Pre Analitik dan Persiapan Pemeriksaan RT PCR SARS

CoV-2

• NAMA : EROS TRESNAWATI

• JENIS KELAMIN : PEREMPUAN

• TANGGAL LAHIR : KUNINGAN, 1 APRIL 1970

• ALAMAT RUMAH :PONDOK PAKULONAN BLOK O4 NO.22 PAKUALAM SERPONG UTARA TANGERANG SELATAN BANTEN

• TEMPATKERJA : UPT LABORATORIUM KESEHATAN DAERAH KOTA TANGERANG

• HP : 085717067938• EMAIL : tresnawatieros@yahoo.co.id

BIODATA

Persiapan APD• Masker N95• S a r u n g t a n g a n t i d a k

bertepung• P e n g a m a n m a t a

(goggles) atau pelindung wajah (face shiled)

• Hazmat• Penutup kepala (cover

head)• Penutup sepatu (cover

shoes)• Apron

Alur Kerja Pengoperasian Alat TCM1. Cek Kondisi Laboratorium dan Alat

Cek Kelembaban ruangan (berkisar 20%–85%)

C e k S u h u r u a n g a n (berkisar 15°C–30°C)

Cek kondisi external alat

N y a l a k a n a l a t d a n computer dengan menekan tombol power.

2. Dekontaminasi Area Kerja

Siapkan larutan bleach 0.5%, akuades, dan alcohol 70%

Bersihkan area kerja dengan tisu yang telah dibasahi dengan bleach 0.5% dan diamkan selama 15 menit

Bersihkan area kerja dengan akuades dan keringkan dengan alcohol 70%

3. Preparasi sampel dan Cartridge Xpert Xpress SARS-CoV-2

Dekontaminasi dan persiapkan BSC.

K e l u a r k a n c a r t r i d g e d a r i refrigerator dan inkubasi di suhu ruang selama 15 menit sebelum digunakan.

Siapkan VTM yang sudah berisi specimen.

Masukkan VTM, cartridge, dan pipet transfer ke dalam BSC.

Beri identitas pada sisi kanan atau kiri cartridge apabila diperlukan

4. Penyimpanan & Penanganan Katrid • Simpan test kits pada suhu 2-28ºC.

• Satu katrid hanya dapat digunakan untuk memproses satu pemeriksaan.

• Jangan membuka penutup katrid hingga siap untuk digunakan. • Jangan mengkocok katrid.

• Hindari kontaminasi silang selama proses penanganan sampel.

• Segera masukkan katrid yang sudah berisi spesimen ke dalam mesin TCM ( m a k s i m a l 3 0 m e n i t s e t e l a h menambahkan sampel ke dalam cartridge).

Stabilitas Penyimpanan Spesimen

Suhu Penyimpanan Durasi Maksimal Penyimpanan

15-30ºC

2-8ºC

8 jam

7 Hari

Katrid tidak boleh digunakan apabila:

• Permukaan telah basah dan kotor

• Segel penutup (Lid) rusak

• Bagian PCR filling tube (ekor) rusak

• Terbalik dan/atau terjatuh (sebelum atau setelah berisi spesimen)

• Sudah pernah digunakan • Sudah kadaluarsa • Selalu perlakukan cartridge yang telah berisi spesimen sebagai bahan infeksius.

Prosedur Pemeriksaan

1.Siapkan VTM yang sudah berisi spesimen 2.Siapkan katrid dan pipet transfer. 3.Beri identitas pada sisi kanan atau kiri katrid. 4.Buka penutup cartridge. 5.Homogenisasikan VTM dengan cara meng-invert / membolak-balik VTM sebanyak 5 kali.

Prosedur Pemeriksaan

Prosedur Pemeriksaan

6.Pindahkan spesimen dari dalam VTM sesuai batas yang ditentukan pada pipet transfer 7.Masukkan pipet ke dalam katrid, lalu keluarkan sampel secara perlahan, hindari terbentuknya gelembung udara 8.Tutup rapat katrid 9.Segera masukkan katrid yang sudah berisi spesimen ke d a l a m m e s i n T C M ( m a k s i m a l 3 0 m e n i t s e t e l a h menambahkan spesimen ke dalam katrid).

PANDUAN PENGGUNAAN REAL TIME PCR QIAGEN

1. Persiapan Ektraksi

2. Pembuatan Master mix/ PCR Mix

3. Ekstraksi dengan Qiacube

4. Pembacaan dengan RT PCR

INAKTIVASI VIRUS DAN EKSTRAKSI VIRUS RNA MENGGUNAKAN QIAAMP VIRAL RNA MINI KIT

Bahan-bahan yang digunakan:

1. Kit ekstraksi

2. Sampel: Swab Nasopharyng dan Oropharyng3. Ethanol absolute

Penyimpanan Kit:Disimpan pada suhu ruang (15–25°C). Preparasi reagen:• Tambahkan 310µl Buffer AVE ke

dalam tabung berisi 310µg lyophilized carrier RNA untuk mendapatkan konsentrasi 1 µg/µl. Kemudian bagi ke dalam 3 tabung, dan simpan pada -20⁰ C.

• Tambahkan Ethanol Absolute ke dalam botol AW1 (130 ml) dan AW2 (160 ml) sesuai dengan yang tertera pada masing-masing botol.

Persiapan Ekstraksi

•Campurkan buffer AVL dan Carrier RNA sesuai tabel dibawah ini: (sesuaikan dengan jumlah sampel yang akan dikerjakan)

•Pipet 560 µl (buffer AVL + carrier RNA) kedalam tube 2 ml steril untuk per sampel.

•Tambahkan 140 µl sampel (vtm yang sudah mengandung sampel swab), vortex selama 15 detik.

•Inkubasi pada suhu ruang selama 15 menit, sentrifugasi sebentar (spin down).

•Pindahkan semua lysat (700 µl) tersebut kedalam tube 2 ml CB/RB, kemudian letakan tube tersebut kedalam rak sampel pada mesin QIAcube.

Persiapan sebelum mengerjakan PCR: 1. Hitung komposisi untuk membuat PCR mix sesuai dengan jumlah sampel yang akan dikerjakan. 2. Siapkan Kontrol Positif, cairkan kontrol positif, kemudian vortex 10 detik dan spindown 10 detik

Catatan: untuk menghitung komposisi PCR mix, jangan lupa untuk menambahkan kontrol positif dan non template control (ntc)

Pembuatan PCR Mix

a. Cairkan Universal Probes Reaction Mix, primer-probe mix, RNAse Free water dan template RNA (bila disimpan).

b. Buat PCR Mix dalam tabung microsentrifuge 1.5ml, dengan komposisi sesuai dengan tabel di bawah:

Step # Reagent Vol. of Reagent Added per Reaction

1 RNase Free Water N x 8.4 μL 2 Universal Probes Reaction Mix N x 12.5 μL 3 Primers – Probes Mix N x 1.0 μL 4 Reverse Transcriptase N x 0.5 μL 5 Internal Control Template N x 0.1 μL Total Volume N x 22.5 μL

c. Campur PCR mix sesuai jumlah sampel, kemudian distribusikan ke dalam tabung pcrl masing-masing 22.5 μl.

d. Tambahkan 2.5 μl template RNA ke dalam tabung PCR yang sudah berisi PCR Mix.

e. Baca di mesin PCR