Aplikasi PemeriksaanRT-PCR SARS CoV 2

Basti AndriyokoPokja MolekulerPDS PatKLIn

Image from:WHO web

Pokok Bahasan

Pengambilan spesimen: Swab, Media Transport, Prosedur

BSL : Risk group, Design, Sarana, APD

Real time PCR: Alat, Reagen, interpretasi

Pengambilan spesimenSwab: Plastic applicator stick,

Nylon,dacron,rayon tip

Kualitas Swab mempengaruhi hasil PCRHindari penggunaan material organik

Nasofaring swab

Cek sertifikasi : FDA, CE, ISO

orofaring swab

Media Transport UTM/VTM : Paten

Buatan sendirihttps://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/Viral-Transport-Medium.pdfhttps://www.who.int/ihr/publications/Annex8.pdf?ua=1

ITM (Inactivated Transport Media)Inactivate microbial viability à Mengurangi potensi biohazardPreserved RNA and DNA in the sample

Lain-lain: PBS / Saline steril

Bila Paten Cek sertifikasi : FDA, CE, ISO

https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/downloads/Viral-Transport-Medium.pdfhttps://www.who.int/ihr/publications/Annex8.pdf%3Fua=1

Safe

ty p

roce

dure

s

APD: aerosol-generating procedures

WHO.Laboratory testing for 2019 Novel Coronavirus in suspected human cases.2020

Apus nasofaring

Apus orofaring

Prosedur Pengambilan spesimen

To reduce or eliminate exposure of lab workers, other persons, and the outside environment to potentially hazardous agents.

Stan

dardGood laboratory practices

and technique

Three elements of safe containment of microorganisms

Safety equipment Facility design

• BSC• Eyewash / shower• Fire extinguisher• First aid kit

• Control access to the laboratory• Wash hands• No food / drink• Wear PPE à risk assessment• Disinfect work areas before & after use• Dispose all solid waste material in a

biohazard bag and autoclave it• Treat all microorganisms as potential

pathogens• etc.

• BSL

U.S. Department of Health and Human Services,CDC,NIH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 2009

Principles of Biosafety (containment)

Classified SARS-CoV-2 as a risk group 3 biological agentRisk Group Classification

Containment Levels

Due to the ongoing public health emergency, limited diagnostic work such as non-propagative diagnostic laboratory work (for example, sequencing, nucleic acid amplification test [NAAT]) can be carried out at containment level 2 (Biosafety Level 2-BSL2).

www.hsa.ie

https://www.hsa.ie/eng/topics/biological_agents/biological_agents_introduction/classification_of_biological_agents/interim_statement_covid_19_virus.pdf

BSL

2

www.CDC.Gov/24-7WHO. Laboratory biosafety manual. 2004

Ventilation system• Mechanical ventilation systems that

provide an inward flow of air without recirculation to spaces outside the laboratory

Sarana yg perlu diperhatikan terkaitSARS CoV 2:• BSC : Minimal Class II A• Autoclave : pengolahan limbah• Untuk pengaturan udara à Portable

Hepafilter

à risk assessment

http://www.cdc.gov/24-7

PCR Lab

Rachel Lee. Molecular Laboratory Design. 2015

PCR in small Lab

• In a small lab the entire procedure of PCR can be done in a single room.

• The areas may be demarcated or physically separated by creating partitions.

• Whether PCR is done in separate rooms or separate areas in a single room the flow of work should remain uni-directional.

http://grcpk.com/wp-content/uploads/2014/10/12.-Setting-up-PCR-Lab.pdf

Sarana yg perlu diperhatikan

Portable Hepafilter/plasma ion generator à Untuk pengaturan udara biladiperlukan

BSC : Minimal Class II A Autoclave : pengolahan limbah

Semua harus terpelihara dan terkalibrasi

Memilih Portable Hepafilter• Target ACH (Air Change per Hour): 6-12• Hitung Berapa m3/jam atau CFM (cubic feet per minute) untuk

menentukanPanjang ruang x Lebar ruang x Tinggi ruang x target ACH = m3/jam

CFM = m3/jam x 0,588Contoh:

4m x 4m x 3,5m x 10 ACH = 560 m3/jamCFM = 560 x 0,588 = 329 CFM

à Cari alat portable hepafilter yang memiliki cakupan spesifikasi berkisar di angka 560 m3/jam atau 329 CFM

APD saat proses PCR risk group 3

• Saat penyiapan master mixDidalam laminar flow lebih baikGunakan APD standar: Jas lab, sarung tangan, masker bedah

• Saat pengolahan sampelDilakukan di dalam BSCGunakan APD : minimal menggunakan N95, Gown, Sarung tangan, face shield

• Saat PCRSampel sudah dalam bentuk RNA à amanGunakan APD standar: Jas lab, sarung tangan, masker bedah

Pastikan ganti APD setiap pindah ruangan

Alat PCR Hal hal yang harus diperhatikan: • Alat PCR à Real time PCR• Open system atau close system

