DIAGNOSTIC BIOLUMINESCENT PHAGE FOR DETECTION OF YERSINIA PESTIS

SITI GUSTI NINGRUM

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2014

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL iv  DAFTAR GAMBAR iv  PENDAHULUAN 1  

Latar Belakang 1  Tujuan 1  

TINJAUAN PUSTAKA 1  Karakteristik Bakteriofag 1  Peran Bakteriofag Reporter untuk Mendeteksi Bakteri Patogen 2  Rekombinasi Genetika pada Bakteriofag 3  

METODE 4  Alur Penelitian 4  Strain Bakteri dan Fag 4  Preparasi Gen LuxAB ke dalam Genom Fag 5  Rekombinasi Homolog dan Isolasi Fag Rekombinan ϕA1122::LuxAB 5  Identifikasi Fag Rekombinan 5  Bioluminescence Assay 6  

HASIL DAN PEMBAHASAN 6  SIMPULAN 8  DAFTAR PUSTAKA 8  

DAFTAR TABEL 1 Spesies bakteri yang dideteksi oleh bakteriofag reporter rekombinan 3 2 Spesifisitas fag reporter 8

DAFTAR GAMBAR

1 Struktur bakteriofag 2  2 Identifikasi PCR terhadap ϕA1122::luxAB 6  3 Deteksi Y. Pestis berdasarkan respon sinyal bioluminescens 7  4 Deteksi Y. Pestis pada serum manusia 7  

PENDAHULUAN

Latar Belakang Yersinia pestis merupakan bakteri gram negatif dan termasuk ke dalam

keluarga Enterobactericeae yang merupakan penyebab plague. Plague merupakan zoonosis dengan reservoarnya adalah tikus, anjing, dan rodensia. Y. pestis dapat menyebabkan bubonic plague yang dikarakterisasikan dengan adanya demam, kelemahan, dan membengkaknya limfonodus atau bubo. Penyakit ini dapat berkembang menjadi septisemia. Y. pestis disadari menjadi agen yang berpotensial untuk digunakan sebagai senjata biologis karena kemampuannya bertransmisi dari orang ke orang, gejala klinis yang cepat, dan tingkat kematian tinggi. Plague paru lebih memungkinkan menyebabkan kematian jika tidak diatasi dalam waktu 12-24 jam pertama setelah onset. Oleh sebab itu, deteksi dan diagnosa dini sangat diperlukan untuk mengatasi permasalahan Y. pestis di masyarakat.

Fag reporter rekombinan dapat digunakan sebagai alat deteksi yang alami dan spesifik untuk mendeteksi Y. pestis. Sistem deteksi yang diperantarai fag reporter telah dikembangkan untuk bakteri-bakteri patogen. Fag yang spesifik spesies mampu menginfeksi Y. pestis secara luas. Sebagai contoh, fag ϕA1122 digunakan sebagai alat diagnostik untuk mengidentifikasi Y. pestis. ϕA1122 sangat cocok digunakan sebagai fag diagnostik karena fag tersebut mampu menginfeksi hampir semua Y. pestis. Permasalahannya adalah ϕA1122 masih harus dilakukan di laboratorium dan membutuhkan waktu 24-36 jam. Sementara itu, penyakit plague sangat cepat memberikan reaksi dan kebutuhan prognosa positif dini untuk pertolongan sangatlah penting.

Tujuan Tujuan dari dibuatnya makalah ini adalah untuk mengetahui perkembangan

alat diagnostik berbasis fag yang dilabel cahaya dan bersifat rekombinan.

TINJAUAN PUSTAKA

Karakteristik Bakteriofag

Bakteriofag merupakan virus yang menginfeksi dan bereplikasi dalam bakteri. Bakteriofag berasal dari bahasa Yunani yaitu phagein yang berarti menelan. Bakteriofag terdiri dari protein yang menyelubungi genom DNA atau RNA. Genomnya disandikan sekurang-kurangnya empat gen dan sebanyak-banyaknya ratusan gen. Fag bereplikasi dalam bakteri dan kemudian menginjeksikan genom mereka ke dalam sitoplasma. Fag secara luas menyebar luas di lokasi yang mengandung bakteri. Salah satu sumber alami untuk keberadaan fag adalah air laut yaitu mencapai 9x108 virion/ml ditemukan dalam

2

mikroba permukaan dan hampir 70% bakteri laut terinfeksi oleh fag (Prescott 1993). Berikut merupakan struktur bakteriofag (Gambar 1).

