PENGEMBANGAN METODE DETEKSI HUMAN RHINOVIRUS (HRV) … · 2020. 7. 4. · 05/07/2020 8 TES...
Transcript of PENGEMBANGAN METODE DETEKSI HUMAN RHINOVIRUS (HRV) … · 2020. 7. 4. · 05/07/2020 8 TES...
05/07/2020
1
PERAN AHLI TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK
(ATLM) DALAM TES MOLEKULER
VIRUS SARS CoV-2
Biografi
Nama : ASRYADIN, S.ST., M.Si
Agama : Islam
Riwayat Tempat Tugas : - ATLM Puskesmas Asakota (2006-2009)
- ATLM Seksie PL Dikes Kota Bima (2009-2015)
- Kabag. QC CV. Sinar Mas Lestari (2009-present)
- ATLM RS PKU Muhammadyah Bima (2010)
- ATLM UPT. Labkesda Kota Bima (2015-present)
- ATLM RSKB Jatiwinangun Purwokerto (2016-2018)
Riwayat Pendidikan : - SMAK Mataram (2002)
- DIII Analis Kesehatan Poltekkes KEMENKES Mataram (2005)
- DIV Analis Kesehatan Poltekkes KEMENKES Surabaya (2012)
- S2 Mikrobiologi (Virologi dan Molekuler) Universitas Jenderal
Soedirman Purwokerto Jawa Tengah (2018)
Riwayat Organisasi : - Bidang Pelayanan Kesehatan BSMI DPC Kota Bima, periode
2014-2019 dan 2019-2023.
- Wakil Ketua Patelki DPC Kota Bima, Periode 2016-2020
- Ketua Patelki DPC Kota Bima, Periode 2020-2024.
Email : [email protected]
05/07/2020
2
Overview
Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019
Metode Diagnosa
MIKROSKOPIS
KULTIVASI
BIOTESTING
METODE IMUNOLOGIK
AL
METODE BIOKEMIKAL
METODE MOLEKULER
Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019
05/07/2020
3
Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019
05/07/2020
4
Ahli Teknologi Laboratorium Medik (ATLM)
Tenaga Keteknisian Medis yang bekerja pada sarana
kesehatan (laboratorium) yang melaksanakan
pelayanan pemeriksaan, pengukuran, penetapan, dan
pengujian terhadap bahan yang berasal dari manusia
atau bahan bukan berasal dari manusia untuk
penentuan jenis penyakit, penyebab penyakit, kondisi
kesehatan atau faktor-faktor yang dapat berpengaruh
pada kesehatan perorangan dan masyarakat (UU
No.36 tahun 20 14)
Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019
ATLM dalam One PATELKI COMBAT COVID-19
1. Seruan Internal
2. Advokasi Kebijakan
3. Tetap Melayani secara
Profesional & Ikhlas
Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019
05/07/2020
5
Pelayanan ATLM = Profesional
UU No 36 TAHUN 2014 pasal 11Tenaga Kesehatan Lain
1.Radiografer2.Elektromedis3.Fisikawan Medik4.Radioterapi5.Ortotis Prostetis6.Teknisi Gigi7.Tenaga Bidan
7. Apoteker8. Teknisi Farmasi9. Tenaga Prom Kes10. Sanitasi11. Nutrisionis12. Fisioterapis13. Okupasi Terapis
15. Terapis Wicara16. Akupunktur17. Rekam Medis18. TTD19. Penata Anesthesi20. Psikolog
21. ATLM
05/07/2020
6
Ahli Teknologi Laboratorium Medis
Mempunyai :
1. Body of knowledge2. Bersifat altruistik3. Memiliki kompetensi4. Etika profesi
Peran ATLM dalam Uji Molekuler SARS CoV-2
05/07/2020
7
Peran ATLM dalam Uji Molekuler SARS CoV-2
Pemeriksaan laboratorium
Molekuler
Peran Serta ATLM Melawan COVID-19
Sampling darah untuk pasien COVID-19,
Beberapa dilatih melakukan sampling swab
nasopharing
Penangan Spesimen COVID-19
Pengiriman Spesimen COVID-19
Pemeriksaan Baik di Lab maupun diluar Lab
terkait COVID-19
Memilih reagen terkait COVID-19 dilab masing
masing
05/07/2020
8
TES MOLEKULER VIRUS SARS CoV-2
Asryadin/PNTP : A-0040/09/2019
SARS CoV-2
Single stranded RNA virus
Genome terdiri dari ≥ 27.000 basa
Zoonosis
Tipe virus Alfa dan Beta menyebabkan
penyakit
pada manusia
SARS-CoV-2 memiliki 96% kesamaan asam
nukleat dengan coronavirus pada kelelawar
(RaTG13)
Perlman, et al., Nat Rev Microbiol 7, 439–450 (2009)
Zhang et al., Current Biology 30, 1346-1351 (2020)
05/07/2020
9
Metode Pemeriksaan
Rapid Test
Molecular test : Polymerase Chain Reaction
Immunofluorescence Assay
Test Serologi
Kultur virus
05/07/2020
10
Proporsi Kesalahan Pemeriksaan Laboratorium
