Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapatdilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupundengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahanbahansel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufernonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjenyang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariotlangkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis,remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengansentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik sepertikloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis denganproteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampurdengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA.Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahanamonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl (lihatBab II).Gambar 9.1. Skema tahapan kloning genTeknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNAvektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yangakan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya beradadalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closedcircular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya danmempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmidjauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Olehkarena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA

kromosom.Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNAyang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmidakan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNAkromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidiumbromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNAplasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

Genom → jumlah total (keseluruhan) khromosom dalaminti yang berisi semua informasi genetik darisuatu sel/organisme1 sel manusia → berisi 3.3 milyar pb (23 pasang khromosom)1 sel sapi → berisi 30 ps khromosom1 sel E.coli → berisi 1 ps khromosom

1. Isolasi dan Pemurnian DNA meliputi :- sumber DNA (mikroba, virus, tumbuhan, hewan dsb)- pemecahan sel

- pemisahan (DNA inti dari DNA mitokondria)- pengendapan DNA- pemurnian (elektroforesis)

isolasi plasmid metode LISIS ALKALI

PEMANENAN SEL

tahap satu ini ditujukan untuk mendapatkan pelet sel yang terpisah dari media pertumbuhannya.

# PELEPASAN PLASMID DARI SEL

setelah diberi Lar II, maka seharusnya terdapat lendir pada tutup tube (jika dibuka); Lar I, II, III diusahakan dingin.; setelah diberi Lar III, biasanya akan ada gumpalan putih.

STE (Sodium Tris EDTA) berfungsi sebagai pencuci sel dari media dan bahan lain. saat sel dicampur dengan Lar I, maka tris-EDTA dapat mengikat Mg 2+ dan Ca2+ --> mendestabilisasi membran (karena ion Mg ada pada protein membran hilang) dan menghambat DNAse. sedangkan glukosa dari Lar I akan mencegah buffer (tris) merusak sel dan membuat lingkungan hiperosmotik.

SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) dari Lar II dapat melubangi membran sel karena SDS adalah salah satu jenis deterjen yang mampu mengikat (menyelimuti)protein membran sehingga terpisah dari bilayer lipid. NaOH akan memecahkan dinding sel dan juga mendenaturasi DNA kromosom sehingga tampak lebih kusut. plasmid juga terdenaturasi, namun yang membedakan adalah ukurannya, plasmid mudah untuk renaturasi. plasmid dan RNA akan keluar dari pori-pori membran tapi DNA kromosom masih tetap di dalam sel karena terlalu besar untuk keluar.

KAc (Kalium Acetic) (asam) akan menetralkan NaOH sehingga plasmid dapat terenaturasi

PEMISAHAN DAN PEMEKATAN PLASMID

# jika etanol tidak kering, maka dapat mengganggu kerja enzim dan tidak mengendapkan DNA saat dielektroforesis.

penambahan Na Asetat membuat konsentrasi garam tinggi dan single stranded RNA tidak bisa larut pada keadaan tersebut. etamol absolut dingin --> mengendapkan DNA plasmid dan juga untuk membilas dan mencuci plasmid. bagaimana bisa etanol mempresipitasi DNA? : penambahan garam berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA. ion-ion seperti kation (Na+ Mg2+) akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. jika di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air (ingat air memiliki 2 muatan +pada H dan - pada O). atau dapat dikatakan air punya konstanta dielektrik yang tinggi. fungsi penembahan pelarut organik seperti etanol adalah menurunkan konstanta dielektrik tsb. atau memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi. mungkin ilustrasi di bawah ini dapat membantu membayangkan................

kira2 yang terjadi di dalam tube ......

etanol 70% --> membersihkan lagi dan lebih memekatkan plasmid

hasil setelah dielektroforesis.

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat di dalam inti sel, dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplast. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria, DNA genom kloroplast berasal dari kloroplast. Pada organisme tingkat rendah, DNA penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri) atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus). Kromosom eukariot berbentuk linear sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan mulekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding kromosom.

Isolasi DNA kromosom.

Prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.

Sumber DNA bisa dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 90 oC untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian di presipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air.

