unud-320-1860003455-tesisgabung
-
Upload
nuii-ishaq -
Category
Documents
-
view
224 -
download
0
Transcript of unud-320-1860003455-tesisgabung
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
1/78
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek
yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang
cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki
keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan
(Shitandi et al.,2007; Dommels et al.,2009; Weichselbaum, 2009).
Probiotik umumnya dari golongan bakteri asam laktat (BAL), khususnya
genus Lactobacillus dan Bifidobacterium yang merupakan bagian dari flora
normal pada saluran pencernaan manusia (Sujaya et al. 2008b). Lactobacillus
merupakan probiotik yang dapat memberikan efek yang menguntungkan bagi
kesehatan seperti penanggulangan diare (Salazar et al.,2007; Pant et al.,2007 ;
Tabbers dan Benninga, 2007; Collado et al., 2009 ), menstimulasi sistem
kekebalan (immune) tubuh (Isolauri et al.,2001 ; Isolauri dan Salminen, 2008),
menurunkan kadar kolesterol (Pereira et al.,2003; Yulinery et al., 2006; Belviso
et al.,2009; Lee et al.,2010), pencegahan kanker kolon dan usus (Brady et al.,
2000; Pato, 2003; Liong, 2008), dan penanggulangan dermatitis atopik pada anak-
anak (Betsi et al.,2008; Torii et al.,2010).
Menurut Food and Agriculture Organization/World Health Organization
(FAO/WHO) (2001), idealnya strain probiotik seharusnya tidak hanya mampu
bertahan melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
2/78
2
berkembang biak dalam saluran pencernaan, tahan terhadap cairan lambung dan
cairan empedu dalam jalur makanan yang memungkinkan untuk bertahan hidup
melintasi saluran pencernaan dan terkena paparan empedu. Selain itu probiotik
juga harus mampu menempel pada sel epitel usus manusia, mampu membentuk
kolonisasi pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan zat anti mikroba
(bakteriosin), dan memberikan pengaruh yang menguntungkan kesehatan
manusia. Syarat lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi.
Strain probiotik juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan
makanan dan penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan
tahan terhadap proses psikokimia pada makanan (Prado et al.,2008).
Lactobacillus rhamnosus SKG34 yang diisolasi dari susu kuda Sumbawa
sangat berpotensi dikembangkan sebagai probiotik. Lactobacillus rhamnosus
SKG34 memiliki daya hambat yang besar terhadap pertumbuhan bakteri patogen.
(Sujaya et al. 2008b). Uji in vitro L. rhamnosus SKG34 mampu melewati
simulasi kondisi lambung dengan pH 3 dan 4, tidak mengubah asam kolat primer
(kolat) menjadi asam kolat skunder (deoksikolat), serta dapat menghidrolisis
garam empedu (Sujaya et al.,2008a).
Pengujian secara in vivo terhadap L. rhamnosus SKG34 perlu dilakukan
untuk menindaklanjuti hasil penelitian secara in vitro yang sudah dilaksanakan,
untuk mengetahui populasi L. rhamnosus SKG34 pada sekum dan pengaruhnya
terhadap kadar kolesterol serum darah dengan menggunakan hewan coba tikus
tutih (R. norvegicus), sebelum L. rhamnosus SKG34 dikembangkan dan
dikomersialkan sebagai probiotik.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130 -
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
3/78
3
1.2 Rumusan Masalah
Rumusan masalah yang diangkat dalam penelitian ini adalah :
1. Bagaimanakah populasiL. rhamnosus SKG34 pada sekum tikus putih (R.
norvegicus)
2. Bagaimanakah pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 terhadap kadar
kolesterol serum darah tikus putih (R. norvegicus)
1.3Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1. Untuk mengetahui populasi L. rhamnosus SKG34 pada sekum tikus putih
(R. norvegicus)
2. Untuk mengetahui pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34 terhadap
kadar kolesterol darah tikus putih (R. norvegicus)
1.4 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Memberikan informasi tentang populasi L. rhamnosus SKG34 pada
sekum tikus putih (R. norvegicus)
2. Memberikan informasi pengaruh pemberian L. rhamnosus SKG34
terhadap kadar kolesterol pada darah tikus putih (R. norvegicus)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
4/78
4
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Probiotik
Lilly dan Stillwell memperkenalkan istilah "probiotik" pada tahun 1965
untuk nama bahan yang dihasilkan oleh mikroba yang mendorong pertumbuhan
mikroba lain (FAO/WHO, 2001). Probiotik merupakan organisme hidup yang
mampu memberikan efek yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila
dikonsumsi dalam jumlah yang cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002;
ISAPP, 2009) dengan memperbaiki keseimbangan mikroflora intestinal pada saat
masuk dalam saluran pencernaan (Shitandi et al.,2007; Dommels et al.,2009;
Weichselbaum, 2009).
Probiotik telah banyak dimanfaatkan untuk penanggulangan penyakit
gastroenteritis seperti diare (Salazar et al.,2007; Pant et al.,2007 ; Tabbers dan
Benninga, 2007; Collado et al.,2009 ), menstimulasi sistem kekebalan (immune)
tubuh (Isolauri et al., 2001 ; Isolauri dan Salminen, 2008), menurunkan kadar
kolesterol (Pereira et al.,2003; Yulinery et al., 2006; Belviso et al.,2009; Lee et
al.,2010), pencegahan kanker kolon dan usus (Brady et al.,2000; Pato, 2003;
Liong, 2008), penanggulangan dermatitis atopik pada anak-anak (Betsi et al.,
2008; Torii et al., 2010), menanggulangi penyakit irritable bowel syndrome
(Malinen et al.,2010; Lyra et al.,2010), penatalaksanaan alergi (Vanderhoof,
2008), pencegahan dan penanganan penyakit infeksi (Wolvers et al., 2010).
Probiotik dapat memproduksi bakteriosin untuk melawan pathogen yang
bersifat selektif hanya terhadap beberapa strain patogen. Probiotik juga
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
5/78
5
memproduksi asam laktat, asam asetat, hidrogen peroksida, laktoperoksidase,
lipopolisakarida, dan beberapa antimikrobial lainnya. Probiotik juga
menghasilkan sejumlah nutrisi penting dalam sistem imun dan metabolisme host,
seperti vitamin B (Asam Pantotenat), pyridoksin, niasin, asam folat, kobalamin,
dan biotin serta antioksidan penting seperti vitamin K (Adams, 2009).
Manfaat probiotik bagi kesehatan tubuh dapat melalui 3 (tiga) mekanisme
fungsi: (1) fungsi protektif, yaitu kemampuannya untuk menghambat patogen
dalam saluran pencernaan. Terbentuknya kolonisasi probiotik dalam saluran
pencernaan, mengakibatkan kompetisi nutrisi dan lokasi adhesi (penempelan)
antara probiotik dan bakteri lain, khususnya patogen. Pertumbuhan probiotik juga
akan menghasilkan berbagai komponen anti bakteri (asam organik, hidrogen
peroksida, dan bakteriosin yang mampu menekan pertumbuhan patogen)
(Rahayu, 2008; Collado et al.,2009) ; (2) fungsi sistem imun tubuh, yaitu dengan
peningkatan sistem imun tubuh melalui kemampuan probiotik untuk menginduksi
pembentukan IgA, aktivasi makrofag, modulasi profil sitokin, serta menginduksi
hyporesponsiveness terhadap antigen yang berasal dari pangan.; (3) fungsi
metabolit probiotik yaitu metabolit yang dihasilkan oleh probiotik, termasuk
kemampuan probiotik mendegradasi laktosa di dalam produk susu terfermentasi
sehingga dapat dimanfaatkan oleh penderita lactose intolerance(Rahayu, 2008).
Efek probiotik terhadap kesehatan dan mekanismenya dalam tubuh
disajikan pada Tabel 2.1.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
6/78
6
Tabel 2.1.
Efek probiotik terhadap kesehatan dan mekanismenya dalam tubuh
Manfaat Fungsi Mekanismenya
1.Membantupencer-naan
a.Irritable bowel syndrome,mengurangigejala saluran cerna (konstipasi, diarenon patogenik, flatulensi, kram, nafasyang berbau penyebab dari gangguanpencernaan)
b. Intoleran terhadap laktosa
- Perubahan populasi atau aktivitasdari mikroflora usus
- Pemindahan mikroba laktase ke
usus halus2. Sebagai
pertahanantubuh
a. Alergi (eksema atopik, alergi terhadap
susu, rematik artritis)
- Translokasi, efek barrier
b. Kariogenik - Perubahan populasi, aktivitasmikroflora oral atau yangmenempel pada gigi
c.Karsinogenik, mutagenik, tumor - Penyerapan mutagen, merangsang
sistem imun, penghambatanproduksi karsinogen olehmikroflora usus
d. Diare karena penggunaan antibiotika,diare yang disebabkan olehRotavirus, Kolitis yang disebabkanoleh C. difficile, diare nosokomial
- Kompetisi pengeluaran,translokasi/efek barrier,meningkatkan respon imun
e. Peradangan usus, Kolitis ulserasi,Penyakit Crohns
- Penurunan regulasi respon imun
f. Pertumbuhan bakteri usus yangberlebihan
- Aktivitas antimikroba,pengeluaran kompetisi
g. Imunomodulasi (status imun, responvaksin)
h. Vaginosis, infeksi saluran kemih
- Interaksi dengan sel imun untukmeningkatkan aktivitas pagositosisdari sel darah putih, meningkatkanIgA setelah kontak dengan antigen.Meningkatkan proliferasi lekositintra epitel, regulasi Th1/Th2,induksi sitosis sitokin
- Aktivitas antipatogenik,pengeluran kompetisi3. Manfaatyang lain
a. Menurunkan kolesterol darah - Dekonjugasi garam empedu
b. Endotoksemia dengan sirosis - Penghambatan produksiendotoksin oleh mikroflora usus
c. Hipertensi - Unsur seluler atau peptida yangberasal dari aktivitas fermentasisebagai penghambatan ACE(Angiotensin Converting Enzyme)
d. Batu ginjal - Perubahan pencernaan yangmempengaruhi pemecahan oksalat
Sumber : Sanders (2003) dalamToma dan Pokrotnieks (2006)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
7/78
7
Konsumsi probiotik biasanya diaplikasikan pada pembuatan produk
pangan olahan seperti; yogurt, keju, minuman penyegar, es krim, yakult, permen
dan yogurt beku (Senok, 2009; Granato et al., 2010). Jumlah minimal strain
probiotik yang ada dalam produk makanan adalah sebesar 106CFU/g atau jumlah
strain probiotik yang harus dikonsumsi setiap hari sekitar 108 CFU/g, dengan
tujuan untuk mengimbangi kemungkinan penurunan jumlah bakteri probiotik pada
saat berada dalam jalur pencernaan (Shah, 2007).
Beberapa jenis bakteri probiotik yang sering digunakan dalam industri
makanan seperti : Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
johnsonii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus
reuteri, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium longum, Bifidobacterium brevis, Bifidobacterium infantis,
Bifidobacterium animalis (Granato et al., 2010), Enterococcus faecalis,
Enterococcus faecium, Sporolactobacillus inulinus (Holzapfel dan Schillinger,
2002),Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, dan Streptococcus
thermophilus (Senok, 2009). Mikroba yang sering digunakan sebagai probiotik
dapat dilihat pada Tabel 2.2.
