RESUME

“Biotechnological Production of Vitamins”

Oleh :

Ahmad Faizin H 0910005

Eky Budi Wardani H 0910030

Ikfini Ma’anillah H 0910037

M. Fatchurrohman H 0910042

Ratri Rosdiana Putri H 0910060

Rulliana Purbasari H 0910065

PROGRAM STUDI ILMU DAN TEKNOLOGI PANGAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

2013

Vitamin didefinisikan sebagai mikronutrien penting yang dibutuhkan

dalam jumlah sedikit dimana tidak bisa disintesis oleh mamalia, juga penting

untuk metabolisme semua organisme hidup dan dihasilkan lewat mikroorganisme

atau tumbuhan. Sebagian besar vitamin sekarang diproduksi secara industri

sementara sebagian yang lain diproduksi lewat salah satu diantara sintesis kimia

atau proses ekstraksi. Proses ini memerlukan energi intensif, dan juga merugikan

dari pembuangan limbah yang mahal. Selanjutnya, proses ini menumbuhkan

kesadaran konsumen berkenaan dengan keamanan bahan tambahan makanan. Ini

menjadi rujukan untuk meningkatkan ketertarikan di dalam subtitusi proses ini

dengan proses bioteknologi.

A. Vitamin Larut Lemak

1. Vitamin E (α-tocopherol)

Vitamin E terdiri atas kelompok komponen lemak larut, termasuk

diantaranya α-tocopherol yang paling berlimpah dan mempunyai aktivitas

antioksidan tertinggi. Beberapa sumber alternatif produksi tokoferol :

beberapa strain mikro alga air tawar Euglena gracilis Z dan mikro alga laut

Dunaliella tertiolecta yang menghasilkan alpha tokoferol dengan konsentrasi

lebih tinggi. Studi optimasi produksi alpha tokoferol pada E. gracilis Z

dengan modifikasi kondisi kultur, kultur 2 tahap, dan menyeleksi subtrat

yang paling efektif bukan hanya untuk pertumbuhan organisme tetapi juga

terhadap produksi alpha tokoferol. Pengaturan kondisi tumbuh dari

organisme juga mempengaruhi produksi alpha tokoferol.Produksi vitamin c

dan E dalam jumlah besar secara simultan ditunjukkan oleh E. gracilis Z.

Carballo-cardenas mempelajari produksi tokoferol lewat Dunaliella

tertiolecta dan Tetraselmis suecica untuk membuktikan pengaruh

pencahayaan.

2. Menaquinone (vitamin K2)

Ada 2 bentuk alami vitamin K, vitamin K1 dan K2. Vitamin K1

(phylloquinone) diproduksi oleh tumbuhan. Vitamin K2 (menaquinone/MK)

secara umum disintesis oleh bakteri. Beberapa peneliti telah melakukan

studi intensif tetanng mekanisme pembentukan menaquinone pada Bacillus

subtilis. Pada fermentasi kedelai Bacillus subtilis memproduksi

menaquinone, komponen yang banyak yaitu MK-7 dan yang sedikit yaitu

MK-6.

B. Vitamin Larut Air

1. Riboflavin atau vitamin B2

a. Fermentasi menggunakan Ashbya gossypii

Hasil riboflavin lebih dari 15 g L / kultur pada fermentasi Ashbya

gossypii dengan media nutrisi yang mengandung molase. Produksi

riboflavin oleh Ashbya gossypii di media mengandung whey dengan

suplemen yang berbeda seperti kulit, glisin + pepton, sukrosa, glisin,

ekstrak ragi, pepton, dan minyak kedelai adalah 389,5, 120, 87,5, 78,3,

68,4, 23,2, dan 17,5 mg / L. limbah bumi yang mengandung minyak

sawit 40% digunakan untuk produksi riboflavin oleh Ashbya gossypii,

konsentrasi riboflavin mencapai 2,1 g / L dalam 10 hari. Konsentrasi ini

hampir 1,5 kali lebih tinggi dibandingkan kultur pada kelapa sawit murni.

Produksi Riboflavin dalam Ashbya gossypii ditingkatkan menjadi 1,6 kali

setelah 4 hari (2,5 g / L) dengan penambahan mineral 1% ke media

minyak kedelai.

b. Fermentasi menggunakan Bacillus subtilis.