Isolasi DNA plasmid

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Isolasi RNA

RNA, terutama mRNA merupakan materi genetik yang mengkode suatu protein. Jumlah populasi mRNA akan lebih banyak dibanding dengan DNA. mRNA eukariot dapat dipisahkan dari DNA dengan menggunakan oligonukleotida dT. Atau RNA total juga dapat di isolasi dari sel dengan menambahkan enzim DNase yang berfungsi untuk mendegradasi DNA

Ekstraksi DNA dari organisme eukaryote (manusia, hewan dan tumbuhan) dilakukan melalui proses penghancuran dinding sel (lysis of cell walls), penghilangan protein dan RNA (cell digestion) dan pengendapan DNA (precipitation of DNA) dan pemanenan. Berbagai teknik ekstraksi DNA telah dikembangkan dari prinsip dasar tersebut, sehingga saat ini muncul berbagai teknik ekstraksi dan purifikasi DNA. Prinsip dasar ekstraksi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen-komponen sel lainnya. Hasil ekstraksi tersebut merupakan tahapan penting untuk langkah berikutnya. Oleh sebab itu dalam pelaksanaannya harus dilakukan dengan baik dan bebas kontaminasi.

Secara kimiawi penghancuran sel dilakukan dengan memanfaatkan senyawa kimia seperti EDTA (ethyllenediamine tetraacetic), dan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate). EDTA berfungsi sebagai perusak sel dengan cara mengikat ion magnesium (ion ini berfungsi untuk mempertahankan integritas sel maupun mempertahankan aktivitas enzim nuclease yang merusak asam nukleat). SDS merupakan sejenis deterjen yang berfungsi merusak membrane sel. Enzim proteinase K dapat digunakan untuk menghancurkan protein. Kotoran akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Kemudian molekul nuleotida (DNA dan RNA) yang telah dipisahkan dibersihkan dari protein yang masih ada dengan menggunakan phenol. Dalam proses ini sebagian kecil RNA juga dapat dibersihkan. Sedangkan choloform digunakan untuk membersihkan sisa-sisa protein dan polisakarida dari larutan. Enzim RNAase digunakan untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh. Pemurnian atau purifikasi DNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan DNA tersebut dengan NaCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan DNA dari larutan, dan mengendapkan DNA sewaktu dicampur dengan ethanol. Proses sentrifugasi dengan kecepatan tinggi akan mengendapkan tepung berwarna putih (DNA) dan menempel di dasar tabung ependorf.

Pada manusia, hanya sel darah putih yang mempunyai inti dan mengandung DNA. Agar lebih efisien, isolasi DNA dilakukan hanya terhadap sel darah putih. Oleh sebab itu sampel darah total (whole blood) yang masih segar langsung dipisahkan menjadi serum, sel darah merah dan sel darah putih (dilapisan buffy coat) dengan teknik sentrifugasi. Setelah disentrifugasi, sampel darah total akan terbagi menjadi tiga lapisan, yaitu lapisan paling atas merupakan serum, lapisan tengah berwarna putih tipis adalah sel darah putih (buffy coat) dan lapisan bawah adalah sel darah merah. Lapisan kedua yang merupakan sel darah putih diambil dengan klinipette.

Isolasi DNA

Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk

hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi

ke generasi selanjutnya (Suryo 2004: 57).

Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang

fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme. DNA genom meliputi gen

danintergen(Campbell dkk.2004:221).

DNA organisme prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk. Organisme

prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedangkan organisme eukariotik mempunyai DNA

berbentuk linier. DNA eukariot terletak dalam inti sel, sedangkan DNA prokariot terletak dalam

sitoplasma (Jusuf 2001:7).

Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson dan Francis Crick. Mereka

memperoleh model DNA dari hasil foto difraksi sinar X yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan

Maurice Wilkins. Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai

ganda (double helix). Untai ganda tersusun dari dua rantai polinukelotida yang terpilin. Kedua

rantai memiliki susunan antiparalel, yaitu satu rantai berorientasi dari ujung 5’ ke 3’sedangkan

yang lain berorientasi ujung 3’ ke 5’. Ujung 5’ merupakan ujung yang berakhir dengan gugus 5-

fosfat dan ujung 3’ berakhir dengan gugus OH. Kedua rantai dihubungkan dengan ikatan

hidrogen yang memghubungkan kedua basa nitrogen (Sadava dkk.2004:218--220).

Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa nitrogen. Komponen gula pada DNA

adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada

pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam,

yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava

dkk.2004:219).

DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan

DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut

adalah:

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup (Sadava

dkk.2004:220).

2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan molekul-

molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk

mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).

DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat ditemukan pada

mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat berbentuk

sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA

kloroplas penting dalam proses fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94). DNA juga dijumpai

pada organisme prokariotik. DNA prokariot mempunyai DNA ekstranuklear yang dinamakan

plasmid. Plasmid merupakan DNA yang tidak terlalu esensial bagi fungsi kehidupan bakteri,

tetapi penting dalam pengaturan siklus hidup dan perumbuhan dalam lokasi hidupnya.

