Validasi Metode Analisis

Metode validasi adalah proses yang digunakan untuk mengkonfirmasi bahwa

prosedur analitis digunakan untuk tes tertentu cocok untuk digunakan. Hasil dari

validasi metode dapat digunakan untuk menilai kualitas, keandalan dan konsistensi

dari hasil analisis, melainkan merupakan bagian integral dari setiap praktek analitis

yang baik.

metode Analytical perlu divalidasi atau revalidated

a. sebelum diperkenalkan ke dalam penggunaan rutin;

b. setiap kali perubahan kondisi untuk metode mana yang telah divalidasi

(misalnya, instrumen dengan karakteristik yang berbeda atau sampel yang

berbeda dengan matriks)

c. kapan metode ini berubah dan perubahan di luar lingkup asli metode ini.

Metode validasi telah menerima perhatian yang cukup besar dalam literatur dan

dari komite industri dan badan pengatur.

a. The US FDA cGMP permintaan di bagian metode yang akan divalidasi:

Ketelitian, sensitivitas, spesifisitas, dan reproduksibilitas metode pengujian

yang digunakan oleh perusahaan harus dibuat dan didokumentasikan. validasi

semacam itu dan dokumentasi dapat dicapai sesuai persyaratan-persyaratan

termasuk pernyataan dari setiap metode yang digunakan dalam pengujian

sampel yang tepat untuk memenuhi standar akurasi dan reliabilitas,

sebagaimana yang diterapkan untuk produk diuji. FDA Amerika juga

mengusulkan bimbingan industri untuk Analitik Prosedur dan Metode Validasi.

b. ISO / IEC 17025 mencakup sebuah bab tentang validasi metode dengan daftar

sembilan parameter validasi. The ICH telah mengembangkan teks validasi

konsensus mengenai prosedur analitis. Dokumen tersebut mencakup definisi

untuk delapan karakteristik validasi. ICH juga mengembangkan pedoman

dengan metodologi rinci .

c. US EPA dipersiapkan untuk menjadi pedoman pembangunan dan validasi

metode untuk Konservasi Sumber Daya dan Recovery Act (RCRA). The

AOAC, EPA dan organisasi ilmiah lain memberikan metode yang disahkan

melalui studi multi-laboratorium.

USP telah menerbitkan pedoman khusus untuk validasi metode untuk evaluasi

senyawa. USP mendefinisikan delapan langkah untuk validasi:

a. Ketepatan

b. Ketelitian

c. Kekhususan

d. Batas deteksi

e. Batas kuantisasi

f. Linieritas dan jangkauan

g. Kekasaran

h. Kesegaran

FDA juga telah menerbitkan petunjuk untuk validasi metode bioanalytical.

Dokumen paling komprehensif adalah laporan konferensi konferensi Washington

1990: Validasi Metode Analitik: Bioavailabilitas, Bioekuivalensi dan

Farmakokinetika Studi, yang disponsori oleh, antara lain, Asosiasi Amerika untuk

ilmuwan Farmasi (AAPS), yang AOAC dan FDA Amerika Serikat. Laporan ini

menyajikan prinsip untuk memvalidasi studi tentang manusia dan hewan subyek

keduanya. Laporan ini juga telah digunakan sebagai dasar untuk dokumen industri

bimbingan FDA.

Perwakilan dari industri farmasi dan kimia telah menerbitkan makalah di

validasi metode analisis. Hokanson menerapkan pendekatan siklus hidup, yang

dikembangkan untuk sistem komputerisasi, untuk validasi dan revalidation metode.

Green memberikan panduan praktis untuk validasi metode analisis, dengan deskripsi

dari serangkaian persyaratan minimum untuk suatu metode. Renger dan rekan-

rekannya menggambarkan validasi prosedur analitis khusus untuk analisis tablet

teofilin dalam menggunakan performa tinggi kromatografi lapisan tipis

(HPTLC). Prosedur validasi dalam artikel ini khusus didasarkan pada persyaratan

untuk pendaftaran multistate Uni Eropa.

Wegscheider telah menerbitkan prosedur untuk validasi metode dengan fokus

khusus pada kalibrasi, eksperimen pemulihan, metode perbandingan dan penyelidikan

kekasaran.  AOAC telah mengembangkan program-Verified Metode validasi rekan

dengan panduan lengkap tentang hal apa yang parameter harus divalidasi. Winslow

dan Meyer merekomendasikan definisi dan penerapan rencana induk untuk validasi

metode analisis. J. Breaux dan rekan telah menerbitkan sebuah studi pada

pengembangan metode analisis dan validasi. Titik kunci adalah untuk

mengembangkan metode untuk validasi mudah dan revalidation. O. Krause

menerbitkan sebuah panduan untuk transfer metode analitis, komparatif,

pemeliharaan dan kriteria penerimaan untuk pengujian biopharmaceuticals.

Pelajaran ini memberikan review dan strategi untuk validasi metode analisis

untuk kedua metode yang dikembangkan in-house serta metode standar, dan

rekomendasi mengenai dokumentasi yang harus dihasilkan selama, dan pada saat

penyelesaian, validasi metode. Hal ini juga menjelaskan apa yang penting ketika

mentransfer sebuah metode.

Validitas dari metode spesifik harus ditunjukkan dalam percobaan laboratorium

menggunakan contoh atau standar yang mirip dengan sampel yang tidak diketahui

dianalisis secara rutin. Penyusunan dan pelaksanaan harus mengikuti protokol

validasi, sebaiknya ditulis dalam instruksi langkah demi langkah

format.Kemungkinan langkah-langkah untuk validasi metode lengkap yang tercantum

dalam Tabel 1. Prosedur yang diusulkan ini mengasumsikan bahwa instrumen

tersebut telah dipilih dan metode telah dikembangkan. Hal ini memenuhi kriteria

seperti kemudahan penggunaan, kemampuan untuk menjadi otomatis dan

dikendalikan oleh sistem komputer; biaya per analisa; throughput sampel; waktu

penyelesaian, dan lingkungan, kesehatan dan keselamatan.