Aspek keamanan dan fungsional menjadi pertimbangan utama dalam
proses seleksi mikroba probiotik. Aspek keamanan seperti : menyehatkan saluran
pencernaan), bersifat non patogen, dan tahan terhadap antibiotik. Aspek
fungsional seperti kemampuan hidup dan tahan dalam saluran pencernaan,dapat
diaplikasikan pada dunia industri, dan tidak menimbulkan aroma yang
menyimpang pada makanan (Saarela et al.,2000; Prodo et al., 2008).
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b149http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b67http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b149 -
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
8/78
8
Tabel 2.1.
Mikroba yang sering digunakan sebagai Probiotik
BALSelain spesies
BALLactobacillus Bifidobacterium Spesies BAL yang
lain
Lactobacillus
acidophilus
Bifidobacterium
adolescentis
Enterococcus
faecalis
Bacillus cereus
var. toyoi
Lactobacillus
casei
Bifidobacterium
animalis
Enterococcus
faecium
Escherichia coli
strain nissle
Lactobacillus
amylovorus
Bifidobacterium
bifidum
Lactococcus lactis Propionibacterium
freudenreichii
Lactobacillus
delbrueckii subsp
bulgaricus
Bifidobacterium
breve
Leuconostoc
mesenteroides
Saccharomyces
cerevisiae
Lactobacillus
gallinarum
Bifidobacterium
infantis
Pediococcus
acidilactici
Saccharomyces
boulardii
Lactobacillus
gasseri
Bifidobacterium
lactis
Steptococcus
thermophilus
Lactobacillus
johnsonii
Bifidobacterium
longum
Sporolactobacillus
inulinus
Lactobacillus
paracasei
Lactobacillus
plantarum
Lactobacillusreuteri
Lactobacillus
rhamnosusSumber : Holzapfel et al. (2001).
Menurut Food and Agriculture Organization/World Health Organization
(FAO/WHO) (2001), mikroba probiotik, seharusnya tidak hanya mampu
bertahan melewati saluran pencernaan tetapi juga memiliki kemampuan untuk
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
9/78
9
berkembang biak dalam usus. Ini berarti mikroba probiotik harus tahan terhadap
cairan lambung dan dapat tumbuh dalam cairan empedu yang terdapat dalam
saluran pencernaan, atau dikonsumsi dalam jalur makanan yang memungkinkan
untuk bertahan hidup melintasi saluran pencernaan dan terkena paparan empedu.
Selain itu probiotik juga harus mampu menempel pada permukaan enterosit,
mampu membentuk kolonisasi pada saluran pencernaan, mampu menghasilkan
zat anti mikroba (bakteriosin), dapat berkembang biak dengan baik, dan
memberikan pengaruh yang menguntungkan kesehatan manusia. Hal yang penting
lainnya adalah tidak bersifat patogen dan aman jika dikonsumsi. Strain probiotik
juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan makanan dan
penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan tahan terhadap
proses psikokimia pada makanan (Prado et al.,2008).
2.2 Kolesterol
Kolesterol merupakan produk khas hasil metabolisme hewan. Oleh karena
itu kolesterol terdapat dalam makanan yang berasal dari hewan seperti kuning
telur, daging, hati, dan otak (Murray et al., 2003). Kolesterol banyak terdapat
pada membran sel. Kolesterol berwarna putih dan bersifat larut dalam air
(Hofmann, 2004). Kolesterol merupakan prekursor senyawa steroid lainnya
dalam tubuh, seperti: kortikosteroid, hormon seks, asam empedu dan vitamin D
(Murray et al., 2003), hormon adrenokortikoid, progesteron, esterogen, dan
testosteron (Hirakawa, 2005).
Sebagian besar kolesterol dibentuk di hati, walaupun semua sel mampu
memproduksi kolesterol (Hirakawa, 2005). Hati mensintesis sekitar 20 %
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130 -
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
10/78
10
kolesterol dalam tubuh. Total produksi kolesterol termasuk yang diserap dari
makanan dan hasil sintesa dalam tubuh kira-kira 1 g/hari. Jumlah kolesterol yang
direkomendasikan sekitar 300 mg/hari. (Gropper et al., 2005). Orang dewasa
normal, mensintesa kolesterol sekitar 1g/hari, dan mengkonsumsinya sekitar 0,3
g/hari. Kadar kolesterol dalam tubuh sekitar 150-200 mg/dl, yang digunakan
untuk mengatur sintesa de novo. Kecepatan sintesa kolesterol tergantung pada
intake kolesterol dari makanan (King, 2010).
Kolesterol dalam makanan diserap dari usus bersama lipid lainnya,
termasuk kolesterol yang disintesis dalam usus, diinkorporasikan ke dalam
kilomikron dan Very Low Density Lipoprotein (VLDL). Sebanyak 80-90%
kolesterol yang diserap, diesterifikasikan dengan asam lemak rantai panjang
dalam getah bening (Murray et al., 2003). Potter (2007) menyatakan bahwa
kolesterol dari makanan sebesar 335 mg/hari masuk ke saluran pencernaan dalam
bentuk kilomikron. Selanjutnya masuk ke hati dan mengalami sintesa sebanyak
800 mg/hari. Kilomikron yang masuk ke hati disintesa menjadi HDL dan VLDL.
Very Low Density Lipoprotein selanjutnya diubah menjadi LDL, dan bersama
dengan HDL masuk ke jaringan periperal, kulit, dan kelenjar endokrin. Diagram
peredaran kolesterol dalam tubuh disajikan pada Gambar 2.1.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
11/78
11
KOLESTEROL
Gambar 2.1. Peredaran kolesterol dalam tubuh (Potter, 2007).
Kolesterol dalam tubuh diserap dalam bentuk asam kolat di hati yang
dikonjugasikan dengan bahan lain membentuk garam empedu. Garam empedu
membantu pencernaan dan penyerapan lemak (Hofmann, 2004; Hirakawa, 2005).
Kolesterol dari makanan dan hasil sintesa digunakan dalam pembentukan
membran dan sintesa hormon steroid dan asam empedu. Sebagaian besar jumlah
kolesterol digunakan dalam proses sintesis asam empedu (King, 2010).
Berdasarkan kerapatannya (densitas), kolesterol dapat di bedakan menjadi:
kilomikron, Very Low Density Lipoprotein (VLDL), Low Density Lipoprotein
(LDL),High Density Lipoprotein(HDL). Dari keempat jenis lipoprotein tersebut,
LDL memiliki kadar kolesterol yang paling tinggi, sedangkan kadar protein
Saluran
Pencernaan
Sterol Kulit
(85mg/hari)
HormonSteroid
(50mg/hari)
Kelenjar
Endokrin
Kulit
Asam
Empedu
(400mg/hari)
Feses
Makanan
Jaringan
Periperal
Hati
Sintesa
Kolesterol
(800mg/hari)
Kilomikron
LDL
VLDL
HDL
Kolesterol
makanan
(335mg/hari
Kolesterol
Empedu
(600mg/har
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
12/78
12
tertinggi terdapat pada HDL (Gropper et al.,2005; Hirakawa, 2005). Selain itu
ada juga Intermediate Density Lipoprotein (IDL), yang memiliki densitas antara
VLDL dan LDL. Kilomikron merupakan lipoprotein pertama yang dibentuk dari
konsumsi lemak. Selain kilomikron, lipoprotein lainnya merupakan hasil sintesa
lemak dalam tubuh (Gropper et al.,2005).
Kolesterol diedarkan ke seluruh sel oleh LDL dan HDL (Hirakawa, 2005).
Low Density Lipoprotein merupakan komponen lipoprotein yang terbesar
membawa kolesterol (60% total serum kolesterol), ke jaringan tubuh, yang
digunakan untuk pembentukan membran atau dimetabolisme menjadi hormon
steroid. High Density Lipoprotein memiliki peran yang bertentangan dengan
LDL, yaitu mengangkut kolesterol dan lipoprotein lainnya yang sudah
terakumulasi dari sel dan mengembalikan kolesterol ke hati untuk selanjutnya
diekskresikan dalam empedu (Gropper et al.,2005).
Jumlah LDL yang berlebihan dapat menyebabkan penyumbatan arteri dan
meningkatkan resiko penyakit jantung dan stroke. Sebaliknya konsentrasi HDL
yang tinggi dalam darah dapat menurunkan resiko penyakit jantung. Penyakit
jantung koroner dan stroke merupakan penyebab utama kematian dan kejadian
cacat di seluruh dunia. Tingginya kandungan total kolesterol darah sangat
berhubungan dengan peningkatan resiko penyakit jantung koroner. Kadar LDL
diatas 100 mg/dl dan kadar HDL dibawah 40 mg/dl dapat meningkatkan resiko
penyakit kardiovaskular (Hirakawa, 2005; Baigent dan Clarke, 2008).
Beberapa strain BAL mampu memetabolisme kolesterol dari makanan
dalam usus halus sehingga tidak diserap oleh tubuh. Lactobacillus sp F2.13,
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
13/78
13
strain endogen Indonesia mampu menurunkan kadar kolesterol total sebesar 33%
(Nursini, 2010). Bifidobacterium infantis 17930, memiliki kemampuan
dekonjugasi garam empedu paling tinggi dan aktivitas Bile salt hydrolase (BSH)
lebih baik (Liong dan Shah, 2005).
Mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan oleh
enzim BSH yang mendekonjugasi garam empedu, dimana glisin atau taurin
dipisahkan dari steroid, sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau
terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan garam empedu terdekonjugasi dalam
bentuk asam kolat bebas yang kurang diserap oleh usus halus. Dengan demikian
garam empedu yang kembali ke hati selama sirkulasi enterohepatik menjadi
berkurang, sehingga total kolesterol dalam tubuh menjadi berkurang. Beberapa
jenis BAL memiliki dinding sel yang mampu mengikat kolesterol dalam usus
halus sebelum kolesterol diserap oleh tubuh (Surono, 2004; Ooi dan Liong, 2010).
Enzim BSH akan memberikan keuntungan khusus bagi strain bakteri
probiotik yang tumbuh pada lingkungan yang penuh persaingan dalam saluran
pencernaan dengan memberikan daya tahan yang lebih baik terhadap garam
empedu, serta membantu dalam menurunkan kadar kolesterol darah (Begley et
al.,2006; Noriega et al.,2006; Patel et al., 2010). Bile salt hydrolasedimiliki
oleh beberapa strain bakteri saluran pencernaan seperti: Lactobacillus,
Enterococcus, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus, danBacteroides
(Ooi dan Liong, 2010)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
14/78
14
2.3 Empedu
Pembentukan empedu sangat penting dalam pencernaan dan penyerapan
lemak, ekskresi xenobiotik larut lemak dan racun dalam tubuh, dan keseimbangan
kadar kolesterol. Garam empedu secara alamiah bersifat amphipilik karena
memiliki gugus polar dan non polar. Gugus polar memiliki permukaan yang
bersifat hidrofilik yang mengandung gugus hidroksil dan gugus karbonil,
sedangkan gugus non polar bersifat hidropobik (Salen dan Batta, 2004).
Cairan empedu merupakan gabungan antara asam empedu dan garam
empedu. Bilirubin tetrapyrrole (berwarna coklat), merupakan komponen pemberi
warna terbesar pada empedu dan merupakan produk akhir dari metabolisme heme.
Apabila bilirubin mengalami oksidasi akan berubah menjadi biliverdin (berwarna
hijau) (Bijl et al.,2009).
