BIOTEKNOLOGI MOLEKULERTeknik Pemotongan dan

Penempelan DNA

KELOMPOK II:

ANDI MUSDALIFAHKARTI APRIANI GIOVANA

TRISNAWATI SUDDIN

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEOKENDARI

2016

Tahapan Teknologi DNA Rekombinan

Enzim Restriksi Endonuklease

Enzim Restriksi Endonuklease merupakan enzim yang memotong bagian internal DNA yang bekerja secara spesifik (urutan tertentu), disebut sebagai gunting biologi.

Enzim Restriksi Endonuklease memotong DNA tepat pada ikatan fosfodiester.

Enzim-enzim ini bekerja dengan memotong DNA pada lokasi-lokasi spesifik yang mampu mengenali 4 – 8 urutan nukleotida, dimana urutan DNA yang dikenali tersebut bersifat PALINDROME

Enzim restriksi yang digunakan harus sama antara pemotongan plasmid dengan pemotong DNA asing.

Enzim restriksi diisolasi dari bakteri. Enzim restriksi biasanya terdapat dalam kombinasi dengan enzim pemodifikasi lain yang melindungi DNA-nya sendiri dari pemotongan, yaitu DNA-metil transferase (dnmt).

Kependekan Kepanjangan Deskripsi

E Escherichia genus co coli species R RY13 strain

I Urutan penemuan Urutan enzim yang ditemukan pada bakteri

• Pada dasarnya, penamaan enzim restriksi diambil dari nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut.

• Seperti contohnya yang memiliki enzim EcoRI

Penamaan Enzim Retriksi

enzim EcoRI

Enzim Restriksi dengan Sekuens Pengenalnya

1. Ujung menggantung 5’

Enzim ini memotong secara asimetris pada situs pemotongan dan menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 5’.

Contoh enzim yang menghasilkan ujung menggantung 5’ adalah BamHI

Pembagian Enzim

2. Ujung menggantung 3’ • Enzim restriksi ini juga memotong secara asimetris pada situs pengenalan,

namun menghasilkan hasil pemotongan memanjang pada ujung 3’.

• Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah KpnI.

Pembagian Enzim

3. Ujung tumpul

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul.

Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini adalah SmaI.

Pembagian Enzim

Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif (sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Hasil Pemotongan

Sticky end : bersifat lengket mudah untuk disambung

Blunt end : bersifat tumpul dan sulit untuk disambung

Cara Kerja Enzim Restriksi• Enzim restriksi menghidrolisis ikatan fosfodiester yang menghasilkan gugus 3’ hidroksil (OH) dan

gugus 5’ fosfat (PO4-) yang berbentuk asimetris atau sticky ends dan bentuk simetris atau blunt ends

• Enzim restriksi dapat melakukan scanning pada untaian molekul DNA. Jika tidak menemukan restriction sites yang spesifik (mekanisme slidding), maka enzim akan melakukan pergerakan di sepanjang lekukan DNA. Namun, enzim restriksi endonuklease akan mengubah konformasinya ketika mengenali daerah restriction sites yang spesifik dan sisi katatiliknya bekerja untuk memotong ikatan fosfodiester

• Enzim retriksi bekerja dengan bantuan kofaktor , contoh Mg2+, sehingga dalam prosedur percobaannya sekuens DNA terkadang diberi MgCl. Kation bivalen Mg2+ dari MgCl tersebut berfungsi dalam proses pemotongan plasmid yang dibutuhkan untuk meningkatkan aktivitas enzim restriksi

SuhuSebagian besar enzim endonuklease restriksi memiliki suhu optimum sekitar

37°C. Beberapa enzim restriksi yang diperoleh dari bakteri thermofilik memiliki aktivitas pemotongan optimum pada suhu tinggi pH

Hampir semua enzim restriksi bekerja dengan baik pada kisaran pH 7.2-8.0 Kekuatan ionik

Hampir semua enzim restriksi dapat menerima kekuatan ionik dari NaCl (50-150 mM) maupun KCl (10-150 mM), namun beberapa enzim restriksi hanya aktif pada kekuatan ionik yang diberikan oleh KCl, seperti enzim SmaI Pengaruh kation

Ion Mg2+ diduga berperan sebagai aktivator molekul air untuk membentuk nukleofil yang dibutuhkan atau untuk menyebabkan polarisasi ikatan fosfodiester yang akan dipotong Waktu reaksi

Lamanya waktu reaksi enzim ditentukan oleh unit aktivitas enzim. Enzim yang memiliki unit aktivitas tinggi tidak membutuhkan waktu reaksi yang terlalu

lama.

