TEKNIK DNA REKOMBINAN

Tugas Mata Kuliah Rekayasa Biokimia

Oleh :

SIGIT MARIYANTO

NPM : 1327011034

PROGRAM PASCA SARJANA MAGISTER KIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS LAMPUNG BANDAR LAMPUNG

2014

TEKNIK DNA REKOMBINAN

A. PENDAHULUAN

Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan

organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan

untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an

berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam

mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang

bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk.

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan

istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan

gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula

dikatakan sebagai kloning gen.

DNA rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar

memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme

penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan.

Misalnya, kita membuat DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat

insulin. DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri

tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui

penyisipan gen dengan plasmid sebagai vektornya/ “kendaraan pemindah”.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan

mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan

tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan

diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar

daripada produksi secara konvensional.

Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu :

1) Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA berantai rangkap dan berbentuk cincin. Plasmid

ditemukan didalam sel bakteri dan dapat berbiak secara bebas, lepas dari

kromosom induk. Dalam rekayasa genetika, plasmid berperan sebagai vektor

(kendaraan) yang digunakan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing.

Keuntungan penggunaan plasmid adalah dapat di pindahkan dari satu sel ke

sel yang lain, misalnya melalui cara transformasi. Ketika satu gen “asing”

(biasanya diekstrak dari satu kromosom sel eukariotik) telah disisipkan ke

dalam satu plasmid, ia akan bertindak seperti kendaraaan yang mengangkut

gen ke dalam sel bakteri. Plasmid yang membawa gen tersebut siap di

absorpsi dan di replikasikan oleh bakteri sehingga setiap anakan sel yang

dihasilkan akan mewarisi gen – gen baru. Selanjutnya, setiap bakteri didalam

kultur gen- gen akan menginstruksi, misalnya “hasilkan hormon insulin

manusia”. Adapun beberapa cara pemindahan DNA diantaranya adalah:

a. Konjugasi: pemindahan DNA dalam sel bakteri melalui kontak fisik antar

kedua sel.

b. Transformasi: pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan sekitarnya.

c. Transduksi: pemindahan DNA daribsatu sel ke sel lainnya melaui

perantara

2) Enzim

Dalam rekayasa genetika dikenal dua macam bahan kimia yang berperan

penting. Kedua macam bahan kimia tersebut adalah enzim pemutus (retriksi

endonuklease) dan enzimperekat (ligase).

Enzim retriksi endonuklease merupakan enzim khusus dari bakteri yang

berguna sebagai alat pertahanan tubuh. Misalnya untuk melawan DNA asing

yang menyusup masuk, seperti yang berasal dari virus. Dalam dunia rekayasa

genetika, enzim tersebut bertindak sebagai gunting biologi yang berfungsi

untuk memotong/ menggunting rantai DNA pada tempat- tempat khusus.

Enzim retriksi endonuklease memiliki dua keutamaan. Pertama, memiliki

fungsi kerja spesifik. Dalam hal ini enzim mampu mengenal dan memotong

urutan nukleotida tertentu pada DNA. Kedua, mampu menghasilkan

potongan- potongan runcing ketika memotong rantai ganda DNA. Fragmen-

fragmen yang dihasilkannya adalah berupa ujung runcing (ujung lengket)

yang terdiri atas untaian tunggal. Setiap ujung dari fragmen memiliki bagian

yang menjorok dengan urutan basa yang dapat dikenali dan dipasangi oleh

basa yang terletak di ujung untaian lainnya. Misalnya, ujung untaian tunggal

dengan urutan basa AATT pada satu ujung dan TTAA pada ujung yang lain.

Kedua fragmen tersebut dapat disambungkan sehingga membentuk satu

untaian nukleotida lagi. Dalam hal ini, enzim ligase berfungsi untuk

merekatkan dan mempersatukan fragmen- fragmen/ potongan- potongan

DNA.

Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:

1. Teknik mengisolasi DNA;

2. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease;

3. Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase;

4. Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)

5. Transformasi dan seleksi

B. PEMBAHASAN

1. Tehnik mengisolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel,

yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan

tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim.

Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat

dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan

bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat

seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot

langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel

mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan

remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi

menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian

disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang

telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA

sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA.

Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan

penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan

menggunakan CsCl. Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik

untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk

memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan di isolasi dapat

digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam

struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently

closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan

kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan

tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi

apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi

kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA

kromosom. Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium

bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-

sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh

lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan

panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan

menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA

plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional

adalah sebagai berikut:

1) Homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 4 0C, semua bahan dan peralatan

steril)

2) Lisis seluler (dengan detergen atau lisosim)

3) Penambahan chelating agents: EDTA/sitrat

4) Penambahan proteinase (proteinase K)

5) Ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform)

6) Presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol)

7) Pelarutan kembali DNA, misalnya dengan bufer TE (Tris-EDTA)

Beberapa senyawa mempunyai fungsi multipel dalam protokol ekstraksi asam

nukleat. Agen chaotropic seperti GuSCN (guanidine isothiocyanate), NaI

(sodium iodide), dan LiCl (lithium chloride) memiliki kemampuan untuk

menghancurkan kapsul lemak dan merusak integritas sel, denaturasi protein

dan menginaktivasi nuklease. GuSCN dengan molaritas di atas 4 M dapat

mempresipitasi DNA dan RNA berberat molekular tinggi.

2. Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi

endonuklease

Enzim restriksi atau disebut juga enzim endonuklease restriksi merupakan

bagian dari sistem kekebalan bakteri untuk melindungi bakteri dari infeksi

DNA asing. Enzim endonuklease restriksi biasanya diberi nama berdasarkan

nama bakteri asal enzim tersebut di isolasi. Saat ini telah dikenal lebih dari

200 enzim restriksi dengan sekuens tempat pembelahan yang spesifik.

Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya

sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan

dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk

menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C.

Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan

kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l

progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang

diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of

plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1.  Namun, jika l yang diisolasi

dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya

hanya 10-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah

yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai

nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada

strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada

strain K.

DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi

pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh

kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak

diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan

demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan

dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi.

Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA.

Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi

hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh

enzim restriksi. Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak

dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim

yang dinamakan enzim restriksi tipe I.  Banyak enzim serupa yang

ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya.

Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian

dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi

tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae

strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II

dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi

salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika.

Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting

sebagai berikut:

1) Mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di

dalam molekul DNA.

2) Memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat

tempat pengenalannya.

3) Menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan

basa.

Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh

beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan

semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang

runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang.

Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan

satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung

lengket (sticky end) atau ujung kohesif.

Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai

tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil

pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-

masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan

ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya

diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan

ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau

penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai

tunggal homopolimerik 3’.

Contoh enzim-enzim restriksi:

Enzim Organisme Urutan Pengenal Ujung Potongan

EcoRI Escherichia

coli RY13

GAATTC sticky-end

Hin

dIII

Haemophylus

influenzae Rd

AAGCTT sticky-end

HinfI Haemophylus

influenzae Rf

GANTC sticky-end

HaeIII Haemophilus

aegyptius

GGCC blund end

AluI Arthrobacter

luteus

AGCT blund end

SmaI Serratia

marcescens

CCCGGG blund end

XbaI Xanthomonas

badrii

TCTAGA sticky-end

3. Teknik menggabung/menyambung DNA dengan menggunakan enzim

Ligase

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi

harus menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya,

fragmen-fragmen DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan

(diligasi) dengan DNA vektor yang sudah berbentuk linier.

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA

secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri.

Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah

diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase.

Jika cara yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung

lengket, cara yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun

pada ujung tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga telah disinggung di atas,

yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai

tunggal homopolimerik 3’. Dengan untai tunggal semacam ini akan diperoleh

ujung lengket buatan, yang selanjutnya dapat diligasi menggunakan DNA

ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada

suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung

lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada

tempat ikatan tersebut.  Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu

antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering

kali hingga semalam).

Pada reaksi ligasi antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor,

khususnya plasmid, dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga

plasmid yang telah dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid

sirkuler kembali. Hal ini jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk

meningkatkan efisiensi ligasi dapat dilakukan beberapa cara, antara lain

penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi (lebih dari 100µg/ml), perlakuan

dengan enzim alkalin fosfatase untuk menghilangkan gugus fosfat dari ujung

5’ pada molekul DNA yang telah terpotong, serta pemberian molekul linker,

molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk

menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’ seperti telah disebutkan di atas.

4. Teknik memasukan DNA kedalam sel hidup ( Vector )

Vector adalah sebuah agen yang dapat membawa fragmen DNA ke dalam sel

inang. Ada dua macam vector yaitu vector cloning yang digunakan untuk

memproduksi fragmen DNA dan vector ekspresi yang digunakan untuk

mengekspresikan gen tertentu dalam fragmen DNA. Ada beberapa vector

yang sering digunakan dalam teknik DNA rekombinan, antara lain plasmid,

phaga, cosmid, YAC, BAC, dan Ti-Plasmid.

a. Plasmid

Plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri.

Plasmid dapat bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen.

Jenis, jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis (copy) plasmid bervariasi antar

sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Ukuran plasmid berkisar

antara beberapa kbp hingga mendekati 100kbp. Sebuah vector plasmid

juga harus mengandung gen resistensi obat untuk amplifikasi selektif.

