BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena

kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi

murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik

pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran .

Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbang

akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang

teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler.

Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah

rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan

penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya

metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian

yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul

yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam

Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa

Junani yangmempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.

Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan Swedia

Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan chanrge mereka dalam tabung

berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi

hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel

elektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang

1

digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada

1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang

berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda

elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di

sini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.

B. Tujuan

a. Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis

b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis

c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis

d.. Mengetahui kegunaan/ aplikasi elekroforesis

2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Prinsip dan Teori Elektroforesis

Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit

menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk

pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam

amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.

keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari

pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al,

2010)

Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul dalam

medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya

buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit

dimasukkan ke dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik

diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung

molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai

bergerak menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan

mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda.

sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik diterapkan.

(Andreas Manz, et.al, 2010)

3

Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010)

Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan

yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. gratis

pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit digunakan. pemisahan ion analit terjadi

karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit

hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran.

pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel

memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang lebih

kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya dua rasio ukuran

yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran. (Andreas Manz, et.al,

2010)

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan

berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik ini

diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis free boundary, elektroforesis

wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).

Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase

tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda sesuai

dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenen

4

atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukan mobilitas

elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat

spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara

spontan bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free

boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum

proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan

memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap vertikal

pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien perbedaan

kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu

medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan

temperatur. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap

kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin,

butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga-rongga kapiler. Kertas

penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat

dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal

dan interferensi anomali paling kecil pada boundary. Pada umumnya istilah

elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transfor fisik zat

terlarut yang bermuatan didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar,

2008).

Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel

bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub

positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub

negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan

pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006)

5

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada

makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan

negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke

kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif

ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap

massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan

dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan

kondisi elektris lingkungan(Ricardson dkk. 1986):

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan

listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996 ektroforesis adalah suatu cara analisis

kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam

medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh

bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986

Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang

dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium

penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen protein tersebut

akan mulai bermigrasi (Ricardsondkk. 1986).

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya

muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi

elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika

kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi

mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh

oleh suatu partikel bermuatan sesuai dengan :

6

d = Uteqk = U ,V

L (persamaan 2.1)

dimana V= tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U =

Mobilitas ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang ditempuh (Kopkar,

2008).

Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama: mobilitas

elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas Manz,

et.al, 2010)

a. Mobilitas elektroforesis

Mobilitas elektroforesis μep merupakan parameter spesifik untuk senyawa yang

diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik diterapkan.

senyawa dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain.

Ketika pertukaran ion q diposisikan kedalam medan listrik E, pengalamannya sebuah

gaya listrik Fef:

Fef = q . E (persamaan 2.2)

Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode negative

(katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda negative (anoda).

Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul menengah. gaya ini

berbanding lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi elektroforesis, Vep serta

viskositas medium, ἠ. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Ffr = 6 . ἠ . π . r. Vep (persamaan 2.3)

7

Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan gaya

listrik (persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan konstan, Vep

(persamaan 2.5).

Fef = Ffr (persamaan 2.4)

Vep = q . E (persamaan 2.5)

6 . ἠ . π . r

Mobilitas elektroforesisμep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan migrasi Vep

atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). μep lebih sering digunakan daripada VEP

untuk menggambarkan migrasi ion.

μep = Vep / E = q . E (persamaan 2.6)

6 . ἠ . π . r

Untuk media pemisahan diberikan viskositas adalah konstan. maka mobilitas

elektroforesis μep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti yang disebutkan

sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas dasar rasio q / r, ketika

mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam medan listrik. perubahan pH

penyangga mengubah muatan suatu analit dan dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas

Manz, et.al, 2010)

b. Aliran elektroosmosis (EOF)

Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti kaca, menyatu

silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan yang paling bioanalitik, pH

buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif yang dihasilkan. Kelompok Silanol (-

SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler

8

menjadi negatif . Ini menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi

massal. (Andreas Manz, et.al, 2010)

Dalam penerapan medanlistrikkationdilapisandifusbergerak menujukatodadan

tariksolusimassaldengan mereka. gerakan inidari solusimassaldisebutaliranelektroosmosis.

dalamelektroforesisgelphenomenonofEOFjugadisebut sebagaielectroendoosmosis.

Kecepatan dari EOF ,VEOFberbanding lurus dengankonstanta dielektrikdan potensizeta, dari

buffersertakekuatan medanlistrik diterapkan, E.Veofberbanding terbalik

denganviskositasbufferpemisahan.