1. Mengembangkan protokol validasi, sebuah prosedur operasi atau rencana

validasi master untuk validasi

2. Untuk proyek validasi spesifik mendefinisikan dan tanggung jawab pemilik

3. Mengembangkan rencana proyek validasi

4. Tentukan aplikasi, tujuan dan ruang lingkup metode

5. Tentukan parameter kinerja dan kriteria penerimaan

6. Tentukan validasi eksperimen

7. Verifikasi karakteristik kinerja peralatan yang relevan

8. Kualifikasi bahan, misalnya standar dan reagen untuk kemurnian, jumlah yang

cukup akurat dan stabilitas

9. Melakukan percobaan pra-validasi

10. Sesuaikan parameter metode atau / dan kriteria penerimaan jika perlu

11. Melakukan penuh internal (dan eksternal) eksperimen validasi

12. Mengembangkan SOP untuk melaksanakan metode ini dalam rutinitas

13. Tentukan kriteria untuk revalidation

14. Menetapkan jenis dan frekuensi uji kesesuaian sistem dan / atau pengendalian

mutu analitis (AQC) cek untuk rutin

15. Dokumen validasi eksperimen dan hasil dalam laporan validasi

Keberhasilan penerimaan parameter validasi dan kriteria kinerja, oleh semua

pihak yang terlibat, membutuhkan upaya kerjasama dari beberapa departemen,

termasuk pengembangan analitis, QC, urusan peraturan dan individu yang

membutuhkan data analitis. Prosedur operasi atau Validasi Master Plan (VMP) harus

secara jelas mendefinisikan peran dan tanggung jawab masing-masing departemen

yang terlibat dalam validasi metode analisis.

Ruang lingkup metode dan kriteria validasi yang harus didefinisikan pada awal

proses. Ini termasuk pertanyaan-pertanyaan berikut:

a. Apa analit harus terdeteksi?

b. Apa tingkat konsentrasi yang diharapkan?

c. Apakah matriks sampel?

d. Apakah ada zat campuran yang diharapkan, dan jika demikian, zat campuran

tersebut harus dideteksi dan dihitung?

e. Apakah ada peraturan khusus legislatif atau persyaratan?

f. Secara kualitatif atau kuantitatif?

g. Apa saja yang diperlukan deteksi dan batas kuantisasi?

h. Berapa kisaran konsentrasi yang diharapkan?

i. Apa yang presisi dan akurasi diharapkan?

j. Bagaimana metode yang sesuai?

k. Jenis peralatan yang harus digunakan? Apakah metode untuk satu instrumen

tertentu, atau seharusnya itu digunakan oleh semua instrumen dari jenis yang

sama?

l. Apakah metode yang digunakan dalam satu laboratorium khusus atau

seharusnya itu bisa diterapkan di semua laboratorium di satu sisi atau seluruh

dunia?

m. Keterampilan apa yang telah diantisipasi pengguna metode ini?

Karakteristik performa Metode harus didasarkan pada tujuan penggunaan

metode ini. Hal ini tidak selalu diperlukan untuk memvalidasi semua parameter

analitik yang tersedia untuk teknik tertentu. Sebagai contoh, jika metode ini

digunakan untuk melacak tingkat analisis kualitatif, tidak perlu untuk menguji dan

memvalidasi metode yang membatasi kuantisasi, atau linieritas, selama rentang

dinamis penuh peralatan. Parameter awal harus dipilih menurut analis pengalaman

dan penilaian terbaik. Final parameter harus disepakati antara lab atau ahli kimia

analitis melakukan validasi dan laboratorium atau individu menerapkan metode dan

pengguna data yang akan dihasilkan oleh metode ini. Tabel 2 memberikan contoh

yang mungkin parameter diuji untuk tugas analisis tertentu.

Ruang lingkup metode ini juga harus mencakup berbagai jenis peralatan dan

lokasi di mana metode yang akan dijalankan. Sebagai contoh, jika metode ini akan

dijalankan pada instrumen tertentu dalam suatu laboratorium khusus, tidak perlu

menggunakan instrumen dari vendor lain atau untuk memasukkan laboratorium lain

pada percobaan validasi. Dengan cara ini, eksperimen dapat terbatas pada apa yang

benar-benar diperlukan.

Mayor

senyawa

Mayor senyawa

dan jejakJejak Jejak

kuantitatif kuantitatif kualitatif kualitatif

batas deteksi tidak Tidak Ya tidak

batas

kuantisasi

tidak Ya Tidak ya

linieritas ya Ya Tidak ya

jarak ya Ya Tidak tidak

ketelitian ya Ya Tidak ya

ketepatan ya Ya Tidak ya

kekhususan ya Ya Ya ya

kekasaran ya Ya Tidak mungkin

Tabel 2. Validasi parameter untuk tugas-tugas tertentu

Percobaan validasi harus dilakukan oleh seorang analis yang berpengalaman

untuk menghindari kesalahan karena kurangnya pengalaman. Analis harus sangat

berpengalaman dalam teknik dan operasi dari instrumen. Sebelum instrumen

digunakan untuk memvalidasi metode, spesifikasi kinerjanya harus diverifikasi

menggunakan standar kimia generik. Memuaskan hasil untuk metode dapat diperoleh

hanya dengan peralatan yang berkinerja baik. Perhatian khusus harus diberikan

kepada mereka karakteristik peralatan yang penting untuk metode ini.Misalnya, jika

batas deteksi adalah penting untuk suatu metode khusus, instrumen yang spesifikasi

untuk kebisingan dasar dan, untuk detektor tertentu, respon terhadap senyawa tertentu

harus diverifikasi.

Setiap bahan kimia yang digunakan untuk menentukan parameter validasi yang

penting, seperti reagen standar referensi dan, harus

1. tersedia dalam jumlah yang cukup,

2. diidentifikasi secara akurat,

3. cukup stabil dan

4. diperiksa untuk komposisi yang tepat dan kemurnian.

Setiap bahan lainnya dan bahan habis pakai, misalnya, kromatografi kolom,

harus baru dan memenuhi syarat untuk memenuhi kriteria performa kolom. Hal ini

memastikan bahwa satu set bahan baku dapat digunakan untuk eksperimen yang

paling dan menghindari kejutan yang tidak menyenangkan selama validasi metode.

