TEKNIK PENYIMPANAN MIKROORGANISME

Dosen Pengampu : Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si

Disusun oleh :

Iqbal Ali Musthofa (125100500111002)

Nunung Prasetyo (125100507111018)

Rabitha Almas Fasya (125100500111010)

Anggi Nurvianti Pradana (125100501111006)

Dininurilmi Putri (125100501111014)

Sugiyati Ningrum (125100501111022)

Lydia Ariyani (125100507111008)

Ullyvia Dewi Octarina (125100507111016)

Elysabeth (125100507111026)

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI INDUSTRI

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Indonesia yang terletak didaerah tropik merupakan sumber biodiversitas yang

luas, termasuk mikrobanya, baik yang menguntungkan maupun yang merugikan

bagi masyarakat. Mikroba tersebut, disamping beragam jenisnya juga sangat

mudah mengalami perubahan sifat sehingga menjadi strain baru yang berbeda

dengan aslinya. Hal ini menambah cepat tumbuh dan berkembangnya

biodeversitas tersebut.

Mikroba yang ditemukan disuatu lingkungan ditemukan dalam bentuk

populasi campuran, dan jarang sekali ditemukan sebagai satu spesies tunggal.

Penelitian mengenai mikroorganisme biasanya memerlukan teknik untuk

memisahkan populasi campuran pada permulaannya atau biakan campuran

menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni (Presscott,

2003). Hal yang perlu diperhatikan adalah pemeliharaan mikroba selama

penyimpanan agar produk atau metabolisme suatu mikroba tetap terjaga.

Untuk itu, para ahli melakukan suatu proses koleksi penyimpanan dan

pemeliharaan mikroba utuk mempelajari teknik penyimpanan dan karakteristik

dari mikroba tersebut.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Teknik Penyimpanan Mikroorganisme

Penyimpanan (preservasi) bertujuan untuk menjaga agar biakan mikroba

tetap hidup, ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah, serta hemat

biaya dan tenaga. Metode yang dipilih sangat tergantung pada sifat mikroba

dan tujuan preservasi. Tujuan koleksi dan preservasi meliputi tujuan jangka

pendek dan jangka panjang. Preservasi jangka pendek dilakukan untuk

keperluan rutin penelitian yang disesuaikan dengan kegiatan program atau

proyek tertentu. Preservasi jangka panjang dilakukan dalam kaitannya dengan

koleksi dan konservasi plasma nutfah mikroba, sehingga apabila suatu saat

diperlukan, dapat diperoleh kembali atau dalam keadaan tersedia (Suriawiria,

2005).

Penyimpanan jangka pendek mikroba dilakukan dengan memindahkan

secara berkala jangka pendek misalnya sebulan sekali dari media lama ke

media baru. Teknik ini memerlukan waktu dan tenaga yang banyak. Beberapa

teknik penyimpanan sederhana yang efektif untuk penyimpanan isolat jangka

pendek atau menengah, dan biasanya tidak sesuai untuk penyimpanan jangka

panjang. Berikut ini beberapa metode yang digunakan dalam penyimpanan

mikroorganisme antara lain:

1. Metode Agar Slant

Gambar1. Teknik Slant Agar. (a) memasukkan kultur pada slant agar (b)

bagian-bagian yang akan dipindahkan (Rachdie, 2008)

Agar slants adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam agar miring di

dalam tabung reaksi untuk melihat karakteristik koloni bakteri yang

tumbuh. Metode ini digunakan dengan cara kultur ditumbuhkan pada agar

miring. Komposisi media dan suhu serta interval waktu pemindahan harus

tepat dan disimpan pada refrigerator dengan suhu 5oC atau freezer -

20oC. Subkultur setiap 6 bulan atau sampai dengan 1 tahun, bila kultur

ditutup dengan menggunakan mineral oil (Sulistinah, 2006).

Penggunakan metode ini merupakan penggunaan dengan jangka pendek

yang murah dan mudah sehingga tidak cocok untuk penyimpanan jangka

panjang. Namun, penggunaan metode ini dapat mengakibatkan kultur

mudah terkontaminasi. Apabila digunakan untuk mengkultur bakteri

selama 2-3 minggu dan fungi selama 3-4 minggu.

2. Metode Liofilisasi atau Kering Beku (Qiophylization atau Freeze

Drying)

Teknik kering beku atau liofilisasi merupaka teknik penyimpanan yang

paling popular dan banyak digunakan untuk penyimpanan jangka panjang

mikroba. Teknik ini cocok untuk menyimpan berbagai jenis

mikroorganisme termasuk virus (Holding dan Lelliot 2006), bakteri (Sly

2003), khamir, jamur berspora dan jamur yang tidak berspora (Clark

2006). Proses kering beku merupakan kombinasi dua teknik penyimpanan

jangka panjang yang paling baik, yaitu pembekuan dan pengeringan. Garis

besar tahapan proses ini meliputi pembuangan uap air dengan cara

sublimasi vakum dari keadaan beku.