VEOF = ε . ᶊ . E4 . π .ἠ

( persamaan 2.7)

μEOF = VEOF / E (persamaan 2.8)

Seringkaliarahmobilitaselektroosmosisdari solusimassal adalahmelawanarahdari

ionanalit. Iniadalahkarena bagi kebanyakanpemisahanbiomelecularionanalitbermuatan

negatifdan akandiseretke arahanodasedangkanEOFdiarahkankatoda.

ProfilaliranEOFmemilikibentukplug. kecepatan aliranidentikatas

seluruhdiameterkapiler , kecuali untukbergeraklebih lambatlapisandifusdekat dengan

dindingkapiler. Distribusi kecepatanhomogeneusmeminimalkanpelebaran pitadan dengan

demikian meningkatkanefisiensi pemisahan. situasiyang sangat berbedaterjadidengan

tekananalirandidorongdigunakan dalamChromatografycair.di

siniprofilaliranparabolakecepatan aliranmemilikidistribusi besaratasdiameterkolom.

analitdalam arustengahjauh lebih cepat daripadaanalitlebih dekat kedindingsaluran.Hasilini

dalampelebaran pitadan hilangnyaefisiensi pemisahan.

9

Kontrol EOF

Dalam kapiler, eof dapat dikontrol oleh: 1). beroperasi pada pH rendah, 2).

permukaan kimia modification, 3). pelapisan dinamis dinding kapiler misalnya dengan

lapisan polimer atau, 4). menggunakan aditif yang mengubah viskositas, dan potensial zeta.

1). Biaya permukaan dinetralkan dengan mengoperasikan ata pH cukup rendah untuk

protonate kelompok silanol. ini namun hanya terjadi pada pH, 4, pH di mana banyak

biomolekul tidak stabil.

2). Modifikasi kimia dari gugus silanol pada dinding kapiler dapat dilakukan untuk membuat

mereka sangat hydophilic atau sangat hidrofobik. permukaan hidrofilik, diperoleh dengan

pengobatan dengan asam sulfonat, mempertahankan konstan, EOF tinggi. kelompok

fungsional hidrofobik melekat memimpin permukaan penekanan EOF. masalah dengan

modifikasi kimia adalah bahwa stabilitas jangka panjangnya sering sangat redah.

3). Alternatif adalah lapisan dinamis dinding saluran dengan menambahkan polimer seperti

polietilena glikol (PEG) ke buffer run. lapisan polimer kental terbentuk pada dinding

kapiler,yang topeng biaya dan menekan EOF.

4). Aditif netral seperti hidroksil etil selulosa atau Polyvinil alkohol meningkatkan

viskositasbuffer menjalankan dan dengan demikian mengurangi kecepatannya. Selanjutnya,

mereka menekan interaksi permukaan analit. sama, pelarut organik seperti asetonitril

metahnol dan dapat digunakan untuk mengurangi atau meningkatkan viskositas masing-

masing. surfaktan kationik seperti dedocyl trimetilamonium bromidamenyerapke

dindingcapillarlydan dengan demikian mengubahmuatan permukaan.

inimembalikkanarahEOF. surfaktanharus digunakanpada konsentrasi rendahuntuk

menghindaripembentukanmisel, yangdapat menggangguproses pemisahan.

c. Efisiensi Pemisahan dan Resolusi

10

Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh aliran

elektroforesis (EOF). mobilitasnyata μappdarisuatu analitditentukan olehjumlah

darimobilitaselektroforetiknyaμep dan mobilitaselektroosmosisμEOF.(Andreas Manz, et.al,

2010)

μapp = μep + μEOF (persamaan 2.9)

JikaEOFmendominasigerakanelektroforesis, maka semuakomponenanalitbergerak

menujukatoda. mereka dipisahkandari satu sama lainkarena perbedaanmereka

dalammobilitasjelas. kationmemilikiμapp tertinggikarenamerekaberada diarah yang

samadenganμEOF. Spesiesnetraltidak memilikiμep. Karenanya

merekadiseretpadakecepatandari solusimassal.Anionmencapaikatodaterakhir, μepnya

menentangarahμEOF.

