu&ung '"*+ dengan u&ung"*- pada utas lain

.&ung overhang pada utas

sense akan berpasangandengan u&ung overhang utasantisense$

DNA +igase membentuk

ikatan phosphodiestersehingga kedua utas kinimen"adi satu denganikatan yang sangat kuat

http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2010/07/DNA-Ligation.png



Pembentukanikatan-H padaujung-ujung yangkomplemen (sticky

ends)

Ligase membentukikatan fosfodiester

untuk merekatkanbenang-benangDNA



Molekul DNA dalam keadaan ds, dapat dibelah men&adidua$ Gerga&i yang digunakan untuk membelah DNA a$l$ airpanas (/001) atau Na*- 0,+ M$

embelahan DNA penting di dalam 2 roses 13

roses hibridisasi DNA untuk mendeteksi keberadaansuatu gen di dalam genom

Makin banyak komposisi basa G dan 1 maka semakinbesar energi yang diperlukan untuk membelah molekulDNA, karena &umlah ikatan hidrogen semakin banyak$



Diperlukan suatu waana (vehicle)

!kendaraan untuk memasukkan suatu

potongan DNA ke dalam sel agar DNA

tersebut dapat disimpan dan diperbanyak di

dalam sel tersebut "ektor

#eda kendaraan dengan "ektor$ %en yang dipindakan (dari manusia&

ewan&tumbuan& organisme lain

#iotransport)

'istem biotransport dapat diikuti denganteknik biokimia dengan tingkat akurasi * +onto "ektor , DNA plasmid



%&' bukan kromosomterdapat di dalam bakteri

Mampu bereplikasi sendiri

"entuknya benang ganda(double strands DNA,dsDNA) sirkular

Ukuran * jt sp +,, jt %alton

$i!at !enotip - ta.anter.adap antibiotika ta.anlogam berat memiliki genlac-Z.

Plasmid buatan ( Artifcialplasmids) dapat dibuatdengan menamba.kanpotongan/potongan %&'

lain



Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa

potongan DNA lain ke dalam sel bila memiliki,

eplikator (origin of replication)

Penanda (Marker ) yang muda diseleksi (misalnya

gen ketaanan teradap antibiotik) 'itus untuk mengklon (potongan DNA yang

memiliki urutan basa nukleotida yang menjadisasaran en.im restriksi tetapi tidak terletak di dalam

daera replikator atau penanda



http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2010/09/AMG27b_biochem-arizona-edu.gif



Bila suatu bakteri mengandung DNA plasmid dan gen4ac"5 ber#ungsi baik, ditempatkan di dalam mediamengandung 6"Gal (Modi#ikasi galaktosa) dan 78G,maka sel bakteri membentuk koloni biru/

,asil ekspresi gen +a- adalah enzim /-galatosidase#

dapat memeah substrat 0-gal men"adi galaktosadan pre-hromophore $-bromo-1-hloro--hydro2yindole# yang selan"utnya dioksidasi men"adi$#$3-dibromo-1#13-dihloro-indigo yang ber4arnabiru.

Bila gen 4ac"5 rusak maka bakteri membentuk koloni putihDengan melihat perubahan si#at yang ter&adi pada 9arna

koloni Dapat memonitor berhasil tidaknya plasmid

memba9a DNA asing



Plasmid yang %imiliki ole. Escherichia coli

Berasal dari plasmid

Potongan DNA tamb

Potongan DNA tamb



Khimera berasal dari mitologi 0unanimak.luk dengan tubu. gabungan daribagian/bagian mak.luk binatang lain

$etela. pemotongan plasmidmenggunakan suatu enzim restriksipotongan %&' asing yang memiliki ujungpemotongan yang sama dapat disisipkan

$etela. ujung/ujung plasmid danpotongan %&' asing disambung akan

di.asilkan 1plasmid rekombinan1 Plasmid rekombinan dapat bereplikasi

dalam sel inang yang sesuai



"ila diinginkan untukmenginsersikan potongan %&'asing dengan orientasi tertentu

%ilakukan dengan memotong %&' 2ektor maupun %&' sumber gen yang dike.endaki menggunakandua enzim restriksi yang berbeda



* 3ektor berupa plasmid

+ 3ektor berupa bakterio!aga

4 5osmid

6 "'5s ("acterial 'rti7cial

5.romosome) # 0'5 (0east 'rti7cial 5.romosome)



* Memiliki origin o! replication dari

inang yang dituju se.ingga

memungkinkan replikasi secara

independen ter.adap genom inang

+ Memiliki penanda selekti!-Memuda.kan seleksi sel pemba8a

plasmid tersisipi %&' asing

keta.anan ter.adap antibiotik ganda penapisan biru/puti.

4 Memiliki banyak situs pengkloningan

(multiple cloning sites M5$)



Plasmid



Keunggulan: 9ecil muda. pengerjaannya

$trategi seleksi muda.

"erguna untuk mengklon potongan%&' ukuran kecil (: *,kbp)

Kelemahan: 9urang berman!aat untuk mengklon

potongan %&' ukuran besar (;*,kbp)



Lengan kiri- Protein penyusun

kepala # ekor

Lengan kanan-

$intesis %&' Pengendalian

<isis inang

Daerah ang

dihilangkan: integrasi # eksisi

Pengendalian



3ektor berupa bakterio!aga( !ectors)



Keunggulan: "erman!aat untuk mengklon

potongan %&' ukuran besar (*, / +4

kbp) $eleksi berdasar ukuran

Kelemahan:

<ebi. sulit pengerjaannya



Keunggulan: "erman!aat untuk mengklon

potongan %&' berukuran sangatbesar (4+ / 6 kbp)

$eleksi berdasar ukuran Pengerjaan seperti plasmid

Kelemahan: >idak terlalu muda. untuk

mengerjakan plasmid dengan ukuransangat besar (? @, kbp)

Aabungan si!at 2ektor plasmid dan

si!at berguna dari situs cos(di.ilangkan pada 2ektor )



3ektor5osmid



B'P



Replikasi dimediasi ori$ dan oriC

par ' and par "mengendalikanagar .anya terdapatsatu 2ektor dalam

sel Menggunakan

penanda keta.ananter.adap

9.loram!enikolR



%apat disisipi gen asing +,, / +,,,kbp dan dimasukkan ke dalam yeast

telomere telomerecentromere

URA3 ARS HIS3

replicationorigin

markers

largeinserts



Keunggulan: %apat digunakan untuk mengklon potongan

%&' dengan ukuran sangat besar (*,, / +,,,kbp)

Penting digunakan dalam proyek penetapanurutan basa nukleotida total genom

Kelemahan: >idak muda. mengerjakan molekul %&'dengan ukuran sangat besar

"A#s - "acterial 'rti7cial5.romosomes

$A#s - 0east 'rti7cial

5.romosomes



3ektor yang dapat digunakan untuk dua macam

inang (memiliki origin o! replication dari masing/masing inang)



Ukuran %&' yangdisisipkan Ukuran 2ektor $itus enzim

restriksi yang

tersedia Dumla. salinan

(copy number) C7siensi kloning

9emampuan untukmenapis %&'sisipan

Rencana penelitianselanjutnya

Manipulasi DNA Dan Vektor

Documents

Transcript of Manipulasi DNA Dan Vektor