Post Analitik(18-47% )
Analitik(7-13%)
Pre Analitik(46-68%)
Plebani, et al.,Clin Chem Lab Med 2006: 44(6): 750-59
Sensitifitas dan Spesifisitas Pemeriksaan
Sensitifitas dan spesifisitas deteksi virus dalam spesimendipengaruhi :
• Jenis pemeriksaan• Pengambilan spesimen sejak onset• Kualitas spesimen• Jenis spesimen• Penanganan spesimen• Waktu dari pengambilan spesimen hingga pemeriksaan
05/07/2020
11
Jenis Spesimen
Jenis Spesimen
05/07/2020
12
Viral Transport Medium (VTM)
• Steril
• Larutan Isotonik
• Mengandung Protein, Mengandung Antibiotik
• Buffer pH, • Indikator (Phenol Red)*
Contoh VTM :
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), Virocult, MEM, UTM, dll
• Di Simpan dalam Freezer -20oC (Dalam kondisi Beku,
VTM berwarna Kuning = Normal)
• Dicairkan terlebih dahulu jika akan digunakan
• Hindari Beku-Cair (FrezzeThaw) VTM Rusak
• Tidak Bisa digunakan bila berwarna kuning keruh
Alat/Bahan Pengambilan Spesimen
05/07/2020
13
Pengambilan Spesimen Swab
Yang perlu diperhatikan:• Putuskan tangkai plastik di daerah mulut cryotube agar cryotube
dapat ditutup dengan rapat
Pengambilan Spesimen Swab
• Cryotube kemudian dililit parafilm.• Cryotube yang sudah berisi swab dibungkus dalam tissue bersih
lalu dimasukan ke dalam plastik klip• Simpan dalam suhu 4-8°C sebelum dikirim.
Jangan dibekukan dalam Freezer.
05/07/2020
14
Pengepakan dan Pengiriman Spesimen
• Semua spesimen dikemas untukmencegah kerusakan dantumpahan
• Spesimen pasien harus dilakukantatalaksana sebagai UN3373, "Substansi Biologis, Kategori B", ketika akandiangkut/ditransportasikandengan tujuan diagnostik atauinvestigasi
• System yang digunakan adalahdengan menggunakan tiga lapis (Three Layer Packaging) sesuai dengan pedoman WHO danInternational Air Transport Association (IATA).
Pengepakan dan Pengiriman Spesimen
Masing-masing spesimen dimasukkan ke dalam plastik klip berisi tissue sebagaiabsorban secara terpisah (per pasien/spesimen)
05/07/2020
15
Uji Molekuler SARS CoV-2
WHO :
1. IN AREA WITH NO KNOWN COVID -19 VIRUS CIRCULATION
- Hasil PCR positive untuk minimal 2 target gen yang berbeda , dimana salah satu
spesifik untuk COVID 19 atau
- Hasil PCR positive untuk adanya beta corona virus yang kemudian diidentifikasi
dengan sequencing
2. IN AREA WITH ESTABLISHED COVID-19 VIRUS CIRCULATION
- Screening of a single discriminatory target is considered sufficient
Perbedaan Jenis Gen Target Yang Digunakan
05/07/2020
16
Uji Molekuler SARS CoV-2
Mendeteksi antigen atau materi genetik
virus
Sensitif dan spesifik
Cepat
Memerlukan tahapan persiapan sampel
Memerlukan peralatan khusus
Memerlukan fasilitas lab khusus BSL2
Workflow Uji Molekuler SARS CoV-2
RNAIsolation
PCRReaction
DataAnalysis
05/07/2020
17
Ekstraksi RNA
Mengisolasi asam nukleat dari berbagai
material selular di dalam spesimen
Dilakukan di BSL II
Menghilangkan materialnpenghambat yang
tidak diperlukan dalam reaksi PCR
Inaktivasi virus (lysis buffer) HARUS
dilakukan di dalam BSC (Biosafety Cabinet)
II
PCR (Polimerase Chain Reaction)
In 1983 PCR ditemukan oleh Kary Mullis dari Cetus Corporation
PCRMetode yang cepat dan sederhana, untuk memperbanyak urutan
DNA spesifik yang diinginkan tanpa membutuhkan sel bakteri
PCR dapat digunakan untuk amplifikasi DNA maupun RNA (cDNA)
Tahapan utama PCR :
1. Denaturasi (Suhu 95°C)
2. Annealing (Suhu 50-60°C), sesuai hasil optimasi
3. Ekstensi/Elongasi (Suhu 72°C)
05/07/2020
18
Jenis – Jenis PCR
PCR
Konvensional
Real Time (Quantitative)
Reverse Transcription
(RT-PCR)
Konvensional
Real Time (Quantitative)
DNA Replication VS PCR
• PCR is a laboratory version of DNA replication in cells
• The laboratory version is commonly called “in vitro” since it occurs in a test tube while “in vivo” signifies occurring in a living cell.
