Validasi Tes Dipstik Berbasis Serologi Baru untuk Diagnosis Cepat Demam TifoidSurojit Dasa, K. Rajendrana, Phalguni Duttaa, Tushar Kanti Sahab, Shanta DuttaaaDivisi Bakteriologi dan Kedokteran Klinis, Institut Nasional Kolera dan Penyakit Enterik, Kolkata, IndiabPasca Sarjana Ilmu Pediatrik, Institut Dr. BC Roy, Kolkata, IndiaKorespondensi Penulis:No. Telp: + 91-033-2370-0448 / 4578; fax: + 91-033 2370-5066E-mail: shanta1232001@yahoo.co.in (S. Dutta)ABSTRAKSaat ini, tidak ada tes diagnostik demam tifoid yang dapat diutamakan. Satu tes dipstik berbasis serologi, dikembangkan secara indigenous, divalidasi dalam studi ini. Dilakukan pengawetan serum dari 336 pasien yang mengalami demam dengan hasil kultur Salmonella Typhi yang diuji dengan uji Widal dan uji assay terbaru. Sensitivitas analitis, spesifitas, dan efisiensi untuk pengujian assay baru dibandingkan uji Widal adalah 68,8% dibandingkan 62,5%, 71,1% dibandingkan 37,1%, dan 70,5% dibandingkan 43,2%, masing-masing (p 0,5). Peningkatan lebih lanjut dari point-of-care uji assay tifoid baru ini dianjurkan untuk dilakukan sebelum pelaksanaan di lapangan.Kata Kunci: demam tifoid, tes diagnostik, Salmonella typhii, serologiPENDAHULUANDemam tifoid dianggap sebagai salah satu masalah kesehatan masyarakat utama di dunia. Diperkirakan sekitar 21.700.000 kasus demam tifoid dengan lebih dari 217.000 kematian terjadi setiap tahun di Asia Tenggara. Namun, estimasi ini tampaknya tidak dilaporkan karena surveilans penyakit yang buruk dan kurangnya point-of-care dari tes diagnostik yang handal. Diagnosis laboratorium yang akurat dan cepat dari penyakit ini menjadi wajib karena merupakan dasar dari inisiasi awal pengobatan antibiotik, sehingga mengurangi risiko hasil yang memburuk dan kematian. Isolasi dari Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) dalam kultur darah dapat menegakkan diagnosis demam tifoid dan umumnya digunakan sebagai gold standard untuk validasi tes diagnostik baru. Tapi tes ini memiliki sensitivitas yang buruk, berkisar dari sekitar 40% - 60%. Studi di Vietnam telah melaporkan adanya angka yang lebih rendah dari organisme (median, 1 CFU / mL; kisaran, b0.3 ke 387 CFU / mL) dalam darah perifer karena banyaknya asupan antibiotik generasi baru ketika pasien belum dirawat di rumah sakit. Kultur sumsum tulang dinilai lebih sensitif (N80%) dari kultur darah, dan telah didokumentasikan bahwa terdapat angka tinggi pada organisme (median, 9 CFU / mL; kisaran, 1-1580 CFU / mL) di aspirasi sumsum tulang bahkan dengan terapi antimikroba sebelumnya, tetapi jarang digunakan karena sifat invasif dari teknik ini. Isolasi S. Typhi dari tinja, urin, atau duodenum merupakan tes alternatif, tetapi hasilnya harus ditafsirkan dengan hati-hati karena mungkin mencerminkan sebagai carrier kronis daripada infeksi akut.Uji Widal merupakan uji serologi yang paling umum digunakan dengan cara mengukur titer antibodi agglutinating terhadap antigen S. Typhi lipopolisakarida (LPS) "O" dan flagellar "H". Hasil tes dikonfirmasi memiliki korelasi positif dengan kultur hanya 30% pada demam tifoid. False positive telah dilaporkan pada malaria, demam berdarah, demam tifus, dll. yang memiliki pengaruh negatif pada keandalan uji Widal. Penentuan cut-off titer awal yang tepat di populasi sehat dan pemeriksaan sampel serum dikombinaasikan untuk interpretasi spesifik lanjutan yang masih terbatasi dengan penggunaan praktis di daerah endemik.Penggunaan metode molekuler (polymerase chain reaction, DNA microarray) pada sampel secara langsung dapat meningkatkan tingkat deteksi kasus dengan meningkatkan sensitivitas, tapi kurangnya standarisasi dan keahlian, serta