UJI AKTIVITAS ANTIATEROSKLEROSIS ISOLAT … fileAterosklerosis merupakan kondisi terjadinya...
Transcript of UJI AKTIVITAS ANTIATEROSKLEROSIS ISOLAT … fileAterosklerosis merupakan kondisi terjadinya...
1
LAPORAN AKHIR
HIBAH BERSAING
UJI AKTIVITAS ANTIATEROSKLEROSIS ISOLAT ANDROGRAFOLID
DAN EKSTRAK TERPURIFIKASI HERBA SAMBILOTO
(Andrographis paniculata (Burm.f) Ness)
Tahun kedua dari rencana dua tahun
Drs. I Nyoman Kadjeng Widjaja, M.Si., Apt 0014115102
Ni Kadek Warditiani, S.Farm., M.Sc., Apt 0030108303
Luh Putu Febryana Larasanty, S.Farm., M.Sc., Apt 0022028401
UNIVERSITAS UDAYANA
November 2014
3
Uji Aktivitas Antiaterosklerosis Isolat Andrografolid dan Ekstrak Terpurifikasi
Herba Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness)
Ringkasan
Aterosklerosis merupakan kondisi terjadinya penyempitan pembuluh darah akibat adanya penempelan plak-plak lemak. Terjadinya penempelan lemak ini salah satunya disebabkan karena terjadinya oksidasi LDL sehingga timbul plak yang akan mudah menempel di pembuluh darah, selain itu juga karena makanan yang dikonsumsi kaya kolesterol. Salah satu produk hasil oksidasi LDL adalah malondialdehid. Jika kadar malondialdehid meningkat maka kemungkinan aterosklerosis disebabkan oleh terjadinya oksidasi LDL. Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness) merupakan tanaman obat yang memiliki khasiat menurunkan kadar lemak darah secara praklinik pada tikus. Andrografolid (diterpen lakton) merupakan salah satu senyawa yang terkandung dalam sambiloto yang diketahui bertanggung jawab terhadap aktivitas sebagai antiaterosklerosis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui mekanisme kerja isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dalam menurunkan kadara malondialdehid dan memperbaiki profil lipid dalam darah hewan uji. Sehingga dilakukan pengukuran kadar LDL (low density lipoprotein), kolesterol total, trigliserida dan malondialdehid pada tikus yang diinduksi aterosklerosis. Berdasarkan hasil yang diperoleh diketahui bahwa isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat memperbaiki profil lipid (menurunkan kadar kolesterol total, trigliserida dan LDL dalam darah serta meningkatkan kadar HDL dalam darah) dan dapat menurunkan kadar malondialdehid dalam darah. Jika output yang diperoleh menunjukkan hasil yang positif, maka penelitian ini akan dilanjutkan dengan pembuatan sediaan obat tradisional sehingga dapat menutupi rasa pahit dari sambiloto untuk dapat dilakukan uji klinik. Sehingga luaran dari penelitian ini akan mengetahui mekanisme kerja isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dalam mengatasi penyakit aterosklerosis.
Kata kunci: sambiloto, aterosklerosis, andrografolid, ekstrak terpurifikasi, malondialdehid
4
DAFTAR ISI
hal
Cover ..................................................................................................................................
Lembar Pengesahan ............................................................................................................
Ringkasan ...........................................................................................................................
Daftar Isi ............................................................................................................................
BAB I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang ....................................................................................................
1.2 Tujuan Khusus ....................................................................................................
1.3 Urgensi ................................................................................................................
1.4 Rumusan Masalah ..............................................................................................
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sambiloto ............................................................................................................
2.2 Andrografolid .....................................................................................................
2.3 Aterosklerosis .....................................................................................................
2.4 Malondialdehid ...................................................................................................
BAB III TUJUAN DAN MANFAAT
3.1 Tujuan Penelitian ................................................................................................
3.2 Manfaat Penelitian .............................................................................................
BAB IV METODE
4.1 Alat dan bahan ....................................................................................................
4.2 Metode ................................................................................................................
4.3 Analisis data ........................................................................................................
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Hasil .........................................................................................................
5.2 Pembahasan ..............................................................................................
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan .........................................................................................................
6.2 Saran ...................................................................................................................
Daftar Pustaka ............................................................................................................
1
2
3
4
5
6
7
7
8
8
9
10
11
11
14
14
18
19
23
25
25
26
5
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Indonesia merupakan negara dengan biodiversitas (keanekaragaman hayati) terbesar di
dunia setelah Brazil. Biodiversitas tersebut meliputi ekosistem, jenis maupun genetik. Oleh
karenanya perlu dimanfaatkan secara optimal, salah satunya dalam hal pemanfaatan obat
bahan alam. Proses penemuan obat dari tanaman bukan merupakan proses yang mudah dan
membutuhkan jangka waktu yang lama. Proses tersebut meliputi: studi etnofarmakologi,
kemotaksonomi, skrining senyawa bioaktif, kemungkinan upaya sintesis senyawa tunggal,
studi pre-klinik maupun klinik, hingga produksi hingga skala besar untuk tujuan medik. Salah
satu tanaman obat yang baru dieksplorasi untuk dikembangkan sebagai obat
antihiperlipidemia adalah sambiloto atau Andrographis paniculata (Burm.f) Ness.
Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness) merupakan salah satu tanaman
yang efektif digunakan sebagai tanaman obat di Indonesia yang dimanfaatkan untuk tujuan
tersebut. Tanaman ini berasal dari India dan tersebar luas sampai Asia Tenggara termasuk
Indonesia. Penggunaan herba sambiloto sebagai obat mengandung sebagian besar metabolit
sekunder berupa diterpen, glikosida diterpenoid, lakton, flavonoid dan glikosida flavonoid.