Operator harus cukup akrab dengan teknik dan peralatan. Ini akan memungkinkan

mereka untuk mengidentifikasi dan mendiagnosa masalah tak terduga lebih mudah

dan untuk menjalankan seluruh proses secara lebih efisien.

Jika ada sedikit atau tidak ada informasi tentang karakteristik performa metode,

dianjurkan untuk membuktikan kesesuaian metode untuk digunakan dalam

eksperimen awal. Studi-studi ini harus mencakup perkiraan presisi, bekerja jangkauan

dan batas deteksi. Jika muncul validasi data awal tidak sesuai, metode itu sendiri,

peralatan, teknik analisis atau batas penerimaan harus diubah. Metode pengembangan

dan validasi Oleh karena itu, proses berulang-ulang. Sebagai contoh, pada

kromatografi cair, selektivitas dicapai melalui pemilihan komposisi fase gerak. Untuk

pengukuran kuantitatif, faktor resolusi antara dua puncak harus 2,5 atau lebih

tinggi. Jika nilai ini tidak tercapai, komposisi fase gerak membutuhkan optimasi lebih

lanjut. Pengaruh parameter operasi terhadap kinerja metode harus dinilai pada tahap

ini jika hal ini tidak dilakukan selama pengembangan dan optimasi metode ini.

Tidak ada panduan resmi pada urutan yang benar eksperimen validasi, dan

urutan yang optimal tergantung pada metode itu sendiri. Berdasarkan pengalaman

penulis, untuk metode kromatografi cair, urutan berikut telah terbukti sangat berguna:

1. Selektivitas standar (pemisahan mengoptimalkan dan deteksi selektivitas

campuran standar jika tidak mencukupi)

2. Linieritas, batas kuantisasi, batas deteksi, rentang

3. Pengulangan (presisi jangka pendek) dari waktu retensi dan daerah puncak

4. Intermediate presisi

5. Selektivitas dengan sampel nyata

6. Trueness / akurasi pada konsentrasi yang berbeda

7. Ketidakrataan (studi interlaboratory)

Percobaan yang memakan waktu lebih, seperti akurasi dan kekerasan, termasuk

menuju akhir. Dapat diukur dalam eksperimen gabungan. Sebagai contoh, ketika

presisi kawasan puncak diukur selama rentang konsentrasi penuh, data dapat

digunakan untuk memvalidasi linieritas tersebut.

Selama validasi metode, parameter batas penerimaan, dan frekuensi uji

kesesuaian sistem yang sedang berlangsung atau cek QC harus didefinisikan.Kriteria

harus didefinisikan untuk menunjukkan bila metode dan sistem berada di luar kendali

statistik. Tujuannya adalah untuk mengoptimalkan eksperimen ini sehingga, dengan

jumlah minimum analisis kontrol, metode dan sistem analitis lengkap akan

memberikan hasil jangka panjang untuk memenuhi tujuan yang didefinisikan dalam

ruang lingkup metode ini.

Setelah metode ini telah dikembangkan dan divalidasi, laporan validasi yang

harus disiapkan adalah sebagai berikut:

a. Tujuan dan ruang lingkup metode (diterapkan, tipe).

b. Ringkasan metodologi.

c. Jenis senyawa dan matriks.

d. Semua bahan kimia, reagen, standar acuan, QC sampel dengan kemurnian,

kelas, sumber atau petunjuk rinci tentang persiapan mereka.

e. Prosedur pemeriksaan kualitas standar dan bahan kimia yang digunakan.

f. Keamanan tindakan pencegahan.

g. Rencana dan prosedur untuk metoda pelaksanaan dari laboratorium

pengembangan metode untuk analisis rutin.

h. Metode parameter.

i. Parameter kritis diambil dari pengujian ketahanan.

j. Daftar peralatan dan fungsional dan kinerja, persyaratan misalnya perusahaan,

dimensi sel, kebisingan dan suhu rentang awal kolom. Untuk peralatan yang

kompleks, gambar atau diagram skematik dapat berguna.

k. Kondisi rinci tentang bagaimana percobaan dilakukan, termasuk persiapan

sampel. Laporan tersebut harus cukup rinci untuk memastikan bahwa itu bisa

direproduksi oleh teknisi kompeten dengan peralatan yang sebanding.

l. Prosedur dan perhitungan statistik representatif.

m. Prosedur QC dalam analisis rutin, misalnya, sistem tes kesesuaian.

n. Perwakilan plot, misalnya, kromatogram, spektra dan kurva kalibrasi.

o. Metode batas kinerja penerimaan data.

p. Ketidakpastian yang diharapkan dari hasil pengukuran.

q. Kriteria untuk revalidation.

r. Orang (s) yang dikembangkan dan divalidasi metode ini.

s. Referensi (jika ada).

t. Ringkasan dan kesimpulan.

u. Persetujuan dengan nama, judul, tanggal dan tanda tangan dari mereka yang

bertanggung jawab untuk meninjau dan persetujuan dari prosedur tes analitis.

Verifikasi Metode Standar

Sebuah laboratorium menerapkan metode spesifik harus telah mendokumen-

tasikan bukti bahwa metode tersebut telah tepat divalidasi. Ini berlaku untuk metode

yang dikembangkan di-rumah, serta untuk metode standar, misalnya, yang

dikembangkan oleh organisasi-organisasi seperti EPA, American Society for Testing

dan Material (ASTM), ISO atau USP.

Sejumlah pertanyaan biasanya timbul tentang validasi metode standar: Pertama,

metode ini harus menjadi pengguna revalidated di laboratorium dan, jika demikian,

harus revalidation metode mencakup semua percobaan, seperti yang dilakukan

selama validasi awal? Kedua, yang dokumentasi harus tersedia atau dikembangkan

in-house untuk metode standar? pedoman peraturan resmi dan tidak eksplisit tentang

validasi metode standar. Hanya CITAC / Pedoman EURACHEM (19) termasuk

sebuah ayat pendek yang berbunyi sebagai berikut:

Validasi atau bersama-sama diuji metode standar tidak boleh diambil begitu

saja, tak peduli betapa sempurna metode's silsilah - laboratorium harus memenuhi

persyaratan bahwa tingkat validasi metode tertentu adalah cukup untuk tujuan yang

diperlukan, dan bahwa laboratorium itu sendiri dapat mencocokkan data kinerja lain.