Sebelum proses pengeringan, teknik ini menggunakan salah satu dari

dua cara pembekuan suspensi sel. Pada tahap pebekuan (prefreezing),

suspensi sel mikroba dapat dibekukan dengan menambahkan campuran

pendingin seperti es kering (dry ice) dalam etanol. Alternatif lain adalah

pembekuan dengan cara pembekuan sentrifugal, dimana suspensi sel

dibekukan dengan cara pendinginan dan penguapan pada kondisi vakum,

sementara ampulnya diputar dengan kecepatan rendah untuk menghindari

timbulnya buih. Cara ini menghilangkan kendala yang terjadi pada

pengeringan biakan dari kondisi cair. Selanjutnya ampul kering beku dapat

disimpan pada suhu ruang di tempat gelap. Kemampuan bertahan hidup

jangka panjang mikroba dapat ditingkatkan dengan penyimpanan di

kulkas.

Hal yang perlu diperhatikan adalah cairan pengawet (preservatif) yang

akan digunakan untuk pembuatan suspensi sel untuk mencegah kerusakan

sel hidup pada tahap pembekuan dan pengeringan. Fungsi preservatif

adalah menstabilkan protein, mencegah kerusakan akibat pembekuan, dan

melindungi dari kekeringan yang berlebihan. Pemilihan preservatif harus

dapat memelihara mikroorganisme dalam kondisi hidup dan memberi

peluang untuk dapat ditumbuhkan kembali dengan baik dari kondisi

kering. Salah satu preservatif terbaik dan telah digunakan untuk

penyimpanan jangka panjang mikroba adalah mist dessicants (Sly 2003)

yang merupakan cairan dengan komposisi pepton Difco 12 gr dan glukosa

30 gr dalam 100 ml akuades. Beberapa cairan preservatif lain yang sering

digunakan ialah larutan pepton 1%, larutan susu skim 1%, larutan Na-

glutamat 1%, dan larutan campuran serum kuda dengan pepton 10% (Sly

2003).

Tahap penyimpanan kering beku adalah sebagai berikut:

1. Ampul kosong ukuran 1 ml diberi label di dalamnya dengan

menuliskan nomor kode strain mikroba pada sepotong kertas filter

3x20 mm menggunakan pensil, ditutup dengan kapas dan di luar

ampul diberi label nomor kode strain menggunakan spidol permanen.

Ampul disterilkan dengan oven kering bersuhu 1600C selama satu jam.

2. Strain mikroba yang akan disimpan dibiakkan pada medium yang

sesuai hingga pertumbuhan optimum (log phase), umumnya 24-48 jam

pada suhu ruang.

3. Penyediaan larutan preservatif yang sesuai untuk mikroba yang akan

diawetkan.

4. Suspensi pekat strain mikroba 108-109 sel atau konidia/ml dibuat dalam

cairan preservatif.

5. Ampul yang telah disterilkan diisi dengan 0,1-0,3 ml suspensi mikroba

secara aseptik menggunakan pipet Pasteur atau pipet mikro.

6. Suspensi mikroba dalam ampul dibekukan pada suhu -200C sampai -

300C atau menggunakan dry ice.

7. Ampul yang telah dibekukan dengan cepat dilakukan proses kering

beku dengan menempelkan pada alat pengeringan beku. Prosedur

kering beku dilakukan sesuai dengan petunjuk pada masing-masing

alat.

8. Setelah selesai proses kering beku, ampul dipotong menggunakan api

las.

9. Ampul yang sudah dipotong diatur rapi pada kotak penyimpanan

ampul.

10. Sebagian ampul diambil sebagai contoh untuk menguji viabilitas

mikroba setelah proses kering beku.

11. Pengujian juga dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak setiap

setahun, untuk mengetahui viabilitas mikroba.

12. Penumbuhan kembali mikroba:

a. Ampul dikeluarkan dari tempat penyimpanan dan direndam pada

suhu 370C atau dibiarkan beberapa saat pada suhu ruang untuk

mencairkan isi ampul (thawing).

b. Secara aseptik leher ampul dipotong dengan pemotong kaca dan

dipatahkan.

c. Beberapa tetes medium cair dimasukkan ke dalam ampul,

dibiarkan beberapa saat dan agak dikocok agar biakan cepat larut.

d. Sebagian suspensi diambil dan ditumbuhkan pada cawan medium

agar yang sesuai.

e. Koloni mikroba ditumbuhkan pada medium agar miring.