Andrografolid merupakan salah satu senyawa diterpen lakton yang paling banyak terdapat
dalam herba sambiloto (Sundowo dkk., 2002). Ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
merupakan ekstrak herba sambiloto yang mengalami proses fraksinasi untuk mengurangi zat
ballast dan meningkatkan zat aktif tertentu dengan tujuan untuk mendapatkan peningkatan
aktivitas farmakologi (Cannel, 1998).
Ekstrak air sambiloto memiliki kemampuan sebagai inhibitor enzim beta-hidroksi-beta-
metilglutaril koenzim A (HMG Co-A) reduktase pada hewan uji tikus sehingga mampu
menghambat pembentukan kolesterol pada hewan uji tikus (Patel dkk., 2011) dan ekstrak air
sambiloto dapat menurunkan lipid darah pada hewan uji tikus yang dibuat mengalami
hiperlipidemia (Zuraini dkk, 2006). Selain itu penggunaan ekstrak terpurifikasi herba
sambiloto dan isolat andrografolid dapat menurunkan lipid darah hewan uji tikus DM tipe 2
resisten insulin yang mengalami hiperlipidemia (Warditiani, 2012). Andrografolid mampu
mencegah terjadinya aterosklerosis dengan cara menghambat aktivitas ERK1/2, p38MAPK
dan NK-κB akibat dari terjadinya oksidasi LDL pada sel busa makrofag yang dilakukan
secara in vitro (Li dan Li, 2011). Kandungan neoandrografolid dalam fraksi etil asetat
6
sambiloto mampu menangkal radikal superoksida, sehingga ekstrak ini mampu beraktivitas
sebagai antioksidan (Kamdem, dkk., 2002). Berdasarkan penelitian tahun pertama, bahwa
isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto memiliki aktivitas sebagai
antiaterosklerosis sehingga sekarang ingin dilakukan uji penurunan kadar kolesterol total,
LDL, trigliserida dan malondialdehid pada tikus yang diinduksi aterosklerosis. Penelitian
untuk mengetahui mekanisme kerja andrografolid dan ekstrak terpurifikasi untuk mengatasi
aterosklerosis secara in vivo belum banyak dilakukan hanya andrografolid mampu terjadinya
oksidasi LDL pada sel busa makrofag yang dilakukan secara in vitro.
Aterosklerosis merupakan kondisi patologis yang melatarbelakangi terjadinya penyakit
vaskuler seperti serangan jantung koroner, stroke dan penyakit vaskuler lainnya yang
biasanya akan dapat menyebabkan kematian pada penderitanya. Studi epidemiologi
menunjukkan bahwa pola hidup yang tidak sehat (kurang olah raga atau aktivitas fisik,
istirahat tidak teratur dan mengkonsumsi makanan kaya lemak) meningkatkan terjadinya
aterosklerosis (Tedgui dan Ziad, 2006). Sehingga kondisi aterosklerosis merupakan suatu
silent killer yang patut diwaspadai oleh penderita hiperlipidemia.
Dalam memanfaatkan tanaman herbal Indonesia sebagai tanaman obat, maka dilakukan
penelusuran aktivitas farmakologi dari ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dan isolat
andrografolid (yang merupakan senyawa yang paling banyak terkandung dalam tanaman
sambiloto). Pada penelitan ini menggunakan rancangan acak pola searah in vivo. Uji aktivitas
antiaterosklerosis akan menggunakan uji secara in vivo. Metode uji antiaterosklerosis
dilakukan pada hewan uji tikus yang diinduksi mengalami aterosklerosis dengan memberikan
makanan kaya lemak. Sampai sekarang belum terdapat penelitian yang melakukan uji
aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto untuk mencegah atau
mengobati penyakit aterosklerosis pada tikus yang diinduksi aterosklerosis dengan makanan
kaya lemak.
Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah di bidang kesehatan,
khususnya untuk dunia kefarmasian. Selain itu penelitian ini menawarkan senyawa alternatif
yang bisa dikembangkan sebagai obat antiaterosklerosis.
1.2 Tujuan Khusus
Penelitian ini bersifat eksploratif dengan tujuan mempelajari aktivitas isolat
andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f)
7
Ness) dalam menurunkan kadar malondialdehid sebagai salah satu mekanisme kerja
pencegah atau mengobati penyakit aterosklerosis.
1.3 Urgensi (Keutamaan) Penelitian (pentingnya penelitian diusulkan)
Tanaman sambiloto atau Andrographis paniculata (Burm.f) Ness merupakan salah satu
tanaman yang tersebar luas di Indonesia. Ekstrak air tanaman ini dilaporkan mampu
menghambat aktivitas enzim HMG co-A reduktase, sehingga jumlah kolesterol yang
terbentuk akan berkurang. Daun sambiloto mempunyai kandungan andrografolid tertinggi (>
2,39 %). Andrografolid merupakan komponen kimia dalam tanaman sambiloto yang paling
aktif. Untuk memperoleh senyawa tersebut maka perlu dikakukan ekstraksi bertingkat dengan
menggunakan pelarut etanol, n-heksan, kloroform dan metanol. Selanjutnya dilakukan
pemurnian secara rekristalisasi. Dari penelitian sebelumnya diketahui bahwa ekstrak
terpurifikasi herba sambiloto dan isolat andrografolid memiliki aktivitas antihiperlipidemia
pada tikus DM tipe 2 resistensi insulin, sedangkan pada penelitian lainnnya andrografolid
dapat menghambat aktivitas ERK1/2, p38MAPK dan NK-κB akibat dari terjadinya oksidasi
LDL pada sel busa makrofag yang dilakukan secara in vitro. Oleh karena itu, pada penelitian
ini akan diuji aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi sambiloto yang
berpotensi untuk mencegah atau mengobati aterosklerosis pada tikus yang mengalami
aterosklerosis dengan memberikan makanan kaya lemak. Pemilihan model hewan uji ini
karena lebih dapat mencerminkan kondisi aterosklerosis pada manusia.