Garam empedu bersama pospolipid dan kolesterol merupakan cairan
organik terbesar dalam empedu dan merupakan kunci kekuatan dalam
pembentukan empedu pada saat di sekresikan ke canalikuli empedu melewati
membran apikal hepatosit(Beuers dan Pusl, 2004)
Komponen utama asam empedu dalam empedu manusia yaitu asam
xenodeoksikolat (45%) dan asam kolat (31%). Sebelum sebagian besar garam
empedu disekresikan ke lumen canalikuli, terlebih dulu terjadi konjugasi dengan
ikatan amida pada terminal gugus karboksil dengan asam amino glisin dan taurin.
Reaksi konjugasi ini menghasilkan glycoconjugates dan tauroconjugates.
Sebanyak 95% dari total garam empedu yang disintesa di hati diserap oleh usus
distal dan dikembalikan lagi ke hati. Proses sekresi dari hati ke gallbladder,
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
15/78
15
kemudian ke usus, dan akhirnya diserap kembali disebut siklus enterohepatik.
Jumlah total garam empedu yang mengalami siklus berulang-ulang melalui siklus
enterohepatik sekitar 3,5 g. Jumlah tersebut bersirkulasi dua kali per makan dan 6-
8 kali per hari. Apabila empedu tidak ada di usus, maka hapir 50% lemak yang
dimakan akan keluar melalui feses (Ganong, 2002; King, 2010). Siklus
enterohepatik garam empedu dapat dilihat pada Gambar 2.2.
Gambar 2.2. Siklus enterohepatik garam empedu (Ganong, 2002)
Produk akhir dari penggunaan kolesterol adalah asam empedu. Sintesa
asam empedu merupakan mekanisme utama untuk mengeluarkan kelebihan
kolesterol. Ekskresi kolesterol dalam bentuk asam empedu tidak cukup untuk
mengimbangi kelebihan intake kolesterol dari makanan. Walaupun sintesa asam
empedu merupakan jalan untuk proses katabolisme kolesterol, campuran terlarut
antara kolesterol dari makanan, lemak, dan zat gizi essensial juga penting untuk
memperlancar transportnya ke hati. Proses sintesa asam empedu membutuhkan
Garis yang tidak terputusyang masuk ke dalam sistem
portal merupakan garam
empedu yang berasal dari
hati, sedangkan garis
terputus-putus menunjukkan
garam empedu yang
terbentuk akibat aktivitas
bakteri
Kandung kemihSistem portal
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
16/78
16
kerja 17 enzim dan berlangsung di beberapa bagian intraseluler termasuk sitosol,
retikulum endoplasma, mittokondria, dan peroxisom (King, 2010).
2.4 Bakteri Asam Laktat
Mikroba yang terdapat di dalam saluran pencernaan sangat kompleks dan
merupakan komunitas yang dinamis. Total mikroba yang terdapat di saluran
pencernaan diperkirakan mencapai 1012 sel setiap gram isi dengan total sekitar
1015 yang terdiri dari lebih 1000 spesies, atau diperkirakan sekitar 3000-4000
spesies. Berat mikroorganime ini mencapai 1,5 kg di dalam tubuh dan
menyumbang 60% berat feses (Rahayu, 2008).
Bakteri asam laktat merupakan famili yang bersifat heterogenus, gram
positif, anaerob, tidak berspora, dan merupakan bakteri yang tahan terhadap
asam. Bakteri asam laktat dapat memfermentasi berbagai jenis zat gizi baik
secara homofermentatif maupun heterofermentatif terutama menghasilkan asam
laktat, selain itu juga dapat mengasilkan asam asetat, asam format, etanol, dan
CO2. Bakteri asam laktat tidak hanya dapat mengubah rasa makanan menjadi
asam dalam waktu singkat, tetapi juga akan merubah flavor, tekstur, dan
kandungan zat gizi makanan tersebut. Bakteri asam laktat secara alami ditemukan
pada tanaman, daging, susu dan hasil olahannya, dan hasil fermentasi serealia, dan
sudah lama digunakan dalam industri makanan dalam skala besar atau industri
rumah tangga, serta makanan hasil fermentasi. Bakteri asam laktat digunakan
sebagai starter untuk fermentasi sayur atau daging (Liu et al., 2005;
Klaenhammer et al.,2005).
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
17/78
17
Bakteri asam laktat termasuk golongan bakteri mikroaerofilik, yang
memfermentasi heksosa menghasilkan asam laktat. Bakteri asam laktat yang
banyak digunakan dalam dunia industri adalah spesies Lactococcus,
Enterococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Leuconostoc, dan
Lactobacillus (Makarova et al., 2006 ; O'Sullivan et al., 2009). Spesies BAL
dalam memetabolisme hexosa dapat melalui dua proses fermentasi, yaitu
homofermentatif, dimana BAL hanya menghasilkan asam laktat, dan
heterofermentatif, dimana selain menghasilkan asam laktat BAL juga
menghasilkan CO2, asam asetat, dan etanol (Makarova et al.,2006).
Bakteri asam laktat juga dapat menghasilkan peptida antimikroba seperti
bakteriosin, sebagai contoh adalah L. salivarius UCC118, yang sangat efektif
untuk menekan pertumbuhan L. monocytogenes. Beberapa spesies yang biasa
ditemukan pada saluran pencernaan manusia dan hewan, kadang-kadang juga
dapat menimbulkan penyakit. Penyakit yang disebabkan oleh kolonisasi BAL
patogen seperti; infeksi saluran kencing, bakterimia, endokarditis, divertikulatis,
dan meningitis (O'Sullivan et al., 2009).
2.5 Lactobacillus
Genus Lactobacillus terdiri atas banyak kelompok termasuk beberapa
spesies yang digunakan untuk fermentasi dan pengawetan makanan. Beberapa
Lactobacillus merupakan probiotik, yang dapat memberikan efek yang
menguntungkan bagi kesehatan hostnya (Claesson et al.,2007). Lactobacillusdi
tubuh manusia biasanya ditemukan pada vagina dan saluran pencernaan, dimana
bisanya bersimbiosis menjadi bagian kecil dari mikroflora usus. Asam laktat
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
18/78
18
yang dihasilkan membuat lingkungan menjadi asam, yang dapat menghambat
pertumbuhan bakteri berbahaya (Wikipedia, 2010).
Lactobacillus merupakan bakteri gram positif yang berbentuk batang
termasuk dalam kelompok (BAL). Lactobacillus memiliki karakter tergantung
spesies seperti obligat/fakultatif, homo/heterofermentatif dalam perannya
mengubah susu menjadi asam dan sering dimanfaatkan untuk membuat produk
olahan terfermentasi seperti keju, yogurt, dan susu terfermentasi lainnya.
Lactobacillus merupakan kelompok bakteri heterogenus yang terdiri atas 135
spesies dan 27 subspesies (Bernardeau et al.,2008).
Lactobacillusdiisolasi dari isi perut orang sehat, pertama kali pada tahun
1983, pada saat itu menunjukkan ketahanan yang luar biasa terhadap asam kuat
yang biasa terdapat pada saluran pencernaan. Lactobacillus dapat menurunkan
kolesterol dan memberikan efek hipokolesterolemia (Lye et al., 2010).
Lactobacillus sp. Dad 13 yang diisolasi dari dadih terbukti ampuh menurunkan
kolesterol (Rusfidra, 2006). Lactobacillusrhamnosus akan memberikan pengaruh
yang menguntungkan pada saluran pencernaan, sangat berperan dalam
peningkatan sistem imun, terutama dalam melawan patogen yang ada dalam
saluran pencernaan dan saluran kencing (Adams, 2009).
Antarini (2010) menyatakan bahwa pada produk susu terfermentasi
pertumbuhanL. rhamnosus SKG34 sebesar 2,5 x 108 sampai 7,6 x 109 cfu/ml,
serta peningkatan protein terlarut 0,046% - 0,084%, peningkatan asam amino
bebas seperti asam aspartat, asam glutamat, serin, histidin, glisin, treonin, alanin,
tirosin, metionin, isoleusin, leusin, dan lisin.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
19/78
19
BAB III
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN
3.1 Kerangka Konsep
Probiotik merupakan organisme hidup yang mampu memberikan efek
yang menguntungkan kesehatan hostnya apabila dikonsumsi dalam jumlah yang
cukup (FAO/WHO, 2001; FAO/WHO, 2002; ISAPP, 2009) dengan memperbaiki
keseimbangan mikroflora intestinal pada saat masuk dalam saluran pencernaan
(Shitandi et al.,2007; Dommels et al.,2009; Weichselbaum, 2009).
Bakteri asam laktat termasuk golongan bakteri mikroaerofilik, gram
positif yang memfermentasi heksosa menghasilkan asam laktat. Bakteri yang
termasuk BAL, sering digunakan dalam dunia industri (Makarova et al.,2006).
Beberapa jenis BAL seperti L. rhamnosus ATCC 53013 dan L. acidophilus
NCFM, merupakan bakteri probiotik (O'Sullivan et al., 2009). Sujaya et al.
(2008b) menyatakan bahwa bakteri probiotik yang banyak beredar di pasaran
umumnya dari golongan BAL. Adanya klaim menyehatkan, telah memicu
perburuan strain BAL dari berbagai sumber alami, seperti saluran pencernaan,
susu manusia dan hewan serta makanan terfermentasi tradisional.
Beberapa aspek seperti keamanan, fungsional, dan karakterisasi teknologi
menjadi pertimbangan utama dalam proses seleksi mikroba probiotik. Aspek
keamanan termasuk spesifikasi seperti : kemurniannya (menyehatkan saluran
pencernaan), bersifat non patogenik, dan tahan terhadap antibiotik. Aspek
fungsional seperti kemampuan hidup dan tahan dalam saluran pencernaan,
imunomodulation, bersifat antagonis, dan tidak mengalami mutasi (Saarela et al.,
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
20/78
20
2000). Strain probiotik juga harus tahan dan tetap hidup selama proses pengolahan
makanan dan penyimpanan, mudah diaplikasikan pada produk makanan, dan
tahan terhadap proses psikokimia pada makanan (Prado et al.,2008).
FAO/WHO (2002) menyatakan bahwa sebelum dapat dinyatakan sebagai
bakteri probiotik, kandidat probiotik harus melewati uji in vitro dan uji in vivo.
Uji in vitro meliputi uji ketahanan pada saluran cerna termasuk resistensi terhadap
asam lambung dan asam empedu, uji aktivitas antimikrobial, uji adhesif pada sel
eritrosit, uji aktivitas enzim bile salt hydrolase, dan kemampuan untuk
menurunkan jumlah bakteri patogen. Uji-uji tersebut dilakukan untuk
menghindari terjadinya efek negatif akibat mengkonsumsi probiotik.