Kebanyakan plasmid adalah sirkular dan tersusun dari beberapa ribu pasangan basa.

Plasmid mempunyai titik ori (origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa

pengaturan dari DNA kromosom. Replikasi dimulai dari titik ori hingga semua plasmid

tereplikasi (Pierce2005:203).

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu

sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran

berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan

berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.

Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada

bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah

yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994: 254).

Sebuah difenilamin (DPA) indikator akan mengkonfirmasi keberadaan DNA. Prosedur ini

melibatkan hidrolisis kimia DNA: ketika dipanaskan (misalnya ≥ 95 ° C) dalam asam, reaksi memerlukan

gula deoksiribosa dan karena itu spesifik untuk DNA. Dengan kondisi tersebut, 2-deoksiribosa akan

dikonversi ke w-hydroxylevulinyl aldehida, yang bereaksi dengan senyawa, difenilamin, untuk

menghasilkan senyawa berwarna biru. Konsentrasi DNA dapat ditentukan mengukur intensitas

absorbansi larutan pada 600 nm dengan spektrofotometer dan membandingkan dengan kurva standar

konsentrasi DNA diketahui. Mengukur intensitas absorbansi larutan DNA pada panjang gelombang 260

nm dan 280 nm digunakan sebagai ukuran kemurnian DNA. DNA menyerap sinar UV pada 260 dan 280

nanometer, dan protein aromatik menyerap sinar UV pada 280 nm, sebuah sampel DNA murni memiliki

rasio 260/280 pada 1,8 dan relatif bebas dari kontaminasi protein. Sebuah persiapan DNA yang

terkontaminasi dengan protein akan memiliki rasio 260/280 lebih rendah dari 1,8.

DNA bisa diukur dengan memotong DNA dengan enzim restriksi, menjalankannya pada gel

agarosa, pewarnaan dengan bromida etidium atau noda yang berbeda dan membandingkan intensitas

DNA dengan penanda DNA konsentrasi dikenal.

Menggunakan teknik Southern blot ini diukur DNA dapat diisolasi dan diperiksa lebih lanjut

menggunakan analisis PCR dan RFLP. Prosedur ini memungkinkan diferensiasi diulang dalam urutan

genom. Ini adalah teknik-teknik yang ilmuwan forensik digunakan untuk perbandingan, identifikasi, dan

analisis.

Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melalui

tahapan-tahapan antara lain: preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA dari ekstrsk sel dan presipitasi DNA.

Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian

tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa polifenol dan

polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA

dilakukan dengan sample buah, maka kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil

yang berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin

sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat menyebabkan rusaknya membrane sel, melalui ikatan

yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membrane membentuk

senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid

memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk

suatu ikatan kimia. KIRSMAN83.2010.isolasi DNA

Elektroforesis

Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik . Medan listrik dialirkan pada suatu medium

yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan

muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang

bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke

kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub

positif. [2] Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta

tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang

terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

Keterangan: F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan

listrik. Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan

memurnikan fragmen DNA

Pita DNA Setelah Elektroforesis dan Diamati di Bawah Sinar UV

Jenis Elektroforesis

Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan

partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan

ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel

dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang

digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut.

Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk

memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji

(sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein.

Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai

gel media.

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader 193). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Isolasi DNA dengan teknik sentrifugasi akan mengendapkan DNA. Supaya hasil isolasi berupa DNA murni yang tidak tercampur dengan molekul-molekul lain maka dalam proses isolasinya dicampurkan berbagai macam larutan. Larutan A berfungsi sebagai resuspensi yaitu penggabunagn kembali pelet yang telah terbentuk dengan larutan yang dicampurkan. Selain itu

larutan A juga berfungsi sebagai buffer dan pengkelat. Pemilihan buffer tersebut dilihat dari kemampuan buffer menghasilhkan arus listrik. Larutan B yang terdiri atas SDS dan NaOH berfungsi sebagai larutan pelisis. NaOH sendiri dapat mendenaturasi protein. Sedangkan larutan C befrungsi untuk merenarutasikan kembali. Etanol 70% yang digunakan dalam proses isolasi berfungsi untuk mengeluarkan endapan garam karena Na+ bermuatan positif dan DNA bermuatan negatif. Larutan ddH2O yang ditambahkan berfungsi agar endapan DNA yang dihasilkan didapat dengan konsentrasi yang cukup tinggi. Larutan di vortex untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Bakteri yang telah diendapkan tersebut kana lisis dengan penambahan larutan buffer. Agar proses lisisnya bakteri sempurna maka larutan dibolak-balik secara halus. Bakteri yang telah lisis ini ditandai dengan munculnya lendir. Ciran DNA yang dihasilkan kemudina dipisahkan dari endapannya. Cairan ini ditambahkan RNase untuk melisiskan RNA supaya hasil yang diisolasi berupa DNA murni.

