DASAR REKAYASA GENETIKA - ordinary words · PDF fileENZIM YANG TERLIBAT 1. Enzim restriksi...
-
Upload
truongminh -
Category
Documents
-
view
233 -
download
2
Transcript of DASAR REKAYASA GENETIKA - ordinary words · PDF fileENZIM YANG TERLIBAT 1. Enzim restriksi...
Cara:1. Persilangan seksual (perkawinan)2. Hibridisasi somatik3. Mutasi4. Teknologi DNA rekombinan (rekayasa
genetika)
Tujuannya sama: perbaikan genetik darisuatu sifat
DASAR REKAYASA GENETIKADASAR REKAYASA GENETIKARekayasa = manipulasi = modifikasi= perubahan bahan genetik (perubahan & pemindahan gen)
PERSILANGAN SEKSUAL•Kelemahan: Waktu lama, Kurang presisi•Keuntungan: Mudah, murah
HIBRIDISASI SOMATIK• Penggabungan sel somatik (protoplast)• Simetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetuasama
• Asimetrik: kontribusi bahan genetik kedua tetuaberbeda
• Kelemahan: Regenerasi sulit (tanaman)• Keuntungan: Menggabungkan bahan genetikdari spesies berbeda
Pemuliaan Tanaman Konvensional(Persilangan seksual)
Pemuliaan Tanaman Konvensional(Persilangan seksual)
donor (spesies samaatau kerabat dekat)
varietas komersial
gen yang diinginkan
varietas baru
Dikawinkan(disilangkan)
gen yang tidak diinginkan
Dik
awin
kan
bebe
rapa
kali
(sila
ngba
lik)
Rantai gen, seperti untaianmutiara. Pemuliaankonvensional menggabungkanbanyak gen dalam sekalipenyilangan. Penyilangan balik(back-cross) harus dilakukanuntuk menghilangkan gen-genyang tidak diinginkan
Hibridisasi SomatikHibridisasi Somatik
donor (spesies sama atau lain) varietas komersial
gen yang diinginkan
varietas baru
Fusi sel
gen yang tidak diinginkan
Rantai gen, sepertiuntaian mutiara. Fusisel menggabungkanbanyak gen dari 2 individu atau lebih. Penapisan yang intensif harus dilakukanuntuk menghilangkangen-gen yang tidakdiinginkan danmempertahankanfertilitas
Penapisan dan seleksi intensif
MutasiMutasi
varietas baru
gen yang tidak diinginkan
Mutasi terhadap gen dapat mengubah struktur dan fungsi protein yang disandinya. Mutasi bersifat acak sehingga penapisan yang intensif terhadapmutan harus dilakukan untuk memilih individu mutan yang diinginkan
Penapisan dan seleksi intensif
•Fisik: radiasi UV, X, gamma, suhu•Kimia: kolkisin, EMS, 5-BrU
REKAYASA GENETIKA
•Teknologi DNA rekombinan GMO•Cara: penyisipan DNA asing (transgen) kedalam genom sehingga diekspresikan, dan diwariskan
•Transgenesis: proses perakitan organismetransgenik
•Keuntungan:Presisi, cepat, gen dari berbagai organisme
•Kelemahan:Teknologi, mahal
Teknologi DNA rekombinan(Bioteknologi)
Teknologi DNA rekombinan(Bioteknologi)
donor (berasal darispesies yang sama atau lain)
varietas komersial
gen yang diinginkan
varietas baru
pemindahan gen
gen yang tidak diinginkan
Dengan teknologi DNA rekombinan, hanya satugen saja yang dipindahkan.Pemindahan hanya terjadipada gen yang diinginkan
Ekspresi transgen•Elemen pengontrol: promoter dan terminator
•organisme: eukaryot/prokaryot•tujuan: kuantitas, tempat, waktu
•(+enhancer, intron)
•Promoter: tepat sasaran (waktu dan tempat)•konstitutif (ekspresi terus menerus): 35S CaMV•waktu dan tempat spesifik
Penanda seleksi• Tujuan: untuk menapis sehingga sasaran dapatdiindentifikasi dan diisolasi
• Reaksi biokimia sehingga terbentuk warna: X-gal (seleksi biru-putih)
• Reaksi resistensi terhadap antibiotika: ampisilin, kanamisin
Cara introduksi transgen kedalam sel inang• Transformasi (plasmid)• Transfeksi (fage, virus) sel hewan, serangga, bakteri
Metode transformasi•Agrobacterium tumefaciens•Biolistik•Mikroinjeksi•Elektroporasi•Transfer langsung dengan PEG•Liposom
Agrobacterium:•Khusus untuk tanaman•tumefaciens: tumor (pTi)•rhizogenes: akar berambut (hairy root) (pRi)
Plasmid pTi dari A. tumefaciens•Transfer: T-DNA (12-24 kb)•Gen-gen vir: pindah & integrasi•Ori: replikasi•Katabolisme opin
Biolistik•Banyak untuk tanaman tetapi tidak banyak untukhewan
•Jaringan, penggunaan luas•Khimera sehingga seleksi harus ketat•Tekanan udara: He•Partikel (<10 μm): emas atau tungsten•Pengaturan: jarak dan lama tembak
Elektroporasi•Kejutan listrik: membran protoplast•Bakteri, tanaman, hewan