Lactobacillus rhamnosus SKG34 yang diisolasi dari susu kuda Sumbawa,
merupakan kandidat probiotik lokal Indonesia yang sangat berpotensi untuk
dikembangkan sebagai probiotik.Lactobacillus rhamnosus SKG34 telah melewati
uji in vitrodiantaranya, memiliki daya hambat yang besar terhadap pertumbuhan
bakteri pathogen (Sujaya et al., 2008b), mampu melewati simulasi kondisi
lambung, dengan pH 3 dan 4 tidak mengubah asam kolat primer (kolat) menjadi
asam kolat skunder (deoksikolat), serta mampu menghidrolisis garam empedu
Sujaya et al. (2008a)
Saat ini perlu dilakukan uji lanjutan untuk mengetahui populasi L.
rhamnosus SKG34 pada sekum tikus putih (R. norvegicus) dan kemampuannya
untuk menurunkan kadar kolesterol darah tikus putih (R. norvegicus). Diagram
kerangka konsep penelitian disajikan pada Gambar 3.1.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1541-4337.2010.00120.x/full#b130 -
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
21/78
21
Gambar 3.1. Kerangka konsep pengembangan probiotik L .rhamnosus
SKG34
Keterangan :
Tulisan tebal dan digarisbawahi merupkan variable yang diteliti
Parameter yang diteliti dalam penelitian ini, yaitu :
1. Populasi L. rhamnosusSKG34 pada sekum tikus putih (R. norvegicus)
2. Kemampuan L. rhamnosus SKG34 menurunkan kadar kolesterol darah
tikus putih (R. norvegicus)
Kandidat probiotik
Lactobacillus rhamnosusSKG34
Uji in vivo :
A. Ketahanan pada saluran cerna
Populasi pada sekum
B. Efek fungsional :
Kadar kolesterol
Sistem imunAlergi
Konstipasi
Kanker kolon
dan lain sebagainya
Uji in vitro :
A. Ketahanan pada saluran cerna
Resistensi asam lambung
Resistensi asam empedu
B. Aktivitas antimikrobial
C. Adhesif pada sel eritrositD. Bile salt hydrolase
E. dan lain sebagainya
Probiotik potensial
Lactobacillus rhamnosusSKG34
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
22/78
22
3.2 Hipotesis Penelitian
Hipotesis penelitian ini yaitu :
1. Lactobacillus rhamnosus SKG34 dapat bertahan dan melewati
percernaan bagian atas dan ditemukan pada sekum tikus putih (R.
norvegicus).
2. Lactobacillus rhamnosus SKG34 berpengaruh terhadap kadar kolesterol
darah tikus putih (R. norvegicus).
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
23/78
23
BAB IV
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian laboratorium untuk menghitung
populasi L. rhamnosusSKG34 pada sekum dan mengukur kadar kolesterol darah
tikus putih (R. norvegicus). Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini
adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua perlakuan, yaitu kontrol dan
perlakuan pemberianL. rhamnosusSKG34. Setiap perlakuan diulang 6 kali.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di UPT Laboratorium Biosain dan
Bioteknologi Universitas Udayana. Penelitian ini berlangsung selama 5 bulan
dari bulan MaretJuli 2011.
4.3 Alat Penelitian
Jenis peralatan yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain:
a. Pemeliharaan hewan coba (tikus putih)
Alat yang dipergunakan adalah: kandang, timbangan, selop tangan, masker,
sonde, keranjang, kawat, tempat makan dan minum, dan sekam padi
(Lampiran 8).
b. Penyegaran materi hidup, penghitungan koloni bakteri dan pembuatan
suspensi bakteri
Alat yang digunakan adalah: tabung reaksi (iwaki-pyrex), Erlenmeyer (iwaki-
pyrex), gelas beaker (iwaki-pyrex), gelas ukur (iwaki-pyrex), magnetic stirrer,
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
24/78
24
stirer bar (iwaki BS-38), cawan petri (iwaki-pyrex), batang kaca bengkok,
kaca objek, cover glass, tabung eppendorf 1,5 ml, timbangan (Shimadzu
AUX 220), autoklaf (all American modelno. 1925), kompor (Rinai, RI 522
C), luminar air flow cabinet (ESCO), inkubator (Memmert), mikroskop
(Olympus), jarum ose, pipetman (Gilson) ukuran 1000 l, 200 l, tips biru,
kuning (porex bio product), sentrifugasi (Hitachi), vortex (Labinco), kulkas
(Toshiba), frezzer -20oC, chamber anaerobic(Oxoid), dan kertas tissue.
c. Pengukuran pH
Alat yang digunakan adalah: pH meter (TOA ion meter IM 40S), tabung
reaksi (iwaki-pyrex), vortex (Labinco), dan kertas tissue.
d. Pengujian RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) dan PCR
(Polymerase Chain Reaction) sel lisat hasil isolasi.
Alat yang digunakan adalah: tabung eppendorf 1,5 ml, microtube 100 l
(Treff), pipetman (Gilson) ukuran 20 l, 200 l, tips biru, kuning, kristal
(porex bio product), sentrifuge (Hitachi), vortex (Labinco), freezer -20o C,
microwave (Samsung), mesin PCR (Invinegen), mesin elektroforesis set
(Cosmo bio), UV transluminator (Edvotek model TM-10), selop tangan, dan
kertas tissue.
e. Pengukuran kadar kolesterol
Alat yang digunakan adalah: tabung reaksi (iwaki-pyrex), sentrifuge,
spektrofotometer (Genesys20 model 4001/4), dan kertas tissue.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
25/78
25
4.4 Bahan Penelitian
Jenis bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini antara lain:
a. Pemeliharaan tikus
Bahan yang diperlukan adalah: jagung, kacang hijau, telur, dan air. Hewan
percobaan yang digunakan adalah tikus putih (R. norvegicus) jantan yang
berumur 5 minggu dengan bobot 40-50 gram yang diperoleh dari tempat
penangkaran di Jalan Ceningan Sari, Gang Anyar Sari, Sesetan, Denpasar
(Bapak Minggu).
b. Penyegaran materi hidup, penghitungan koloni bakteri, dan pembuatan
suspensi bakteri
Bahan yang digunakan adalah: materi hidup L. rhamnosus SKG34
(UNUDCC), media deMan Rogosa Sharpe broth (MRS) broth (Pronadisa)
media MRS agar (Pronadisa), anaerob agar (Pronadisa),Bromo cresol purple
(BCP), gliserol (Pronadisa), anaerob gas generating kit (oxoid), gram stein
(Bio analitika), hydrogen peroksida (H2O2) (Reidel-de Haen), NaCl (Merck),
alkohol 70% (Brataco chemical), dan aquades.
c. Pengukuran pH
Bahan yang digunakan adalah: buffer pH 4 dan 7, aquades, dan kertas tissue.
d. Pengujian RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sel lisat hasil isolasi
Bahan yang digunakan adalah: agarose (Pronadisa),PCR mix (Intron), primer
M 13F dengan urutan basa (sequences) 5-CGA CGT TGT AAA ACG ACG
GCC AGT-3, deionize water, DNA, Tris Acetic EDTA (TAE) 1X, loading
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
26/78
26
buffer, ethidium bromide (Bio rad), kit isoplant II (isoplant code no. 310-
04151, Nippon Gene, Toyama, Japan), dan kertas tissue
e. Pengujian PCR sel lisat hasil isolasi
Bahan yang digunakan 0,2 mM dNTPs, 1 X PCR Buffer 10 X, 0,6 mM
MgCl2, 0,9 U AmpliTaq, primer spesifik Lactobacillus rhamnosus; Lu5 F
(5-CTA GCG GGT GCG ACT TTG TT-3) dan Rhall R (5-GCG ATG
CGA ATT TCT ATT ATT-3), masing-masing 10 pmol, deionize water,
DNA, TAE 1X, loading buffer, ethidium bromide (Bio rad), DNA marker
(Amresco, Solon, Ohio), dan kertas tissue.
Tabel 3.1
Primer yang dipergunakan dalam penelitian
Primer Sequence (5-3) Sumber Pustaka
M 13
LU5
RhaII
CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
CTAGCGGGTGCGACTTTG TT
GCGATGCGAATTTCTATTATT
Vassart, et al., 1987
Song et al., 2000
Song et al., 2000
f. Pengukuran kadar kolesterol
Bahan yang digunakan adalah: kit kolesterol (Analyticon 200 mg/dl) aquades,
dan kertas tissue.
4.5 Penyegaran Materi Hidup
Stok isolat L. rhamnosus SKG34 yang disimpan dalam gliserol 30%
pada suhu -20o C, diambil sebanyak satu loop ose dan diinokulasikan dalam
tabung reaksi yang berisi 5 ml media MRS broth. Tabung reaksi diinkubasi pada
suasana aerob selama 24 jam pada suhu 37oC. Hasil positif ditunjukkan dengan
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
27/78
27
timbulnya kekeruhan pada tabung reaksi. Selanjutnya dilakukan uji konfirmasi
untuk memastikan bahwa isolat tidak mengalami perubahan. Uji ini diantaranya:
uji gas, katalase, pengecatan gram, dan morfologi. Bila tidak terjadi perubahan,
maka hasil positif ini (kultur) akan dipergunakan untuk tahap pengujian
selanjutnya (Portugal et al.,2006).
4.5.1 Uji Gas
Uji produksi gas dilakukan untuk mengetahui BAL bersifat
homofermentatif atau heterofermentatif. Uji gas dilakukan dengan mencelupkan
ose dalam keadaan panas ke dalam kultur BAL yang telah tumbuh pada media
MRS broth. Kultur BAL bersifat heterofermentatif jika pada saat ose panas
dicelupkan terbentuk buih seperti soda yang dikocok.
4.5.2 Uji Katalase
Pengujian katalase dilakukan dengan meneteskan larutan H2O23% di atas
gelas objek, selanjutnya satu loop ose isolat BAL yang diuji diambil dan
dimasukkan ke dalam larutan H2O2 3% yang ada di gelas objek. Hasil positif
dinyatakan dengan adanya gelembung-gelembung gas, sedangkan apabila tidak
terbentuk gelembung-gelembung gas dinyatakan negatif (Lay, 1994).
4.5.3 Uji Morfologi dan Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram dilakukan dengan membuat preparat ulas pada gelas
objek. Gelas objek dibersihkan dengan kapas yang sudah dibasahi dengan alkohol.
Tabung reaksi berisi isolat BAL divortek, diambil satu loop ose, kemudian
diusapkan pada bagian tengah gelas objek. Preparat difiksasi diatas api untuk
membunuh dan melekatkan bakteri pada gerlas objek. Setelah kering diberi
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
28/78
28
larutan kristal violet (sebagai zat warna) selama satu menit, kemudian dicuci
dengan air mengalir. Selanjutnya diberi larutan lugol (mordan), selama satu menit,
dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian diberi larutan pemucat (aseton
alkohol) selama 5-10 detik, kemudian dibilas lagi dengan air mengalir. Setelah itu
preparat diberi larutan safranin selama 15 detik, dicuci dengan air mengalir,
kemudian dikeringkan dengan cara difiksasi di atas api. Uji morfologi dilakukan
dengan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada pembesaran 100 kali. Hasil
pengamatan berupa morfologi sel dan perbedaan warna, dimana warna ungu
kebiruan menunjukkan bakteri bersifat Gram positif, sedangkan warna merah
atau merah muda menunjukkan bakteri bersifat gram negatif (Lay, 1994).
4.6 Perlakuan pada Tikus Putih (R. norvegicus)
4.6.1 Tahap aklimatisasi tikus putih (R. norvegicus)
Pada penelitian ini akan dipergunakan 20 ekor Tikus Putih (R. norvegicus)
jantan yang berumur 5 minggu dengan bobot 40-50 gram yang diperoleh dari
tempat penangkaran di Jalan Ceningan Sari, Gang Anyar Sari, Sesetan, Denpasar
(Bapak Minggu). Sebelum diberikan perlakuan, hewan percobaan diaklimatisasi
selama 19 hari, yang meliputi; kandang, umur, diet, dan bobot tubuh. Pada tahap
aklimatisasi ini, tikus diberikan makanan standar berupa campuran jagung giling,
kecambah kacang hijau, minyak dari lemak babi dan kuning telur (50:30:10:10).