peningkatan biaya reagen dan peralatan telah membuat metode ini kurang menarik di daerah sulit sumber daya. Oleh karena itu pencarian untuk uji diagnostik demam tifoid yang memiliki point-of-care yang cepat, sederhana, dan terjangkau yang dapat digunakan dalam bidang terpencil daerah endemis merupakan suatu tantangan tersendiri.Sejumlah tes diagnostik generasi baru berbasis serologi yang cepat untuk tifoid telah tersedia secara komersial seperti Typhidot (Malaysia Bio-Diagnostik Penelitian SDN BHD, Malaysia), Tubex (IDL Biotech, Sollentuna, Swedia), Multi-Test Dip-S-Tic (PanBio INDX, Baltimore, MD, USA), telah dievaluasi di seluruh dunia. Tapi tak satu pun dari tes ini menggunakan uji waktu dan menghasilkan hasil yang berkelanjutan ketika divalidasi pada kondisi endemik yang berbeda.Sebuah uji serologi baru, berdasarkan pada prinsip-prinsip immunochromatography sebagai teknologi terbaru dipstik (IC-LFT) telah dikembangkan secara mandiri oleh SPAN Diagnostics, Surat, India. IC-LFT kualitatif dapat mendeteksi IgM dan IgG antibodi, terutama pada lipopolisakarida (LPS) dan flagellin S. Typhi, pada serum/plasma manusia. Tes kit merupakan standar untuk diagnosis spesifik tifoid dengan in-house-test (data tidak dipublikasikan). Sistem uji baru telah divalidasi secara eksternal lebih lanjut di Divisi Bakteriologi dari Institut Nasional Kolera dan Penyakit Enterik (NICED), Kolkata, India. Hasil validasi disajikan dalam artikel ini.Secara singkat, sampel serum (yang dikumpulkan dari kasus demam dengan hasil kultur S. Typhi), diperoleh dari bank serum NICED, Kolkata, dan diuji secara blinded untuk menentukan sensitivitas analitis dan spesifisitas uji baru. Penentuan efisiensi dan evaluasi dari kemampuan kinerja tes diagnostik baru dilakukan di lapangan dengan menguji calon sampel serum dari anak-anak yang dirawat di rumah sakit dengan diagnosis klinis demam tifoid mengikuti metode standar yang berlaku.BAHAN DAN METODEPenentuan Sensitivitas Analitis dan SpesifisitasSampel serum disimpan di bank serum NICED yang dikumpulkan dari pasien demam dari penelitian lain, namun dapat digunakan untuk menentukan sensitivitas analitis dan spesifisitas dalam uji validasi. Sejumlah sampel serum dengan hasil kultur S. Typhi diketahui, dipilih dan diuji oleh kit baru berikut instruksi dari pabriknya dengan 2 teknisi yang terpisah. Sampel kode untuk membutakan oleh orang yang terpisah yang tidak terlibat dalam penelitian ini. Sampel dibacakan positif jika ditemukan positif oleh kedua pekerja. Semua sampel penelitian buta juga diperiksa dengan uji Widal (Span Diagnostics, Surat, India), dan titer ke 1: 80 dianggap sebagai positif. Setelah decoding semua hasil kultur darah, tes Widal dan tes diagnostik baru dibuat tersedia untuk ahli statistik untuk analisis statistik dan perbandingan antara dua tes berbasis serologi (kit baru dibandingkan Widal) mempertimbangkan kultur darah positif sebagai standar emas.Penentuan Kinerja Kit Diagnostik Baru dengan Uji Calon Sampel Serum dari Diagnosis Klinis Kasus Demam Tifoid dalam Situasi SebenarnyaPopulasi PenelitianUntuk menentukan efisiensi kit diagnosyik baru pada percobaan lapangan, pengambilan sampel darah dilakukan di Program Pasca Sarjana Ilmu Pediatrik Institut Dr. BC Roy dari anak-anak demam usia 2-12 tahun yang dirawat di Departemen Rawat Jalan Rumah Sakit selama Senin-Jumat pukul 09.00-13.00 selama periode antara April 2009 hingga September 2010. Anak-anak dengan demam tinggi (N: 39 C) dan tanda-tanda lain dari gejala sugestif demam tifoid, dipilih untuk pengambilan sampel darah dan pemisahan serum dengan riwayat asupan antibiotik serta keparahan/durasi