1.4 Rumusan masalah
1. Apakah isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat menurunkan
kadar malondialdehid pada tikus yang diindukis aterosklerosis?
2. Apakah isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat menurunkan
kadar LDL, kolesterol total dan trigliserida pada tikus yang diinduksi aterosklerosis?
8
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Sambiloto
Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness) merupakan tanaman obat yang
banyak ditemukan di daerah Asia Tenggara yang memiliki rasa sangat pahit dan biasanya
digunakan untuk mengobati gangguan hati, gangguan lambung yang terjadi pada nak-anak,
nyeri pada usus, demam dan infeksi saluran pernafasan atas (Zhang, 2004; Mishra et al.,
2007). Dalam herba sambiloto terkandung metabolit sekunder yaitu diterpenoid, flavonoid
dan polifenol yang merupakan kandungan bioaktif utama (Rao et al., 2007). Sambiloto yang
diekstraksi dengan pelarut etanol dan metanol mengandung sejumlah senyawa aktif meliputi
lebih dari 20 senyawa diterpenoid dan lebih dari sepuluh senyawa flavonoid (Khisore et al.,
2003).
Berdasarkan hasil penelitian bahwa sambiloto memiliki beberapa aktivitas farmakologi.
Zhang, dkk., melaporkan bahwa ekstrak air sambiloto dapat menurunkan tekanan darah
sistolik pada tikus sehingga dapat berperan sebagai antihipertensi (Zhang, dkk., 1996). Isolat
andrografolid dan isoandrografolid yang terkandung dalam ekstrak etanol 85% sambiloto
menunjukkan memiliki kemampuan sebagai antiproliferatif lebih tinggi pada sel leukemia
manusia HL-60 dibandingkan senyawa diterpenoid lainnya dengan nilai IC 50 sebesar 9,33
dan 6,30 μM (Chen, dkk., 2008). Pemberian ekstrak etanol sambiloto secara peroral mampu
menurunkan kadar glukosa darah tikus diabetes yang diinduksi dengan streptozotocin (STZ).
Ekstrak sambiloto juga mampu menurunkan kadar trigliserida serum dan aktivitas hepatik
glukosa 6-fosfatase (G-6-Pase) (Zhang dan Tan, 2000). Andrografolid mampu cegah
terjadinya aterosklerosi dengan cara menghambat aktivitas ERK1/2, p38MAPK dan NK-κB
akibat dari terjadinya oksidasi LDL pada sel busa makrofag (Li dan Li, 2011).
2.2 Andrografolid
Andrografolid (C20H30O5) merupakan senyawa diterpenoid lakton yang paling banyak
terkandung dalam tanaman sambiloto. Andrografolid terkandung 4% dalam ekstrak herba
sambiloto, 0,8-1,2 % terkandung dalam ekstrak batang sambiloto dan 0,5-6 % terkandung
dalam ekstrak daun sambiloto (Cheung, et al., 2001; Pholphana, et al., 2004). Senyawa
diterpenoid lainnya yang terkandung juga dalam sambiloto adalah deoksiandrografolid,
9
neoandrografolid, 14-deoksi-11,12-dehidroandrografolid dan isoandrografolid (Cheung, et
al., 2001; Reddy, et al., 2003).
2.3 Aterosklerosis
Aterosklerosis merupakan kondisi patologis yang melatarbelakangi terjadinya penyakit
vaskuler seperti serangan jantung koroner, stroke dan penyakit vaskuler lainnya yang
biasanya akan dapat menyebabkan kematian pada penderitanya (Tedgui dan Ziad, 2006).
Pembentukan plak aterosklerosis pada dinding pembuluh darah diawali oleh terjadinya
oksidasi LDL (oxLDL) oleh spesies oksigen reaktif (ROS / reactive oxygen species).
Penyerapan oxLDL oleh makrofag melalui reseptor seperti CD36 dan SR-A menyebabkan
terjadinya transformasi makrofag menjadi foam cells yang kaya lipid. Beberapa penelitian
menyatakan bahwa terdapat hubungan antara NF-ĸB dengan aterosklerosis. NF-ĸB tersebar
pada sel-sel otot polos, sel endotelial dan makrofag mononuklear pada bagian lesi
aterosklerosis. Sehingga NF-ĸB sebagai target aksi obat antiaterosklerosis (Brand dkk.,
1996).
Gambar 1. Histopatologi aorta yang telah diwarnai dengan pewarna hematocylin-eosin.
Perbesaran 400X (aorta normal) di bawah mikroskop. Keterangan: A. Sinus subkapsular; B. Kapsul; C. Tunika adventitia; D. Tunika media; E. Vena; F. Lumen besar; G. Endotelium; H. Sel adiposa; I. Kapilari
2.4 Malondialdehid
Malondialdehid merupakan salah satu penanda terjadinya peroksidasi lemak. Pada
kondisi hiperlipidemia akan mengalami kenaikan kadar malondialdehid dalam serum. Salah
10
satu mekanisme terjadinya pembentukan plak lemak pada pembuluh darah yaitu dengan
terjadinya reaksi oksidasi LDL sehingga terbentuk ox-LDL yang akan mudah menempel pada
dinding pembuluh darah sehingga terjadi penebalan pembuluh darah. Jika terjadi reaksi
oksidasi LDL maka kadar malondialdehid akan mengalami peningkatan juga dalam serum
(Yang dkk., 2006).
11
BAB III
TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1 Tujuan penelitian
1. Untuk mengetahui aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
untuk menurunkan kadar malondialdehid pada tikus yang diindukis aterosklerosis.
2. Untuk mengetahui aktivitas isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
untuk menurunkan kadar LDL, kolesterol total dan trigliserida pada tikus yang diinduksi
aterosklerosis.