Penyimpanan dengan teknik pengeringan cairan. Beberapa strain bakteri

yang peka terhadap proses kering beku dapat disimpan dengan cara

pengeringan suspensi (liquid drying) mikroba. Teknik ini dikembangkan oleh

Annear pada tahun 1954, 1956, dan 1962 dan berhasil digunakan untuk

menyimpan bakteri, khamir, jamur, dan virus. Teknik ini dimodifikasi oleh

Banno dan Sakane (1979). Tahapan teknik pengeringan cairan adalah

sebagai berikut:

1. Ampul steril bertutup kapas dan diberi label kertas filter di dalamnya

disediakan seperti untuk penyimpanan dengan teknik kering beku.

2. Suspensi pekat biakan mikroba (108-109sel/ml) dibuat dalam cairan

pengawt seperti larutan mist dessicant, pepton 1%, susu skim 1% atau

Na-glutamat 1%.

3. Pada tiap ampul dimasukkan 0,1-0,3 ml suspensi mikroba, tutup

kapas dipasang dan digunting, kemudian dimasukkan ke dalam ampul

hingga leher ampul atau tempat di atas label.

4. Ampul dipasang pada alat pengering beku dan dilakukan proses kering

beku. Bilamana perlu bawah ampul dicelupkan dalam air (waterbath)

250C.

5. Sebelum ampul dipotong dianjurkan untuk memasukkan gas nitrogen

murni ke dalamya.

6. Uji viabilitas bakteri dilakukan secara periodik dan rutin, paling tidak

setiap tahun.

Sebagian besar mikroba dapat bertahan dalam media preservasi liofilisasi

selama 10 tahun, selain itu untuk pemindahan tidak perlu untuk ditumbuhkan

lagi dalam agar miring atau dicairkan. Metode ini dapat mencegah air terserap

kembali. Air dapat memicu aktivitas mikroba dan enzim yang dapat merusak

substrat. Jika air ini dapat dikurangi maka aktivitas sel dan enzim akan

semakin lambat sehingga daya simpannya lebih lama.

Hal-hal yang dapat menyebabkan kerusakan pada sel ketika dibekukan

antara lain mencakup efeksolusi, formasie ekstraseluler dan dehidrasi

intraseluler pembentukan. Sedangkan kerugian dari metode ini adalah kultur

harus tetap dalam keadaan beku atau ditumbuhkan kembali pada agar miring

selama transportasi.

3. Liquid Nitrogen Freezing

Metode ini memerlukan alat khusus untuk mengontrol tingkat pembekuan

sebelum disimpan dalam waktu lama dalam nitrogen cair. Media yang

digunakan adalah 10 % (vol/vol) gliserol atau 5% (vol/vol) DMSO. Suhu

penyimpanan pada metode ini adalah 77 K atau -1960C yang merupakan titik

didih dari nitogen cair. Pada suhu rendah ini beberapa aktivitas biologis

termasuk reaksi biokimia yang menyebabkan kematian pada sel dapat

diperlambat (Suriawiria, 2005). Penyimpannan dengan menggunakan metode

ini dapat berlangsung hingga 100 tahun.

Nitrogen cair memiliki titik didih pada suhu -195,8 derajat Celsius,

sedangkan karbon dioksida cair -57 derajat Celsius. Pada suhu yang lebih

tinggi dari suhu tersebut, nitrogen dan karbon dioksida akan berbentuk gas

volatil, sehingga umumnya nitrogen cair dan karbon dioksida cair berada pada

suhu lebih rendah daripada titik didihnya. Dengan suhu yang sedemikian

dingin, baik nitrogen cair maupun karbon dioksida cair mempunyai

kemampuan membekukan mikroorganisme yang relatif lebih efektif daripada

pendingin berbahan amonia ataupun freon.

Prosedur pembekuan mikroorganisme dalam nitrogen cair :

1. Slant cultures (media agar miring)

Tambahkan 5 ml cairan nutrien yang terdiri dari 10% (vol/vol) gliserol

pada masing-masing slant. Keruk permukaan slant dengan pipet steril 1 ml

untuk mendapatkan larutan spora. Gunakan pipet 2 sampai 5 ml, masukkan

masing-masing 1 ml larutan spora ke dalam ampul. Tempatkan seluruh ampul

dalam pendingin (5 C) selama 30 menit.