Ada dua persyaratan penting dalam kutipan ini:

1. Metode standar's validasi data yang memadai dan cukup untuk memenuhi

persyaratan's metode laboratorium.

2. laboratorium harus dapat mencocokkan data performa seperti yang dijelaskan

dalam standar.

Hasil harus didokumentasikan dalam protokol validasi. Kedua dokumen akan

menjadi sumber utama untuk laporan validasi.

Revalidation

Kemungkinan besar beberapa parameter metode harus diubah atau disesuaikan

selama hidup metode jika metode kriteria kinerja berada di luar kriteria penerimaan

mereka.  Revalidation juga diperlukan jika ruang lingkup metode telah berubah atau

diperpanjang, misalnya, jika sampel perubahan operasi matriks atau jika kondisi

berubah. Selanjutnya, revalidation diperlukan jika dimaksudkan untuk menggunakan

instrumen dengan karakteristik yang berbeda, dan karakteristik baru ini belum

tercakup dalam validasi awal. Sebagai contoh, metode KCKT mungkin telah

dikembangkan dan divalidasi pada pompa dengan volume delay 5 mL, tetapi pompa

baru memiliki volume keterlambatan hanya 0,5 mL.

Gambar 3. Flow diagram untuk revalidation

Bagian atau revalidation lengkap juga dapat dipertimbangkan jika tes

kesesuaian sistem, atau hasil analisis sampel QC, terletak di luar kriteria penerimaan

preset dan di mana sumber kesalahan tidak bisa dilacak kembali ke instrumen atau

penyebab lainnya.

Setiap kali ada perubahan yang mungkin memerlukan revalidation sebagian

atau penuh, perubahan itu harus mengikuti perubahan sistem kontrol

didokumentasikan. Diagram aliran proses tersebut didokumentasikan dalam Gambar

3. Perubahan ini harus didefinisikan, berwenang untuk implementasi dan

didokumentasikan. Kemungkinan perubahan mungkin termasuk

a. sampel baru dengan senyawa baru atau matriks baru,

b. analis baru dengan keahlian yang berbeda,

c. instrumen baru dengan karakteristik yang berbeda,

d. Lokasi baru dengan kondisi lingkungan yang berbeda,

e. baru bahan kimia dan / atau referensi standar dan

f. modifikasi parameter analitik.

Sebuah evaluasi harus menentukan apakah perubahan tersebut adalah dalam

lingkup metode ini. Jika demikian, revalidation tidak diperlukan. Jika perubahan yang

terletak di luar ruang lingkup, parameter untuk revalidation harus

didefinisikan. Setelah percobaan validasi, uji kesesuaian parameter sistem harus

diselidiki dan merumuskan kembali, jika perlu.

Parameter untuk Validasi Metode

Parameter untuk validasi metode telah ditetapkan dalam kelompok kerja yang

berbeda dari komite nasional dan internasional dan dijelaskan dalam

literatur.Sayangnya, beberapa definisi bervariasi antara organisasi yang

berbeda. Sebuah upaya harmonisasi dibuat untuk aplikasi farmasi melalui ICH, di

mana perwakilan dari industri dan lembaga regulator dari Amerika Serikat, Eropa dan

Jepang batasan tertentu, persyaratan dan, sampai taraf tertentu, metodologi untuk

validasi metode analisis. Parameter, seperti yang didefinisikan oleh ICH dan dengan

organisasi lain dan penulis, diringkas dalam Tabel 3 dan dijelaskan secara singkat

dalam paragraf berikut.

Selektivitas / Spesifisitas

Istilah selektivitas dan spesifisitas sering digunakan secara bergantian. Sebuah

diskusi rinci tentang istilah ini, sebagaimana didefinisikan oleh organisasi yang

berbeda, telah disajikan oleh Vessmann. Ia terutama menunjukkan perbedaan antara

definisi kekhususan yang diberikan oleh IUPAC / WELAC dan ICH.

Meskipun tidak konsisten dengan ICH, istilah yang spesifik umumnya mengacu

pada metode yang menghasilkan respons untuk analit hanya satu, sedangkan istilah

selektif merujuk pada metode yang memberikan tanggapan untuk sejumlah entitas

kimia yang mungkin atau mungkin tidak dibedakan satu sama lain. Jika respon

dibedakan dari semua tanggapan lainnya, metode ini dikatakan selektif.Karena

terdapat beberapa metode yang sangat yang menanggapi hanya satu analit, istilah

selektivitas biasanya lebih tepat. USP monografi mendefinisikan selektivitas suatu

metode analisis sebagai kemampuan untuk mengukur secara akurat suatu analit dalam

kehadiran gangguan, seperti prekursor sintetik, eksipien, enantiomer dan dikenal

(atau mungkin) degradasi produk yang dapat diharapkan untuk hadir dalam matrik

sampel. Selektivitas dalam kromatografi cair diperoleh dengan memilih kolom

optimal dan pengaturan kondisi kromatografi, seperti komposisi fase gerak, kolom

suhu dan panjang gelombang detektor. Selain pemisahan kromatografi, langkah

persiapan sampel juga dapat dioptimalkan untuk terbaik selektivitas.

Ini adalah tugas yang sulit dalam kromatografi untuk memastikan apakah

puncak dalam kromatogram sampel murni atau terdiri dari lebih dari satu

senyawa. Oleh karena itu, analis harus mengetahui berapa banyak senyawa dalam

sampel atau apakah prosedur untuk mendeteksi puncak murni harus digunakan.