Biosintesis riboflavin dalam Bacillus subtilis menggunakan genetika

klasik dan teknologi r-DNA. Kloning dan DNA nukleotida menunjukkan

bahwa enzim yang dibutuhkan untuk biosintesis riboflavin dikodekan

oleh gen sebagai operon 4,3 kb tunggal. B. subtilis penghasil riboflavin

mengandung beberapa salinan dari biosintesis subtilis dimodifikasi B.

riboflavin operon (rib operon)yang terintegrasi pada dua lokasi yang

berbeda di kromosom B. subtilis. Baru-baru ini, Nippon Roche, Jepang,

telah langkah produksi fermentasi tunggal riboflavin menggunakan

Bacillus subtilis galur rekombinan, yang efektif menghasilkan riboflavin

langsung dari glukosa dalam operasi fed-batch. Dalam rangka

mempertahankan stabilitas operasional dan biaya operasi rendah maka

perlu adanya kontrol dari budidaya fed-batch.

c. Fermentasi menggunakan Corynebacterium ammoniagenes

Strain untuk produksi riboflavin melalui rekayasa metabolik

menggunakan teknik DNA rekombinan dalam Corynebacterium

ammoniagenes. Fragmen DNA yang memiliki aktivitas promotor dalam

C. ammoniagenes diisolasi. Ketika fragmen DNA (P54-6) menunjukkan

aktivitas promotor terkuat dalam medium akhir biosintesis gen riboflavin,

akumulasi riboflavin diangkat 3 kali lipat. Aktivitas GTP cyclohydrolase

II enzim pertama dalam biosintesis riboflavin diangkat 2,4 kali lipat

sedangkan yang dari riboflavin synthase enzim terakhir dalam biosintesis

diangkat 44,1 kali lipat. Aktivitas GTP cyclohydrolase II berkorelasi

dengan produktivitas riboflavin. Riboflavin diproduksi pada level 15,3 g

L / setelah 72 jam dalam wadah fermentasi tanpa penghambatan produk

akhir.

d. Fermentasi menggunakan Lactococcus lactis

Mengembangkan galur Lactococcus lactis menggunakan mutagenesis

langsung dan rekayasa metabolisme untuk kelebihan simultan dari kedua

folat dan riboflavin. Lactococcus lactis MG 1363 terdapat analog

riboflavin roseoflavin. The roseoflavin strain (Lactococcus lactis CB010)

menunjukkan deregulasi biosintesis riboflavin sehingga memproduksi

riboflavinyang tidak dapat dikonsumsi. Lactococcus lactis CB010

kemudian ditransformasi dengan pNZ7010 mengekspresikan gen Folke

untuk protein bifunctional 2-amino-4-hydroxy- 6-hidroksimetil

dihydropteridine pyrophosphokinase dan GTP cyclohydrolase I. Hal ini

mengakibatkan lebih dari 10 kali lipat peningkatan tingkat folat

ekstraseluler, dan lebih dari 2 kali lipat peningkatan tingkat folat total.

Metode lain untuk produksi riboflavin didasarkan pada produksi

mikroba D-ribosa, yang berfungsi sebagai bahan awal untuk sintesis kimia

lebih lanjut dari riboflavin. Proses konversi kimia memerlukan beberapa

langkah, dan memakan waktu mengakibatkan biaya tinggi dibandingkan

dengan produksi langsung dengan fermentasi.

2. Vitamin B12

Sebagian besar langkah – langkah biosintesis vitamin

B12 telah dikarakteristikkan pada Pseudomonas

denitrificans, Salmonella typhimurium dan

Propionibacterium freudenreichii. Dua perbedaan biosintetik

jalur untuk vitamin B12 ada di alam:

1. Aerobic, atau jalur yang bergantung pada keberadaan

oksigen ditemukan pada organisme seperti Pseudomonas

denitrificans

2. Anaerobic, jalur yang tidak bergantung dengan

keberadaan oksigen telah diteliti pada organisme P.

shermanii, Salmonella typhimurium dan Bacillus

megaterium.

a.Produksi vitamin B12 dengan fermentasi

Propionibacterium Sp

Propionibacterium shermanii dan Propionibacterium

freudenreichii adalah yang paling umum digunakan.