penyakit. Program Pasca Sarjana Ilmu Pediatrik Institut Dr. BC Roy merupakan rumah sakit rujukan anak terbesar di Kolkata dan pasien dari semua status sosial ekonomi datang ke rumah sakit baik secara langsung maupun setelah dirujuk dari rumah sakit pemerintah lainnya.Pengumpulan Sampel dan Pengolahan DataSampel darah (5 ml) dikumpulkan secara aseptik dari anak-anak dengan demam klinis yang didiagnosis demam tifoid dan diinokulasi (4 ml) ke dalam botol Bactec Peds Plus (BD Bactec System, Franklin Lakes, NJ, USA) untuk isolasi dan identifikasi S. Typhi di laboratorium bakteriologi NICED dengan teknik mikrobiologi standar. Serum dipisahkan dari sampel darah 1 mL dan diuji secara komersial dengan perbandingan kit uji Widal (Span Diagnostics) dan kit uji alat baru. Sampel serum juga diuji menggunakan kit Dengue Ig-M ELISA (Omega Diagnostics, Scotland, UK) untuk diagnosis demam berdarah. Dua tetes sampel darah ditaruh pada slide kaca tunggal untuk apus darah tebal dan tipis yang diwarnai oleh pewarna Leishman dan diperiksa secara mikroskopis untuk mendeteksi parasit malaria.Pertimbangan EtisPenelitian ini ditinjau dan disetujui oleh komite etika institusional. Sampel darah dikumpulkan dari anak-anak demam setelah menerima informed consent dari orang tua atau wali mereka.

Kultur Mikrobiologi DarahBotol Bactec diinokulasi dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 7 hari dalam sistem Bactec 9120 (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, USA), sementara itu subkultur dibuat pada agar MacConkey dan agar nutrisi (Difco, Sparks, MD, USA). Fermentasi koloni halus non-laktosa diperiksa untuk Salmonella dengan pewarnaan Gram dan uji biokimia lainnya mengikuti protokol standar. Konfirmasi identifikasi isolat dilakukan secara serotipe dalam slide dan tabung tes aglutinasi menggunakan antiserum Salmonella O, H, dan Vi (Denka Seiken, Tokyo, Jepang). Jika tidak ada pertumbuhan setelah 7 hari inkubasi, kultur darah dianggap negatif.Tes Serologi: Tes WidalTes Widal dilakukan dengan menggunakan kit uji tabung aglutinasi kuantitatif (Span Diagnostik). Serum serial diencerkan dalam garam fisiologis (0,85%) dengan titer mulai dari 1: 4 hingga 1:64. Untuk setiap set serum telah terdapat suspensi antigen S. Typhi O dan H yang telah diencerkan dan ditambahkan secara terpisah, sehingga titer akhir menjadi 1:40 untuk 1: 640. Tabung diinkubasi selama semalam pada suhu 37 C. Hasil dibacakan dengan pengenceran serum sebagai tertinggi dengan aglutinasi terlihat pada cut-off titer ke 80. Kontrol uji Widal positif berjalan di setiap periode tes.Sistem Uji Baru: IC-LFTKit uji baru akan digunakan sesuai dengan rekomendasi pabrik. Dalam kit terkandung antigen (S. Typhi LPS dan flagelline) yang telah diresapi dipstik dengan larutan penyangga. Sebanyak 200 uL larutan penyangga dicampur dengan 10 ml serum dalam tabung reaksi. Dipstik ditempatkan secara vertikal di dalam tabung reaksi sampai tanda campuran cairan mencapai tanda panah. Dipstik akan melepaskan konjugat yang diresapi dengan emas koloid konjugasi antibodi IgM dan IgG anti-manusia. Sebagai sampel uji mengalir melalui konjugasi melepaskan pad karena aksi kapiler, kompleks anti-manusia IgM dan / atau IgGcolloidal konjugasi emas dibentuk dengan IgM S. Typhi-spesifik dan / atau antibodi IgG hadir dalam sampel. Kompleks pindah membran nitroselulosa dan terikat pada LPS bergerak dan antigen flagellin. Pengembangan satu atau dua merah muda-merah band warna pada dipstick setelah 20 menit dianggap sebagai hasil yang positif. Kehadiran built-in control bergerak memastikan validitas tes. Perangkat tes stabil pada 4-30 C sampai tanggal kadaluwarsa.