Sedangkan pada parameter kromatografi masa lalu seperti komposisi fase gerak

atau kolom yang telah diubah, sekarang aplikasi detektor spektroskopi digabungkan

on-line untuk kromatograf sedang digunakan. UV / terlihat dioda-array detektor dan

spektrometer massa memperoleh spektrum on-line sepanjang seluruh

kromatogram. Spektrum diperoleh pada saat puncak elusi dinormalisasi dan disalut

untuk presentasi grafis. Jika spektrum normal berbeda, puncak terdiri dari paling

sedikit dua senyawa.

Prinsip-array deteksi dioda dalam HPLC dan aplikasi mereka dan batasan yang

berkaitan dengan puncak kemurnian dijelaskan dalam literature. Contoh murni HPLC

puncak dan murni diperlihatkan pada Gambar 4. Sementara sinyal kromatografi

menunjukkan tidak ada kotoran di puncak baik, evaluasi spektral mengidentifikasi

puncak di sebelah kiri sebagai murni. Tingkat kotoran yang dapat dideteksi dengan

metode ini tergantung pada perbedaan spektral, pada detektor performa dan pada

algoritma perangkat lunak. Dalam kondisi ideal, puncak pengotor sebesar 0.05 0,1

persen dapat dideteksi.

Studi Selektivitas juga harus menilai gangguan yang mungkin disebabkan oleh

matriks, misalnya, urin, darah, tanah, air atau persiapan makanan. sampel Optimized

dapat menghilangkan sebagian besar komponen matriks. Tidak adanya gangguan

matriks untuk metode kuantitatif harus dibuktikan oleh analisis setidaknya lima

sumber independen kontrol matriks.

Gambar 4. Contoh murni HPLC puncak dan murni. Sinyal kromatografi tidak

menunjukkan adanya kotoran dalam puncak baik. evaluasi spektral Namun,

mengidentifikasi puncak di sebelah kiri sebagai murni.

Precision dan Reprodusibilitas

Ketepatan metode (Tabel 4) adalah sejauh mana hasil uji individu suntikan

beberapa dari serangkaian standar setuju. Standar deviasi diukur dapat dibagi menjadi

3 kategori: pengulangan, presisi intermediate dan reproduksibilitas. Pengulangan

didapat bila analisis dilakukan di laboratorium oleh seorang operator dengan

menggunakan suatu peralatan dalam waktu yang relatif jangka pendek.Setidaknya 6

penentuan dari 3 matriks yang berbeda pada 3 konsentrasi yang berbeda atau 2 harus

dilakukan, dan RSD dihitung.

The ICH membutuhkan presisi dari setidaknya 6 ulangan yang akan diukur pada

100 persen dari target konsentrasi tes atau dari minimal 9 ulangan meliputi kisaran

tertentu lengkap. Contohnya, hasilnya dapat diperoleh di 3 konsentrasi dengan 3

suntikan pada konsentrasi masing-masing.

kriteria penerimaan ini untuk presisi sangat tergantung pada jenis

analisis. Farmasi presisi QC yang lebih besar dari 1 persen RSD mudah dicapai untuk

analisis senyawa, tapi presisi untuk cuplikan biologi lebih seperti 15 persen di batas

konsentrasi dan 10 persen pada tingkat konsentrasi yang lain. Untuk lingkungan dan

sampel makanan, presisi sebagian besar tergantung pada sampel matriks, konsentrasi

analit, kinerja alat dan teknik analisis. 

Intermediate presisi adalah istilah yang telah didefinisikan oleh ICH sebagai

variabilitas jangka panjang dari proses pengukuran. Hal ini ditentukan dengan

membandingkan hasil dari metode dijalankan dalam sebuah laboratorium tunggal

selama beberapa minggu. yang presisi antara metode A mungkin mencerminkan

perbedaan dalam hasil yang diperoleh

a. dari operator yang berbeda,

b. dari praktek kerja yang tidak konsisten (ketelitian) dari operator yang sama,

c. dari instrumen yang berbeda,

d. dengan standar dan reagen dari pemasok yang berbeda,

e. dengan kolom dari batch yang berbeda atau

f. kombinasi ini.

Analit% Rasio analit Satuan RSD%

100 1 100% 1,3

10 10 -1 10% 2,8

1 10-2 1% 2,7

0,1 10-3 0,1% 3,7

0,01 10-4 100 ppm 5,3

0,001 10-5 10 ppm 7,3

0,0001 10-6 1 ppm 11

0,00001 10-7 100 ppb 15

0.000001 10-8 10 ppb 21

0.0000001 10-9 1 ppb 30

Tabel 4. Versus konsentrasi analit presisi (Ref. 15)

Tujuan validasi presisi menengah adalah untuk memastikan bahwa di

laboratorium metode yang sama akan memberikan hasil yang sama sekali tahap

pengembangan selesai.

Reproducibility (Tabel 5), seperti yang didefinisikan oleh ICH, merupakan

presisi diperoleh antara laboratorium yang berbeda. Tujuannya adalah untuk

memastikan bahwa metode ini akan memberikan hasil yang sama di laboratorium

yang berbeda. Reproducibility dari metode analisis ditentukan dengan menganalisis

aliquots dari banyak homogen di laboratorium yang berbeda dengan analis berbeda,

dan dengan menggunakan dan lingkungan kondisi operasional yang mungkin berbeda

dari, tapi masih dalam, parameter tertentu dari metode (tes interlaboratory). Validasi

reproduksibilitas adalah penting jika metode ini untuk digunakan di laboratorium

yang berbeda.

a. Perbedaan pada suhu kamar dan kelembaban

b. Operator dengan pengalaman yang berbeda dan ketelitian

c. Peralatan dengan karakteristik yang berbeda, misalnya volume penundaan

sistem HPLC

d. Variasi material dan kondisi instrumen, misalnya dalam HPLC, mobile

komposisi fase, pH, laju alir fasa gerak

e. Variasi rincian eksperimental tidak ditentukan oleh metode

f. Peralatan dan bahan habis pakai dari usia yang berbeda

g. Kolom dari pemasok yang berbeda atau berbeda batch

h. Pelarut, reagen dan bahan lain dengan berbagai kualitas

Akurasi

Keakuratan suatu metode analisis adalah sejauh mana hasil tes yang dihasilkan

oleh metode dan nilai yang benar setuju. Keakuratan juga dapat digambarkan sebagai

kedekatan perjanjian antara nilai yang diadopsi, baik sebagai atau, diterima referensi

nilai sebenarnya konvensional, dan nilai ditemukan.