Kecepatan perpindahan ,V pada analit didefinisikan sebagai produk dari mobilitas

nyatanya , μapp, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8). kekuatan medan, E,

adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L. Karena itu v, dapat dijelaskan

sebagai:

v = μapp . E = (μep + μEOF ) . V / L (persamaan 2.10)

Waktu perpindahan, t, dari analit didefinisikan sebagai panjang kapiler , L, kecepatan

perpindahan ,v. Substitusi v untuk persamaan 3.9 menjadi:

11

L2

t = L / v = (persamaan 2.11)

μapp . V

Oleh karena itu kekuatan medan listrik lebih besar , E, lebih cepat velocitynya dan

lebih cepat waktu perpindahannya. Pada elektroforesis , pelebaran pita utamanya disebabkan

ileh difusi longitudinal. Distribusi peak τ2 berbanding lurus dengan koefisien difusi, D dari

analit dan waktu perpindahannya.

2 . D. L2

τ2 = 2 . D . t = (persamaan 2.12)

μapp. V

Jumlah plat teoritik N, pada elektroforesis dapat dijelaskan dengan:

μapp . V

N = L2 / τ2 = (persamaan 2.13)

2. D

Jumlah plat tidak tergantung pada panjang kapiler dan waktu perpindahan. Tegangan

yang besar mentebabkan peningkatan dalam jumlah yang meningkat. Dalam teori jutaan

pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan elektroforesis membuat teknik ini unggul

dari LC, di mana jumlah plate per kolom biasanya di urutan sepuluh ribu. Dalam

prakteknya, bagaimanapun, plat nomor yang lebih rendah diamati pada elektroforesis.

pelebaran pita disebabkan oleh injeksi sampel dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan

yang mengarah ke plat nomor di urutan ratusan ribu ketimbang jutaan .

12

Resolusi, Rs, antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas

elektroforesis antara dua spesies, ∆μep (yaitu selektivitas pemisahan), tegangan pemisahan,V,

mobilitas elektrofoersis nyata, μapp , dan koefeisien difusi, D.

Rs = ∆μep . √V .√ 1μapp

. 1

4 .√2 D(persamaan 2.14)

Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah untuk

meningkatkan selektivitas pemisahan∆μep. ini dapat dicapai misalnya dengan mengubah pH

buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis. meningkatkan tegangan pemisahan,

juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi untuk molekul besar seperti ini memiliki

koefisien difusi yang kecil

B. Jenis – Jenis Elektroforesis

Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan konvensional yang

telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih canggih atau modern sebagai

penyempurnaan dari metode koinvensional yang sebelumnya. Adapun jenis-jenis

elektroforesis yang dikenal 2 (dua) kelompok teknik elektroforesis, yaitu:

a. Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak / moving

boundary)

Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu

protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai

fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang.

b. Dengan pengemban padat atau matriks seperti:

13

- Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)

- Elektroforesis Kertas

- Elektroforesis selulosa asetat

- Elektroforesis gel

1. Elektroforesis Zone (Elektroforesis Wilayah)

Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju perpindahan

elektroforesis wilayah, faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion-ion adalah

mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat

terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena elektroforesis atau elektroosmosis. Medium

yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida

dan bubuk gel (Kopkar, 2008).

Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan

komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas

atau konformasi.

2. Elektroforesis Kertas

Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia

di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis.

Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA

terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang

kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Ternyata mereka

menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis

tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada kesimpulan bahwa

hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu

14

dinamakan ‘elektroforesis‘, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki

kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di

atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.

Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi

tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur

molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida

2′-monoposfat dan nukleosida 3′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan

mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses

elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan

mengidentifikasi setiap komponen tersebut.

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase

diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini

terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel

dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan

yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat

terlarut.

3. Elektroforesis Tirai (elektroforesis kontinu),

Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinu.

Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu larutan buffer.

Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari

suatu resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua

ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan

komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan seperti pada gambar dibawah ini.

15

Gambar 2.2 Elektroforesis Tirai ( Elektroforesis Kontinu), (Khopkar, 2008)

4. Elektroforesis Gel (GE)

Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.

Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan

listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya

oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada

ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,

namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum

digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing

DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang

porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam

nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya

merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida

dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan

16

poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang

lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari

ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)

pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.

Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu

kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah

menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang

dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya

berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida

digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein

didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein

tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar

molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna

"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul

sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium

bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom

radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah

proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita

yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul

yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang

biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda

17

(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan

untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka

tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut

dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur

gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.

DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose

atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.

Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium

bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.

DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan

listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan

kecepatannya tergantung dari :

a. Ukuran molekul DNA

b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA

c. Arus listrik yang diberikan

Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga

muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :

1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur

2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.