3.2 Manfaat penelitian
1. Dapat memberikan informasi bahwa isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba
sambiloto sebagai antiaterosklerosis dengan cara menurunkan kadar malondialdehid
yaitu dengan mencegah terjadinya oksidasi LDL.
2. Memberikan informasi kepada industrial kefarmasian untuk dapat dikembangkan
menjadi sebuah produk fitofarmaka yang dapat mengatasi penyakit ateroskelrosis, serat
penyakit vaskuler pada umumnya.
12
BAB IV
METODE PENELITIAN
Skema 1. Jalannya penelitian secara garis besar
Ilmiah
- Ekstrak air sambiloto ( Patel dkk., 2010) :
dapat menurunkan kadara lipid dalam
darah serta memiliki aktivitas
penghambatan enzim HMG co-A
- Ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dan
isolat andrografolid mampu menurunkan
kadar kolesterol, trigliserida dan LDL
darah pada tikus DM tipe 2 resistensi
insulin (Warditiani, 2012)
- andrografolid dapat menghambat
aktivitas ERK1/2, p38MAPK dan
NK-κB akibat dari terjadinya oksidasi
LDL pada sel busa makrofag yang
dilakukan secara in vitro (Li dan Li,
2011).
Senyawa kandungan :
andrografolid
Deoksiandrografolid,
neoandrografolid, 1,4-
deoksididehidroandrografolid,
dan homolog andrografolid
Andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
sebagai antiaterosklerosis
Uji toksisitas ekstrak terpurifikasi sambiloto dan isolat andrografolid
Mekanisme kerja isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba
sambiloto dalam aktivitasnya sebagai antiaterosklerosis
Sudah dilakukan penelitian
Dilakukan pada tahun I
Dilakukan pada tahun II
Andrographis paniculata (Burm.f) Ness
Aktivitas antihipertensi isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi
herba sambiloto pada tikus aterosklerosis
13
Skema 2. Jalannya penelitian pada tahun kedua
Induksi tikus hewan uji menjadi aterosklerosis uji histopatologi
Determinasi herba sambiloto
Pembuatan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
Isolasi andrografolid dari ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
Pemberian ekstrak
terpurifikasi pada
aterosklerosis tikus
Pemberian isolat
andrografolid pada
aterosklerosis tikus
Pengambilan serum
Pengukuran kadar kolesterol total, trigliserida, LDL dan malondialdehid
Analisa hasil kesimpulan
14
4.1 Alat dan Bahan Penelitian
a. Alat penelitian:
Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat isolasi senyawa tanaman meliputi:
kromatografi kolom, seperangkat alat KLT, lampu UV, HPLC (Shimadzu CLASS-
VP). Sedangkan untuk mengukur kadar glukosa dan lipid darah adalah: satu set
peralatan preparasi hewan uji (Surgical Suture, Bio-Dynamics, Germany), neraca
analitik elektrik (Chyo Jupiter C3-100 MD), stopwatch, komputer yang dilengkapi
piranti lunak Macbiophotonic image.
b. Bahan penelitian:
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba sambiloto yang diperoleh di
Desa Girimulyo, Kecamatan Nanggulan, Kabupaten Kulonprogo. Subjek uji
penelitian ini adalah tikus jantan Wistar dewasa (umur 4-6 minggu) dengan berat
badan 200-300 gram, diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi,
Fakultas Farmasi, Universitas Brawijaya.
Bahan penelitian yang digunakan meliputi alkohol 90%, kloroform p.a, metanol,
metanol p.a, n-heksan, etil asetat, matanol untuk HPLC, silika gel, karboksi metil
selulosa atau CMC-Na kualitas farmasetis, vitamin D (Daichi, Korea).
4.2 Metode penelitian
a. Determinasi tanaman
Determinasi herba sambiloto (A. paniculata (Burm.f) Ness) dilakukan di
Laboratorium Analisis Kandungan Tumbuhan Obat, Bagian Biologi Farmasi Fakultas
Farmasi UGM sesuai dengan buku Flora of Java (Backer dan van der Brink, 1965).
b. Pembuatan ekstrak terpurifikasi
Herba sambiloto dimaserasi dengan pelarut etanol 90% selama 1 hari, kemudian
dilakukan remaserasi selama 1 hari. Etanol 90% yang terdapat di dalam maserat
diuapkan untuk mendapatkan ekstrak kental etanolik. Kemuadian lakukan fraksinasi
dengan n-heksan untuk menghilangkan senyawa seperti lilin, klorofil yang terkandung
di dalam ekstrak etanolik. Bagian yang tidak larut dalam n-heksan difraksinasi
kembali dengan pelarut etil asetat. Bagian yang tidak larut dalam etil asetat
difraksinasi kembali dengan air panas. Bagian yang tidak larut dalam air panas,
dilarutkan kembali dengan etanol 90%. Kemudian uapkan pelarut etanol 90%
tersebut.
15
a. Isolasi andrografolid
Lakukan pemisahan secara kromatografi kolom pada esktrak terpurifikasi herba
sambiloto. Fase gerak yang digunakan adalah metanol p.a kemudian dilanjutkan
dengan menggunakan campuran kloroform:metanol (9:1). Fraksinasi dihentikan jika
fraksi yang diperoleh sudah berwarna hitam kecoklatan. Diamkan fraksi yang telah
diperoleh selama 24 jam dalam lemari pendingin hingga terbentuk kristal
andrografolid. Kristal andrografolid yang terbentuk masih mengandung senyawa
pengotor sehingga perlu dilakukan pencucian dengan menggunakan metanol p.a
dingin kemudian dilanjutkan dengan menggunakan n-heksan dingin.