Bioproses produksi vitamin B12 menggunakan strain

Propionibacterium terbagi menjadi 2 tahapan. Tahap

pertama dilakukan fermentasi selama 3 hari, bakteri-

bakteri tumbuh secara anaerob untuk memproduksi

precursor vitamin B12 yaitu cobamida. Selanjutnya sangat

penting untuk menetralisir akumulasi asam propionate

selama fermentasi berlangsung hal ini untuk menjaga

kultur yang dihasilkan mempunyai pH = 7. Volume asam

propionate berjumlah 10% dari volume fermentasi. Untuk

optimasi nilai pH, suhu dan aerasi, pembentukan kondisi

tersebut untuk produksi asam propionate dan vitamin B12

berbeda. Sementara itu, produksi asam propionate yang

optimal yaitu pada kondisi anaerobik dengan pH 6.5 dan

suhu 37 º C, produksi vitamin B12 yang optimal

membutuhkan suhu 40 ºC dan kondisi aerobic (0.5 vvm

aerasi pada 100 rpm) dengan pH 6.5.

Beberapa penelitian dilakukan untuk mendapatkan

produksi vitamin B12 secara optimum antara lain:

1. Marwaha dkk telah mempelajari peranan asam amino

betain dan kolin pada produksi vitamin B12 dengan 3

strain Propionibacterium yaitu viz. P. shermanii 566, P.

shermanii dan Propionibacterium arl AKU 1251. Sebelas

asam amino yang diujikan, asam L- glutamat

meningkatkan baik pertumbuhan dan susunan produk

menjadi maksimum pada 3 semua strain tersebut.

2. Marwaha dan Sethi menggunakan limbah susu untuk

produksi vitamin B12. Propionibacterium shermanii 566

mensintesis 5.76 mg vitamin B12 per liter whey

kandungan 4 % laktosa ditambah (NH4)2HPO4 dengan

syarat pada saat fermentasi pada suhu 30º C dengan

kondisi anaerobic selama 84 jam separu pertama

kemudian diikuti dengan kondisi aerobik selama 84 jam

separu kedua pada proses fermentasi.

3. Yongsmith and Chutima mempelajari produksi vitamin

B12 dengan mengimobilisasi pada gel kalsium alginat.

Keseluruhan sel Propionibacterium sp. strain arl AKU

1251 masih hidup ketkia diimobilisasi dalam gel alginat.

Hasil maksimum mencapai sekitar 20 mg/ L medium.

Produksi vitamin B12 dan pertumbuhan pada sel-sel

yang diimobilisasi dapat meningkat oleh inkubasi yang di

dalam sel-selnya terdapat sebuah medium terdiri atas

konsentrasi tinggi sumber karbon dan nitrogen.

Kehadiran precursor vitamin B12, yaitu cobaltous

sulphate dan 5,6-dimethyl benzimidazole, bersamaan

dengan surfaktan Tween 80, pada konsentrasi optimum

secara signifikan meningkatkan produksi vitamin B12,

hasil maksimum mencapai sekitar 20 mg/L medium.

Masalah-masalah terkait dengan produksi vitamin

B12

Masalah utama dalam produksi vitamin B12 dengan

menggunakan Propionibacterium adalah terhambatnya

pertumbuhan selama terjadi akumulasi metabolit inhibitor

seperti asam propionat dan asam asetat. Ken-ichiro dkk

meneliti melalui berbagai pendeketan yaitu dengan

mengontrol konsentrasi asam propionate serendah

mungkin dengan cara antara lain:

a) Kultivasi periodik Propionibacterium dimana konsentrasi

Oksigen terlarut (DO) sebagai solusi perubahan antara 0-

1 ppm

b) Sistem daur ulang sel menggunakan serat berongga

modul

c) Pencampuran kultur menggunakan Propionibacterium

dan Ralstonia eutropha dimana mikroorganisme yang

terakhir berasimilasi asam propionat dihasilkan oleh

mikroba pendahulu

Telah ditemukan bahwa produksi vitamin B12 paling

tinggi menggunakan sistem daur ulang sel , ketika

dievaluasi berdasarkan jumlah vitamin B12 yang dihasilkan

per unit volum medium yang digunakan, sistem

penggabungan kultur memberikan nilai yang paling tinggi

b. Produksi vitamin B12 dengan fermentasi

Pseudomonas dinitrificans

Pseudomonas dinitrificans tumbuh paralel cobalamin sintesis

dalam kondisi aerobik, jika culture secara langsung dilengkapi dengan 5,6-

DBIM dan garam kobalt. Mempertahankan DO rendah memiliki efek yang

menguntungkan. Beberapa vitamin B12 derivatif dapat diproduksi baik

oleh fermentasi langsung atau dengan konversi kimia cyanocobalamin.

Culture ini diaerasi selama proses fermentasi seluruh sekitar 2-3 hari pada

suhu 30 ° C dan pH nilai-nilai yang dipertahankan pada 6-7.