3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari

produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian

18

di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat

diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut.

a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui

susunan sekuens berbagai genom

b. DNA Fingerprinting

c. Mendeteksi kelainan genetik.

d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu

e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme

atau percobaan perlakuan gen

f. Mempelajari evolusi tingkat molecular

g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam

h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein

tertentu.

i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu

j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA

plasmid

k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR

Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel

elektrik non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi,

buffer elektrolit. pori-pori fungsi gel molekuler saringan, yang

menghambat molekul bermigrasi menurut ukuran mereka. Selanjutnya,

gel bertindak sebagai media pendukung anticonvective, yang dapat

meminimalkan difusi dari molekul sampel, dan dengan demikian

mengurangi pelebaran pita. karenanya, nomor plat tinggi dan resolusi

19

tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat molekul tinggi seperti

DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya dapat

dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel,

hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak bermigrasi

melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis gel adalah agak lambat

dan tenaga kerja - metode intensif, yang tidak mudah otomatis.

Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam gel native elektroforesis

dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium

dedocylsulfate-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) analit diperlakukan

sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk sixe rasio.

maka mereka hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.

Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE)

Gel Media

Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang umum

digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu : mudah atau

20

cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul biologic, biaya

pemisahan yang sangat besar.

Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan

menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan

elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan

penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan

dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat

terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik

elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media

penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai

adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun

menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel

dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah

model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan

sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan

pemisahan yang lebih baik.

Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan

menganalisis pemanjangan primer.

2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.

3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem

elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).

21

Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa yang dapat

diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa dilarutkan dalam buffer

yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan dituangkan ke dalam tangki elektroforesis.

pada pendinginan gelasi terjadi. pori-pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm

konsentrasi 1% (10 mg mL-1) sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1).

pori-pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam

nukleat. untuk sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.

Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen cross-

linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat

pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang C%

Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagaberikut:

1. Ukuran molekul DNA.

Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia

untuk melintasi gel lebih banyak.

2. Konsentrasi gel.

Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar

melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati

gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar

untuk melintasi gel.

3. Bentuk Molekul

Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.

4. Densitas muatan

22

Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul

dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume

molekul.

5. Pori-pori gel.

Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,

sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.

6. Voltase.

Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut

dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.

7. Larutan buffer.

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi

DNA akan lebih cepat.

5. Elektroforesis Kapiler (CE)

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk

memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi

yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan

pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis kapiler

adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion), baik

bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan

kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju

elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju

anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis

(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

23

Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas

atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan berupa

campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah

satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub

negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau

batang karbon dengan kutub positif arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen

campuran bermuatan listrik maka komponen-komponen campuran tersebut bermigrasi

ketika arus listrik searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak

menuju katoda (kutub negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif

bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang netral tidak

bergerak. Hasil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan oleh adanya noda-noda

berwarna sepanjang media pemisah(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan sederhana.

Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain

kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat dari noda-noda

tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak

dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk

melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan

dengan cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini

disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan

efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih banyak lagi

untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih

komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan

24

konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-kendala yang terdapat pada

elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah

istilah elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Aliran Elektroforentik.

Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan, kation akan

bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan bergerak menuju

anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak akan bergerak. Aliran ion-ion

menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut aliran elektroforetik yang diperlihatkan

dalam gambar 2. Aliran elektroforetik inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam

elektroforesa klasik (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroforetik) (sumber:

L. Thompson, et.al (1997))

Aliran elektroosmotik.

Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan media kertas

atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan buffer dipakai sebagai

pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut berkontak dengan larutan dalam

air maka permukaan gelas akan dilapisi anion (SiO-) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika

dengan air sehingga permukaan pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-

kation yang berasal dari buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan

25

kedua pada permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan

diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan pipa kapiler

tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan kation yang cepat ke

katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran elektroosmotik diilustrasikan dalam

gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.5. Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroosmotik)

(sumber: L. Thompson, et.al (1997))

Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan lebih

dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian secara keseluruhan

aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya semua molekul baik

yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda. Tentunnya ion positif (kation)

bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran

elektroosmotik. Molekul netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling

lambat karena aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar

Hendayana, Ph.D, 2006).

Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen elektroforesis

kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami konsep gerakan ion-ion atau

molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu analogi. Aliran elektroosrnotik dapat

dianalogikan sebagai aliran sungai yang deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan

26

sebagai ikan yang sedang berenang ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan

sebagai ikan yang sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai

ikan mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam sungai

akan menuju ke hilir.

Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda dipengaruhi oleh

medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut

V = μef E + μeo E (persamaan 2.15)

V menyatakan kecepatan solut menuju katoda, μef adalah mobilitas elektroforetik, μeo adalah

mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis kapiler

(sumber: L. Thompson, et.al (1997))

Efisiensi Elektroforesis kapiler.

Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor penentu

keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler menyerupai

kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi, semakin tajam suatu

peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat

dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat

dinyatakan dengan formula berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

27

N = (μef +μeo) E2 D (persamaan 2.16)

Seperti dalam persamaan, μef menyatakan mobilitas elektroforetik, μef menyatakan

mobilitas elektroforentik, μeo adalah mobilitas elektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang

diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik dan

koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin efisien

pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam sistem elektroforesis

sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih cepat berdifusi lambat atau D

besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N)

dalam elektroforesis kapiler berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil

koefisien difusi maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan

semakin baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik

tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai puncaknya

pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak menyebabkan kenaikan

harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi menghilangkan panas yang

ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya efisiensi dalam elektroforesis

konvensional diaktivkan oleh panas yang ditimbulkan oleh tegangan listrik yang

tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

C. Instrumentasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel

Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan

thermostat pendingin dan komponen utama yang diperlukan untuk

28

elektroforesis gel. pemisahan dapat dilakukan secara vertikal atau

horizontal. catu daya memberikan tegangan typi xallally 200-500 V

dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke

dalam waduk penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian pemisahan

biomolekuler, pH Sochen bahwa analit bermuatan negatif. sehingga analit

bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen dalam kotak isolasi untuk

melindungi pengguna dari tegangan tinggi .

Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel

vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan

3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi

panjang tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat

dipolimerisasi pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam

tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang

dan lebar sekitar 8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya

digunakan.

Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi

kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper

reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan menggunakan

sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam

bentuk pita yang sempit dan lebar

Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue

memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk mengusir

panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan

29

waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada

divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.

Gambar 2.7 Bentuk –bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk horizontal; c.

bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010)

Preparasi Sampel Dan Sistem Buffer

30

Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya

mengandung gliserol dan diterapkan pada sumur sampel. untuk

menghindari pemblokiran untuk gel sampel pori-pori harus tidak

mengandung partikel padat. konsentrasi tinggi dan garam dan

penyangga dalam sampel dapat mengganggu pemisahan elektroforesis.

maka harus dijaga agar tetap minimum, biasanya, 50 nm. jumlah sampel

yang diperlukan tergantung pada metode deteksi, jumlah khas di ordee

g. yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel juga, yang bisa

berkisar dari L ke Ml

Visualisasi Dan Deteksi

Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan

dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan

adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi

pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh

jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1.

pewarnaan perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip

dengan protografhy

Metode Gel Elektroforesis

A. Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS – PAGE)

Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran

protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen

anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan

31

protein pada temperature 950C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing

seperti ᵝmercapto etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan

tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino

B. Isoelektrik Focussing (IEF)

Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti

protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan

pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose

dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.

C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)

Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian

yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan

terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau

asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat

dibandingkan dengan database elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk

mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil

dalam operasi.

2. Instrumen Elektroforesis Kapiler

Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri dari

beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan rekorder(Sumar

Hendayana, Ph.D, 2006).

32

Gambar 2.8 Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Pipa Kapiler.

Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti dengan pipa

kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 μm dan

panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan panjang ternyata

mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler. Hal ini dapat diperhatikan

pada gambar 2.9 dan 2.10

33

Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N (pada

gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka pemisahan semakin tidak

efisien.

Gambar 2.10 pengaruh panjang kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis

Kapiler((Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

34

Buffer.

Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut

tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan

arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul. Karena sutu molekul dapat bermuatan

positif, negatif atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat

menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan

elektroforesis. Hal ini dapat ditunjukan pada gambar 2.11

Gambar 2.11 Pengaruh pH buffer terhadap selektivitas pemisahan peptide dengan elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Sumber arus.

Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt tapi dalam

elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi 10.000-30.000 Volt

seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju katoda berbanding dengan tegangan

listrik. Oleh karena itu tidaklah mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler

dapat dilakukan dalam beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional

35

dilakukan mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi

efisiensi pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4.