à reagen bantuan baiknya open system• Alat PCR Single channel atau multi channel

à sebaiknya multi channel, karena reagensudah banyak yang multiplex

• Consumableà stok lancar atau tidak

• Load pemeriksaan

Alat harus diujikan terlebih dahulu

Alat ekstraksiotomatis• Umumnya close system• Consumable• Lama ekstraksi?• Masalah bila kualitas

sampel/vtm kurang baik

Reagen RT-PCR SARS CoV 2• Menggunakan minimal 2 target gen spesifik untuk SARS CoV 2 yang

berbeda (multiplex) + kontrol + reagen ekstraksi (manual)

Target GenE (Envelope) EN (Nucleocapsid) N, N1,N2Orf (open reading frame) Orf1, orf1ab,

orf1a, orf1b, RdRp

Gen E umumnya digunakan untuk skriningsedangkan gen N dan orf untuk konfirmasi.

KontrolPositifNegatifKontrol ekstraksi

Reagen harus diujikan terlebih dahulu

Relative positions of amplicon targets on the SARS coronavirus and the 2019 novel coronavirus genomeE: envelope protein gene; M: membrane protein gene; N: nucleocapsid protein gene; ORF: open reading frame; RdRp: RNA-dependent RNA polymerase gene; S: spike protein gene.

Corman VM et al. Euro Surveill. 2020 Jan 23; 25(3): 2000045.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6988269/

Contoh daftar alat/institusi lainnya dapat dilihatpada link https://www.fda.gov/emergency-use-authorization#2019-ncov

Alat/Perusahaan/Institusi GenAbbott m2000rt N, RdRpCDC N1,N2Cepheid GeneXpert E, N2Roche Cobas 6800/8800 E, orf1Allplex 2019-nCoV Seegene E, RrRp, NnCov Real Time Detection SD Biosensor E, RdRp

Interpretasi

• Atau sesuai petunjuk Kit• Beberapa Kit: 1 target terdeteksi (kecuali gen E saja) : Positif

Hasil InterpretasiSeluruh target gen terdeteksi Positif SARS CoV 2Seluruh target gen tidak terdeteksi Negatif SARS CoV 2Tidak semua target gen terdeteksi, contoh: Dari 2 target hanya 1 gen yang terdeteksiDari 3 target hanya 1 atau 2 gen yang terdeteksi

Probable/Inconclusive

Cut off untuk seluruh target:

Saat interpretasi pastikan untuk melihat grafik PCR dan riwayat pasien

InterpretasiInterpretasi Ket

Positif SARS CoV 2 Sertakan nilai CT, dapat menjadi panduan saat follow upwaktu pengambilan sampel follow up 7-10 hari, setelah hasilnegatif dapat diulang segera setelah hasil keluar.

Negatif SARS CoV 2 Ulang bila perlu sesuai status pasien

Probable/Inconclusive -Pasien baru: Ulang dengan sampel baru-Pada pasien FU menunjukkan load virus sedikit(tetap dianggap positif) ulang dengan sampel baru sampai duakali negatif.Penyebab inconclusive: Load virus sedikit, masalah di reaksi PCR (contoh:Penguapan), mutasi.

CT value

Semakin tinggi nilai CT à semakin rendah load kumanDengan cut off 40 siklus: Semakin mendekati 40 à semakin rendah load kuman

GeneXpert Xpert Xpress SARS-CoV-2Proses pengolahan specimen dilakukan di dalam BSC : 1. Pastikan tutup VTM rapat.

Homogenisasi dengan membolak balikperlahan VTM (+ 5 kali).

2. Transfer sampel dengan menggunakanpipet yang telah disediakanàmasukkan ke dalam catridge.

3. Tutup catridge dengan rapat.4. Swab catridge dengan alkohol swab

(kecuali bagian segitiga dibelakang), sebelum keluar dari BSC.

Patients in convalescence should also be regularly tested for infectivity assessment, and all the discharged patients should be homequarantined for at least 14 days.

Saran

• Gunakan ITM à mengurangi risiko biohazard• Gunakan BSC minimal class II A à Prinsip containment• Gunakan APD sesuai risk assessment• Gunakan hepafilter portable atau plasma generator untuk mengatur

aliran udara, mengurangi kontaminasi dan risiko biohazard.• Kerjasama dengan instansi lain, jejaring (terkait sarana, SDM, dll)Pastikan : Aman untuk petugas yang bekerja di dalam dan aman untukorang yang ada di luar ruangan.

Pustaka• Risk group classification SARS CoV 2:

https://www.hsa.ie/eng/topics/biological_agents/biological_agents_introduction/classification_of_biological_agents/interim_statement_covid_19_virus.pdf

• Molecular Laboratory Design: https://www.aphl.org/programs/newborn_screening/Documents/2015_Molecular-Workshop/Molecular-Laboratory-Design-QAQC-Considerations.pdf

https://www.hsa.ie/eng/topics/biological_agents/biological_agents_introduction/classification_of_biological_agents/interim_statement_covid_19_virus.pdfhttps://www.aphl.org/programs/newborn_screening/Documents/2015_Molecular-Workshop/Molecular-Laboratory-Design-QAQC-Considerations.pdf

TERIMA KASIH