Methanogen juga dapat digunakan untuk produksi vitamin B12

(54,55). Vitamin B12 produksi oleh methanogen mungkin telah mengikuti

keunggulan dibandingkan konvensional B12 produsen vitamin:

• konsentrasi vitamin B12 dalam kaldu adalah sepuluh kali lebih besar

daripada menggunakan asam propionat memanfaatkan mikroba;

• produk utama, metana, tidak menghambat pertumbuhan methanogen dan

dapat memberikan kepadatan sel sistem culture tinggi;

• metanol, asam asetat dan CO2 digunakan sebagai substrat yang murah,

relatif stabil dan terbarukan.

Namun, butuh waktu yang lama untuk substrat karena methanogen tumbuh

lebih lambat dari mikroba aerobik, dan ini membuat fasilitas fermentasi yang

lebih besar.

4. Asam askorbat

Saat ini sebagian besar diproduksi secara komersial L-asam askorbat

disintesis melalui proses Reichstein menggunakan D-glukosa sebagai bahan

awal. Inovasi baru dalam proses fermentasi dan kemajuan teknologi DNA

rekombinan biokimia dan memperluas pilihan yang tersedia untuk

eksploitasi bioteknologi di L-askorbat produksi asam.

a. Proses fermentasi bakteri

1. Jalur sorbitol

Sorbitol diubah dengan fermentasi menjadi 2-KLG melalui

peantara L-sorbosone. Transformasi dilakukan oleh beberapa strain

genera Pseudomonas dan Acetobacter, yang mengkatalisasi oksidasi

dari L-sorbose (dan atau D-sobitol) untuk 2-KLG melalui serangkaian

dehidrogenase membran terikat, mengarah ke pembentukan L-

sorbosone. Oksidasi terakhir untuk 2-KLG dikatalisis oleh salah satu

membran terikat atau dehydrogenasi sorbosone cytosolic, tergantung

pada ketegangan. Sugisawa et al. (69) isolasi kultur G. Oxidan yang

dihasilkan sampai 60 g/L dari 2-KLG dari L-sorbose atau D-sorbitol,

dengan konversi 60 %.

Saito et al. (70) diisolasi Glucanobacter oxydans G624, yang

dapat mengkonversi D-sorbitol untuk L-sorbose hampir kuantitatif

melalui dehidrogenase membran-terikat sorbitol, tetapi tidak mampu

mensintesis 2-KLG. Membran-terikat sorbose dehidrogenase dan

dehidrogenase sitosol sorbosone diklon dari Glucanobacter oxydans

T-100, strain yang dapat menghasilkan 2-KLG, dan dinyatakan dalam

Glucanobacter oxydans G624. Setelah optimalisasi sistem ekspresi,

mutagenesis kimia untuk memblokir lebih lanjut 2-KLG metabolisme

menghasilkan Glucanobacter oxydans strain yang disediakan lebih

dari 85% dari hasil 2-KLG.

2. Jalur Asam 2-Ketod-Glukonat.

Dalam jalur ini, D-glukosa diubah menjadi 2-KLG melalui

Asam D-glukonat, asam 2-ketoD-glukonat dan Asam 2,5-diketo-D-

glukonat (2,5-DKG). Sampai sekarang tidak ada bakteri strain

secara efisien mengatalisasi konversi lengkap D-glc untuk 2-KLG

telah diisolasikan. Hal ini dilakukan dalam tiga langkah utama,

setiap langkah dilakukan dengan menggunakan mikroorganisme

berbeda (3):

(i) transformasi Asam D-glukosa menjadi 2-ketoD-glukonat :

transformasi glukosa menjadi Asam 2-ketoD-glukonat dilakukan

oleh Acetobacter melanogenus (71) dan Pseudomonas

albosesamae (72). Beberapa Acetobacter strain juga mensintesis

asam 2-ketoD-glukonat;

(ii) Asam oksidasi 2-ketoD-glukonat : oksidasi ini dilakukan oleh

Bakteri hoshigaki dan Bakteri gluconimani dengan 2,5-DKG

sebagai produk. Selain itu, Acetomonas albosesamae langsung

dapat mengubah D-glukosa 2,5-DKG;

(iii) asam oksidasi 2,5-DKG:. Sonoyama et al (73) telah

menggambarkan proses untuk konversi 2,5-DKG menjadi 2-KLG.

Strain tersebut adalah dari genera Brevibacterium dan

Pseudomonas, dan hasil maksimum diperoleh dari

Brevibacterium ketosoreductum.

