5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 1/14

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Oleh:

Nama : Asep Setiadi

NIM : B1J008105

Rombongan : IV

Kelompok : 4

Asisten :Anriani Puspita Karunia Ning Widhi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI

PURWOKERTO

2011

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 2/14

I.  PENDAHULUAN

A.  Latar Belakang

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh

medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju

perpindahannya oleh gaya gerak listrik  di dalam matriks gel. Laju perpindahan

tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya

dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik 

preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain

seperti spektrometri massa,  PCR,  kloning,  sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang

(crosslinked ) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk 

memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA,  RNA, atau

oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat

dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan

pertautan silang (cross-linker ), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran

rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar

dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak  rumput

laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur

(well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan

kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke

arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah

pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami

pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan

asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti

natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat

berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya

natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan

bermuatan negatif.

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 3/14

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining)

agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau

pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini.

Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai"

dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel

mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band ) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak 

setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur"

gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis

mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis

dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut

berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker ) yang merupakan campuran molekul

dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul

dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang

paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan

dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel

berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

.

B.  Tujuan

Tujuan praktikum adalah untuk mengetahui cara kerja dan prinsip kerja

elektroforesis.

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 4/14

II.  MATERI DAN METODE

A.  Materi

Bahan yang digunakan pada praktikum ini yaitu DNA marker, misalnya DNA

λ yang dipotong dengan HindIII, DNA produk PCR, agarosa, larutan buffer TAE 50x

(242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan

dalam akuades hingga 1000 ml),  Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25%

xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM), akuades, larutan Etidium

Bromid (EtBr).

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur 1000 ml, labu

erlenmeyer 50 ml, seperangkat mikropipet beserta tipnya ( Bio-Rad  dan  AxygenScientific), tabung mikrosentrifuga, kertas parafilm, seperangkat alat elektroforesis,

sarung tangan, kaca mata UV, UV transluminator, kamera digital.

B.  Matode

Praktikum ini dilakukan dengan cara sebagai berikut:

No. Keterangan Gambar

1.  Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%,

timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan

asisten)

2.  Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20

mL

3.  Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat

 jernih.

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 5/14

4.  Biarkan larutan agarosa mendingin (55ºC)

dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10

mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke

dalam pencetak gel

5.  Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke

dua ujung pencetak gel dan menempatkan

sisir pada salah ujung pencetak gel

6.  Tuangkan larutan agarosa ke dalam

pencetak gel.

7.  Setelah gel memadat, pindahkankan gel

agarosa beserta pencetak gel ke dalam

tangki elektroforesis.

  Sebelum dipindahkan ke tangki

elekstroforesis, selotip pada kedua

ujung pencetak gel dilepas terlebih

dahulu

8.  Masukkan 10 µL sampel DNA yang telahdicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke

dalam sumur (well) gel agarosa

9.  Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda

warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose

bagian bawah.

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 6/14

10. Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel

agarosa di atas UV transillumitor dan tutup

kaca pelindung dan amati pita DNA

11. Dokumentasikan pita DNA yang tampak 

menggunakan kamera .

III. 

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 7/14

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A.  Hasil

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 8/14

B.  Pembahasan

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel

DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel

yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan

untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000

pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan

bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran

molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat

diperkirakan dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi

fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahuiukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet

setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium

bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam

larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12

tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel

 Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-

akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein

dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas,

namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA

dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA

kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

( Pratiwi, 2001).

Metode Elektroforesis Gel Agarosa didasarkan pada pergerakan molekul

bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik.

Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis

gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar

dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid

dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid

biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing). Prinsip pemisahan

dalam elektroforesis didasarkan atas perbedaan migrasi komponen pada fase

pendukung, karena adanya perbedaan muatan dan masa molekul ( Zubay, 1989).

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 9/14

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur

yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutub negatif, apabila dialiri arus

listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke

kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan

massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk 

DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding

yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA

berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan

etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita

fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa

diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar ( Pratiwi, 2001).

Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada

suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik 

tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis

dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).

Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis

untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya

difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis

biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-

mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan

dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam

elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel

poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai

untuk separasi protein dan asam nukleat ( Zubay, 1989).

Menurut Soedarmadji (1996), beberapa faktor mempengaruhi kecepatan

migrasi dari molekul protein yakni:

1. Ukuran molekul protein

Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi

molekul berukuran kecil.

2. Konsentrasi gel

Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat

daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 10/14

3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan

dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein

yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas

sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan

molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga

aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.

