Ricky Rahadian Lazuardi

11/317055/PA/14172

ELEKTROFORESIS DNA

A. Pendahuluan

DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses

metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen,

dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat

berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses

metabolisme lain.

Elektroforesis dilakukan untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengkarekterisasi dan purifikasi dari

molekul DNA/ RNA. Elektroforesis merupakan cara pengamatan DNA dengan bantuan sinar Ultra violet. Cara

pemisahan dengan elektroforesis ini merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA

rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai tunggal atau untai ganda molekul

DNA. Elektroforesis digunakan untuk pengamatan DNA dalam penampakan flouresensinya.

B. Prinsip Kerja

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul DNA ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel

yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi

dengan sisi lainnya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu

kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda

positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju

perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium

hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein

didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk

linear dan bermuatan negatif pada sisi luarnya sehingga pada saat dielektroforesis akan menuju ke kutub positif

secara seragam. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul

sampel yang telah terpisah dapat dideteksi. Senyawa yang biasanya digunakan adalah Etidium bromida sebagai

zat pewarnanya,. Etium bromida akan berinteraksi dengan basa dari molekul DNA dan akan memberikan warna

orange fluoresance yang dapat dilihat di bawah sinar ultraviolet.

C. Pembahasan

Ketika dilihat di bawah sinar ultraviolet akan terlihat pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang

berbeda pada gel; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari sumur gel. Pita-pita yang berjarak sama

dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama

elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama.

Penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk

menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis penanda tersebut pada lajur di gel

yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marker tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk

menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul. Dalam

Hasil pengamatan terlihat bahwa terdapat fragmen DNA yang terlihat terurai dan tidak terurai. Semakin sedikit

DNA yang terurai, maka semakin baik hasil elektroforesis DNA nya.

beberapa faktor yang mempengaruhi Elektroforesis migration rate selama DNA bergerak

menembus gel agarose, sebagai berikut :

1. Ukuran molekul DNA

Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA linier lebih cepat dibanding DNA

sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah

pasangan basa.

2. Konsentrasi gel agarose

Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak sesuai dengan konsentrasi dari gel

agarose yang digunakan. Rumusnya adalah: log=log-KrT dimana adalah free electrophoresis

mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel konsentrasi serta adalah electrophoretic

mobility DNA.

Tabel 1. konsentrasi gel agarose dan ukuran molekul DNA

No Konsentrasi Gel Agarose

(%)

Effisiensi range Pemisahan pada

DNA linier (kb)

1 0.3 60-5

2 0.6 20-1

3 0.7 10-0.8

4 0.9 7-0.5

5 1.2 6-0.4

6 1.5 4-0.2

7 2.0 3-0.1

3. Konformasi DNA

Laju migrasi juga tergantung pada bentuk/konformasi DNA, kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA

yaitu super-helix circular (I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu mempunyai

berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:

konsentrasi gel agarose

kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan

densitas kembaran superheliks pada bentuk I

pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III

tergantung juga kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat, pengikatan DNA meningkat

pula sehingga mobilitas meningkat tajam, contoh untuk bentuk I

konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg

4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris

Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional. Idealnya untuk DNA 2kb pada gel

agarose bergerak 5v/cm. Arah dari bidang elektris konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan

laju yang sama, akan berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan berubah juga.

5. Komposisi basa DNA atau temperature

Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh, mobilitas DNA stabil pada temp. 4-

30C. Dan elektroforesis gel agarose dilakukan pada suhu kamar

6. Keberadaan pewarna DNA

Iintercalating agent ethidium bromide (EtBr) adalah pewarna fluoresen untuk deteksi asam nukleat,

EtBr ini akan mengikat pada sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA

linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara langsung dengan cara gel

diletakkan pada media UV-transilluminator. EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single- atau

double-stranded asam nukleat (DNA atau RNA). Meskipun, affinity dari EtBr-dye ini untuk single-

stranded asam nukleat relative rendah dan pendaran fluorensen minimum. PERHATIAN! EtBr ini

powerful mutagen, pengguna harus selalu memakai sarung tangan pada saat bekerja, dan lindungi

mata anda dengan kaca pelindung pada saat mengamati di atas UV-transilluminator.

7. Komposisi buffer elektroforesis

Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan untuk pembuatan

gel agarose. Missal:

Tris-acetate; umum dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah, tetapi efektif untuk

isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.

Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose kurang effektif, karena ada interaksi dengan agarose

D. Referensi

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press

Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga