MAKALAH KIMIA ANALITIK

Problem Based Learning (PBL)

Pemicu 3

Kromatografi Gas dan Spektroskopi Massa

Ju

Disusun oleh :

Kelompok 8

Kamila Luthfia Putri (1306412193)

Khairunnisa(1306370934)

Meriell Jade E.T.( 1306447770)

Seffiani (1306370782)

Terry Muhammad Octaryno (1306370770)

Teknologi Bioproses

Departemen Teknik Kimia

Universitas Indonesia

Depok, 2014

KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat dan

anugerah yang telah diberikan kepada penyusun sehingga makalah yang berjudul

KROMATOGRAFI GAS DAN SPKETROSKOPI MASSA dapat diselesaikan dengan

baik. Makalah ini berisi tentang kromatografi, serta segala sesuatu yang berhubungan

dengannya, meliputi prinsip dasar, instrumen alat, cara kerja, parameter yang digunakan

serta penerapannya dalam analisis kandungan alkohol pada sampel darah.

Penyusun berharap agar makalah ini dapat membantu para pembaca untuk lebih

memahami materi bahasan kimia analitik yang tealh diberikan. Kami selaku penyusun,

mengucapkan terima kasih yang sebesar-sebesarnya kepada seluruh pihak yang telah

mendukung kami baik dalam bentuk dukungan fisik maupun mental, diantaranya:

kepada orang tua kami yang telah memberikan dukungan moril sehingga kami

tetap bersemangat melaksanakan seluruh kegiatan perkuliahan;

kepada dosen Mata Kuliah Kimia Analitik, Ibu Ir. Dianursanti, M.T, yang telah

membimbing kami dalam belajar dan menyelesaikan makalah ini sehingga kami

dapat memberikan sebuah hasil yang maksimal;

pihak-pihak lainnya yang tidak dapat disebutkan seluruhnya.

Tak ada gading yang tak retak. Penyusun pun tetap manusia yang tidak pernah

luput dari kesalahan. Oleh karena itu, penyusun memohon maaf yang sebesar-besarnya

apabila terjadi kesalahan penulisan dalam makalah ini. Tak lupa penyusun juga memohon

kritik dan saran yang membangun dari penilai. Terima kasih.

Depok, November 2014

Penyusun

Daftar Isi

Lembar Judul .................................................................................................................. i

Kata Pengantar .............................................................................................................. ii

Daftar Isi....................................................................................................................... iii

BAB I Pendahuluan....................................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ........................................................................................................ 1

1.2 Teori Dasar .............................................................................................................. 1

BAB II Pembahasan ...................................................................................................... 3

2.1 Tugas 1 .................................................................................................................... 3

2.2 Tugas 2 .................................................................................................................. 10

2.3 Tugas ..................................................................................................................... 21

BAB III Kesimpulan ................................................................................................... 27

Daftar Pustaka ............................................................................................................. 28

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pengidentifikasian suatu senyawa dapat dilakukan dengan berbagai macam

metode. Akan tetapi, tidak semua metode dapat dilakukan dengan mudah dan

efektif. Semakin berkembangnya zaman, maka semakin pula berkembang ilmu

pengetahuan . Hal ini mendukung perkembangan dan kemajuan metode analisis

yang digunakan. Salah satu metode yang dikenal saat ini adalah GC/MS. GC/MS

adalah teknik yang handal untuk memisahkan komponen dalam campuran.

Sampel disuntikkan pada GC untuk memisahkan semua protein, metabolit, obat,

dsb yang ada dalam sampel menjadi komponen individu. Komponen individu

kemudian dilewatkan ke MS untuk mengidentifikasi komponen campuran.

Kemampuan GC/MS dalam memisahkan dan mengidentifikasikan

komponen dalam suatu senyawa digunakan dalam mengecek kandungan alkohol

dalam darah seseorang yang diduga menggunakan alkohol. Oleh karena itu dalam

makalah ini, penulis membahas lebih dalam tentang teknik analisis GC/MS untuk

mengetahui aplikasi dari teknik ini dalam kehidupan.

1.2 Teori Dasar

Kromatografi adalah suatu metode pemisahan campuran senyawa menjadi

senyawa murni dan untuk mengetahui kuantitasnya. Untuk itu, kemurnian bahan

atau komposisi campuran dengan kandungan yang berbeda dapat dianalisis

dengan benar. Teknologi yang penting untuk analisis dan pemisahan preparatif

pada campuran bahan adalah kromatografi. Kromatografi dapat dibedakan

menjadi 2 yaitu GLC, GSC dan GC.

Pada gas-solid chromatography, fasa diam yang digunakan berupa

padatan. Sistem gas padat ini telah digunakan dalam pemurnian gas dan

penghilangan asap. Secara umum, instrumen dan cara kerja yang digunakan dalam

sistem gas padat ini tidak berbeda dengan dengan sistem gas cair. Perbedaannya

adalah pada gas-liquid chromatography, fase diam yang digunakan berupa cairan

yang di injeksikan pada kolom, sedangkan pada gas-solid chromatography

senyawa padat berfungsi sebagai permukaan yang menyerap.