Tikus diberi tanda dengan cat kuku pada bagian kuku kaki belakang, ekor dan
telinga. Tikus ditempatkan pada kandang yang terbuat dari bak plastik dengan
ukuran 50 cm x 30 cm x 10 cm. Bak diisi dengan penutup kawat dan pada dasar
bak diisi dengan sekam padi sebagai penyerap urin dan kotoran tikus seperti
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
29/78
29
terlihat pada Lampiran 8 (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988). Bagan penelitian
dengan hewan coba tikus putih dapat dilihat pada Gambar 4.1.
Gambar 4.1. Bagan penelitian dengan hewan coba tikus putih
4.6.2 Persiapan suspensi bakteri L . rhamnosusSKG34
Biakan yang telah tumbuh pada media MRS broth (sub bab 4.5), divortex
(untuk mendapatkan biakan yang homogen), kemudian diambil sebanyak 1 ml
dengan pipet mikro, dimasukkan ke dalam eppendorf dan disentrifugasi dengan
kecepatan 5000 rpm selama 7 menit untuk memisahkan massa sel dengan
supernatan. Supernatan dibuang dan massa sel yang diperoleh dicuci sebanyak 2
kali dengan larutan salin (NaCL 0,85%) untuk menghilangkan sisa-sisa media.
Pencucian dilakukan dengan menambahkan 1 ml salin pada massa sel, divortex
hingga homogen, disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 7 menit. Pada
tahap akhir, massa sel dilarutkan dengan 1 ml salin, sehingga diperoleh
konsentrasi suspensi kurang lebih 108cfu/ml (Sujaya, 2009 dalam Nursini, 2010).
4.6.3 Perlakuan in vivopada tikus putih (R. norvegicus)
Suspensi bakteri L. rhamnosus SKG34 yang diperoleh (anak sub bab
4.6.2), diberikan pada tikus putih dengan metode oral gavage, yaitu dengan cara
memberikan suspensi masing-masing sebanyak 0,5 ml ( 9,2 x108sel/ml) kepada
10 ekor tikus putih dengan metode sonde. Sebagai kontrol 10 ekor tikus lainnya
diberikan salin. Perlakuan ini dilakukan selama 3 minggu dengan frekuensi
Pemberian diet
hiperkolesterol
Pemberian L .
rhamnosus SKG34
Pembedahan
tikus
19 hari 21 hari
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
30/78
30
pemberian sekali dalam sehari (pada jam 13.00 13.30 WITA). Perlakuan
diberikan setelah pemberian makan pada tikus putih. Setiap hari selama
perlakuan, berat makanan yang diberikan dan pertambahan berat badan tikus
selalu di timbang (Sujaya, 2009 dalam Nursini, 2010).
4.6.4 Pengukuran pH sekum
Isi sekum diukur pHnya menggunakan pH meter (TOA ion meter IM 40S)
yang sebelumnya telah dikalibrasi dengan buffer pH 4 dan pH 7. Isi sekum yang
telah diencerkan sebanyak 1 kali (1:1), kemudian dihomogenkan dengan divortex.
Selanjutnya pH isi sekum diukur dengan mencelupkan elektroda pH meter ke
dalam sampel dan hasilnya dicatat.
4.6.5 Penghitungan populasi bakteri
Setelah 3 minggu perlakuan, tikus putih yang diambil sekumnya dibius
dengan kloroform 10%, dibedah dan diambil bagian sekumnya. Sekum yang
diperoleh diletakkan pada cawan petri steril, kemudian isinya dikeluarkan dan
ditampung dalam tabung steril dan ditambahkan larutan fisiologis (NaCl 0,85%)
sesuai dengan berat isi sekum (pengenceran 1:1) dan dihomogenkan. Selanjutnya
0,5 ml suspensi isi sekum dimasukkan ke dalam tabung pengencer yang berisi 4,5
ml salin sehingga diperoleh pengenceran 10-1, divortex hingga homogen,
kemudian diencerkan lagi sampai diperoleh pengenceran 10-7. Untuk penentuan
total BAL digunakan metode permukaan. Sebanyak 0,1 ml sampel yang telah
diencerkan (pengenceran 10-3 10-5) disebar pada permukaan media MRS agar
yang telah ditambahkan dengan Bromo Cresol Purple (BCP), kemudian
diinkubasi secara anaerob selama 48 jam pada suhu 37o
C. Metode yang sama
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
31/78
31
dilakukan untuk penghitungan total bakteri anaerob, penanaman dilakukan pada
media anaerob agar (pengenceran 10-4
10-7
) dan diinkubasi secara anaerob
dengan menggunakan anaerobic gas pouchdalam anaerobic chamber (Lampiran
10). Setelah diinkubasi selama 48 jam, dilakukan penghitungan jumlah koloni
yang tumbuh. Total populasi bakteri diperoleh dengan mengalikan jumlah koloni
yang tumbuh dengan faktor pengencernya dikalikan 10 (Fardiaz, 1993).
4.6.6 Analisis kolesterol darah tikus putih (R. norvegicus)
Kadar kolesterol total pada serum tikus putih diukur dengan metode
enzimatik Cholesterol Oxidase Phenol Aminoantipyrin (CHOD-PAP) yang
dikembangkan oleh Roche Diagnostic, Germany (Analyticon 200 mg/dl) dan
diukur menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 510 nm.
Sampel darah tikus diambil pada awal penelitian, setelah masa
aklimatisasi, dan setelah perlakuan pemberian L. rhamnosus SKG34. Darah
diambil dari medial canthus sinus orbitalis menggunakan mikrohematokrit atau
tabung kalpiler, ditampung dalam tabung eppendorf. Sampel kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 10 menit, sehingga serumnya
terpisah dari sel darahnya. Selanjutnya serum darah dipindahkan ke tabung
eppendorf baru dan disimpan pada suhu -20o C, untuk selanjutnya dianalisis
(Smith dan Mangkoewidjojo, 1988).
Langkah-langkah dalam pengukuran kolesterol :
a. Larutan standar kolesterol 50 mg/dl
Dipipet sebanyak 50 l standar kolesterol dengan pipet mikro ke dalam
eppendorf, kemudian ditambahkan 150 l aquadest steril untuk mendapatkan
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
32/78
32
konsentrasi larutan baku 50 mg/dl. Larutan baku tersebut dipipet sebanyak 10
l kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol.
Selanjutnya larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit.
Tahap selanjutnya adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 510 nm.
b. Larutan standar kolesterol 100 mg/dl
Dipipet sebanyak 100 l standar kolesterol dengan pipet mikro ke dalam
eppendorf, kemudian ditambahkan 100 l aquadest steril untuk mendapatkan
konsentrasi larutan baku 100 mg/dl. Larutan baku tersebut dipipet sebanyak
10 l kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol.
Selanjutnya larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit.
Tahap selanjutnya adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 510 nm.
c. Larutan standar kolesterol 150 mg/dl
Dipipet sebanyak 150 l standar kolesterol dengan pipet mikro ke dalam
eppendorf, kemudian ditambahkan 50 l aquadest steril untuk mendapatkan
konsentrasi larutan baku 150 mg/dl. Larutan baku tersebut dipipet sebanyak
10 l kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol.
Selanjutnya larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit.
Tahap selanjutnya adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 510 nm.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
33/78
33
d. Larutan standar kolesterol 200 mg/dl
Dipipet sebanyak 10 l standar kolesterol dengan pipet mikro ke dalam
eppendorf, kemudian ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol
untuk mendapatkan konsentrasi larutan baku 200 mg/dl. Selanjutnya larutan
tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit. Tahap selanjutnya
adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 510 nm.
e. Larutan blanko
Sebanyak 10 l aquadest steril dipipet dengan pipet mikro kemudian
ditambahkan 1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol. Selanjutnya larutan
tersebut diinkubasi pada suhu 37o C selama 10 menit. Tahap selanjutnya
adalah pengukuran absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 510 nm.
f. Larutan sampel
Dipipet sebanyak 10 l serum dengan pipet mikro kemudian ditambahkan
1000 l reagen kit CHOD-PAP kolesterol. Selanjutnya larutan tersebut
diinkubasi pada suhu 37oC selama 10 menit. Tahap selanjutnya pengukuran
absorbansi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 510 nm.
Nilai absorban yang muncul dicatat dan konsentrasi kolesterol total
dihitung dengan cara membagi nilai absorban sampel dengan nilai absorban
blanko dan dikalikan dengan absorban standar kolesterol.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
34/78
34
4.7 Analisis Populasi L. rhamnosusSKG34
4.7.1 Isolasi genomik DNA
Isolasi genomik DNA BAL menggunakan kit isoplant II. Diambil 1 ml
kultur yang telah tumbuh pada 5 ml MRS broth (sub bab 4.5), kemudian
disentrifugasi pada 5000 rpm selama 7 menit untuk mendapatkan massa sel.
Massa sel yang diperoleh dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali untuk
menghilangkan sisa media. Massa sel yang telah dicuci divortex, ditambahkan
dengan 300 l solution I, divortex selama 1-3 detik, ditambahkan 150 l solution
II dan divortex selama 5-6 detik. Selanjutnya adalah penambahan solution IIIA
dan IIIB masing-masing sebanyak 75 l dan divortex selama 1-2 detik kemudian
diletakkan di atas es selama 15 menit. Selanjutnya campuran disentrifugasi pada
15.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC. Sebanyak 200-400 l cairan DNA
yang telah terpisah diambil dan ditambahkan etanol 99% sebanyak 2 2,5 kali
cairan DNA, kemudian disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 30 menit pada
suhu 4oC, sehingga diperoleh DNA pellet dan ditambahkan 100 l alkohol 70%
kemudian disentrifugasi pada 15.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4o C.
Langkah selanjutnya adalah DNA pellet dievavorasi dan ditambahkan 20-25 l
TE pH 7,5 dan divortex. Selanjutnya dilektroforesis untuk memastikan berhasil
tidaknya isolasi DNA.
4.7.2 RAPD DNA L . rhamnosusSKG34
Tahapan RAPD dilakukan mengacu pada prosedur Ivanova et al. (2008).
Campuran reaksi RAPD merupakan campuran pada total volume 12,5 l dengan
komposisi 6,25 l Master Mix Solution Intron Biotechnology, 1,00 l primer
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
35/78
35
M13F dengan urutan basa (sequences) 5-CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC
AGT-3, 4,25 l air steril , dan 1,00 l DNA sehingga total volume reaksi 12,5
l. Aplifikasi dilakukan pada mesin Infinigen Thermocycler, dengan kondisi satu
siklustahap pre denaturasi pada 95oC selama 5 menit, diikuti dengan 40 siklus
tahap denaturasi pada 95oC selama 20 detik, tahap annealing pada 40o C selama 2
menit, dan tahap ekstensi 72oC selama 30 detik, serta tahap akhir yaitu elongasi
tambahan pada 72oC selama 5 menit. Setelah reaksi selesai, sampel dikeluarkan
dari mesin dan dielektroforesis.
4.7.3 RAPD koloni biakan yang diisolasi dari sekum tikus
Koloni tunggal terpisah yang telah tumbuh pada cawan petri setelah
diinkubasi (hasil pengerjaan anak sub bab 4.6.5) yang telah dibuat stock culture
pada MRS agar, selanjutnya dibiakkan dalam MRS broth sebanyak 10 koloni
untuk setiap perlakuan dan kontrol, diinkubasi secara aerob selama 24-48 jam
pada suhu 37o C. Koloni yang tumbuh ditandai dengan terjadinya kekeruhan,
selanjutnya 1 ml dan ditampung pada eppendorf kemudian disentrifugasi pada
kecepatan 5000 rpm selama 7 menit. Selanjutnya supernatant dibuang dan massa
sel dicuci dengan air steril sebanyak 2 kali untuk menghilangkan sisa media.