Gambar 1 Struktur bakteriofag; (Prescott 1993)

Bakteriofag memiliki siklus lisis dan lisogenik. Fag lisis akan melisiskan sel bakteri dan menghancurkannya setelah replikasi virion. Setelah dihancurkan, fag progeni dapat menemukan inang baru untuk diinfeksi. Sementara itu, siklus lisogenik tidak menyebabkan secara langsung lisisnya sel inang. Fag ini disebut juga temperate phage. Genom viral akan berintegrasi dengan DNA inang dan bereplikasi bahkan menjadi plasmid. Virus akan dormant sampai kondisi inang memburuk. Kemudian, endogenous phage menjadi aktif. Pada saat ini lah bakteriofag menginisiasi siklus reproduksi dan menyebabkan lisisnya sel inang (Mason et al. 2011).

Peran Bakteriofag Reporter untuk Mendeteksi Bakteri Patogen

Bakteriofag reporter telah dikembangkan untuk mendeteksi beberapa

spesies bakteri seperti Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, dan Mycobacterium spp. Tabel 1 menunjukkan spesies bakteri yang dideteksi oleh bakteriofag reporter rekombinan. Bakteriofag membawa gen reporter yang dapat digunakan untuk mendeteksi mikroorganisme. Sebagai contoh, penggunaan gen lux dari Vibrio fisheri disisipkan ke dalam kromosom bakteriofag λ dengan meligasi DNA nya sehingga luminescent phage teridentifikasi. Dengan menggunakan fag yang mengandung lux dapat memungkinkan untuk mendeteksi 10-100 E. coli sel/ml susu. Semenjak itu, bakteriofag reporter semakin dikembangkan untuk mampu mendeteksi beberapa mikroorganisme patogen (Goodridge and Griffths 2002).

3

Tabel 1 Spesies bakteri yang dideteksi oleh bakteriofag reporter rekombinan; (Goodridge & Griffths 2002)

Spesies bakteri Gen reporter E. coli O157:H7 Lux E. coli Lux Salmonella spp. Lux M. bovis BCG Lux Staphylococcus aureus Lux L. monocytogenes Lux Enteric bacteria Lux

Rekombinasi Genetika pada Bakteriofag

Rekombinasi genetika didefinisikan sebagai penyusunan kembali bagian gen. Perolehan gen baru dan penyusunan kembali gen lama telah dilakukan melalui rekombinasi genetika antara bakteriofag dan genom bakteri. Pada Escherichia coli, rekombinasi genetika telah dilakukan melalui mekanisme yang penuh hati-hati. Rekombinasi genetika dapat menyebabkan aktifnya perbaikan kerusakan DNA selama periode stres atau pun keberagaman genetika (Hillyar 2012).

Bakteriofag rekombinan kini sudah semakin luas penggunaannya. Sebagai contoh, sistem deteksi Salmonella menggunakan bakteriofag rekombinan untuk mendeteksi keberadaan Salmonella pada telur dengan menambahkan secara langsung bakteriofag rekombinan ke dalam telur. Selain itu, rekombinasi antara bakteriofag dengan gen luxAB Vibrio harveyi menghasilkan fag rekombinan (A511::luxAB). Fag rekombinan (A511::luxAB) diuji untuk mendeteksi L. monocytogenes dalam pangan (Goodridge and Griffths 2002).

4

METODE

Alur Penelitian

Strain Bakteri dan Fag

Strain Y. Pestis A1122 yang telah dilemahkan, Y. Enterocolitica, dan Y. pseudotuberculosis diperoleh dari Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository. Y. pseudotuberculosis NCTC 1105, NCTC 9507, NCTC 21, NCTC 10275, dan NCTC 9509 diperoleh dari American Type Culture Collection. Escherichia coli ER2738 diperoleh dari New England Biolabs. Fag ϕA1122 CDC diperoleh dari Divisi Vector-Borne Infectious Diseases di CDC. Bakteri ditumbuhkan dalam 2 ml Luria-Bertani (LB) pada suhu 26 °C, 28 °C, dan 37 °C selama 18-24 jam dengan shaking (225rpm) untuk mendapatkan kultur tersaturasi. Kultur kemudian didilusi 1:15 (Y. pestis) dan 1:50 (E. coli, Y. enterocolitica, dan Y. pseudotuberculosis) ke dalam media segar dan diinkubasi pada suhu yang sama hingga didapatkan A600.