Plasmid dapat dimodifikasi untuk mampu membawa potongan DNA lain

ke dalam sel bila memiliki:

1) Replikator (origin of replication)

2) Penanda (Marker) yang mudah diseleksi (misalnya gen ketahanan

terhadap antibiotik)

3) Situs untuk mengklon (potongan DNA yang memiliki urutan basa

nukleotida yang menjadi sasaran enzim restriksi tetapi tidak terletak di

dalam daerah replikator atau penanda

b. Phaga

Phaga merupakan virus yang dapat menginfeksi bakteri, tersusun atas

molekul DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein

yang membungkus). Keuntungan utama dari vector phaga adalah efisiensi

transformasi yang tinggi, sekitar 1000 kali lebih efisien dari pada vector

plasmid.

c. Cosmid

Cosmid merupakan vector kombinasi antara vector plasmid dan situs COS

yang memungkinkan DNA target untuk dimasukkan ke dalam kepala situs

COS. Teknik ini memiliki keuntungan yaitu efisiensi transformasi yang

tinggi dan cosmid dapat membawa 45 kbp dibandingkan plasmid dan

phaga yang dibatasi hingga 25 kbp.

d. YAC

Yeast Artificial Chromosomes (YAC) merupakan vector yang mampu

membawa fragmen DNA hingga sebesar 2mbp, untuk membuat pustaka

genom yang berukuran besar. Digunakan untuk membuat pengurutan

(sequencing) organisme genom organisme eukaryote, namun efisiensi

transformasi sangat rendah.

e. BAC

Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) adalah membentuk DNA

berdasarkan kesuburan fungsional plasmid (atau F-plasmid), digunakan

untuk mengubah dan kloning pada bakteri, F-plasmid memainkan peran

penting partisi karena mengandung gen yang mempromosikan pemerataan

plasmid setelah pembelahan sel bakteri. The bacterial artificial

chromosome's usual insert size is 150-350 , but can be greater than 700

kbp. A similar called a has also been produced from the bacterial P1-

plasmid. Buatan bakteri yang biasa menyisipkan kromosom ukuran 150-

350 KBP, tetapi dapat lebih besar dari 700 KBP.

f. Ti-Plasmid

Ti-Plasmid merupakan vector plasmid yang berukuran besar (200-900

kbp) pada sel bakteri Agrobacterium. Agrobacterium mampu menginfeksi

tanaman dengan mengintgrasi pada DNA kromosom tanaman. Sifat unik

inilah yang memungkinkan Ti-Plasmid menjadi alat transport dari gen lain

dengan cara menyisipkan gen asing tersebut pada T-DNA. Kemudian

dengan sengaja Agrobacterium diinfeksikan pada sel atau jaringan

tanaman yang memiliki potensi menjadi tanaman utuh. Keuntungan teknik

ini antara lain adalah gen yang terintegrasi umumnya hanya satu copy atau

sedikit karena disisipkan pada T-DNA.

5. Transformasi dan seleksi

Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan

DNA genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul

DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis

menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan

baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan,

campuran reaksi ligasi dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat

diperbanyak dengan cepat. Dengan sendirinya, di dalam campuran reaksi

tersebut selain terdapat molekul DNA rekombinan, juga ada sejumlah

fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang tidak terligasi satu sama lain.

Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang ini dinamakan

transformasi karena sel inang diharapkan akan mengalami perubahan sifat

tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA

rekombinan, maka kita harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang

transforman yang membawa DNA rekombinan. Selanjutnya, di antara sel-sel

transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan seleksi

untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen

sisipan atau gen yang diinginkan.

Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan

tentang plasmid. Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi

setelah transformasi dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak dimasuki DNA apa

pun atau berarti transformasi gagal, (2) sel inang dimasuki vektor religasi

atau berarti ligasi gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor rekombinan

dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan. Untuk membedakan

antara kemungkinan pertama dan kedua dilihat perubahan sifat yang terjadi

pada sel inang. Jika sel inang memperlihatkan dua sifat marker vektor, maka

dapat dipastikan bahwa kemungkinan kedualah yang terjadi. Selanjutnya,

untuk membedakan antara kemungkinan kedua dan ketiga dilihat pula

perubahan sifat yang terjadi pada sel inang. Jika sel inang hanya

memperlihatkan salah satu sifat di antara kedua marker vektor, maka dapat

dipastikan bahwa kemungkinan ketigalah yang terjadi.

Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan

dengan mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe),

yang pembuatannya dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi

polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR). Pelacakan

fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang

dinamakan hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke

membran nilon, dilisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan

remukan sel lainnya hingga tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya,

dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di dalam larutan pelacak. Posisi-

posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak dicocokkan dengan

posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian, kita bisa

menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang

diinginkan.

C. KESIMPULAN

Teknik DNA rekombinan adalah rekayasa genetika untuk menghasilkan sifat

baru dengan cara merekombinasikan gen tertentu dengan DNA genom. Teknik

DNA rekombinan merupakan kumpulan teknik untuk merekombinasi gen

dalam tabung reaksi. Teknik itu diantaranya isolasi DNA, teknik memotong

DNA, teknik menggabung DNA dan teknik untuk memasukan DNA ke dalam

sel hidup.

DAFTAR PUSTAKA

1. http://aguskrisnoblog.wordpress.com/2012/01/12/genetika-lanjut-rekayasa-genetika/

2. http://biogen.litbang.deptan.go.id/index.php/2013/01/prinsip-dasar-teknik-teknik-dna-rekombinan-analisis-transkrip-dan-analisis-protein/

3. http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/

4. http://teknogaptek.blogspot.com/2012/01/rekayasa-genetika.html