ELEKTROFORESIS

JUMARDIN F1C113024SITI MARSALINA F1C113064HASMAWATI F1C113088ALFIN SAFYUDIN F1C113004

JURUSAN KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEOKENDARI

2015

PENGERTIAN ELEKTROFORESIS

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik

PRINSIP KERJA

berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode).

JENIS ELEKTROFORESIS

ADA TIGA

Elektroforesis Kertas Elektroforesis Gel

Elektroforesis Kapiler

- katoda

Bagian sampel yang bermuatan

negatif

sampel Media pendukung kertas, agarosa, poliakrimide dll

+ anoda

buffer

Bagian sampel yang bermuatan positif

BAGIAN-BAGIAN ELEKTROFORESIS

ELEKTROFORESIS KERTAS

Tahun 1952

Sejarah

Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat.

Elektroforesisdibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Elektroforesis ini digunakan untuk pemisahan DNA/RNA

ELEKTROFORESIS KERTAS

jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks

Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut.

Cara kerjanya ???

Kertas saring dibasahi dengan larutan buffer

Setiap jenis molekul bermuatan pada campuran (mixtura) akan berpindah pada jarak tertentu baik ke anoda maupun ke katoda tergantung pada muatan dimensi dan akan nampak sebagai titik pada kertas dengan posisi yang baru

Dibandingkan dengan suatu standar

kertas dipindahkan dikeringkan dan diwarnai dengan pewarna yang mewarnai substansinya untuk dianalisa(diperiksa)

Satu tetes campuran yang akan dianalisis ditempatkan pada satu ujung kertas dan listrik dialirkan

Kertas saring direntangkan diantara dua elektroda

Contoh kasus : pemisahan asam amino

Campuran asam aspartat, histidin dan lisin

setetes larutan dari campuran asam amino, dikeringkan pada kertas dan diberi pewarna

Ujung kertas dicelupkan ke dalam kompartemen elektroda

Asam amino yang bersifat sebagai kation pada PH tersebut akan bermigrasi menuju katoda atau kutub negatif. Asam amino yang bersifat anion akan bergerak menuju anoda atau kutub positif

kertas dibasahi dengan buffer pada PH tertentu dan ditempatkan diantara lempengan pendingin

kertas dikeringkan, disemprot dengan ninidrin dan panaskan yang memperlihatkan letak asam amino

diidentifikasikan dengan posisi asam amino yang telah diketahui, sebagai marker

Tahun 1955Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang

terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum

manusia.

Menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh.Ternyata elektroforesis gel yang Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahuludiperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida.

ELEKTROFORESIS GEL

ELEKTROFORESIS GEL

Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida yang digunakan untuk DNA

Dalam elektroforesis gel molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam kandungan gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan

ELEKTROFORESIS GEL

Contoh kasus

Agarose ditempatkan pada kotak elektroforesis yang berisi buffer TAE

Agarose direndam dalam larutan Ethidium Bromida (konsentrasi 5 mikro gr/mL) selama 10 menit sambil digoyangkan pelan.

Angkat agarose dan dicuci dengan akuades selama beberapa menit (destaining, agar kelebihan EtBr tercuci).

Mesin elektroforesis dimatikan dan agarose diangkat

Hidupkan sumber arus dengan voltase 100 volt, dan dijaga agar tetap konstan. Elektroforesis selama 30 menit.

Hubungkan tangki elektroforesis dengan sumber arus. Kutub negatif pada sisi yang dekat dengan sumuran

Permukaan plat UV dicuci dengan air, kemudian agarose ditempatkan pada plat tersebut.

Pita kemudian dilihat di uv (trasliminator

ELEKTROFORESIS KAPILER

Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat dan nukleotida, dengan resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler  berisi buffer.

Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. Elektroforesis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia.Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel.

