RESUME

Teknik Isolasi dan Pemurnian

KELOMPOK 1 :

Wulan Nursyam (111810401024)

Suci Ummi R (111810401027)

Galen Rahardian (111810401030)

Nur Putri R (111810401040)

Anis Barokah (111810401042)

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS JEMBER

2013

Berbagai macam mikroorganisme dapat ditemukan di alam dalam

populasi yang heterogen. Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat

di alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi

mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba dengan lainnya yang berasal dari

campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan

menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu

koloni sel yang tetap pada tempatnya. Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media

padat pada beberapa tempat yang terpisah, maka setiap sel sel atau kumpulan sel

yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah. Sehingga

memudahkan pemisahan selanjutnya.

Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secra

individu karena terlalu kecildan tidak tetap tinggal ditempatnya. Akan tetapi, bila

sel-sel itu dipisahkan dengan cara pengenceran, kemudian ditumbuhkan dalam

media padat dan dibiarkan membentuk koloni maka sel-sel tersebut selanjutnya

dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri-cawan petri yang

terpisah.

Beberapa faktor yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi mikroorganisme

adalah:

Sifat dan jenis mikroorganisme

Habitat mikroorganisme

Media pertumbuhan

Cara menginokulasi dan inkubasi

Cara mengidentifikasi

Metode isolasi

Teknik isolasi secara keseluruhan tidak hanya cara bagaimana kita

meletakkan mikroba dalam sebuah media. Namun, terdapat teknik-teknik lain

yang berhubungan dengan teknik isolasi berupa:

Teknik pengenceran

Teknik penanaman

Teknik pemurnian

Teknik perhitungan jumlah

Keterangan lebih lanjut dari rangkaian teknik isolasi adalah;

1. Teknik Pengenceran

Pengenceran suspensi bakteri dari sampel atau sumber isolat dari

lingkungan dilakukan sebagai upaya untuk mendapatkan kuantitas bakteri dalam

jumlah yang dapat terhitung. Selain mendapatkan kuantitas yang dapat terhitung,

pengenceran suspensi bakteri dari sampel/ sumber isolat dari alam juga diperlukan

dalam rangka memudahkan dalam pengamatan koloni, terutama dalam kegiatan

bertahap pemurnian isolat (Waluyo,2005).

Langkah-Langkah:

dimasukkan ke dalam masing-masing tabung

reaksi dengan ketentuan sebagai berikut : satu

tabung pertama diisi dengan 10 mL NaCl

Fisiologis dan enam tabung berikutnya masing-

masing diisi dengan 9 mL NaCl Fisiologis

Sterilisasi seri tabung pengenceran di atas beserta

mortar keramik dan penumbuknya serta pipet

volumetrik ke dalam autoclave

Gerus sumber isolat/ sampel lingkungan dengan

bantuan NaCl Fisiologis steril di atas Mortar

keramik steril

Timbang 1 (satu) gram sampel (di atas

alumunium foil), kemudian masukkan ke dalam

tabung I, vortex sebentar agar suspense homogen

Ambil sebanyak 1 mL suspensi dari tabung I

dengan menggunakan Pipet Volumetrik steril,

NaCl Fisiologis

kemudian masukkan ke dalam tabung II, vortex

sebentar agar suspense homogeny

Lakukan langkah No. 5 untuk tabung III, IV,

V,VI, dan VII.

2. Teknik Penanaman

Pengenceran

Teknik penanaman ini merupakan lanjutan dari pengenceran bertingkat.

Pengambilan suspensi dapat diambil dari pengenceran mana saja tapi biasanya

untuk tujuan isolasi (mendapatkan koloni tunggal) diambil beberapa tabung

pengenceran terakhir(Dwidjoseputro,1998).

Spread Plate (agar tabur ulas)

Spread plate adalah teknik menanam dengan menyebarkan suspensi

bakteri di permukaan agar diperoleh kultur murni.

Langkah-Langkah:

diambil sebanyak 0,1 ml dengan pipet ukur

kemudian teteskan di atas permukaan agar

yang telah memadat.

Batang L atau batang drugal diambil

kemudian disemprot alkohol dan dibakar

diatas bunsen beberapa saat, kemudian

didinginkan dan ditunggu beberapa detik.

Kemudian disebarkan dengan

menggosokannya pada permukaan agar

supaya tetesan suspensi merata, penyebaran

akan lebih efektif bila cawan ikut diputar.

