PRAKTIKUM VI

A. JUDUL PRAKTIKUM

Perhitungan Bakteri Coliform Pada Air Degan Metode Most Probable Number

(Mpn)

B. TUJUAN PRAKTIKUM

Untuk mengetahui jumlah bakteri coliform bakteri air dengan

mrnggunakan uji penduga metode most probable

C. DASAR TEORI

Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan

pada cawan petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui pengenceran,

perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara

kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji

pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji

kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform

masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji ini

mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel. Metode perhitungan MPN

sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung jumlah bakteri yang

terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter. Kedua jenis

bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan pertumbuhan dan

produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam mengikat N2 dari

udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Dwidjoseputro, 1994).

Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit

tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam

sampel. Namun  pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan

jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per

gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap

nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi

(Dwidjoseputro, 1994).

Bakteri coliform adalah golongan bakteri intestinal, yaitu hidup dalam

saluran pencernaan manusia. Bakteri coliform adalah bakteri indikator

keberadaan bakteri patogenik lain. Lebih tepatnya, sebenarnya, bakteri coliform

fecal adalah bakteri indikator adanya pencemaran bakteri patogen. Penentuan

coliform fecal menjadi indikator pencemaran dikarenakan jumlah koloninya

pasti berkorelasi positif dengan keberadaan bakteri patogen. Selain itu,

mendeteksi coliform jauh lebih murah, cepat, dan sederhana daripada

mendeteksi bakteri patogenik lain (Dwidjoseputro, 1994).

Salah satu anggota kelompok coliform adalah E.coli.

Karena E.coli adalah bakteri coliform yang ada pada kotoran manusia,

maka E.coli sering disebut sebagai coliform fekal. Pengujian coliform jauh lebih

cepat jika dibandingkan dengan uji E.coli karena hanya memerlukan uji penduga

yang merupakan tahap pertama uji E.coli (Dwidjoseputro, 1994).

Istilah bakteri indikator sanitasi dikenal dalam bidang mikrobiologi

pangan. Bakteri indikator sanitasi adalah bakteri yang keberadannya dalam

pangan menunjukkan bahwa air atau makanan tersebut pernah tercemar oleh

kotoran manusia yang mengingat banyaknya jumlah mikroorganisme ini, maka

perlu dilakukan suatu uji pemeriksaan terhadap bahan pangan tersebut agar

aman dikonsumsi. Bakteri-bakteri indikator sanitasi umumnya adalah bakteri

yang lazim terdapat dan hidup pada usus manusia sehingga dengan adanya

bakteri tersebut pada air atau makanan dapat menunjukkan bahwa dalam satu

atau lebih tahap pengolahan air atau makanan pernah mengalami kontak dengan

kotoran yang berasal dari usus manusia dan oleh sebab itu kemungkinan terdapat

bakteri patogen lain yang berbahaya. Ada tiga jenis bakteri yang dapat

digunakan untuk menunjukkan adanya masalah sanitasi, yaitu Escherichia coli,

kelompok Streptococcus (Enterococcus) fecal, dan Clostridium perfringens

(Hastowo, 1992).

Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan

untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam

cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar,

ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara

perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari

suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan

ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung

hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih

hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu :

perhitungan pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui

pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan

kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo, 1992).

Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan

pangan, meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu

makanan, uji kualitatif bakteri patogen untuk menenetukan tingkat keamanan

dan uji indikator untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian

yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai

faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan (Hastowo, 1992).

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi

air dalam praktikum digunakan kelompok Coliform sebagai indikator.

Kelompok Coliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik

fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Coliform

memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48

jam pada suhu 35°C (Hastowo, 1992).

Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode

cawan yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan

berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba

setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat

dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham

(Lay, 1992).

Pendekatan lain untuk enumerasi bakteri hidup adalah dengan metode

MPN. Metode MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan).

Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada

air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan

kontaminan utama sumber air minum. Ciri-ciri utamanya yaitu bakteri gram

negatif, batang  pendek, tidak membentuk spora, memfermentasi laktosa

menjadi asam dan  gas yang dideteksi dalam waktu 24 jam inkubasi pada 37º C.

Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi

untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika

dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri. Media pada tabung adalah  Lactose Broth 

yang diberi indikator perubahan pH dan ditambah tabung durham. Pemberian

sampel pada tiap seri tabung berbeda-beda. Untuk sampel sebanyak 10 ml

ditumbuhkan pada media LBDS (Lactose Broth Double Stegth) yang memiliki

komposisi  Beef  extract  (3 gr),  peptone  (5 gr),  lactose  (10 gr) dan

Bromthymol Blue (0,2 %) per liternya. Untuk sampel 1 ml dan 0,1 ml

dimasukkan pada media LBSS (Lactose Broth Single Stegth) yang berkomposisi

sama tapi hanya kadar laktosa setengah dari LBDS yaitu 5 gr (Lay, 1992).

MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan

menggunakan medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan

medium cair di dalam tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah

tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi

pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat

dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung

kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad

renik yang membentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya dengan

menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan

menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas (tabung reaksi) yang

digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005).

Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara

ini secara luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan

seperti air, susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat

untuk kemudian ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah

inkubasi jumlah koloni dihitung. Setelah dikonversi sesuai dengan

pengencerannya, akan diketahui jumlah bakteri per milliliter. Karena

pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara desimal, maka angka

yang diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most Probable

Number (MPN) (Irianto, 2006).

Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel

sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang

pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan

tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah

sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka

semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang

dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang

tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah

yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua

tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dari probabilitas sel yang

terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media. Oleh karena itu

homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau

negative (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel

sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).

Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada

pengenceran pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi

medium cair yang diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut

mengandung 1 jasad renik, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1

sel, sedangkan tabung yang lain mengandung sel sama sekali. Dengan demikian

setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung, yang

dinyatakan sebagai tabung positifm sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo,

2004).

Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di

dalam sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk

sampel yang berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspense 1:10

dari sampel tersebut. Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode

MPN juga bervariasi tergantung dari medium yang digunakan untuk

pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005).

Lebih lanjut mengenai metode MPN, dari setiap pengenceran masing-

masing dimasukkan 1 ml masing-masing ke dalam tabung yang berisi medium,

dimana untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Setelah

inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah tabung yang positif.

Kriteria tabung positif atau tidak ditandai dengan timbulnya kekeruhan  atau gas

pada tabung durham. Misalnya pada pengnceran pertama, 3 tabung

menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran ke 2 tabung positif, pada

pengenceran ke 3 satu tabung positif, dan pada pengenceran teakhir tidak ada

tabung yang positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil 3

pengenceran pertama kombinasinya menjadi 3,2,1. Angka kombinasi ini

kemudian dicocokkan dengan table MPN, kemudian nilai MPN sampel dapat

dihitung sebagai berikut :

MPN sampel = Nilai MPN tabel x1

faktor pengenceranditengah

D. ALAT DAN BAHAN

1. Tabung reaksi

2. Tabung durham

3. Pipet volume

4. Cawan petri

5. Aquades

6. Kaldu nutrisi agar

7. Kapas

8. Sampel air aquades

9. Laktosa broth

E. PROSEDUR KERJA

1. Buatlah pengenceran dari sampel yang akan diperiksa mulai dari

pengenceran 10-1 , 10-2, 10-3, atau 10-4, 10-5, 10-6

2. Sediakan 12 tabung reaksi, 3 tabung berisi 9 mL aqudest steril, 9 tabung

berisi 9 mL Laktosa broth (LB)

3. Masukan 1 mL sampel kedalam tabung pertama (isi aquadest), kocok sampi

homogen hingga konsentrasi larutan dalam tabung pertama menjadi 10-1

4. Ambil 1 mL dari tabung pertama masukan kedalam tabung kedua, kocok

sampai homogen, hingga konsentrasi larutan didalam tabung kedua menjadi

10-2 dan buat juga pengenceran 10-3

5. Ambil larutan dari tabung 10-1 , sebanyak masing-masing 1 mL untuk 3

tabung (isi LB 9 mL) 10-1 , kemudian ambil larutan dari tabung 10-2

sebanyak masing-masing 1 mL untuk 3 tabung 10-2 , juga untuk pengenceran

10-3.

6. Inkubasi dengan suhu 22-37o C selama 2×24 jam.

7. Hitung jumlah tabung reaksi yang positif kemudian hitung nilai MPN

dengan menggunakan rumus sebagai berikut :

MPN sampel = Nilai MPN tabel × 1

faktor pengenceranditengah

F. HASIL DAN PEMBAHASAN

1. Hasil pengamatan

Hasil pengamatan dari praktikum perhitungan bakteri pada air dengan

metode MPN yaitu :

2. Pembahasan

Berbeda dengan metode cawan dimana digunakan media padat (agar),

dalam metode MPN digunakan  medium cair didalam tabung reaksi, dimana

perhitungan dilakukan  berdasarkan  jumlah  tabung yang positif, yaitu yang

di tumbuhi  oleh mikroba setelah diinkubasikan   pada suhu 37 0C dan

waktu 2 x 24 jam. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan

mengamati timbulnya kekeruhan ( hijau – orange) atau terbentuknya gas

didalam tabung durham untuk mikroba pembentuk gas.

Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel

mikroba per ml, per g atau per cm permukaan, memerlukam perlakuan

pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar pada cawan petri,

sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni tersebut dalam jumlah yang

terbaik adalah diantara 30 dan 300.

Dalam praktikum ini sampel yang digunakan adalah ikan kaleng yang

sudah mendekati masa kadaluarsa, ikan kaleng tersebut dibuat suspensi,

kemudian dibuat pengenceran secara desimal. untuk melakukan

pengenceran dari masing-masing pengenceran dimasukan 1 ml suspensi

ikan kaleng kedalam tabung yang berisi Lactosa Broth dan tabung durham.

Untuk setiap pengenceran digunakan 3 seri tabung. Setelah inkubasi pada

suhu dan waktu tertentu dilihat tabung yang positif, yaitu tabung yang

ditumbuhi mikroba yang dapat ditandai dengan terbentuknya gas didalam

tabung durham dan juga terdapat perubahan warna.

Pada pengenceran 10-1  ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan negatif

Pada pengenceran 10-2  ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan negatif

Pada pengenceran 10-3  ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan negatif

G. KESIMPULAN

Dalam praktikum ini tidak terjadi perubahan warna dari hijau ke orange,

yang berarti tidak terdapat bakteri E.coli dalam sampel ikan kaleng tersebu. Hal

ini disebabkan karena ikan kaleng tersebut masih dalam keadaan steril.

DAFTAR PUSTAKA

Dwijoseputro,D . 1994 . Dasar - Dasar Mikrobiologi . jakarta : djambatan

Hastowo, sugyo . 1992 . Mikrobiologi . jakarta : rajawali

Lay,bibiana.W . 1992 . Analisis Mikroba Di Laboratrium . jakarta : rajawali