Pemurnian isolat andrografolid terus dilakukan sampai mendapatkan kemurnian isolat
mencapai diatas 95%. Kemurnian isolat andrografolid dapat diketahui dengan
menguji menggunakan HPLC. Sedangkan untuk mengtahui kebenaran isolat
andrografolid, dapat diketahui dengan menggunakan alat FTIR, yang akan
membandingkan pola spektro IR standar andrografolid dan isolat yang diperoleh.
b. Pembuatan makanan kaya lemak
Hewan uji akan diberikan makanan kaya lemak untuk menaikkan kadar lemak dalam
darah. Makanan hewan uji akan dicampur dengan lemak babi (15%) dan kuning telur
bebek (5%). Jumlah kelompok hewan uji yang mendapatkan makanan kaya lemak
sebanyak 6 kelompok (kelompok kontrol positif, kelompok kontrol negatif, kelompok
isolat dosis I, kelompok isolat dosis II, kelompok ekstrak terpurifikasi dosis I,
kelompok ekstrak terpurifikasi dosis II). Masing-masing kelompok terdiri dari 10 ekor
tikus. Jumlah makanan yang dikonsumsi tikus akan diperhitungkan berdasarkan hasil
orientasi awal. Pembuatan pakan kaya lemak dilakukan setiap hari, karena pakan
dicampur dengan kuning telur bebek dan minyak babi, sehingga tidak tahan bila
dibuat untuk penggunaan lebih dari satu hari.
c. Pembuatan hewan uji menjadi aterosklerosis
Kondisi hewan uji yang diinginkan pada percobaan ini adalah menghasilkan hewan
uji (tikus) aterosklerosis yaitu terjadi penumpukan lemak pada dinding pembuluh
darah yang akan dilihat dengan uji histopatologi. Hewan uji dibuat mengalami
hiperlipidemia dan akhirnya mengalami ateroklerosis dengan cara induksi pemberian
pakan kaya lemak (lemak babi 15% dan kuning telur 5%) selama 60 hari yang
16
dikombinasikan dengan pemberian kalsium dan vitamin D3 dosis tinggi (Norman dan
Powell, 2005).
d. Pemeriksaan histopatologi organ aorta tikus
Organ tikus yang terdiri dari jantung dan aorta diambil pada hari terakhir perlakuan
untuk dibuat preparat histopatologi. Jantung dan aorta diambil dari jantung tikus
untuk pemeriksaan histopatologi. Jantung dan aorta tersebut difiksasi dalam larutan
formalin dan dikirim ke bagian Histopatologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah
Mada. Kemudian lakukan tahap pengambilan aorta dari jantung tikus, kemudian
diproses sesuai prosedur histopatologi yaitu dibuat dalam bahan blok, lalu dipotong
transversal ditengah dengan mikrotom setebal 5 mikron. Preparat dieltakkan di atas
gelas objek, diwarnai dengan haematocilin eosin (HE), ditutup dengan desk glass
kemudian ditutup dengan kanada balsem pada bagian tepinya. Preparat irisan aorta ini
siap untuk dilihat dengan mikroskop (Farmayuda, 2011).
e. Pengambilan serum
Sebelum diambil darahnya, tikus dipuasakan terlebih dahulu selama 6-8 jam tetapi
tetap diberi minum. Darah tikus diambil sebanyak 2,0 mL melalui vena mata. Darah
disentrifugasi dengan kecepatan 4.000 rpm selama 5-10 menit. Kemudian diambil
bagian yang jernih dengan hati-hati untuk dianalisis selanjutnya.
f. Pengukuran kolesterol total, trigliserida, LDL dan malondialdehid
Pada tikus aterosklerosis, dilakukan juga pengukuran terhadap kadar trigliserida,
LDL, kolesterol dan malondiladehid pada hari ke 90. Pada penelitian ini akan
dilakukan pengukuran kadar LDL, trigliserida, kolesterol dan malondialdehid
berdasarkan nilai serapan yang diperoleh.
- Penetapan kadar kolesterol total
Ambil 10 μL serum sampel, kemudian ditambahkan dengan 1000 μL reagen
kolesterol. Kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks. Setelah campur
dengan baik, inkubasi pada suhu kamar selama 20 menit. Absorbansinya dibaca
dengan spektrofotometer. Kadar kolesterol total dalam serum diperhitungkan dengan
membandingkan besarnya absorbansi sampel dan absorbansi standar dikalikan dengan
kadar standar kolesterol. Rumus yang digunakan untuk mencari kadar kolesterol total
dalam plasma adalah:
Kolesterol total (mg/dL) = ) = Absorbansi serum x kons. standar
Absorbansi standar
17
- Penetapan kadar trigliserida
Ambil 10 μL serum sampel, kemudian ditambahkan dengan 1000 μL reagen
trigliserida. pemudian dicampur dengan menggunakan vorteks. Setelah campur
dengan baik, inkubasi pada suhu kamar selama 20 menit. Absorbansinya dibaca
dengan spektrofotometer. Kadar trigliserida dalam serum diperhitungkan dengan
membandingkan besarnya absorbansi sampel dan absorbansi standar dikalikan dengan
kadar standar trigliserida. Rumus yang digunakan untuk mencari kadar trigliserida
dalam plasma adalah:
Trigliserida (mg/dL) = ) = Absorbansi serum x kons. standar
Absorbansi standar
- Penetapan kadar kolesterol LDL
100 μL serum sampel ditambahkan dengan 1000 μL reagen presipitan LDL, vorteks,
kemudian diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar, lalu disentrifus selama 20
menit dengan kecepatan 2500 rpm. Setelah selesai, ambil bagian atas sampel
sebanyak 100 μL, kemudian tambahkan reagen kolesterol 1000 μL. Absorbansinya
dibaca dengan spektrofotometer. Kadar kolesterol dalam supernatant serum
diperhitungkan dengan membandingkan absorbansi sampel terhadap absorbansi
standar kemudian dikalikan dengan kadar standar kolesterol. Rumus yang digunakan
untuk mencari kadar kolesterol dalam supernatan adalah:
Kolesterol total (mg/dL) = ) = Absorbansi serum x kons. standar
Absorbansi standar
Perhitungan untuk kolesterol LDL adalah dengan cara mengurangi kolesterol total
terhadap kolesterol dalam supernatan. Rumus yang digunakan untuk mencari kadar
kolesterol dalam supernatan adalah:
Kolesterol LDL = kolesterol total – kolesterol dalam supernatant
d. Penetapan kadar kolesterol Malondialdehid
Dilakukan pengambilan sampel serum sebanyak 100 µL, kemudian dimasukkan
kedalam tabung reaksi dan ditambahkan 50 µL larutan TCA 10% dan 300 µL
akuadest lalu divorteks selama 1 menit. Selanjutnya larutan disentrifus pada
kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk diambil
kemudian dimasukkan kedalam tabung reaksi lain dan ditambahkan1000 µL TBA
0,67%. Selanjutnya tabung dimasukkan kedalam penangas air pada suhu 95 - 100º
18
C selama 10 menit. Setelah itu tabung reaksi dikeluarkan dari penangas air dan
didinginkan. Hasil reaksi diambil kemudian diukur serapannya dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang maksimumnya 532 nm.