4. Medium penyangga

Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang

bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai

migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel

poliakrilamid (Sudarmadji, 1996). Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama

dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di

dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam

migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi

penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.

5. Kekuatan voltase

Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul

sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Voltase yang dipakai tinggi

(500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan

untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai

selalu harus searah (bukan bolak balik).

6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung.

Gel elektroforesis digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan

ukurannya. Dimana jika sentrifugasi berarti memisahkan molekul menggunakan

kekuatan gravitasi sementara gel elektroforesis berarti memisahkan molekul dengan

menggunakan kekuatan elektrik. Gel elektroforesis mengambil keuntungan bahwa,

sebagai asam organik, DNA bermuatan negatif. Ketika diletakkan di dalam medan

listrik, molekul DNA menuju ke kutub positif (anoda) dan menjauhi kutub negatif 

(katoda). Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA terlebih dahulu harus

ditambahkan loading buffer (dye), yang berfungsi untuk menambah densitas,

sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur; pewarna untuk memudahkan

meletakkan sampel DNA ke dalam sumur, agar dapat bergerak ke arah anoda dengan

laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

Pewarna yang biasa digunakan adalah bromophenol blue dan xylene cyanol. Selain

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 11/14

itu, pembacaan pita DNA di dalam gel yang telah diwarnai dengan ethidium bromida

di atas lampu UV yang dibandingkan dengan DNA standar juga sering dilakukan

untuk menganalisis kuantitas jumlah DNA (Suharsono dan Widyastuti , 2006).

Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein

dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya

protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda

negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid

tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka

semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein

dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek 

atau mobilitasnya rendah (Sumitro et al., 1996).

Hasil praktikum menunjukkan bahwa DNA sampel terbaca, namun DNA

marka tidak terbaca malainkan terjadi penumpukan. Hal ini terjadi mungkin karena

kurang tepat dan kurang hati-hati dalam memasukkan DNA marka ke dalam

sumuran, sehingga DNA marka terlalu banyak dan hingga memenuhi sumur

sebelahnya. Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang

terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk 

dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang

mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama.

Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul

bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul

dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang

sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 12/14

 

Fungsi dari alat dan bahan yang digunakan dalam elektroforesis gel

agarosa:

a.  Aquades : sebagai pelarut

b.  Etidium bromide : sebagai pewarna DNA

c.  Baki gel agarosa : sebagai cetakan gel agarosa

d.  UV Transiluminator : untuk melihat pita-pita DNA

e.  TAE : Trisbase sebagai buffer sesuai dengan pH,

a.  Asam Asetat Glasial sebagai elektrolit gram,

b.  EDTA (Etylen Diamine Tetra Asetic Acid)

sebagai pe-non aktif DNA-se

f.  DNA marka : DNA penanda

g.  Sisir elektroforesis : untuk membuat sumuran pada gel agarosa

h.  Tangki elektroforesis : untuk running DNA

i.  Loading dye : sebagai pemberat DNA

 j.  Mikropipet : untuk mengambil dan menghomogenkan sampel

DNA dan loading dye

k.  Kertas Parafilm : untuk tempat menghomogenkan sampel DNA dan

loading dye

l.  Sarung tangan : Melindungi terkena DNA-se yang dapat merusak 

DNA

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 13/14

V.  KESIMPULAN DAN SARAN

A.  Kesimpulan

Berdasarkan hasil dan pembahasan, dapat disimpulkan :

1. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik .

2. Hasil yang didapat dilihat dari perpendaran pita-pita DNA yang terbentuk pada

elektroforesis, DNA marka mengalami degradasi atau mengumpul tetapi DNA

sampel dapat terbaca. Hal ini terjadi karena beberapa kemungkinan antara lain

kesalahan dalam memasukkan DNA marka ke dalam sumur gel, waktu yang

kurang atau voltase naik turun.

B.  Saran

Sebisa mungkin semua praktikan melakukan percobaan, kalau tidak buat apa di

bikin kelompok yang terdiri dari -+ 5 praktikan.

5/15/2018 Elektroforesis Gel Agarosa - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/elektroforesis-gel-agarosa-55ab4e996acef 14/14

 

DAFTAR REFERENSI

Anonim, 2011. http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/ 

Anonim. 2011 http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid

Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor

1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta

Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama Liberty.

Yogyakarta.

Suharsono dan Widyastuti, U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik 

Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi,

IPB.

Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus

Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA

Universitas Brawijaya. Malang

Zubay, G.L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation.

New York.