Faktor yang Mempengaruhu Kerja Enzim Restriksi

(Pingoud et al., 1993).

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua ujung potongan DNA

Mengkatalisis pembentukan ikatan antara 3’-OH dari satu untai dan 5’-PO4 dari untai DNA lain

Ligase bekerja lebih efisien pada ujung lancip dibanding dengan ujung tumpul.

Enzim DNA ligase bekerja dengan bantuan kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP. Jenis kedua enzim tersebut memerlukan kofaktor yang berbeda, tetapi memiliki mekanisme katalitik yang sama.

Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4

Enzim DNA Ligase

Jenis-Jenis DNA Ligase

DNA ligase yang umum adalah T4 DNA ligase dan T7 DNA ligase

Enzim yang dapat mengkatalisis ikatan fosfodiester . Tidak seperti enzim T4, blunt end ligation tidak efektif dikatalisis oleh T7 DNA ligase. Enzim ini

dihasilkan oleh strain rekombinan bakteri E.coli yang mengandung gen penkode T7 DNA Ligase.

T4 DNA ligase berasal dari T4 bakteriofage. Enzim ini akan meligasi fragmen DNA yang menggantung, memiliki ujung kohesif maupun ujung tumpul.Untuk meligasi fragmen DNA yang memiliki ujung tumpul, diperlukan konsentrasi enzim yang lebih besar.

T4 DNA ligase

T7 DNA ligase

Penyambungan DNAEnzim DNA ligase bekerja dengan menyambungkan utas DNA yang memiliki ujung 5′-PO4 dengan ujung 3′-OH pada utas lain. Mekanismenya bisa 2 cara, sesuai hasil pemotongannya

DNA dengan ujung sticky

DNA dengan ujung blunt

Cara Kerja Enzim Ligase

1. DNA dengan ujung sticky

Ujung overhang ini harus saling komplemen agar dapat menempel dengan baik. Ujung overhang pada utas sense akan berpasangan dengan ujung overhang utas antisense. Lalu DNA Ligase tinggal membentuk ikatan

phosphodiester sehingga kedua utas kini sudah menjadi satu dengan ikatan yang sangat kuat. Mekanisme ini cenderung lebih mudah karena kedua

ujung overhang dapat menempel lebih dulu

Cara Kerja Enzim Ligase

2. DNA dengan ujung blunt

Menyambungkan utas-utas DNA yang sama-sama memiliki ujung blunt hasil pemotongan enzim restriksi atau hasil blunt PCR. DNA dengan ujung blunt lebih sulit untuk ‘dilem’ dengan enzim DNA Ligase karena tidak ada ujung overhang

yang membantu kedua utas untuk saling menempel terlebih dulu sebelum ‘dilem’.

Mekanisme Enzim DNA Ligase Mekanisme DNA ligase dimulai dari

hidrolisis kofaktor, yaitu NAD+ atau ATP.

Dan menghasilkan kompleks enzim-adenylate AMP yang berikatan kovalen dengan grup α-amino residu lysin pada sisi aktif dengan melepaskan pyrofosfat inorganik (PPi), jika kofaktor berupa ATP atau nicotinamide mononucleotide (NMN), jika kofaktor berupa NAD+

Kemudian sebagian AMP akan berpindah dari sisi aktif lysin ke ujung bebas 5’-fosfat yang berada pada nick utas DNA.

Pada akhirnya, iktan fosfodiester akan terbentuk antara ujung 3’-OH yang berada di ujung nick dengan 5’-fosfat dan melepaskan AMP dan enzim adenylate