PRAKTIKUM 5

ISOLASI DNA

I. Judul Blok

Blok 3 (Sel & Molekul)

II. Topik Praktikum

Sel & molekul

III. Laboratorium Pelaksana

Laboratorium Biomol

IV. Tujuan Belajar

Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA genom

Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA plasmid

Mahasiswa dapat menjelaskan fungsi masing-masing reagen & tahapan dalam proses

isolasi DNA genom & DNA plasmid

V. Alat dan Bahan

ISOLASI DNA GENOM

Bahan: Tanaman sampel, alkohol 70%, alkohol 96 %, akuades, CTAB

(cetyltrimethylammonium bromide), β-merkaptol, KIA (kloroform: isoamilalkohol= 24:1),

isopropanol, bufer TE, SDS,RNA-se

RNAse, amonium asetat.

Alat: Tabung reaksi, beaker glass, spatula, mikropipet beserta tipnya, tabung mikrosentrifuga

1,5 ml, vortex, waterbath, mikrosentrifuga, LAF, freezer, dan sarung tangan.

ISOLASI DNA PLASMID

A. BAHAN

1. Solution I (150mM glukosa, 25mM Tris C1 (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0))

2. Solution II (0,2 n NaOH, 1% SDS)

3. Solution III (60 ml 5M potassium acetate, 11,5 ml Glacial acetic acid, 28,5 ml H20)

4. PCI/phenol : chloroform Isoamylalcohol (24:1)

5. Buffer TE

6. Ethanol pa

7. NaAc

B. ALAT

1. Mini sentrifuge berpendingin

2. Micropipet

3. Vortex

4. Pengering DNA

VI. Prosedur

A. CARA KERJA ISOLASI DNA GENOM

1. 2 gram sampel gerus dengan N2

2. Pindahkan serbuk sampel halus dalam kondisi beku ke tabung sentrifugasi

3. add 8 ml buffer ekstraksi, 10 µl betamercopto, 400 µl 20% SDS

4. Vortex sampai homogen, inkubasi pada suhu 65°C for 10min

5. Tambahkan 2,6 ml 5 M potasium acetat, mix dengan membolak-balik

6. Inkubasi on ice 20 min

7. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C

8. Take supernantan + 5 ml 1sopropanol, mix gentle

9. Jika DNA tampak melayang-layang, keringkan, larutkan dengan 600 µl TE buffer

10. Bila tidak inkubasikan suhu -20°C, for 30 min

11. Sentrifugasi 10.000 rpm, 10 min 4°C

12. Take pellet, keringkan +600 µl TE buffer

PURIFIKASI DNA

13. +5 µl RNA-se (10 mg/ml), inkubasi suhu 37°C, for 15 min

14. +PCI 700 µl, vortex,

15. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C

16. Kloroform equal volume, kemudian sentrifugasi seperti PCI

17. Pindahkan larutan bagian atas + 0,8 vol isoprapanol dan 0,2 vol 3M sodium asetat

18. Campur, inkubasi suhu -80°C, for 15 h

19. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C

20. Pellet cuci dengan 70% ethanol, kemudian disentrifugasi lagi.

21. Pellet DNA dikeringkan dengan vacum + 200 µl TE buffer

22. Estimasi kandungan DNA dengan spektrofotometer.

CARA KERJA ISOLASI DNA PLASMID

1. Transfer single koloni bakteri pada media LB 2 ml yang mengandung antibiotik dan

diinkubasi selama satu malam pada suhu 37°C di dalam penggojok dengan kecepatan 120

rpm

2. Masukkan 1,5 ml kultur bakteri pada ependolf. Sentrifuge pada 12.000 rpm selama 10

menit pada suhu 4°C, kemudian supernatan dibuang

3. Tambahkan 100 µl solution I, padfa pellet bakteri dan di vortex sampai bakteri benar-

benar tersuspensi

4. Tambahkan 200 µl fresh solution II, kemudian dibolak-balik 5c (swirling) dan jangan di

vortex. Inkubasi selama 5 menit sampai bening (menunjukkan lisis terjadi)

5. Tambahkan 150 µl solution III, lakukan swirling dan letakkan dalam es selama 5 menit

6. Sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. Transfer supernatan pada tube

sentrifuge baru.

7. Selanjutnya ukur volume supernatan dan tambahkan PCI equal volume, lakukan vortex

dan sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selam 10 menit

8. Ambil supernatan (lap. Atas) lalu tambahkan ethanol pa dan 3M NaAc, ditambahkan

masing-masing sebanyak 2,5 dan 0,1 dari volume supernatan. Selanjutnya dipresipitasi

pada suhu -20°C selama satu jam

9. Kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm 10 menit pada suhu 4°C

10. Pellet dicuci dengan 1ml 70% ethanol dan disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm 5

menit pada suhu 4°C

11. Pellet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 µl buffer TE dan disimpan pada suhu 4°C

dan disimpan sampai siap digunakan

VII. DASAR TEORI

Komponen utama kromosom pada eukariota adalah DNA dan protein histon. Protein

histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel

mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang terdapat di nukleus disebut

DNA kromosomal, sedangkan DNA lain yang terdapat di dalam sel dan di luar nukleus yaitu

DNA mitokondria, DNA kloroplas, dan DNA plasmid, ketiganya disebut DNA

ekstrakromomal.

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA

dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada motokondria dan

kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk

memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari

berbagai komponen sela yang lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak

rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA

Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain – dengan

cara diekstraksi atau dilisiskan – biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan

bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada kondisi sampel tertentu,

untuk membantu lisis dari membran sel/nukleus/organel atau juga dinding sel, maka sampel

daun dimasukkan dulu ke nitrogen cair dan langsung digerus sebelum ditambahkan bufer

ekstraksi. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang

murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamil alkohol.

Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau

kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sela yang lain, termasuk

debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.

Kontaminan yang umum ditemukan di antaranya adalah polisakarida yang dapat

mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjajdi hambatan aktifitas Taq polimerase,

atau kontaminan lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA

secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga

tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi.

Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA dengan

menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut

dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan

mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain. Pada sampel darah,

presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein dan debris

sela dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh

supernatan DNA yang kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi,

siapkan tabung yang berisi 70%-etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet 1000

µL, dan pindahkan ke tabung yang berisi 70%-etanol.

Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing,

maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan

memiliki berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat

terjadi antara lain :

DNA patah-patah selama proses isolasi.

DNA terdegradasi oleh enzim nuklease.

Terjadi kontaminasi oleh polisakarida.

Metabolit sekunder ikut terisolasi.

Denaturasi dan Renaturasi DNA

Proses denutarasi dan renaturasi melekul DNA tergantung pada banyak faktor, antara lain:

1. Suhu. Suhu leleh (melting temperature, Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA

akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila suhu ini diturunkan secara perlahan, maka

akan terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula.

2. Derajat keasaman (pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dapat menyebabkan DNA

terdenaturasi.

3. Konsentrasi isoelektrolit seperti Na+ dan K pada larutan ekstraksi yang digunakan.

4. Perbandingan kandungan antara basa nukleotida GC terdapat AT. Tingginya kandungan

GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan AT

yang tinggi akan menyebabkan pita DNA mudah putus/patah.