.
4.3 Analisis Penelitian
Pada penelitian ini, data yang dikumpulkan dalam bentuk serapan. Kemudian, nilai
serapan yang terkumpul diubah menjadi kadar lemak darah (mg/dl), dengan
menggunakan persamaan:
K = As/Ab x 100 mg%
Dimana: K = kadar senyawa yang diukur dalam darah (mg%);
As = serapan larutan sampel;
Ab = serapan larutan baku
Semua besaran yang digunakan pada analisis tersebut dinyatakan dengan X (rerata) ±
SEM (Standar Error of Means). Data yang diperoleh pada kelompok kontrol negatif dan
perlakuan (baik pada hewan uji kontrol positif dan hewan hiperlipidemia), dibandingkan
satu sama lain dengan menggunakan uji parametrik paired t test dan unpaired t test
dengan taraf kepercayaan 95%. Program statistik yang digunakan adalah perangkat lunak
SPSS (for Windows).
19
BAB V
HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Hasil
A. Ekstraksi Herba Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f) Ness)
Dilakukan ekstraksi herba sambiloto dengan menggunakan metode maserasi. 2 kg
serbuk herba sambiloto dimaserasi dengan menggunakan pelarut etanol 90% sebanyak 10 L
selama 2 hari. Selama proses maserasi, sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 2 hari proses
maserasi, dilakukan pemisahan maserat dengan ampasnya. Kemudian ampasnya diremaserasi
kembali selama 24 jam. Setelah 24 jam dilakukan pemisahan maserat dan ampasnya.
Kemudian dilakukan remaserasi kedua pada ampasnya selama 24 jam. Setelah 24 jam,
lakukan pemisahan maserat dan ampasnya. Kemudian dilakukan pengumpulan semua
maserat yang diperoleh sebanyak 15.200 mL. Ekstrak etanol herba sambiloto yang telah
diperoleh diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator sehingga diperoleh ekstrak
kental.
B. Pembuatan Ekstrak Terpurifikasi
Sebelum dibuat ekstrak terpurifikasi dalam jumlah banyak, perlu dilakukan penentuan
metode yang optimal untuk mendapatkan cara terbaik untuk mendapatkan ekstrak
terpurifikasi yang terbaik. Setelah diperoleh metode yang terbaik untuk mendapatkan ekstrak
terpurifikasi maka dilanjutkan dengan pembuatan ekstrak dalam jumlah yang besar. Ekstrak
etanolik yang sudah kental difraksinasi dengan pelarut n-heksan untuk mengurangi jumlah
klorofil dan lilin yang ikut teresktraksi dalam ekstrak etanolik. Fraksinasi dengan pelarut n-
heksan dihentikan setelah diperoleh fraksi n-heksan berwarna jernih. Fraksi yang tidak larut
n-heksan disisihkan dan dilanjutkan fraksinasi dengan pelarut etil asetat. Fraksi yang tidak
larut dalam etil asetat difraksinasi kembali dengan menggunakan air panas. Kemudian bagian
yang tidak larut dengan air panas disisihkan dan dilarutkan kemabil dengan etanol 90%,
inilah yang kita sebut dengan ekstrak terpurifikasi. Ekstrak terpurifikasi yang diperoleh
sejumlah 17,59 g.
C. Isolasi senyawa andrografolid
Berdasarkan hasil orientasi metode isolasi, maka diperoleh metode isolasi yang terbaik
yaitu dengan cara ekstraksi cair-cair dengan menggunakan pelarut etil asetat:n-heksan. Lalu
kristal yang diperoleh dilakukan rekristalisasi kembali dengan cara melarutkannya kedalam
pelarut metanol lalu didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC. kristal yang diperoleh
20
dipisahkan dari pelarut metanol untuk mendapatkan kristal yang bersih. Rendemen kristal
andrografolid yang diperoleh sebanyak 1%. Berdasarkan hasil pengukuran kemurnian isolat
andrografolid, diperoleh kandungan andrografolid dalam isolat andrografolid sebesar 89,7%.
Sedangkan untuk kandungan andrografolid dalam ekstrak terpurifikasi herba sambiloto
sebesar 31,6%.
D. Pemeliharaan Tikus Jantan Galur Wistar
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus jantan galus wistar.
Dilakukan pengkondisian tikus terlebih dahulu untuk menyesuaikan diri tikus terhadap
lingkungan yang baru. Pengkondisian lingkungan dilakukan selama seminggu. Selama
pengkondisian, tikus diberi pakan standar pellet.
E. Induksi Aterosklerosis pada Tikus Jantan Galur Wistar selama 75 hari
Setelah selesai dilakukan pengkondisian terhadap tikus. Untuk uji aktivitas kuratif
antiaterosklerosis esktrak terpurifikasi herba sambiloto dan isolat andrografolid, tikus dibagi
menjadi 7 kelompok yaitu kelompok normal, kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol
positif, kelompok ekstrak dosis 8 mg/kg BB, ekstrak dosis 24 mg/kg BB, isolat andrografolid
dosis 1,5 mg/kg BB dan isolat andrografolid dosis 4,5 mg/kg BB. Kelompok normal hanya
diberikan makanan biasa, sedangkan kelompok kontrol negatif, kontrol positif, ekstrak dosis
24 mg/kg BB, ekstrak dosis 72 mg/kg BB, isolat andrografolid dosis 6 mg/kg BB dan isolat
andrografolid dosis 18 mg/kg BB diberikan pakan kaya lemak (kuning telur 5% dan lemak
babi 15%) dan diberikan vitamin D3 (dosis 20.000 IU) dan kalsium. Induksi aterosklerosis
dilakukan dengan memberikan pakan kaya lemak selama 60 hari dan diberikan vitamin D3
dan kalsium setiap minggu sekali. Pemberian perlakuan (isolat andrografolid, ekstrak
terpurifikasi herba sambiloto dan atorvastatin) diberikan setelah 45 hari pemberian pakan
kaya lemak, vitamin D3 dan kalsium. Pemberian perlakuan dilakukan selama 30 hari.
Berdasarkan hasil pengamatan, diketahui bahwa induksi aterosklerosis selama 45 hari sudah
menunjukkan terjadinya perubahan (terdapatnya sel-sel busa dan adanya proliferasi otot polos
pada penampang aorta)
21
Berdasrkan gambar 2, terlihat adanya sel busa ( tanda ) dan adanya proliferasi otot
polos (tanda ). Hal ini menunjukkan bahwa sudah terjadinya perubahan bentuk pada
dinding aorta tikus karena adanya asupan pakan kaya lemak dan vitamin D3 dalam jumlah
berlebih. Timbulnya sel busa pada dinding aorta menunjukkan telah terjadinya oksidasi LDL.
Lambat laun sel busa akan berakumulasi dan menyebabkan terjadinya proliferasi otot polos.
Hal ini akan mengakibatkan terjadinya kekakuan dinding aorta yang menyebabkan elastisitas
pembuluh darah menurun. Pemberian kalsium juga akan menyebabkan teradinya kalsifikasi
pada dinding pembuluh darah. Hal ini juga akan memperburuk kejadian kekakuan pada
dinding pembuluh darah.
F. Pengukuran profil lipid dan malondialdehid dalam darah
Dilakukan pengukuran darah pada hari ke 45 setelah pemberian pakan kaya lemak,
vitamin D3 dan kalsium (hari ke 0 pemberian perlakuan); hari ke 60 pemberian pakan kaya
lemak, vitamin D3 dan kalsium (hari ke 15 setelah pemberian perlakuan) dan hari ke 75
pemberian pakan kaya lemak, vitamin D3 dan kalsium (hari ke 30 setelah pemberian
perlakuan). Dimana terjadi penurunan kadar malondialdehid setelah dilakukan pemberian
isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto. Terjadi penurunan kadar
kolesterol total dan trigliserida dalam darah serta terjadi peningkatan kadar HDL dalam
darah. Gambar 2 merupakan gambaran terjadinya penurunan kadar kolesterol total,
trigliserida dan peningkatan kadar HDL dalam darah.
Gambar 2. Histopat aorta tikus yang sudah diinduksi pakan kaya lemak, vitamin D3 dan
kalsium selama 45 hari
A B C
22
Gambar 3. Perubahan kadar kolesterol total, trigliserida dan HDL dalam darah dari hari ke-0,
ke-15 dan ke-30
Gambar 4. Perubahan kadar malondialdehid dalam darah dari hari ke-0, ke-15 dan ke-30
23
Gambar 5. Kadar lipid dalam darah kelompok tikus preventif
Berdasarkan gambar 5, bahwa isolat androgrfaolid dan ekstrak terpurifikasi herba
sambiloto dapat mencegah terjadinya kenaikan kadar lipid dalam darah dan kadar
malondialdehid dalam darah. Hal ini selaras dengan kemampuan andrografolid dalam
menurunkan kadar lipid pad tikus yang terlebih dahulu sudah diinduksi aterosklerosis.
5.2 Pembahasan
Pemberian pakan kaya lemak, vitamin D3 dan kalsium selama 45 hari telah mampu
menyebabkan perubahan kadar lipid dalam darah (kolesterol total, trigliserida) meningkat dan
HDL dalam darah menurun, serta kadar malondialdehid dalam darah meningkat. Terjadinya
peningkatan kadar malondialdehid menunjukkan telah terjadinya oksidasi lipid di dalam
darah. terjadinya oksidasi lipid di dalam darah juga akan menyebabkan timbulnya sel busa
yang dapat menempel atau berfiltrasi masuk ke dinding pembuluh darah sehingga
menyebabkan perubahan pada morfologi pembuluh darah. selain adanya sel busa, pemberian
pakan aterogenik tersebut dapat menyebabkan terjadinya proliferasi otot polos yang akan
mengakibatkan ulserasi pembuluh darah. kalsium yang diberikan juga akan mengakibatkan
terjadinya kalsifikasi aorta pada dinding pembuluh darah. berdasarkan gambar 2, telah
dijumpai sejumlah sel-sel busa dan telah terjadi proses proliferasi otot polos.
Berdasarkan hasil uji bahwa pemberian ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dan isolat
andrografolid dapat memperbaiki profil lipid dalam darah serta dapat menurunkan kadar
malondialdehid dalam darah. Hal ini dikarenakan adanya kandungan senyawa andrografolid.