Nilai yang benar untuk penilaian akurasi dapat diperoleh dengan beberapa

cara.Salah satu alternatifnya adalah untuk membandingkan hasil metode dengan hasil

dari metode referensi ditetapkan. Pendekatan ini mengasumsikan bahwa

ketidakpastian metode referensi diketahui. Kedua, akurasi dapat dinilai dengan

menganalisis sampel dengan konsentrasi yang dikenal (misalnya, sebuah sampel

kontrol atau bahan referensi bersertifikat) dan membandingkan nilai yang diukur

dengan nilai yang benar sebagai yang disertakan dengan bahan tersebut. Jika bahan

referensi bersertifikat atau sampel kontrol tidak tersedia, sampel kosong matriks dapat

bunga berduri dengan konsentrasi dikenal dengan berat atau volume. Setelah

ekstraksi dari analit dari matriks dan injeksi ke dalam instrumen analitis, pemulihan

nya dapat ditentukan dengan cara membandingkan respon ekstrak dengan tanggapan

mengenai materi referensi dilarutkan dalam pelarut yang murni. Karena penilaian ini

akurasi mengukur efektivitas persiapan sampel, perawatan harus dilakukan untuk

meniru persiapan sampel aktual sedekat mungkin. Jika divalidasi dengan benar,

faktor pemulihan dihitung untuk konsentrasi yang berbeda dapat digunakan untuk

memperbaiki hasil akhir.

Konsentrasi harus mencakup rentang perhatian dan harus mencakup konsentrasi

mendekati batas kuantisasi, satu di tengah jangkauan dan satu di akhir yang tinggi

dari kurva kalibrasi. Pendekatan lain adalah dengan menggunakan nilai keputusan

penting sebagai titik konsentrasi yang harus menjadi titik akurasi terbesar.

Dokumen ICH pada metodologi merekomendasikan akurasi validasi akan

dinilai menggunakan minimal sembilan penentuan selama minimal tiga tingkat

konsentrasi yang mencakup kisaran tertentu (misalnya, tiga konsentrasi / masing-

masing diulang tiga kali). Akurasi harus dilaporkan sebagai pemulihan persen pada

uji jumlah ditambahkan dikenal analit dalam sampel atau sebagai perbedaan antara

mean dan nilai sebenarnya diterima, bersama-sama dengan interval keyakinan.

Linieritas dan Kurva Kalibrasi

Linieritas suatu metode analisis adalah kemampuannya untuk memperoleh hasil

tes yang secara langsung proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel

dalam jarak tertentu atau proporsional dengan cara transformasi matematika

didefinisikan-baik. Linieritas bisa ditunjukkan secara langsung pada substansi uji

(dengan pengenceran dari larutan stok standar) dan / atau dengan menggunakan

penimbangan terpisah dari campuran sintetis produk komponen pengujian,

menggunakan prosedur yang diusulkan.

Linearitas ditentukan oleh serangkaian 3 sampai 6 suntikan dari 5 atau lebih

standar yang konsentrasi span 80-120 persen dari rentang konsentrasi yang

diharapkan. Tanggapan harus berbanding lurus dengan konsentrasi dari analit atau

proporsional dengan cara perhitungan matematika yang ditetapkan-baik.Sebuah

persamaan regresi linier diterapkan pada hasil harus memiliki sebuah mencegat tidak

berbeda dari 0. Jika mencegat nol signifikan diperoleh, harus menunjukkan bahwa hal

ini tidak berpengaruh pada keakuratan metode ini.

Pendekatan lain adalah data sinyal bagi dengan konsentrasi masing-masing,

menghasilkan respon relatif. grafik adalah diplot dengan tanggapan relatif pada

sumbu y dan konsentrasi yang sesuai pada sumbu x-, pada skala log. Garis horizontal

yang diperoleh harus selama rentang linier penuh. Pada konsentrasi yang lebih tinggi,

biasanya akan ada deviasi negatif dari linieritas. garis horisontal paralel ditarik pada

grafik yang berhubungan dengan, misalnya, 95 persen dan 105 persen dari garis

horizontal. Metode ini linier sampai ke titik di mana garis merencanakan respon

relatif memotong garis 95 persen HPLC. Gambar 5 menunjukkan perbandingan grafis

dua evaluasi pada sampel menggunakan kafein.

ICH merekomendasikan, untuk pelaporan akurasi, linieritas kurva koefisien

korelasi, y-intercept, kemiringan garis regresi dan jumlah kuadrat sisa. Selain itu,

analisis deviasi titik data aktual dari garis regresi juga dapat membantu untuk

mengevaluasi linearitas. Beberapa prosedur analitis, seperti immunoassays, tidak

menunjukkan linieritas setelah transformasi ada). Ini Dalam kasus ini, analitis respon

harus dijelaskan dengan tepat fungsi dari konsentrasi (jumlah dari analit dalam

contoh. Dalam rangka membangun linieritas, minimal lima konsentrasi

dianjurkan. pendekatan lain harus dibenarkan.

Gambar 5. Presentasi grafis plot linieritas sampel kafein menggunakan HPLC.

Jarak

Kisaran suatu metode analisis adalah interval antara bagian atas dan tingkat

bawah (termasuk tingkat-tingkat) yang telah menunjukkan akan ditentukan dengan

presisi, akurasi dan linearitas menggunakan metode seperti yang tertulis. Rentang ini

biasanya dinyatakan dalam satuan yang sama dengan hasil uji (misalnya, persentase,

bagian per juta) yang diperoleh dengan metode analitik.

Untuk tes uji, yang ICH memerlukan rentang minimum spesifikasi untuk

menjadi 80-120 persen dari konsentrasi uji, dan untuk penentuan suatu kenajisan,

untuk memperluas jangkauan dari batas kuantisasi, atau dari 50 persen dari

spesifikasi setiap kenajisan, mana yang lebih besar, sampai 120 persen dari

spesifikasi.