Dalam proses konvensional (bioconversion), 2-KLG diubah

menjadi asam L- askorbat kimia melalui dua rute :

Yang pertama libatkan beberapa tahapan termasuk:

• esterifikasi turunan 2-KLG bawah kondisi asam kuat untuk

menghasilkan metil 2-ketoL-gulonate (MeKLG);

• reaksi MeKLG dengan basa untuk menghasilkan logam garam

askorbat;

• perlakuan garam logam askorbat dengan rasa asam yang untuk

mendapatkan asam askorbat.

Rute kedua adalah metode satu-langkah yang terdiri dari asam-katalis

siklisasi KLG.

b. Ragi berbasis proses fermentasi untuk produksi asam askorbat

Banyak bukti menunjukkan bahwa biosintesis asam L-ascorbic dari

substrat ini dalam ragi terjadi melalui activitas enzim dari jalur asam D-

erythroascorbic (82). Selain itu, ekspresi D-arabinono-1 ,4-lactone

oxiDase dari Saccharomyces cerevisiae di Escherichia coli dapat

memproduksi dgn kelebihan asam D-erythroascorbic dan asam L-

askorbat bila diaktifkan dengan D-arabinono-1 ,4-lakton dan D-ga

lactono-1 ,4-lakton, berturut-turut (83).

Saccharomyces cerevisiae dan Zygosaccharomyces bailii

mengumpulkan asam L- askorbat intrasel saat inkubasi dengan L-

galaktosa. Ekspresi dari dehidrogenase D-arabinosa dan oxidase D-

arabinono-1 ,4-lactone pada Saccharomyces cerevisiae meningkatkan

kemampuan ini secara signifikan. Kenyataanya , strain rekombinan

bahkan memperoleh kemampuan untuk mengumpulkan Asam L-askorbat

dalam media kultur. Bahkan lebih baik kembali Hasil pengujian dapat

diperoleh dengan overekspresi tanaman enzyme L-galaktosa

dehidrogenase dari Arabidopsis thaliana (84).

c. Produksi asam L- askorbat menggunakan ganggang

Skatrud dan Huss (85) menjelaskan metode untuk efisieni produksi

asam L- askorbat dalam ganggang. Metode melibatkan awal

pertumbuhan Chlorella pyrenoidosa ATCC 53170 dalam fermentor

dengan sumber karbon yang cukup untuk sel untuk tumbuh kepadatan

menengah. Di tahap habis, sumber karbon tambahan ditambahkan

berurutan atau terus menerus untuk mempertahankan konsentrasi sumber

karbon di bawah tingkat yang ditentukan sampai penambahan dihentikan.

Hal ini mengakibatkan produksi 1,45 g / L asam L- askorbat. Euglena

gracilis Z. adalah salah satu beberapa mikroorganisme yang sekaligus

menghasilkan antioksidan vitamin seperti b-karoten (71 mg / L), vita min

C (86,5 mg / L) dan vitamin E (30.1 mg / L) (1).

4. Biotin

Jalur biosintesis biotin dalam strain bakteri yang berbeda seperti

Escherichia coli (86), sphaericus Bacillus (87), Bacillus subtilis (88) dan

Sphingomonas sp. (89) telah dilaporkan. Hanya langkah terakhir, konversi

dethiobiotin (DTB) ke biotin, belum diselesaikan secara enzimatik,

meskipun sphaericus Bacillus dapat mengkonversi dethiobiotin menjadi (+)-

biotin. Sebuah kontribusi besar terhadap pemahaman jalur metabolisme

untuk sintesis biotin dari pimelyl-CoA awalnya dijelaskan untuk E. coli.

Jalur biotin melewati tiga intermediet, 7-keto-8-aminopelargonic acid

(KAPA), 7,8-diaminopelargonic acid (dapa) dan DTB. Ini intermediet

secara individual atau kolektif disebut sebagai vitamers atau vitamers total.

Kesimpulan

Proses mikroba atau mikroalga untuk produksi vitamin memiliki banyak

keuntungan dibandingkan dengan proses sintesis kimia (jika sama sekali

ada). Produk dari proses kimia sering campuran rasemat, sedangkan

fermentasi atau biokonversi reaksi menghasilkan senyawa enansiomer yang

diinginkan. Selain itu, kemajuan teknologi biokimia dan DNA bersama-

sama dengan revolusi genomik telah memperluas pilihan yang tersedia

untuk eksploitasi bioteknologi dalam produksi vitamin. Selain itu, proses

bioteknologi dan produk umumnya memiliki dampak lingkungan positif dan

daya tarik positif kepada orang-orang.