05/07/2020
19
Komponen PCR
1. Primer (oligonukleotida)
2. DNA Template
3. Water
4. Buffer mengandung ion Mg
5. Enzim (DNA Polymerase) termostabil
6. Buffer
7. Ion Mg2+
Komponen PCR
05/07/2020
20
Tahapan Utama PCR
Tahapan Utama PCR
05/07/2020
21
Tahapan Utama PCR
Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)
• Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction, bukan realtime-PCR
• Amplifikasi DNA dengan template RNA
• Terdiri dari 2 tahap:
RT : Reverse Transcription cDNA Synthesis
PCR : Amplifikasi DNA
05/07/2020
22
1. Primer (oligonukleotida)
2. RNA Template
3. Water
4. Buffer mengandung ion Mg
5. Enzim DNA Polymerase termostabil
6. Enzim Reverse Transcriptase
7. Buffer
8. Ion Mg2+
Komponen RT-PCR
Tahapan RT-PCR
1. Reverse Transcripsi RNA
2. Amplifikasi PCR
05/07/2020
23
Tahapan PCR / RT-PCR
Real Time PCR / Quantitative PCR (qPCR)
It is a technique used to monitor the
progress of a PCR reaction in real-time
It is based on the detection of the
fluorescence produced
a relatively small amount of PCR product
can be quantified
Faster than normal PCR
It gives a look in to the reaction that is
help to decide which reactions have
worked well and which have failed
05/07/2020
24
Komponen Real Time PCR / Quantitative PCR (qPCR)
1. Primer (oligonukleotida)
2. Probe
3. DNA Template
4. Water
5. Buffer mengandung ion Mg
6. Enzim (DNA Polymerase) termostabil
7. Buffer
8. Ion Mg2+
Sekuen oligonukleotida pendek yang didesain untuk berhibridisasi dengan sekuen target
Probe qPCR
• Kelebihan TaqMan Probe dibandingkan dengan Sybr green :Menempel pada target yang lebih spesifik
Sybr Green Probe TaqMan Probe
05/07/2020
25
Multiplex PCR In One Step RT-PCR
Contoh Platform Kerja qPCR
44 siklus
2. Optimasi pasangan primer dan probe
Komponen qRT-PCR:
• Primer (40µM)
• Probe (10µM)
• DNA Template
• Reagen kit
Tahapan Suhu Waktu
Reverse transkripsi
Predenaturasi
Denaturasi
Annealing dan ekstensi
50oC
95oC
95oC
• 50oC
• 55oC
• 60oC
30 menit
2 menit
15 detik
1 menit
Sampel dikatakan positif apabila nilai Ct 18-38
05/07/2020
26
Real Time PCR Workflow
Real Time PCR Workflow
05/07/2020
27
Threshold
Threshold berada diatas baseline sinyal fluorescence. Sinyal yangterdeteksi diatas threshold adalah sinyal yang digunakan dalam menentukannilai threshold cycle (Ct).
Pengaturan threshold manual diletakkan diatas noise atau background kurva amplifikasi
Validasi Hasil
1. Pemeriksaan RP gene yang merupakan gen yang terdapat
di dalam sel epitel manusia
2. Hasil RP positif menunjukkan bahwa proses ekstraksi asam
nukleat dan proses pengambilan spesimen telah dilakukan
dengan benar
05/07/2020
28
Fasilitas Laboratorium PCR
Fasilitas Laboratorium PCR
05/07/2020
29
Lay out untuk Lab PCR
Setiap area memiliki alat lab, reagen, bahan habis pakai, dan APDmasing-masing, TIDAK untuk dipindahkan ke ruangan lain
Pemilihan Reagensia PCR
Dipilih berdasarkan kebutuhan
Perhatikan spesifitas dan sensitivitas reagensia (terutama bila primer
probe dari manufacture)
Sesuaikan chemistry reagensia dengan alat PCR yang ada di lab
05/07/2020
30
Refference
Lorenz, T.C. 2012. Polymerase Chain Reaction : Basic protocol Plus Troubleshooting
and Optimization Strategy. Journal of Visualized Experiments, pp. 1-15.Marantina
SS., 2008. Deteksi Fragmen Produk PCR. FMIPA UI, pp. 30-46
Thermofisher, 2016. Real-time PCR handbook. Appliedbiosystem, pp. 2-68.
Viljoen, G.J., L.H. Nel and J.R. Crowther. 2005. Molecular Diagnostic PCR
Handbook. Springer, pp. 1-260.
Terimakasih
Evaluasi Narasumber
http://bit.ly/kuisionerPNTP