2. Submerged cultures

Tambahkan 20% (vol/vol) gliserol ke dalam biakan cair sehingga

konsentrasi akhir menjadi 10% (vol/vol). Goyangkan tabung perlahan-lahan

sehingga tercampur rata. Gunakan pipet agar 2 – 5 ml, masukkan masing-

masing 1 ml larutan ke dalam ampul 2 ml. Letakkan seluruh ampul dalam

pendingin (5 C) selama 30 menit untuk ekuilibrasi antara sel dan larutan

media.

3. Pengontrolan tingkat pembekuan

Letakkan ampul yang telah ditutup dalam kaleng aluminium yang terdapat

dalam wadah yang lebih besar. Kemudian masukkan wadah tersebut ke dalam

tabung freezer pengontrol tingkat pembekuan. Pertahankan tingkat dingin 1

hingga 2 C/menit sampai beberapa derajat dibawah perubahan fase yang

didapat. Titik beku biasanya adalah -30 C. Biasanya nitrogen cair harus

ditambahkan ke dalam system, secara manual maupun otomatis, sehingga

mendekati titik beku dan perubahan fase akan segera dicapai. Setelah sel

membeku, atur tingkat dingin lagi hingga 1 C/menit sampai kurang lebih

mencapai suhu -50 C. pindahkan segera ampul ke dalam ruang penyimpanan

akhir dalam pendingin nitrogen cair (-156 C sampai -196C)

Pencairan

Untuk mencairkan kultur, letakkan ampul dalam water bath dengan suhu

37 - 40 C. Gerakkan perlahan-lahan untuk mempercepat pencairan. Usap

bagian luar ampul dengan kertas tissue steril yang dibasahi etanol 70%

(vol/vol). Pindahklan isi ampul ke dalam tabung reaksi berisi 2 ml air steril,

campurkan dengan cara mengocoknya. 0.1 – 0.2 ml diinokulasikan pada media

agar miring.

.

4. Gliserol

Gliserol pada umumnya digunakan sebagai media dalam pengawetan atau

penyimpanan jangka pendek, jangka panjang atau sekedar sebagai media untuk

memindahkan mikroorganisme. Sebagai contoh dalam metode pembekuan

menggunakan nitrogen, media yang digunakan adalah 10 % (vol/vol) gliserol

atau 5% (vol/vol) DMSO.

Gliserol dapat digunakan sebagai media karena gliserol dapat melindungi

aktivitas antimikroba dengan cara meningkatkan stabilitas struktur protein asli

dari mikroba sehingga dapat mencegah protein dari proses termal dan agregasi.

Selain itu gliserol dapat meningkatkan energi bebas dari kompleks yang

diaktifkan dan mengeser kesetimbangan energo tersebut. Gliserol ini dapat

menyerap air pada permukaan protein yang dapat mengakibatkan hidrasi yang

dapat melindungi protein dari kerusakan. Oleh karena itu giserol dapat

memperpanjang penyimpanan mikroorganisme.

BAB III

PENUTUP

Kesimpulan

Berdasarkan uraian tentang teknik penyimpan mikroorganisme dapat

disimpulkan bahwa, Teknik penyimpanan mikroorganisme dapat dilakukan

melalui empat cara yakni agar slants, glyserol, liofilisasi dan liquid nitrogen. Dari

keempat cara tersebut , didapatkan cara yang paling efektif yakni liquid nitrogen

karena dalam teknik tersebut menggunakan suhu rendah pada prosesnya sehingga

reaksi biokimia yang menyebabkan kematian pada sel dapat diperlambat dan

teknik ini termasuk dalam penyimpanan jangka panjang yakni 100 tahun

penyimpanan.

DAFTAR PUSTAKA

Clark, W. A. 2006. Selected bibliography of literature on preservation of

microorganisms, blood, tissues, and vaccines with emphasis on freezing and

freeze-drying (1968-1976). Atlanta: US Departement of Health Education and

Welfare, Center of Disease Control.

Holdings, M. and R.A. Lelliot. 2006. Preservation of some plant viruses by

freeze-dry. Plant Pathology 9:63.66.

Prescoot, L.M. 2003. Mikrobiology 5th edition. Mc Graw Hill. New York

Rachdie. 2008. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba.

http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang-mempengaruhi-

pertumbuhan-mikroba/. Diakses pada tanggal 17 April 2010

Sly, L.I. 2003. Preservation of microbial culture. In fahy, P.C. and G.J. Persley

(Eds). Plant Bacterial Diseases.A. Diagnostic Guide. Sidney: Academis Press.

Sulistinah, N. 2006. Mikroba Pentranformasi Adiponitril di Palembang. Jurnal

Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia : 1-8

Suriawiria, U. 2005.Mikrobiologi Dasar. Papas Sianr Sinanti, Jakarta.