Selanjutnya massa sel ditambahkan 200 l air steril dan dihomogenkan, kemudian
dilakukan pemanasan pada suhu 100o C selama 10 menit dan perlakuan pada
suhu rendah (-20oC) selama 20 menit. Perlakuan ini dilakukan sebanyak 2 kali
untuk melisiskan dinding sel dan mengeluarkan DNA bakteri. Selanjutnya
dilakukan RAPD dengan kondisi yang sama dengan anak sub bab 4.7.2. Setelah
reaksi selesai, 5 l sampel diambil untuk dielektroforesis (Sujaya et al.,2005).
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
36/78
36
4.7.4 Elektroforesis
Elektroforesis menggunakan 1,5% agarose. Sebanyak 1,5 g agarose
disuspensikan dalam 98,5 ml buffer TAE IX dan dipanaskan dalam microwave
sampai larut sempurna. Selanjutnya agarose ini distirer sambil menunggu sampai
suhunya 50oC untuk dituang pada cetakan yang sudah dilengkapi sisir (comb)
untuk membuat sumur (well), tebal gel 2/3 dari cetakan dan ditunggu sampai gel
padat. Setelah padat, gel agarose dimasukkan ke dalam chamber elektroforesis
yang telah diisi buffer TAE IX, dengan tinggi permukaan larutan buffer 2-3 mm
di atas agar. Selanjutnya setiap suspensi DNA hasil RAPD dipipet sebanyak 3 l
dan ditambahkan 1 l loading buffer 6X yang diteteskan pada parafin film,
kemudian dihomogenkan dengan pipet berulang kali. Sampel-sampel DNA yang
telah homogen dimasukkan secara vertikal ke dalam sumur-sumur gel. Pada gel
elektroforesis ini, dimasukkan juga DNA ladderpada salah satu sumur gel untuk
menentukan panjang pita yang terbentuk. Elektroforesis dilakukan selama 40
menit pada tegangan 100 volt. Visualisasi hasil elektroforesis dapat dilihat dengan
UV Transluminator setelah gel terendam dalam larutan ethidium bromide (5
g/100 ml air steril) (staining) selama 10 menit dan direndam dalam aquadest
selama 2 menit (distaining) untuk mencuci kelebihan ethidium bromide.
Dokumentasi pola band dilakukan dengan mengambil gambar menggunakan
kamera digital Panasonic DMC-FS15 (Sujaya et al.,2005).
4.7.5. Pengamatan mikroskopis pada konsorsium bakteri sekum tikus putih
Konsorsium bakteri yang tumbuh pada media MRS agar, dikerok
denganose kemudian ditumbuhkan pada media MRS brothdan diinkubasi dalam
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
37/78
37
lingkunagan anaerob selama 48 jam. Pewarnaan gram dilakukan dengan membuat
preparat ulas pada gelas objek. Gelas objek dibersihkan dengan kapas yang sudah
dibasahi dengan alkohol. Tabung reaksi berisi isolat BAL divortek, diambil satu
loop ose, kemudian diusapkan pada bagian tengah gelas objek. Preparat difiksasi
diatas api untuk membunuh dan melekatkan bakteri pada gerlas objek. Setelah
kering diberi larutan kristal violet (sebagai zat warna) selama satu menit,
kemudian dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya diberi larutan lugol (mordan),
selama satu menit, dicuci dengan air mengalir. Preparat kemudian diberi larutan
pemucat (aseton alkohol) selama 5-10 detik, kemudian dibilas lagi dengan air
mengalir. Setelah itu preparat diberi larutan safranin selama 15 detik, dicuci
dengan air mengalir, kemudian dikeringkan dengan cara difiksasi di atas api. Uji
morfologi dilakukan dengan pengamatan dengan mikroskop cahaya pada
pembesaran 100 kali. Hasil pengamatan berupa morfologi sel dan perbedaan
warna, dimana warna ungu kebiruan menunjukkan bakteri bersifat Gram positif,
sedangkan warna merah atau merah muda menunjukkan bakteri bersifat gram
negatif (Lay, 1994).
4.7.6 PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus konsorsium bakteri
sekum tikus putih
Sebanyak 1 l lisat sel di pergunakan sebagai sumber DNA dalam reaksi
PCR dengan mempergunakan primer spesifik L. rhamnosus. Reaksi campuran
PCR dengan volume total 12,5 l yang mengandung; 0,2 mM dNTPs, 1 X PCR
Buffer 10 X, 0,6 mM MgCl2, 0,9 U AmpliTaq, primer spesifik L. rhamnosus;
Lu5 F dan Rhall R, masing-masing 10 pmol. Reaksi amplifikasi dilakukan
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
38/78
38
sebagai berikut: satu siklus pada suhu 95oC selama 5 menit, diikuti dengan 35
kali siklus pada 95o
C selama 30 detik, 57o
C selama 40 detik, dan 72o
C selama
30 detik. Pada tahap akhir ditambahkan satu siklus pada suhu 72 o C selama 5
menit. Produk PCR selanjutnya dielektroforesis dengan menggunakan agarosa 2%
dengan TAE buffer 1 X. selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan EtBr, kemudian
produk PCR divisualisasikan pada transluminator dengan sinar UV dan difoto
(Aryantini, 2008).
4.8 Penyajian dan Analisis Data
Data hasil penelitian disajikan dalam bentuk tabel, grafik, dan gambar.
Data populasi L. rhamnosusSKG34 dalam saluran pencernaan, total BAL, total
bakteri anaerob, dan pH dianalisis secara deskriptif. Data hasil kadar kolesterol
darah dianalisis menggunakan Uji Hipotesis Beda Rataan untuk dua populasi yang
saling bebas (T-test Independent) (Steel dan Torrie, 1993).
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
39/78
39
BAB V
HASIL PENELITIAN
5.1. Kolonisasi Lactobacil lus rhamnosus SKG34 pada Saluran Pencernaan
Tikus Putih (Rattus norvegicus)
Pengujian secara in vivo bertujuan untuk mengetahui kemampuan suatu
strain untuk dikembangkan sebagai probiotik yang potensial. Pengujian in vivo
dapat menjelaskan kemampuan suatu strain yang dianggap potensial sebagai
probiotik, mampu untuk melewati barrier saluran pencernaan bagian atas, mampu
mencapai usus dalam keadaan hidup dan dalam jumlah yang ditetapkan, mampu
berkolonisasi di usus, dan mampu memberikan efek yang menguntungkan bagi
pertumbuhan dan perkembangan mikroorganisme yang terdapat dalam usus.
Hasil RAPD koloni Lactobacillus rhamnosus SKG34 pada sekum tikus
dapat dilihat pada Gambar 5.1. Berdasarkan hasil deteksi L. rhamnosus SKG34
dari 10 koloni BAL yang diambil secara acak pada MRS agar tidak ditemukan
adanya DNA yang menggambarkan koloni L. rhamnosus SKG34. Akan tetapi
berdasarkan pengecatan Gram yang dilakukan terhadap kultur sekum tikus putih
yang diberikan L. rhamnosus SKG34 yang dibiakkan pada media MRS agar
menunjukkan adanya morfologi sel yang menyerupai L. rhamnosus SKG34,
seperti terlihat pada Gambar 5.2. Hasil pengecatan gram yang dilakukan terhadap
kultur sekum tikus putih yang tidaki diberikan L. rhamnosus SKG34 yang
dibiakkan pada media MRS agar tidak ditemukan adanya koloni BAL yang
morfologinya mirip dengan morfologiL. rhamnosus SKG34, seperti terlihat pada
Gambar 5.3.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
40/78
40
Gambar5.1.
RAPD
kolon
iBALpadasekumtikusyang
diberikanLactobacillusrhamnosusSKG34yangdiambil
secaraacakpadaMRSaga
r..
M,
Marker100bp;K,
Kon
trolpositif(L.rhamnosusSKG34);1-10,
kulturBALP1;
11-30,
kulturBALP2;21-30,
kulturBALP6;31-40,
kulturBALP7;41-50kulturBAL
P9;dan51-60kulturBAL
P10.
tandapanahmenunjukkanpanjangpita(bp)
1
2
3
5
6
8
9
10
000
3000
500
500
1500
31
32333
35363
3839
0
1000
HasilRAPDkoloniBALpadasekumtikusperlakuan,dari10koloniBALyangdiamb
ilsecaraacakpadaMRS
agartidakditemukanadanyaDNAyangmenggambarkan
koloniL.rhamnosusSKG34(tidakditemukanpolaband
yangsamadenganpolaban
dpadalajurK
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
41/78
41
Gambar5.2.
Cat
Gram
konsorsium
bakteripadasekum
tikusperlakuany
ang
ditumbuhkanpada
MRSbroth.
1-6,
tikusperlakuan;7,
Lactobacillusrhamno
sus
SKG34;bar10m
denganpembesaran1000kali
2
1
3
4
5
6
7
Padasekumtikusperlakuanditemukanadanyam
orfologiselyangmenyerupai
L.
rhamnosusSKG34
(panel7),yangditunjukkano
lehtandapanahmerah(
)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
42/78
42
Gambar5.3.
CatGramkonsorsiumbakteripada
sekumtikuskontrolyangditumbuhkan
padaMRSbroth.
1-6,
tikuskontrol;7,
LactobacillusrhamnosusSKG34;ba
r10m
denganpembesaran1000kali
2
1
3
4
5
6
Padasekumtikus
kontroltidakditemukanmorfo
logiselyangmenyerupai
Lactobacillusrha
mnosusSKG34(panel7)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
43/78
43
Berdasarkan data Gambar 5.2 dan 5.3,, selanjutnya dilakukan PCR kultur
sekum tikus putih dengan menggunakan primer spesifik Lactobacillus rhamnosus.
Hasil PCR kultur sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosus SKG34 dan
yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34 dapat dilihat pada Gambar 5.4. Hasil
PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus menunjukkan bahwa dalam
sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosus SKG34 dapat dideteksi adanya
DNA L. rhamnosus yang diduga merupakan koloni L. rhamnosus SKG34,
sedangkan pada sekum tikus putih yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34,
tidak ditemukan adanya DNAL. rhamnosus.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
110 bp
1000 bp
500 bp
3000 bp
Gambar 5.4. PCR bakteri sekum perlakuan dan kontrol yang ditumbuhkan padaMRS agar dengan primer spesifikLactobacillus rhamnosus. M, Marker 100 bp;
1, Kontrol positif (L. rhamnosus SKG34); 2-7, Tikus perlakuan; 8-13, Tikus
kontrol; Tanda panah menunjukkan panjang pita (bp)
Hasil PCR menggunakan primer spesifik L.rhamnosus, menunjukkan bahwa
pada sekum tikus perlakuan yang diberikan L. rhamnosus SKG34 (2-7) dapat
dideteksi DNA yang diduga merupakan koloni L. rhamnosus SKG34
(ditunjukkan oleh pita yang terbentuk pada lajur 2-7 sama dengan pita yang
terbentuk pada lajur 1), sedangkan pada sekumtikus kontrol (8-12) tidak
terdeteksi adanya DNAL. rhamnosus SKG34 (tidak terbentuk pita sama sekali)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
44/78
44
5.2 Populasi Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Anaerobpada Sekum Tikus
Putih (R. Norvegicus)
Pemberian Lactobacillus rhamnosus SKG34 sebanyak 108sel/ ml selama
3 (tiga) minggu berpengaruh terhadap populasi BAL dan total bakteri
anaerobyang tumbuh dalam sekum tikus. Populasi BAL pada sekum tikus yang
diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 4,1 x 107 cfu/g, sedangkan populasi
BAL pada sekum tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus SKG34 sebanyak 1,1 x
107 cfu /g (Lampiran 2). Populasi bakteri anaerobpada sekum tikus yang
diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 8,3 x 107 cfu /g, sedangkan populasi
bakteri anaerobpada sekum tikus yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34