Gambar 6. Definisi untuk linearitas, jangkauan, LOQ, LOD

Limit Deteksi

Batas deteksi adalah titik di mana suatu nilai yang terukur lebih besar dari

ketidakpastian yang terkait dengannya. Ini adalah konsentrasi terendah dari analit

dalam suatu sampel yang dapat dideteksi namun tidak selalu diukur. Batas deteksi

sering bingung dengan sensitivitas dari metode ini. Sensitivitas dari metode analisis

adalah kemampuan metode ini untuk membedakan perbedaan-perbedaan kecil

konsentrasi atau massa analit uji. Dalam istilah praktis, sensitivitas kemiringan kurva

kalibrasi yang diperoleh dengan merencanakan respons terhadap konsentrasi analit

atau massa.

Pada kromatografi, batas deteksi adalah jumlah injeksi yang menghasilkan puncak

dengan ketinggian minimal dua atau tiga kali lebih tinggi tingkat kebisingan

baseline. Selain itu sinyal / kebisingan metode, yang ICH menjelaskan tiga metode

lebih lanjut:

1. Inspeksi visual: Batas deteksi ditentukan oleh analisis sampel dengan

konsentrasi analit dan dikenal dengan penentuan tingkat minimum yang analit

dapat dipercaya terdeteksi.

2. Standar deviasi respon berdasarkan deviasi standar dari kosong: Pengukuran

besarnya respons latar belakang analitis dilakukan dengan menganalisis jumlah

sampel yang tepat kosong dan menghitung standar deviasi tanggapan ini.

3. Standar deviasi respon berdasarkan kemiringan kurva kalibrasi: Sebuah kurva

kalibrasi tertentu dipelajari dengan menggunakan sampel yang mengandung

analit dalam kisaran batas deteksi. Deviasi standar residu dari garis regresi, atau

standar deviasi dari y-perpotongan garis-garis regresi, dapat digunakan sebagai

standar deviasi.

Gambar 7. Batas deteksi dan batas kuantisasi melalui sinyal terhadap kebisingan

Batas Kadar

Batas kuantisasi adalah jumlah minimum yang disuntikkan menghasilkan

pengukuran kuantitatif dalam matriks target dengan presisi diterima dalam

kromatografi, biasanya membutuhkan ketinggian puncak 1-20 kali lebih tinggi dari

dasar suara.

Jika diperlukan presisi metode di batas kuantisasi telah ditentukan,

EURACHEM (Gambar 8) pendekatan dapat digunakan. Sejumlah sampel dengan

penurunan jumlah analit adalah disuntikkan enam kali. RSD persen dihitung dari

ketepatan diplot terhadap jumlah analit. Jumlah yang sesuai dengan yang dibutuhkan

presisi didefinisikan sebelumnya adalah sama dengan batas kuantisasi.Adalah penting

untuk tidak hanya menggunakan standar murni untuk tes ini tetapi juga matriks

runcing yang erat merupakan sampel yang tidak diketahui.

Untuk batas deteksi, para ICH merekomendasikan, di samping prosedur seperti

yang dijelaskan di atas, inspeksi visual dan deviasi standar respon dan kemiringan

kurva kalibrasi.

Gambar 11. Batas kuantisasi dengan EURACHEM metode.

Setiap hasil deteksi dan batas kuantisasi pengukuran harus diverifikasi oleh tes

eksperimen dengan sampel yang mengandung analit pada tingkat di dua

daerah..Gambar 6 menggambarkan batas kuantisasi (bersama dengan batas deteksi,

kisaran dan linieritas). Gambar 7 mengilustrasikan kedua batas deteksi dan batas

kuantisasi.

Kekasaran

Ketidakrataan tidak dibahas dalam dokumen ICH telah digantikan oleh

reproduktibilitas, yang memiliki arti yang sama seperti kekasaran, ditetapkan oleh

USP sebagai tingkat reprodusibilitas hasil diperoleh berdasarkan berbagai kondisi,

seperti yang berbeda laboratorium, analis, instrumen, kondisi lingkungan, operator

dan bahan. Ketidakrataan adalah ukuran reprodusibilitas hasil tes di bawah normal,

kondisi operasional diharapkan dari laboratorium ke laboratorium dan dari analis ke

analis. Ketidakrataan ditentukan oleh analisis aliquots dari banyak homogen di

laboratorium yang berbeda.

Robustness

Robustness tes yang menguji pengaruh parameter operasional terhadap hasil

analisis. Untuk penentuan ketahanan metode, sejumlah parameter metode, misalnya,

pH, laju alir, suhu kolom, volume injeksi, panjang gelombang deteksi atau komposisi

fase gerak, bervariasi dalam kisaran yang realistis, dan pengaruh kuantitatif dari

variabel-variabel ini ditentukan. Jika pengaruh parameter adalah dalam toleransi yang

ditentukan sebelumnya, parameter dikatakan dalam rentang's ketahanan metode.

Memperoleh data tentang efek-efek ini membantu untuk menilai apakah suatu

metode perlu revalidated ketika satu atau lebih parameter yang berubah, misalnya,

untuk mengkompensasi kinerja kolom dari waktu ke waktu. Dalam dokumen ICH,

dianjurkan untuk mempertimbangkan metode evaluasi yang ketahanan selama tahap

pengembangan, dan hasil yang sangat penting untuk metode ini harus

didokumentasikan. Ini bukan, bagaimanapun, diperlukan sebagai bagian dari

registrasi.

Stabilitas

Banyak zat terlarut mudah terurai sebelum investigasi kromatografi, misalnya,

selama penyusunan solusi sampel, ekstraksi, pembersihan, transfer fase atau

penyimpanan botol disiapkan (dalam lemari pendingin atau di sampler

otomatis).Dalam keadaan ini, pengembangan metode harus menyelidiki stabilitas

analit dan standar.