UJI  BIOLUMINESCENS  

IDENTIFIKASI  FAG  REKOMBINAN  

Rekombinasi  Homolog  dan  Isolasi  Fag  Rekombinan  ϕA1122::LuxAB  Kultur  diinfeksi  dengan  ϕA1122  (1x105  

PFU/ml)   Uji  keberadaan  lux  dengan  PCR  

Preparasi  Gen  LuxAB  ke  dalam  Genom  Fag  

Gen  lux  A  dan  lux  B  dari  Vibrio  harveyi     Genom  fag  ϕA1122    

Isolasi  bakteri  dan  fag  

Y.  Pes0s  A1122   Fag  ϕA1122    

5

Preparasi Gen LuxAB ke dalam Genom Fag

Gen lux A dan lux B dari Vibrio harveyi digunakan sebagai reporter gen dan ditargetkan untuk integrasi ke dalam genom fag ϕA1122 downstream dan upstream. pBlue script II-SK- yang mengandung gen luxAB (pluxAB-SK) digunakan sebagai vektor parental untuk langkah kloning subsequent. Fragmen 178 pasangan basa dari DNA ϕA1122 diamplifikasi menggunakan DNA fag sebagai template. Primer 5’0.3 memiliki lokasi restriksi SaCI dan XbaI untuk kloning ke dalam pluxAB-SK sehingga dapat dibuat DNA fag 5’-flanking untuk rekombinasi homolog (p5’0.3-luxAB-SK). Fragmen 176 pasangan basa dari DNA fag diamplifikasi dengan primer yang mengandung XhoI dan SphI. Produk PCR diklon 3’ dari luxAB ke dalam lokasi p5’0.3-luxAB-SK sehingga didapatkan kaset luxAB dengan DNA fag p5’0.3-luxAB-3’0.3-SK.

Rekombinasi Homolog dan Isolasi Fag Rekombinan ϕA1122::LuxAB

Gen luxAB digabungkan ke dalam genom fag melalui rekombinasi homolog antara fag ϕA1122 dan gabungan DNA kaset. Y. pestis A1122 ditransformasikan menggunakan metode kalsium klorat dengan p5’0.3-luxAB-3’0.3-SK. Transforman diseleksi setelah 48 jam pada suhu 28 °C pada agar LB yang ditambahkan ampicillin 100 μg/ml. Transforman menunjukkan hasil yang positif terhadap bioluminescens. Kultur yang ditumbuhkan dalam agar tadi diinfeksi dengan ϕA1122 (1x105 PFU/ml) dan diinkubasikan hingga lisis terlihat. Supernatan dijernihkan dengan sentrifugasi dan disaring dengan nilon steril. titer lisat diuji dengan teknik overlay agar pada beberapa plate untuk melisiskan. Fag yang dihasilkan dielusi dalam SM buffer dan aliquot dari tiap plate diuji dengan PCR untuk melihat keberadaan luxA. Titer lisat fag dari plate yang positif terhadap luxA diuji lagi dan diuji ulang dengan dilusi yang lebih tinggi. Proses ini menguji titer pada dilusi yang lebih tinggi dan mengidentifikasi lisat plate yang positif luxA. Lisat yang positif luxA tadi diulang delapan kali hingga tiap plak dapat diambil dan diuji terhadap luxA. Klonal ϕA1122::luxAB disiapkan dari satu plak dan diamplifikasi saat pertumbuhan eksponansial dari Y. pestis pada suhu 28 °C dan supernatant fag dijernihkan dengan sentrifugasi lalu difiltrasi. Stok klonal dari ϕA1122::luxAB mengandung 1010-1011 PFU/ml dan disimpan pada suhu 4 °C dengan kondisi gelap.

Identifikasi Fag Rekombinan

Supernatan sel fag bebas dianalisis dengan PCR. Primer diatur untuk mendeteksi keberadaan luxA atau memanjangkan lokasi penggabungan 5’ dan 3’. Tiap penggabungan primer diatur untuk menjamin bahwa ikatan primer terjadi pada luar dan dalam kaset.

6

Bioluminescence Assay

Fag ϕA1122::luxAB dan sel Y. pestis dicampur dan diinkubasi pada suhu yang telah diatur. Cahaya bioluminescens diukur menggunakan Biotek Synergy II multiplate detection reader. Kultur diinjeksikan dengan n-decanal dan dibaca selama 10 detik. Kontrol mengandung sel saja atau fag saja. Bioluminescens digambarkan sebagai relative light unit (RLU).