DNA yang telah diisolasi diuji kualitas dan kuantitasnya melalui elektroforesis dan spektrofotometer. Elektroforesis memisahkan DNA, RNA, dan protein berdasarkan bobot molekul dan muatanya dengan menggunakan media pemisah. DNA bermuatan negatif sehingga pada elektroforesis DNA akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan pergerakan ini tergantung pada ukuran molekul DNA, kerapatan media gel yang dilalui DNA, serta arus listrik yang diberikan untuk bermigrasi molekul DNA. Sebelum proses elektroforesis suspensi DNA dicampur dengan peyangga muatan berwarna loading dye. Penambahan warna ini berfungsi untuk menambah densitas sehingga DNA bearada di bagian bawah sumur, selain itu pewarna ini digunakan untuk memudahkan meletakan contoh DNA ke dalam sumur dan bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat digunakan sebagai tanda migrasi DNA.

DNA hasil elektroforesis yang terlihat di atas lampu UV dapat dilihat pergerakannya. Hasil elektroforesis DNA total menunjukkan adanya pita-pita DNA yang diisolasi dari bakteri Escherichia coli yang kemungkinan adalah DNA plasmid (Gambar 1). Hal ini dapat dilihat dari pergerakannya yang tinggi. Pergerakan DNA di agarose berhubungan dengan besar molekul. Sehingga pergerakan yang tinggi ini menunjukan ukuran DNA yang tidak terlalu besar. Plasmid merupakan DNA sirkuler yang ukurannya relatif kecil. Hal ini menunjukkan bahwa DNA total yang diisolasi mempunyai keutuhan yang tinggi. Akan tetapi pada beberapa kelompok pergerakan DNA tiadak dapat diamati. Kejadian ini dapat terjadi karena kesalahan teknis saat memasukan DNA ke dalam sumur gel agarose. Bisa jadi DNA yang dimasukan tidak masuk benar-benar ke dalam sumur gel sehingga saat elektroforesis DNA tidak bergerak. Selain itu kesalahan juga dapat terjadi karena DNA yang telah masuk ke dalam sumur tersedot kembali masuk ke dalam pipet mikro. Sehingga sumur tidak berisi DNA.

Kuantifikasi DNA total dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm menunjukkan bahwa rendemen isolasi DNA konsentrasinya berkisar antara 19610 ng/ µL dan 19800 ng/ µL tiap 1500 µL bahan biakan E. coli. Tingkat kemurnian DNA plasmid yang diisolasi dilihat dari nilai absorban pada panjang gelombang 260 nm dibadi nilai absorban pada panjang gelombang 280 nm. Kemurnian DNA plasmid kelompok 8 menunjukan hasil sebesar 1,115. Nilai ini belim termasuk nilai DNA murni karena isolasi DNA murni nilainya lebih besar atau sama dengan 1,8.

1.1 Metode Kerja

Isolasi DNA TanamanAlat :

mikrovivet berbagai ukuran

tabung 1,5 ml

tips mikropipet berbagai ukuran

saringan

gelas kimia

sendok

penangas

vorteks

mini sentrifuga

blender / lumping

Bahan :

buffer ekstraksi (100 mM tris- HCl, Ph 8; 50 mM EDTA; 500 mM NaCl, CTAB 2%)

Potasium asetat 5 M

SDS 20%

Kloroform : Isoamil alcohol (24:1)

Alkohol 100% (pa)

TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8)

Buah strowberi

CTAB 2%

Elektoforesis DNARange pemisahan molekul DNA dengan agarose gel

Agarose % Seaparsi optimal dari

molekul DNA (Kb)

0,3 5,0-60

0,6 1,0-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7,0

1,2 0,4-6,0

1,5 0,2-4,0

2,0 0,1-3,0

Bahan kimia :

Buffer TAE 10 X (400 mM Tris asetat, 10 mM EDTA Ph 8 )

Eidium bromida

Loading buffer

DNA Marker

Agarose

Alat dan bahan :

Elektroforesis unit (meliputi comb dan tray)

Power suply

Mikropipet digital

Transilluminator UV