• Teori Dasar :– Aliran digerakkan oleh EOF dlm kapiler– Dipengaruhi oleh pH, medan listrik, suhu dan– Senyawa lain (EOF) modifier

• Detektor (UV-Vis)– langsung dan Tidak Langsung

• Sistim Injeksi– Hidrodinamik– Elektrokinetik– Tekanan (Positif dan reduksi)

PROSEDUR ELEKTROFORESIS KAPILER

1. Dalam elektroforesis, sampel yang mengandung protein biasanya dicampur dengan SDS (sodium dodecyl sulfat)

2. Muatan negatif SDS tersebut mengganggu kestabilan protein, sehingga protein mengalami denaturasi.

3. Suatu protein multimer juga akan terurai menjadi monomer penyusunnya

4. Sampel dengan protein rantai polipeptida lurus tersebut dimasukkan dalam suatu membran poliakrilamid yang dialiri arus listrik

5. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan terbentuk pita-pita yang merupakan protein-protein yang telah terpisah berdasarkan berat molekul

ELEKTROFORESIS PROTEIN

DNA, RNA atau protein

Gel

Loading dye

EtBr

Buffer TAE

Alat elektroforesis

KOMPONEN PROSES ELEKTROFORESIS

RNA, DNA DAN PROTEIN

Gel agarose

Gel poliakrilamid

ELEKTROFORESIS DNA

Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu sebagai berikut :

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda   oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.

2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang  berukuran besar.

3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.

GEL AGAROSA

Agarosa Gel agarose merupakan fase diam dalam pemisahan fragmen DNA, konsentrasi agarose yang digunakan dalam pemisahan fragmen DNA sangat mempengaruhi mobilitas fragmen DNA, semakin besar konsentrasi agarose yang digunakan maka semakin kecil pori-pori gel, dan semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin besar pori-pori gel.

merupakan polisakarida turunan yang didapat dari alga merah. Gel agarose dapat digunakan untuk memisahkan DNA berukuran lebih dari 100 bp.

GEL POLIAKRILAMIDA

Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi jika dibandingkan gel agarosa sehingga panjang molekul DNA yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi.

Elektroforesis gel poliakrilamid dapat memisahkan protein dengan ukuran 5—200 kDa, sedangkan untuk pemisahan fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit yaitu antara 5—500 bp.

ETIDIUM BROMIDA

Gel direndam dalam larutan buffer TBE atau TAE yang mengandung ethidium bromide, selanjutnya ethidium bromide akan berdifusi ke dalam gel dan berasosiasi dengan DNA (Switzer, 1999).

Ethidium bromide mampu berinterkalasi diantara pasang basa nukleotida pada struktur double heliks (Gambar 3) dan saat gel hasil elektroforesis disinari dengan ultraviolet maka fragmen-fragmen DNA yang telah terpisah tampak sebagai band-band berwarna oranye (Campbell dan Shawn, 2009). 

LOADING DYE

Dibuat dari bromophenol blue; xylene cyalol; ficoll tipe dan EDTA

Sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran

TRIS ASETAT EDTA

TAE (Tris-Asetat-EDTA) adalah buffer memberikan resolusi yang lebih baik dari fragmen> 4 kb, tegangan untuk buffer TAE adalah 5-50 V / cm dibandingkan dengan 5-10 V / cm.

Buffer TAE ini dibuat dari 20 mM Tris asetat dengan 1 mM EDTA pH 8,0. b. Tris / Borat / EDTA (TBE) Buffer TBE (Tris-Borat-EDTA) memberikan resolusi yang lebih baik 0,1-fragmen 3-kb (<300-bp pada gel agarosa 2%).

APLIKASI ELEKTROFORESIS

Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.

Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari.

Kelebihan

Mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung

• Sampel dapat ditangani dengan baik dan baik

• Gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalamkantong plastik dan didinginkan seteah percobaan, sehigga dapat dipakai untuk dokumentasi penting yang dapat dipelajari lebih lanjut dilain wakt.

Kekurangan

• Rawan terjadi kesalahan pada proses pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel,karena slot gel ukurannya sangat kecil

Kelebihan Dan Kekurangan Elektroforesis Kertas

kelebihan

Proses migrasi lebih cepat Pemisahan spot menjadi

lebih kecil dengan spektrofotometri

Mudah dilarutkan dalam jumlah sedikit

kekurangan

Adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya gugus OH yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah

Kelebihan Dan Kekurangan Elektroforesis Gel