Transfer langsung• Mg2+, Ca2+, PEG• Heat shock• Tanaman: regenerasi dari protoplast ke sel ke tanaman utuh
Mikroinjeksi• Banyak untuk hewan, jaranguntuk tanaman
• Injeksi di inti sel (kloroplastatau mitokondria)
• Sel hewan: injeksi di sel telurterbuahi
Transfeksi
Tahapan Pengklonan GenDASAR PENGKLONAN GEN
1. Isolasi DNA (gen)2. Penyisipan DNA kedalam vektor3. Introduksi vektor (rekombinan) kedalam sel
inang (bakteri)
ENZIM YANG TERLIBAT1. Enzim restriksi endonuklease•Memotong DNA pada situs spesifik•Tipe II: situs pengenalan dan pemotongan spesifik•Situs pengenalan: palindrom (simetri)
5’-N-N-G-G-C-C-N-N-3’3’-N-N-C-C-G-G-N-N-5’
HaeIII
EcoRI
5’-N-N-G-G C-C-N-N-3’3’-N-N-C-C G-G-N-N-5’
5’-N-N-G A-A-T-T-C-N-N-3’3’-N-N-C-T-T-A-A G-N-N-3’
•Hasil pemotongan•Ditentukan oleh situs pemotongan•Pusat simetri: ujung rata (blunt end)•Di luar pusat simetri: ujung tidak rata/kohesif(sticky end)
5’-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N-3’3’-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N-3’
Contoh Enzim Restriksi Endonuklease
Enzimrestriksi
Organisme asal Situs pengenalan(arah 5’-3’)
Ujung potonganyang dihasilkan
EcoRI Escherichia coli G AATTC kohesifBamHI Bacillus amyloliquefaciens G GATCC kohesifBglII B. globigii A GATCT kohesifPvuI Proteus vulgaris CGATCG kohesifPvuII P. vulgaris CAGCTG rataHindIII Haemophilus influenzae Rd A AGCTT kohesif
HinfI H. influenzae Rf GANTC kohesifSau3A Staphylococcus aureus GATC kohesifAluI Arthrobacter luteus AG CT rataTaqI Thermus aquaticua TCGA kohesifHaeIII H. aegyptius GG CC rataHpaII H.parainfluenzae C CGG kohesifNotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC kohesif
2. Enzim Ligase•Untuk menyambung potongan DNA•5P dari nukleotida 1 dengan 3OH nukleotida 2•2 tipe:DNA ligase dari E.coli
DNA ligase dari fage T4
ISOLASI GEN1. Pemotongan DNA dengan enzim restriksi
endonuklease
Pemotongan DNA Pustaka Genom
Construction of genomic library
DNA total
Partial digestion
Ligation
Packaging
Transvection
λBlueSTAR7-20 kb DNA fragment
2. Isolasi cDNA•cDNA: DNA yang disintesis berdasarkan mRNA•RNA total = mRNA + rRNA + tRNA•RNA total + Oligo (dT) → (Oligo (dT)+ mRNA) + (rRNA+tRNA)
Pengklonan gen melalui RT-PCR
RT
PCR
Ligasi
mRNA
Tran
sform
asi
cDNA
3. Transposon•Dapat berpindah tempat di kromosom•Bila menyisip ke gen, gennya mengalami mutasi•Mutan dapat dilacak dengan transposon sebagaipelacaknya•Perlu: konstruksi pustaka genom
VEKTOR PENGKLONAN• Pembawa molekul DNA
1. PlasmidKarakteristik:•Replikasi (autonom)•Ekstra kromosom•Stabil•Ukuran 1-300 kb
Jenis:•F (fertilitas → konjugasi)•R (resistensi → antibiotika)•Toksin (ColE1 dari E.coli)•Degradatif (TOL dari Pseudomonas putida)•Patogenesitas (pTi dari A. tumefaciens)
Cloning vector & host
Cloning gene by RT-PCR: pGEM-T Easy (Promega)Host: E. coli DH5α
Keadaan plasmid di dalambakteri:
• Non-integratif (tidakmenyisip di kromosominang)
• Episom (menyisip dikromosom inang)
Syarat menjadi vektor:•Ukuran kecil•Punya situs penyisipan•Gen penanda seleksi
2. Fage•Virus yang menyerang bakteri
Fage λ•Bentuk: kepala dan ekor•Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni•Ukuran genom: 49 kb, utas ganda•Kedua ujung: situs cos → (1) sirkuler, (2) situspemotongan
Fage M13•Bentuk: batang/filamen•Ukuran genom: 6,407 kb, linier•Perbanyakan: tanpa lisis sel inang
Cloning vector & host
E. coli strain ER1647 Host:, BM25.8, DH5α
3. Cosmid•DNA hibrid: λ dan plasmid•Ukuran: 5 kb sehinggadapat membawa 40 kb DNA•Dapat digunakan sebagaivektor dengan karakteristik:•Mempunyai titik asalreplikasi
•Mempunyai situs cos•Mempunyai genpenanda seleksi
• Dapat membawa sisipanDNA berukuran besar•Konstruksi pustaka genom
• Karakteristik sebagai vektor:•Mempunyai sentromer•Mempunyai telomer(menghindari ligasi dengankromosom lainnya)
•Mempunyai titik asalreplikasi
4. Kromosom buatan dari khamir (Yeast Artificial Chromosome = YAC)
5. Kromosom buatan dari bakteri (Bacterial Artificial Chromosome = BAC)
• Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar•Konstruksi pustaka genom