sebanyak 3,7 x 109cfu /g (Lampiran 3). Pada Gambar 5.5 dapat dilihat pemberian
L. rhamnosus SKG34 mampu mengurangi pertumbuhan bakteri anaerob.
Gambar 5.5. Grafik populasi BAL dan bakteri anaerobpada sekum tikus yang
tidak diberikan L. rhamnosus SKG34 (Kontrol) dan yang diberikan
L. rhamnosus SKG34 (Perlakuan)
3,7E+09
8,3E+07
1,1E+07
4,1E+07
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
1,E+09
1,E+10
Kontrol Perlakuan
PopulasiBALdanBakteriAnaerob
padaSekum(
cfu/g)
Bakteri anaerob
BAL
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
45/78
45
5.3 Kadar kolesterol serum darah tikus putih (Rattus norvegicus)
Pengukuran kadar kolesterol serum tikus dilakukan dengan membuat
kurva standar terlebih dahulu. Hasil penghitungan regresis standar Lampiran 4)
menunjukkan bahwa (P
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
46/78
46
Gambar 5.6. Grafik uji kenormalan kadar kolesterol serum darah tikus putih
(Rattus norvegicus)
Berdasarkan grafik pengujian (Gambar 5.6) tersebut diperoleh (P = 0,147)
berarti P > 0,01, sehingga dapat dikatakan bahwa data yang dianalisis memenuhi
asumsi yaitu data menyebar secara normal (lampiran 7). Selanjutnya dilakukan
uji beda rataan untuk dua populasi saling bebas (T-Test Independent)
(Lampiran 8). Pada uji ini masing-masing menggunakan enam ekor tikus kontrol
dan enam ekor tikus perlakuan. Pemberian L. rhamnosus SKG34 secara in vivo
memberikan pengaruh yang nyata (P < 0,05) terhadap penurunan kadar kolesterol
serum darah tikus pada keadaan hiperkolesterolemia, sebesar 28,5% dibandingkan
dengan serum darah tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus SKG34.
325300275250225200175150125
kadar kolesterol akhir
0.350
0.325
0.300
0.275
0.250
0.225
0.200
0.175
0.150
0.125
0.100
absorbansiserum
R Sq Linear = 1
P = 0,147
Mean = 206,50
St Dev = 62,069
N = 12
(mg/dl)
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
47/78
47
Gambar 5.7. Grafik perubahan kadar kolesterol serum darah tikus yang tidak
diberikan L. rhamnosus SKG34 (Kontrol) dan yang diberikan L.
rhamnosus SKG34 (Perlakuan); huruf a dan huruf b menyatakan
berbeda nyata (P 0,05)
Dari gambar di atas dapat dilihat terjadi penurunan kadar kolesterol serum
darah tikus perlakuan yang signifikan dibandingkan dengan tikus kontrol yang
mengalami peningkatan kadar kolesterol serum darah.
Gambar 5.8. Grafik perubahan berat badan tikus yang tidak diberikan L.
rhamnosus SKG34 (Kontrol) dan yang diberikan L. rhamnosus
SKG34 (Perlakuan)
131,67
234,17
240,83
128,50
249,33
172,17
0
50
100
150
200
250
300
sebelum pemberiandiet hiperkolesterol
setelah pemberiandiet hiperkolesterol
setelah pemberian L.rhamnosus SKG34
KadarKolesterolSerumDarahTikus
(mg/dL)
Kontrol
Perlakuan
53,1
72,0
112,4
48,2
62,6
97,8
00
20
40
60
80
100
120
sebelum pemberian
diet hiperkolesterol
setelah pemberian
diet hiperkolesterol
setelah pemberian L.
rhamnosus SKG34
BeratBa
danTikus(gram
Kontrol
Perlakuan
a
b
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
48/78
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
49/78
49
BAB VI
PEMBAHASAN
6.1. Kolonisasi L.rhamnosusSKG34 pada Saluran Pencernaan Tikus Putih
(R. norvegicus)
KolonisasiL. rhamnosusSKG34 pada sekum tikus putih, dideteksi dengan
melakukan RAPD. Koloni BAL sekum yang ditumbuhkan pada media MRS agar
dipilih secara acak. Berdasarkan hasil deteksi L. rhamnosusSKG34 pada sekum
tikus putih setelah perlakuan in vivo, tidak ditemukan adanya DNA L. rhamnosus
SKG34 pada sekum tikus putih dari 10 koloni yang diambil secara acak. Akan
tetapi berdasarkan hasil PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus,
menunjukkan bahwa dalam sekum tikus perlakuan dapat dideteksi adanya DNA
L. rhamnosus. Hal ini menunjukkan L. rhamnosus SKG34 memang ada pada
sekum tikus putih, tetapi dalam populasi yang belum bias ditentukan secara pasti.
KoloniL. rhamnosusSKG34 pada sekum tikus putih tidak dapat dideteksi
dengan RAPD disebabkan karena L. rhamnosusSKG34 bukan merupakan strain
yang berasal dari saluran pencernaan sehingga kemungkinan besar L. rhamnosus
SKG34 kurang tahan terhadap kondisi lingkungan pada saluran pencernaan tikus,
tidak dapat beradhesi pada dinding saluran pencernaan, tidak mampu
berkolonisasi pada saluran pencernaan, dan L. rhamnosus SKG34 kurang dapat
berkompetisi dengan bakteri endogen yang terdapat pada saluran pencernaan. Hal
ini sesuai dengan hasil penelitian Suryadarma (2008), yang menyatakan bahwa L.
rhamnosus SKG34 kurang dapat bersaing atau berkompetisi dengan bakteri
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
50/78
50
endogen saluran pencernaan, karena memiliki daya adhesi yang rendah pada
enterosit, yang disebabkan karenaL. rhamnosusSKG34 tidak memiliki molekul
adhesin yang dapat mendeteksi reseptor pada permukaan enterosit yang
memungkinkan bakteri untuk dapat melekat dan membentuk kolonisasi pada
permukaan enterosit.
Mikroba yang terdapat di dalam saluran pencernaan sangat kompleks dan
merupakan komunitas yang dinamis dan terjadi persaingan hidup di antara
komunitas tersebut. Menurut Rahayu (2008), total mikroba yang terdapat dalam
saluran pencernaan diperkirakan mencapai 1012 sel setiap gram isi perut yang
terdiri atas lebih dari 1000 spesies, atau diperkirakan sekitar 3000-4000 spesies.
Beberapa genus bakteri yang hidup di saluran pencernaan antara lain :
Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Viellonella, Enterobacteria,
Enterococcus, Bacteroides, Clostridium, Eubacterium, Peptococci,
Desulfovibrios, Actinomyces, Fusobacteria, Bifidobacterium, Ruminococcus,
Peptostreptococcus, Propionibacterium, Escherichia, dan Methanobrevibacter
(Young dan Huffman, 2003; Ridlon, et al., 2006; Vernazza, et al., 2006).
Hasil pengecatan Gram yang dilakukan untuk melihat secara morfologi
keberadaan L. rhamnosus SKG34 yang ditumbuhkan pada media MRS agar,
menunjukkan adanya morfologi pertumbuhan koloni BAL positif berbentuk
batang yang mirip dengan morfologi L. rhamnosus SKG34 (Gambar 5.2).
Berdasarkan hasil ini, maka untuk lebih menegaskan keberadaan L. rhamnosus
SKG34 pada sekum tikus putih dilakukan pengujian lanjutan dengan PCR dengan
menggunakan primer spesifikL. rhamnosus.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
51/78
51
Hasil PCR menggunakan primer spesifik L. rhamnosus (Gambar 5.4),
menunjukkan bahwa dalam sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosus
SKG34 dapat dideteksi adanya DNA L. rhamnosus, sedangkan pada sekum tikus
putih yang tidak diberikanL. rhamnosusSKG34, tidak ditemukan adanya DNAL.
rhamnosus. Dari hasil penelusuran pustaka, tidak ada yang menyatakan L.
rhamnosus dapat diisolasi dari saluran pencernaan tikus. Wood dan Holzapfel
(1995) menyatakan bahwa L. rhamnosusumumnya diisolasi dari susu dan hasil
olahannya, manusia, limbah, dan bahan-bahan medis. Hal ini menunjukkan DNA
yang terdeteksi pada hasil PCR spesifik merupakan DNAL. rhamnosus SKG34
yang terdapat pada sekum tikus putih yang diberikan L. rhamnosusSKG34, tetapi
populasinya belum bisa ditentukan secara pasti.
6.2 Populasi Bakteri Asam Laktat dan Bakteri Anaerobpada Sekum Tikus
Putih (R. norvegicus)
Populasi BAL pada tikus yang diberikanL. rhamnosusSKG34 lebih tinggi
jika dibandingkan dengan tikus yang tidak diberikan L. rhamnosusSKG34. Hal
ini diduga disebabkan oleh keberadaan L. rhamnosus SKG34 yang mampu
menciptakan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan BAL lainnya dalam
saluran pencernaan. Sehubungan dengan hal ini Vernazza et al. (2006)
menyatakan bahwa, keberadaan BAL sebagai probiotik di dalam saluran
pencernaan dapat menstimulasi populasi BAL lainnya dalam saluran pencernaan.
Hal ini disebabkan karena bakteri probiotik dapat memodifikasi lingkungan
mikroekosistem usus dengan memproduksi asam laktat, sehingga dapat
menurunkan pH. Penurunan pH akan mengakibatkan pertumbuhan BAL dalam
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
52/78
52
saluran pencernaan akan mengalami peningkatan. Hal ini juga didukung oleh hasil
pengecatan Gram yang dilakukan untuk mengetahui morfologi sel yang tumbuh
pada sekum tikus putih (Gambar 5.2), dimana didominasi oleh pertumbuhan sel
gram positif berbentuk batang. Setelah dilakukan pengujian dengan metode PCR
dengan menggunakan primer spesifik L. rhamnosus untuk memastikan
keberadaan L. rhamnosus SKG34, diperoleh hasil bahwa pada sekum tikus
perlakuan memang terdeteksi adanya DNAL. rhamnosus.
Populasi bakteri anaerobpada sekum tikus yang diberikan L. rhamnosus
SKG34 mengalami penurunan dibandingkan dengan populasi bakteri anaerob
pada sekum tikus yang tidak diberikan L. rhamnosus SKG34. Populasi bakteri
anaerobpada sekum tikus yang tidak diberikan L. rhamnosusSKG34 sebanyak
3,7 x 109 cfu/g, sedangkan populasi bakteri anaerob pada sekum tikus yang
diberikan L. rhamnosusSKG34 sebanyak 8,3 x 107cfu/g, Hal ini menunjukkan
pemberianL. rhamnosusSKG34 pada tikus perlakuan dapat menurunkan populasi
bakteri anaerob.