Hal yang perlu diingat bahwa batang L yang

terlalu panas dapat menyebabkan sel-sel

mikroorganisme dapat mati karena panas.Spread Plate

Suspensi Cair

Pour Plate (agar tuang)

Teknik ini memerlukan agar yang belum padat (>45oC) untuk dituang

bersama suspensi bakteri ke dalam cawan petri lalu kemudian dihomogenkan dan

dibiarkan memadat. Hal ini akan menyebarkan sel-sel bakteri tidak hanya pada

permukaan agar saja melainkan sel terendam agar (di dalam agar) sehingga

terdapat sel yang tumbuh dipermukaan agar yang kaya O2 dan ada yang tumbuh di

dalam agar yang tidak banyak begitu banyak mengandung oksigen

( Winarni,1997).

Langkah-Langkah:

Media Padat yang Masih Cair

diteteskan 1 ml secara aseptis. suspensi sel

ke dalam cawan kosong

dituangkan media yang masih cair ke

cawan

diputar cawan untuk menghomogenkan

suspensi bakteri dan media

diinkubasi.

Alasan diteteskannya bakteri sebanyak 0,1 ml untuk spread plate dan 1

ml untuk pour plate karena spread plate ditujukan untuk menumbuhkan

dipermukaanya saja, sedangkan pour plate membutuhkan ruang yang lebih luas

untuk penyebarannya sehingga diberikan lebih banyak dari pada spread plate.

Pour Plate

3. Teknik Pemurnian

Kultur murni adalah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari

pembelahan dari satu sel tunggal, artinya mikroba ditumbuhkembangkan dari

bakteri yang dihomogenkan dengan kata lain bakteri di isolasikan agar didapatkan

bakteri murni yang dibutuhkan nantinya dalam kegiatan praktikum. Objek yang

harus diperhatikan adalah bakteri. Teknik pemurnian bertujuan untuk mengisolasi

mikroorganisme dari campurannya atau meremajakan kultur ke dalam medium

baru(Pelczar,1986).

Goresan (Streak)

Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari

koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi.

a. Goresan Sinambung

Langkah-Langkah:

Suspensi

dimbil satu mata ose dan digoreskan

setengah permukaan lempengan agar.

Jangan pijarkan ose, putar lempengan 180o,

gunakan sisi mata ose yang sama dan gores

pada sisa permukaan lempengan agar.

Goresan Sinambung

b. Goresan Kuadran

Bagi cawan menjadi 4 bagian menggunakan spidol

marker.

Inokulasi daerah 1 dengan streak zig-zag

Panaskan jarum inokulasi dan tunggu dingin

Lanjutkan streak zig-zag pada daerah 2

Cawan diputar untuk memperoleh goresan yang

sempurna

Lakukan hal yang sama pada daerah 3

Goresan selanjutnya dipotongkan atau disilangkan

dari goresan pertama sehingga jumlah semakin

sedikit dan akhirnya terpisah pisah menjadi koloni

tunggal

4. Teknik Perhitungan

Media

Goresan Kuadran

Prinsip dari metode hitungan cawan ini adalah jika sel mikroba yang

masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba akan berkembang

biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan

menggunakan mata telanjang tanpa harus dengan menggunakan mikroskop

(Saputro,1988).

Metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan

jumlah mikroba, hal ini disebabkan oleh hal-hal berikut.

1. Hanya sel yang masih hidup saja yang dapat dihitung.

2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus.

3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba, karena koloni

yang terbentuk mungkin berasal dari suatu mikroba yang mempunyai

penampakan pertumbuhan secara spesifik.

Kelemahan penggunaan metode cawan ini adalah sebagai berikut.

1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena

sel yang berdekatan kemungkinan membentuk koloni.

2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai

yang berbeda.

3. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan

membentuk koloni yang kompak dan jelas.

4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang relatif lama.

Dalam metode hitungan cawan, bahan pangan yang diperkirakan

mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml atau per gram atau per cm,

memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar

dalam cawan petri. Setelah inkubasi terbentuk koloni pada cawan tersebut, namun

masih dalam jumlah yang dapat dihitung. Jumlah yang terbaik adalah diantara 30

sampai 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu, 1:10,

1:100, 1:1000 dan seterusnya. Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat

berupa larutan buffer fosfat, 0,85% NaCl atau larutan ringer (Saputro,1988).

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.

Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Program Studi D3 Teknik Kimia FTI-ITS :Surabaya.

Saputro D. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Cetakan ke – 10. Jakarta : Universitas Indonesia ( IU-Press