Sistem Pemasukan Cuplikan

Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa

kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat

dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan elektrokinetika yang masing-

masing dapat diformasi dengan persamaan.

Q = ∆ pπ 4 tC

8 ηL (persamaan 2.17)

Q = ¿ (persamaan 2.18)

Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua ujung pipa

kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran tegangan listrik, C adalah

konsentrasi cuplikan, η adalah visikositas, μef dan , μeo, kuata rus, dan L adalah panjangh pipa

kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan ke dalam cuplikan maka dengan gaya kapilaritas

cuplikan akan terisap dengan sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di antara kedua

ujung pipa kapiler. Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali ke dalam

larutan buffer. Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa saat ketika

salah satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah cuplikan

akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan mempengaruhi efisiensi

elektroforesis kapiler pada gambar 2.12 dan 2.13.

36

Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak dancyl leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.13 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap efisiensi (N)(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Detektor.

Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah yaitu

kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian detektor dapat

diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda. Berbagai detektor telah

digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain spektrometri

(seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor elektrokimia (seperti konduktometri dan

37

amperometri). Detektor UV diperlihatkan dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa

kapiler yang terbuat dari gelas silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini

memungkinkan pendeteksian aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak

perlu mengganggu aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15

dapat digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama detector

UV, detektor elektrokimia pada gambar 2.16.

Gambar 2. 14 Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati sinar UV

maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya yang diserap oleh

solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.

Gambar 2. 15 Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

38

Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

D. Aplikasi Elektroforesis

1. Elektroforesis Gel (GE)

Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang ditunjukkan pada

gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan untuk visualisasi asam nukleat.

Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar pencampuran dijalankan secara paralel.

Standar pencampuran mengandung molekul dengan dasar berpasangan panjangnya.

Pemisahan pattern dikandung dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder.

Jumlah dasar berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan

pita ke pita dalam barisan DNA.

39

Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari Genomic

DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida

2. Elekroforesis Kapiler (CE)

Analisis Peptida.

Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar daripada

molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode CE dan HPLC

diperlihatkan pada gambar 2.17.

Gambar 2.17 Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode ( A) CE dan B (HPLC) (sumber Anal, chem. 61, 1188, 1989)

40

Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE dilakukan pada

pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer dalam buffer citrate.

Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8 (220 x 2 mm) dengan fas gerak

0.1 % “ (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan

jumlah peak yang lebih banyak daripada peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi

yang lebih baik daripada HPLC untuk pemisahan peptide.

Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :

1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang

memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam

mengungkap sebuah kasus.

2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk

memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

Kelebihan dan Kekurangan dalam Elektroforesis

Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana, digunakan untuk

memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan

karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. Akan tetapi memiliki

keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama,

dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat

arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan

tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan

noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan

41

tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis

menjadi tidak terlalu jelas memisah.

42

BAB III

KESIMPULAN

1. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit

menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan

untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat,

asam amino dan karbohidrat.

2. Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel bermuatan

oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif

(anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative

(katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan

pemisahan pada metode elektroforesis.

3. Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah), elektroforesis kertas,

elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler

4. Gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah gel agarosa dan Gel poliakrilamida

5. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :di

bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki

karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap

sebuah kasus.Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu

cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk

PCR.Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

43

DAFTAR PUSTAKA

Andreas Manz, et.al, 2010, “Bioanalytical Chemistry” published by Imperial College Press, London

Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi + 175 hlm.

Richardson, b. J, p. R. Baverstock and m. Adams 1986. Allozyme electro- phoresis. A handbook for animal sys- tematics and population studies. Aca- demic press, inc. San diego : 410 pp. Sambrook, j. & d. W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual vol 2. 3rd ed. Cold spring harbour laboratory press, new york: xvii + 3.4--14.53 + 1.44

Rothe, g. M. 1995. Electrophoresis of enzymes. Springer - verlag. Berlin heidelberg: 278 pp. Hlm.

S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.

Sumar Hendayana , PH.D. 2006, “ Kimia Pemisahan Metode kromatografi dan Elektroforesis Modern “ PT. Remaja Rosdakarya.

Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.

file:///D:/Kelebihan%20Dan%20Kekurangan%20Elektroforesis.htm. Sumber:Dr.Endang Saepuddin dan Dra. Siswati Setiasih Msi.Apt. 2009.Handout Kuliah Bioteknologi, Diaccess pada tanggal 15 Mei 2013.

44