Penurunan pupulasi ini disebabkan karena L. rhamnosusSKG34 memiliki
kemampuan untuk menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Menurut Sujaya et
al. (2008b), L. rhamnosus SKG34 memiliki daya hambat yang luas terhadap
pertumbuhan bakteri patogen (Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella
thypimurium, dan Shigella flexneri)dengan diameter zone hambat sebesar 0,8
1,2 cm. Selain itu penurunan populasi bakteri anaerobpada tikus yang diberikan
L. rhamnosusSKG34, disebabkan oleh terjadinya penurunan pH. Penurunan pH
akan meningkatkan populasi BAL yang dapat menekan pertumbuhan bakteri
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
53/78
53
anaerob, selain itu penurunan pH juga dapat mengurangi populasi bakteri
patogen yang tidak tahan terhadap pH yang rendah (Vernazza et al., 2006).
Bakteri anaerob yang tumbuh di dalam saluran pencernaan terdiri atas
bakteri yang menguntungkan kesehatan (Bifidobacterium, Eubacterium, dan
Lactobacillus) dan bakteri yang dapat membahayakan kesehatan. Bakteri yang
membahayakan kesehatan, antara lain: Clostridia, Veillonella, Staphylococci,
Proteus, P. aeruginosa, Bacteroides, Eubacteria, Fusubacteria, E. coli, dan
Enterobacteria(Bourliux et al., 2003). Vernazza et al. (2006) menyatakan bahwa,
dominasi bakteriE colidan Clostridium dapat meningkatkan pengaruh patogenik,
seperti terjadinya diare akut dan proses pembusukan dalam saluran pencernaan.
Keberadaan BAL dalam saluran pencernaan dapat memodulasi saluran
pencernaan menjadi lebih stabil, mencegah pertumbuhan bakteri patogen, dan
meningkatkan sistem pertahanan tubuh terhadap penyakit (Vaughan et al., 2002).
6.3. Pengaruh Pemberian L . rhamnosus SKG34 terhadap Kadar Kolesterol
Serum Darah Tikus Putih (R. norvegicus)
Pada Gambar 5.7 dapat dilihat kadar kolesterol serum darah tikus yang
diberikan L. rhamnosus SKG34 mengalami penurunan yang signifikan,
dibandingkan dengan tikus kontrol yang mengalami peningkatan kadar kolesterol
serum darah. Pemberian L. rhamnosus SKG34 selama tiga minggu mampu
menurunkan kadar kolesterol serum darah tikus sebesar 28,5 %. Akan tetapi
pemberianL. rhamnosusSKG34 pada tikus perlakuan tidak mampu menurunkan
berat badan tikus putih. Hal ini sejalan dengan yang diungkapkan oleh
Hardiningsih dan Nurhidayat (2006), yang menyatakan bahwa pemberian
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
54/78
54
Lactobacillustidak dapat menurunkan pertambahan berat badan tikus putih wistar
yang diberikan diet tinggi kolesterol.
Pemberian Lactobacillus untuk menurunkan kadar kolesterol dapat
melalui beberapa mekanisme. Menurut Lee, et al. (2009), terdapat beberapa
mekanisme penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL. Mekanisme pertama yaitu
produk hasil fermentasi oleh BAL menghambat sintesa kolesterol sehingga
menurunkan produksi kolesterol. Mekanisme kedua adalah melalui pembuangan
garam empedu melalui feses, dimana garam empedu yang terdekonjugasi tidak
diserap oleh usus, dan lebih mudah terbuang dari saluran pencernaan
dibandingkan dengan garam empedu yang terkonjugasi. Hal ini mengakibatkan
semakin banyak kolesterol yang dibutuhkan untuk mensintesis garam empedu lagi
sehingga akan menurunkan kadar kolesterol. Mekanisme ketiga adalah
kemampuan BAL untuk mengikat kolesterol sehingga mencegah penyerapan
kolesterol kembali ke hati (Lee, et al., 2009). Beberapa jenis BAL memiliki
dinding sel yang mampu mengikat kolesterol dalam usus halus sebelum kolesterol
diserap oleh oleh tubuh (Usman dan Hasono, 1999; Surono, 2004). Mekanisme
penurunan kolesterol oleh aktivitas BAL disebabkan oleh enzim Bile salt
hydrolase(BSH) yang mendekonjugasi garam empedu, dimana glisin atau taurin
dipisahkan dari steroid, sehingga menghasilkan garam empedu bebas atau
terdekonjugasi. Enzim BSH menghasilkan garam empedu terdekonjugasi dalam
bentuk asam kolat bebas yang kurang diserap oleh usus halus. Dengan demikian
garam empedu yang kembali ke hati selama sirkulasi enterohepatik menjadi
berkurang, sehingga total kolesterol dalam tubuh menjadi berkurang. Bile salt
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
55/78
55
hydrolase dimiliki oleh beberapa strain bakteri saluran pencernaan seperti:
Lactobacillus, Enterococcus, Bifidobacterium, Clostridium, Peptostreptococcus,
danBacteroides(Surono, 2004; Ooi dan Liong, 2010).
Penurunan kadar kolesterol serum darah tikus yang diberikan L.
rhamnosusSKG34, diduga karena adanya pengaruh produk hasil fermentasi oleh
BAL dalam sekum tikus. Hasil fermentasi oleh BAL dalam saluran pencernaan
dapat menurunkan pH, yang dapat mengakibatkan terjadinya pengendapan garam
empedu dalam saluran pencernaan, sehingga sulit untuk diserap kembali dalam
siklus enterohepatik dan akan ikut terbuang bersama feses. Hal ini mengakibatkan
semakin banyak kolesterol yang dibutuhkan untuk mensintesis garam empedu,
lagi sehingga akan menurunkan kadar kolesterol (Yulinery et al., 2006; Lee et al.,
2009). Dari hasil penelitian yang dilakukan, diperoleh hasil dengan pemberian L.
rhamnosus SKG34 dapat menurunkan pH sekum dari 6,65 menjadi 6,55
(Gambar5.9). Apabila penurunan nilai pH ini dihubungkan dengan populasi BAL
pada sekum (Gambar 5.5) dan data perubahan kadar kolesterol serum darah tikus
putih (Gambar 5.7), menunjukkan tikus yang diberikan L. rhamnosus SKG34
mengalami peningkatan populasi BAL, memiliki pH yang lebih rendah, dan
mengakibatkan penurunan kadar kolesterol yang signifikan, dibandingkan dengan
tikus yang tidak diberikanL. rhamnosusSKG34. Jadi peningkatan populasi BAL
akan menurunkan pH pada saluran pencernaan yang diduga bisa mengakibatkan
terjadinya pengendapan garam empedu, sehingga akan menurunkan kadar
kolesterol serum darah tikus yang diberikanL. rhamnosusSKG34.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
56/78
56
BAB VII
SIMPULAN DAN SARAN
7.1. Simpulan
1. Populasi L. rhamnosus SKG34 dalam saluran pencernaan tikus putih (R.
norvegicus), tidak bisa ditentukan secara pasti, tetapi keberadaannya dapat
diduga dengan PCR spesifik L. rhamnosus, setalah pemberian L. rhamnosus
SKG34 sebanyak 108sel/ hari selam 3 (tiga) minggu.
2. PemberianL. rhamnosusSKG34 sebanyak 108sel/ hari selam 3 (tiga) minggu
berpengaruh terhadap populasi BAL dan total bakteri anaerobyang tumbuh
dalam saluran pencernaan tikus putih (R. norvegicus). Populasi BAL pada
sekum tikus yang diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 4,1 x 107cfu/g,
sedangkan populasi BAL pada sekum tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus
SKG34 sebanyak 1,1 x 107cfu /g. Populasi bakteri anaerobpada sekum tikus
yang diberikan L. rhamnosus SKG34 sebanyak 8,3 x 107 cfu /g, sedangkan
populasi bakteri anaerobpada sekum tikus yang tidak diberikanL. rhamnosus
SKG34 sebanyak 3,7 x 109cfu /g
3. PemberianL. rhamnosusSKG34 sebanyak 10
8
sel/ hari selam 3 (tiga) minggu
berpengaruh terhadap kadar kolesterol serum darah tikus putih (R.
norvegicus), dimana terjadi penurunan kadar kolesterol serum darah yang
signifikan sebesar 28,5%.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
57/78
57
7.2. Saran
1. untuk meningkatkan jumlah L. rhamnosus SKG34 yang mampu melewati
saluran pencernaan bagian atas dan mampu untuk berkompetisi pada saluran
pencernaan, perlu perlindungan yang lebih baik terhadap L. rhamnosus
SKG34 sebelum diadministrasikan secara oral gavage dengan teknik
mikroenkapsulasi.
2. untyuk pengembanganL. rhamnosusSKG34 sebagai probiotik yang potensial,
perlu dilakukan pengujian secara in vivotentang efek fungsional pemberianL.
rhamnosus SKG34 untuk mencegah alergi, mencegah konstipasi, dan
meningkatkan sisten imun.
-
7/22/2019 unud-320-1860003455-tesisgabung
58/78
58
DAFTAR PUSTAKA
Adams, C. 2009. Probiotics - Protection Against Infection: Using Nature's Tiny
Warriors To Stem Infection. Available at: http://probiotic.org/
lactobacillus-rhamnosus.htm.Opened : Nopember 24, 2010
Ajmal, S. and N. Ahmed. 2009. Probiotic potential of lactobacillus strains in
human infections. African Journal of Microbiology Research. 3(12):851-
855
Antarini, A. A. N. 2010. Populasi Lactobacillus rhamnosusSKG34 dalam susu
terfermentasi selama penyimpanan. Tesis S2 Program Studi BioteknologiPertanian, Universitas Udayana. Tidak dipublikasikan.
Aryantini, N P. D. 2008. Identifikasi Bifidobacterium Isolat Feses Bayi yang
Berpotensi Dikembangkan sebagai Probiotik Isolat Lokal Asli Indonesia.
Skripsi S1 Program Studi Ilmu Kesehatan Masyarakat, Universitas
Udayana. Tidak dipublikasikan.
Baigent, C. and R. Clarke, 2008. Cholesterol and Lipids. International
Encyclopedia of Public Health,Pages 693-704, Elsevier Inc, USA
Begley, M., C. Hill, and C. G. M. Gahan. 2006. Bile Salt Hydrolase Activity in
Probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 72 (3):1729-1738.
Belviso, S., M. Giordano, P. Dolci and G. Zeppa. 2009. In vitro cholesterol-
lowering activity of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus
paracasei strains isolated from the Italian Castelmagno PDO cheese.
Dairy Sci. Technol. 89 : 169-176
Bernardeau, M., J. P. Vernoux, S. H. Dubernet, and M. Guguen. 2008. Safety
assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus.
International Journal of Food Microbiology126 : 278-285.
Betsi G. I., E. Papadavid and M.E. Falagas. 2008. Probiotics for the Treatment or
Prevention of Atopic Dermatitis: A Review of the Evidence From
Randomized Controlled Trials. Am. J. Clin. Dermatol. 9(2) : 93 - 103.
Beuers, U. and T. Pusl. 2004. Bile Salts and their Metabolism.Encyclopedia of
Biological Chemistry,Pages 159-163, Elsevier Inc, USA
Bijl, N., A. v.d. Velde, and A. K. Groen. 2009. Bile Acids and Their Role in
Cholesterol Homeostasis. Biomedical and Life Sciences -Cellular Lipid
Metabolism,Pages : 107-129
http://probiotic.org/%20lactobacillus-rhamnosus.htmhttp://probiotic.org/%20lactobacillus-rhamnosus.htmhttp://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/9780123739605http://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/9780123739605http://www.sciencedirect.com/science/journal/01681605http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235061%232008%23998739996%23696746%23FLA%23&_cdi=5061&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=11c2a343c71d4030f6030cc4bceaf902http://www.sciencedirect.com/science/referenceworks/97801244