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penggunaan fag untuk mendeteksi spesies bakteri semakin luas. Usaha untuk menurunkan waktu yang signifikan dalam mendeteksi bahan pangan dapat dilakukan dengan fag reporter yang disisipkan gen luxAB. Gen luxAB digunakan sebagai reporter karena dapat mendeteksi keberadaan bakteri patogen gram negatif dan positif. Hal ini ditunjukkan oleh kemampuan luxAB berintegrasi pada lokasi genom yang tepat (Gambar 2). Selain itu, sinyal bioluminescens dapat divisualisasikan dengan alat deteksi yang sederhana seperti kamera dan tidak membutuhkan preenrichment (Schofield et al. 2009).

Gambar 2 Identifikasi PCR terhadap ϕA1122::luxAB; (Schofield et al. 2009)

Hasil menunjukkan kemampuan fag reporter untuk mendeteksi Y. pestis dengan cepat karena fag reporter mentransduksikan respon sinyal bioluminescens dalam waktu 10-15 menit setelah penambahan fag (Gambar 3). Jika dibandingkan dengan uji lisis fag standar yang biasanya membutuhkan 24 jam, pengujian baru ini jauh lebih cepat. Deteksi dan diagnosa yang cepat dibutuhkan karena plague menyebabkan kematian jika tidak ada perlakuan pada 12-24 jam pertama setelah onset. Fag reporter juga menunjukkan kemampuan secara langsung dalam

7

mendeteksi Y. pestis pada serum manusia tanpa persyaratan isolasi dan pengujian lanjutan (Gambar 4). Dengan kemampuan alat deteksi yang bisa dibawa kemana saja menjadikan temuan ini sebagai kit diagnostik yang dapat digunakan langsung di lapangan (Schofield et al. 2009).

Gambar 3 Deteksi Y. Pestis berdasarkan respon sinyal bioluminescens;

(Schofield et al. 2009)

Gambar 4 Deteksi Y. Pestis pada serum manusia; (Schofield et al. 2009)

Hasil lain menunjukkan spesifisitas ϕA1122 yang tumbuh pada hampir seluruh isolat Y. pestis dan tidak tumbuh pada spesies selain Y. pestis sehingga ϕA1122::luxAB berpotensi sebagai uji yang sangat spesifik terhadap Y. pestis (Tabel 2). Mekanisme spesifisitas ϕA1122 dengan ϕA1122:;luxAB tidak sama. Hal ini disebabkan oleh ϕA1122 mampu menyerang inang melalui infeksi, replikasi, dan melisiskan sel yang ditunjukkan dengan adanya plak. Sebaliknya,

8

kerentanan inang terhadap ϕA1122::luxAB diukur dengan respon sinyal bioluminescens yang hanya membutuhkan tahapan yang lebih sedikit yaitu hanya infeksi fag dan ekspresi luxAB (tidak multiplikasi atau pun lisis) (Schofield et al. 2009). Tabel 2 Spesifisitas fag reporter; (Schofield et al. 2009)

Fag reporter mampu medeteksi Y. pestis pada konsentrasi 4x103 CFU/ml

dalam waktu 60 menit. Hasil ini diperoleh tanpa pengumpulan sel, tanpa preenrichment, dan menggunakan multideteksi reader yang membaca absorban dan fluorescens sebagai fungsi primer dan luminescens sebagai fungsi sekunder. Telah tersedia uji diagnostik komersial untuk mendeteksi plague yaitu Plague BioThreat Alert test strips dengan limit deteksi antara 6x103-7x103 CFU/ml. Sensitivitas pada alat uji tersebut sama dengan sensitivitas pada pengujian ini (Schofield et al. 2009).

SIMPULAN

Fag rekombinan yang dilabel luxAB dapat menjadi fag reporter yang cepat mentransduksikan respon sinyal bioluminescens dari Y. Pestis. Fag ini dapat menjadi alat deteksi pada isolat mau pun matriks relevan lainnya.

DAFTAR PUSTAKA

Goodridge L, Griffiths M. 2002. Reporter bacteriophage assays as a means to detect foodborne pathogenic bacteria. Food Research International. 35:863-870.

Hillyar CHT. 2012. Genetic recombination in bacteriophage lambda. Bioscience

9

Horizons. 5:1-7. Mason, Kenneth A, Jonathan BL, Susan RS, Peter HR, George BJ. 2011. Biology.

Hal. 533. McGraw-Hill, New York. ISBN 978-0-07-893649-4. Prescott L. 1993. Microbiology. Wm. C. Brown Publishers, ISBN 0-697-01372-3. Schofield DAS, Molineux IJ, Westwater C. 2009. Diagnostic bioluminescent

phage for detection of Yersinia pestis. J Clin Microbiol. 47(12):3887-3894. 10.1128/JCM.01533-09.