Sistem stabilitas jangka telah didefinisikan sebagai stabilitas dari sampel yang

dianalisis dalam larutan sampel. Itu adalah ukuran dari bias dalam hasil uji yang

dihasilkan selama suatu selang waktu terpilih, misalnya, setiap jam sampai 46 jam,

menggunakan solusi tunggal (Gambar 9). Stabilitas sistem harus ditentukan oleh

mereplikasi solusi analisis sampel. Sistem stabilitas yang dianggap pantas ketika

RSD, dihitung berdasarkan hasil uji yang diperoleh pada interval waktu berbeda,

tidak melebihi lebih dari 20 persen dari nilai yang sesuai dari sistem presisi. Jika,

merencanakan hasil uji sebagai fungsi waktu, nilai lebih tinggi, durasi maksimum

kegunaan larutan sampel dapat dihitung.

Gambar 9. Schematics stabilitas pengujian

Pengaruh penyimpanan jangka panjang dan siklus beku-thaw dapat diselidiki

dengan menganalisis sampel berduri segera setelah persiapan dan pada hari-hari

berikutnya periode penyimpanan diantisipasi. A minimum dua siklus pada dua

konsentrasi harus dipelajari dalam rangkap dua. Jika integritas obat dipengaruhi oleh

pembekuan dan thawing, sampel berduri harus disimpan dalam kontainer individu,

dan hati-hati yang tepat harus digunakan untuk studi sampel.

Parameter yang Harus Ada dalam Validasi Metode

Untuk proses validasi efisien, sangat penting untuk menentukan parameter

validasi yang tepat dan kriteria penerimaan. Parameter lebih, semakin banyak waktu

yang diperlukan untuk memvalidasi. Semakin ketat spesifikasi atau batas penerimaan,

semakin sering peralatan harus dikalibrasi ulang, dan mungkin juga dikualifikasi

ulang, untuk memenuhi spesifikasi yang lebih tinggi pada satu waktu. Hal ini tidak

selalu penting untuk setiap memvalidasi parameter kinerja analitis, tetapi perlu untuk

menentukan mana yang dibutuhkan.

Tugas AnalitikIdenti-

fikasi

Kenajisan

kuantitatif

Kenajisan

kualitatif

Assay

Cate 3

Ketepatan tidak tidak ya Ya

Ketelitian

- Pengulangan tidak ya tidak Ya

- Interim presisi tidak ya tidak Ya

- Reproduksibilitas tidak tidak tidak Tidak

Spesifikasi ya ya ya Ya

Batas deteksi tidak tidak ya Tidak

Batas kuantisasi tidak ya tidak Tidak

Linieritas tidak ya tidak Ya

Jarak tidak ya tidak ya *

Tabel 8. ICH Karakteristik

* Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat dari tes khusus

Tugas AnalitikAssay

Kategori 1

Cat 2

kuantitatif

Cat 3

kualitatif

Assay

Cate 3

Ketepatan ya ya * *

Ketelitian ya ya tidak Ya

Spesifikasi ya ya ya *

Batas deteksi tidak tidak ya *

Batas kuantisasi tidak ya tidak *

Linieritas ya ya tidak *

Jarak ya ya * *

Kekasaran ya ya ya *

Tabel 9. Karakteristik USP

* Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat dari tes khusus

Parameter validasi bergantung pada analisis tugas dan lingkup metode

ini.Sebagai contoh, baik USP dan ICH berisi bab-bab tentang prosedur validasi untuk

tugas-tugas analitik yang berbeda, yang keduanya termasuk untuk memberikan

beberapa ide tentang apa jenis validasi yang diperlukan untuk tugas yang berbeda

(lihat tabel 8 dan 9 ). Misalnya, menurut ICH, akurasi, presisi semua jenis dan batas

deteksi dan kuantisasi tidak diperlukan jika tugas analisis adalah identifikasi. Untuk

pengujian dalam 1 USP, kategori komponen utama atau bahan aktif yang akan diukur

biasanya hadir pada konsentrasi tinggi, sehingga validasi batas deteksi dan kuantisasi

tidak diperlukan.

Karena jenis analisis dan informasi yang harus diperoleh dari sampel memiliki

banyak pengaruh sebagainya validasi, tujuan dan ruang lingkup metode harus selalu

didefinisikan sebagai langkah pertama dari setiap validasi metode.

Referensi

1. US FDA - Pedoman untuk Industri (draft) Prosedur Analitis dan Metode Validasi:

Kimia, Manufaktur, dan Kontrol dan Dokumentasi, 2000

2. Konferensi Internasional Harmonisasi (ICH) Persyaratan Teknis Pendaftaran Farmasi

Manusia Penggunaan, Validasi prosedur analitis, Jenewa (1996)

3. US EPA, Bimbingan untuk metode pengembangan dan validasi metode untuk

Konservasi Sumber Daya dan Recovery Act (RCRA) Program, Washington DC

(1995)., http://www.epa.gov/sw-846/pdfs/methdev.pdf

4. JM Hijau, Sebuah panduan praktis untuk validasi metode analitik, Anal. Chem.Berita

& Fitur, 1 Mei 1996, hlm. 305A-309A.

5.  AOAC rekan-Verified Metode Program, Manual kebijakan dan prosedur, Arlington,

Va., USA (1998). http://www.aoac.org/vmeth/PVM.pdf

6. 16. Winslow PA dan RF Meyer, Mendefinisikan rencana induk untuk validasi metode

analisis, J. Validasi Teknologi, hal). 361-367 (1997.

7. J. Vessman, Selektivitas atau spesifisitas? Validasi metode analisis dari perspektif

kimiawan analitis dalam industri farmasi, J. Pharm & BioMed Analisis 14:867-869

(1996).

8. L. Huber dan S. George, diode-array deteksi dalam kinerja tinggi kromatografi cair,

New York, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-4 (1993).

VALIDASI METODE ANALISIS

UNTUK MEMENUHI TUGAS AKHIR SEMESTER IV

FAKULTAS MIPA, PRODI FARMASI,

MATA KULIAH ANALISIS FISIKOKIMIA 2

DISUSUN OLEH :

FARIDA ISKANATI (08613095)

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA

YOGYAKARTA

2009/2010