24
Andrografolid memiliki aktivitas sebagai antioksidan, sehingga mampu mengurangi
terjadinya oksidasi lipid yang ditandai dengan terjadinya penurunan kadar MDA dalam darah
hewan uji. Dimana kadar MDA untuk kelompok perlakuan berbeda signifikan dengan
kelompok kontrol negatif. Sedangkan untuk masing-masing kelompok perlakuan tidak ada
perbedaan signifikan.
Berdasarkan pengamatan kadar lipid dalam darah kelompok tikus preventif, diketahui
bahwa isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi herba sambiloto dapat mencegah
terjadinya peningkatan kadar lipid dan kadar malondialdehid dalam darah. kemampuan ini
dikarenakan isolat andrografolid memiliki aktivitas sebagai antioksidan dan sebagai
antidislipidemia.
25
BAB VI
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1 Kesimpulan
a. Isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi dapat memperbaiki profil lipid dalam
darah.
b. Isolat andrografolid dan ekstrak terpurifikasi dapat menurunkan kadar
malondialdehid dalam darah.
6.2 Saran
a. Perlu dilakukan metode kristalisasi untuk mendapatkan kristal yang bersih.
26
DAFTAR PUSTAKA
Cannell, R.J.P., 1998, Natural Product Isolation, Glaxo Wellcome Research & Development,
Stevenage, Herb, UK
Cheung H.Y., Cheung C.S., and Kong C.K., 2001, Determination of bioactive diterpenoids
from Andrographis paniculata by micellar electrokinetic chromatography, J
Chromatogr A, 930(1-2):171-176
Chen L, Zhu H, Wang R, Zhou K, Jing Y, and Qiu F, 2008, ent-Labdane diterpenoid lactone
stereoisomers from Andrographis paniculata, J Nat Prod, 71:852-855
Farmayuda, F., 2011, Pengaruh pemberian berulang piperin dan fraksi dari ekstrak etanolik
buah cabe jawa (Piper retrofractum Vahl) terhadap kualitas spermatozoa tikus galur
wistar, Tesis, Program Pascasarjana Program Studi Ilmu Farmasi, Universitas Gadjah
Mada, Yogyakarta.
Hadjiisky P, Renais J, Scebat L. 1981. Myocyte aortique et calcification arte ´rielle calcife
´rolique. Etude ultrastructurale et histochimique. Par Art, 4(2):111–33.
Kamdem RE, Sang S, and Ho CT, 2002, Mechanism of the superoxide scavenging activity of
Neoandrographolide a natural product from Andrographis paniculata Nees. J Agric Food
Chem, 50:4662-4665
Kishore, P.H., reddy, M.V., Reddy, M.K., Gunasekar, D., Caux, C., and Bodo, B., 2003,
Flavonoids from Andrographis lineata, Phytochemistry, 63 (4): 457-461
Kim, Young Sook, Yun Mee Lee, Hyojun Kim, Junghyun Kim, Dae Sik Jang, Joo Hwan
Kim, Jin Sook Kim, 2010, Anti-obesity effect of Morus bombycis root extract: Anti-
lipase activity and lipolytic effect, J. Ethno., 130: 621-624
Li, F.X., and Li, S.S., 2011, Effects of andrographolide on the activation of mitogen activated
protein kinases and nuclear factor-κ B in mouse peritoneal macrophage-derived foam
cells, Chin J Integr Med., pubmed.
Mishra, S. K., Sangwan, N.S and Sangwan, R.S., 2007, Andrographis paniculata (Kalmegh):
A review, Pharmacog. Rev., 1, 283-298
Norman, P.E., and Powell, J.T., 2005, Vitamin D, Shedding Light on the Development of
Disease in Peripheral Arteries, Arterioscler Thromb Vasc Biol, 25:39-46.
Pholphana N., Rangkadilok N., Thongnest S., Ruchirawat S., Ruchirawat M., Satayavivad J.,
2004, Determination and variation of three active diterpenoids in Andrographis
paniculata (Burm.f.) Nees., Phytochem Anal, 15(6):365-371
Rao, Y.K., Vimalamma, G., Rao, C.V., and Tzeng, Y., 2004, Flavonoids and
andrographolides from Andrographis paniculata, Phytochemistry, 65: 2317-2321
Reddy M.V.B., Kishore P.H., Rao C.V., Gunasekar D., Caux C., Bodo B., 2003, New 2'-
oxygenated flavonoids from Andrographis affinis, J Nat Prod, 66:295-297
Sundowo, S., Dewi, P., dan Kardono, 2002, Cara Mudah Isolasi Senyawa Andrografolid dari
Daun Sambiloto (Andrographis paniculata), Prosiding Seminar Tantangan Dunia
Kimia: 193-198, Serpong
Tedgui A. dan Ziad M., 2006, Cytokines in Atherosclerosis: Pathogenic and Regulatory
Pathways, Physiol Rev, 86: 515–581,
27
Warditiani, Ni Kadek, 2012, Uji Aktivitas Antihiperlipidemia dan Antiaterosklerosis Isolat
Andrografolid dan Ekstrak Terpurifikasi Herba Sambiloto (Andrographis paniculata
(Burm.f) Ness) pada Tikus Diabetes Mellitus tipe 2 Resisten Insulin, Tesis, Universitas
Gadjah Mada, Yogyakarta
Zhang, X., 2004, WHO monograph on selected medicinal plants, vol. 2, World Health
Organization, Genewa.
Zhang CY and Tan BK, 1996, Hypotensive activity of aqueous extract of Andrographis
paniculata in rats, Clin Exp Pharmacol Physiol, 23:675-678
Zhang XF and Tan BK, 2000, Anti-diabetic property of ethanolic extract of Andrographis
paniculata in streptozotocin-diabetic rats, Acta Pharmacol Sin, 21(12):1157-1164