2

Sedangkan pada GC (Gas Chromatography) volume pembawa yang

diperlukan untuk menggerakkan pita zat terlarut pada keseluruhan panjang suatu

kolom adalah volume retensi (VR), yaitu besaran fundamental yang diukur dalam

kromatografi gas. Untuk suatu kolom tertentu yang dioperasikan pada temperatur

(tc) dan laju aliran gas pembawa (Rc), maka waktu yang diperlukan masing-

masing komponen untuk tinggal di dalam kolom dikenal sebagai waktu retensinya

(tR)

MS atau Mass Spectrometry atau mass-spec merupakan teknik analisis

yang digunakan untuk menghitung rasio massa permuatan dari ion. Kegunaan dari

mass-spec adalah untuk menentukan komposisi sampel melalui mass spektra yang

menunjukan massa dari komponen sampel.

Mass-spec sering dirangkaikan dengan gas kromatografi (GC/MS). Pada

teknik ini, gas kromatografi digunakan untuk memisahkan komponen-komponen

dari campuran dan mass-spec memberikan karakteristik dari masing-masing

komponen. Dengan mengkombinasikan kedua teknik ini, seorang analisis dapat

mengetahui secara kualitatif mampun kuantitatif campuran yang mengandung

sejumlah komponen. Biasanya ion yang dihasilkan mass-spec membawa satu

muatan positif, maka rasio massa per muatan (m/z) akan sama dengan berat

molekul dari fragment. Analisis dengan mass-spec memberikan informasi

kumpulan fragmen yang terbentuk, kemudian menganalisis spectra ke belakang

(dari kiri ke kanan) untuk mendapatkan molekul yang sebenarnya. Setelah

komponen dari campuran terpisah oleh proses GC kemudian komponen tersebut

memasuki MS.

3

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 Tugas 1

Susunlah pertanyaan penting atau variabel penelitian untuk merancang

suatu penelitian analisis alkohol dan obat-obatan terlarang dalam darah,

paling sedikit terdapat tujuh pertanyaan

1. Apa saja komponen darah?

Darah tersusun atas empat komponen penyusun utama yaitu:

- plasma

- eritrosit (sel darah merah)

- leukosit (sel darah putih)

- trombosit

a. Plasma

Plasma merupakan komponen darah dengan komposisi tertinggi

yaitu 55% konten darah. Plasma tersusun atas 90% air, 8% protein, 0,9%

garam, dan 1,1% senyawa organik. Plasma mengandung lebih dari 40000

jenis protein dan memiliki konsentrasi 50-70 mg/mL plasma. Sementara

itu, garam yang terkandung dalam plasma terdiri atas natrium, kalium,

kalsium, karbonat, dan fosfat. Plasma berperan dalam transportasi nutrisi,

hormon, dan protein-protein ke seluruh bagian tubuh yang memerlukan.

b. Eritrosit

Eritrosit terdapat dalam darah sebanyak 4-8 x 106

sel per mikroliter

darah. Eritrosit tersusun atas 90% haemoglobin yang berperan dalam

fungsi penting eritrosit yaitu membawa oksigen ke seluruh tubuh.

c. Leukosit

Leukosit memiliki peran umum yaitu sebagai sistem pertahanan

tubuh terhadap virus, bakteri, dan benda-benda asing lainnya. Terdapat

tiga jenis umum leukosit yaitu:

- granulosit

- limfosit

- monosit

4

Granulosit terdiri dari tiga jenis yaitu neutrofil, eosinofil, dan basofil.

Neutrofil berperan dalam fagositosis bakteri dan jamur dan mencakup 56%

total sel darah putih. Eosinofil berperan dalam serangan parasit dan reaksi

alergi, serta mencakup 4% total leukosit. Sementara itu, basofil berfungsi

mensekresi histamin dan berjumlah 3% total leukosit dalam tubuh. Jenis

leukosit berikutnya yaitu limfosit, memiliki fungsi memproduksi antibodi

dan menyusun 25% leukosit total. Monosit berfungsi membunuh bakteri.

d. Trombosit

Trombosit terdapat dalam darah sebanyak 150000-350000 per

mikroliter darah. Trombosit berperan dalam hemostatsis dan koagulasi

darah.

Gambar 1 Komponen Darah

(Sumber: http://www.britannica.com/EBchecked/topic/69685/blood)

2. Apa saja sifat-sifat dari darah?

Total volume darah dalam tubuh manusia adalah sekitar 5L yang

merupakan 8% total berat tubuh. Darah memiliki osmolalitas atau

konsentrasi larutan dalam jumlah terlarut per kilogram larutan sebesar

275-295 miliosmol per kg. Terdapat beberapa karakteristik darah yang

perlu dijaga agar tetap pada nilai optimum. Sifat-sifat darah ini adalah

5

suhu, pH, kadar glukosa, dan tekanan darah. Suhu darah perlu dijaga agar

tetap berada pada kisaran 37-38oC atau 100,4

oF. Di sisi lain, pH perlu

dijaga agar tetap pada nilai di antara 7.35 hingga 7.45. Kadar glukosa

optimum darah adalah di antara 130-140 mg/L darah. Tekanan darah

normal seharusnya berkisar di nilai 120/80 mmHg.

Karakteristik-karakteristik darah ini dijaga nilainya agar tetap

optimum melalui proses homeostasis. Dalam pengaturan suhu, terjadi

sistem vasodilasi dan vasokonstriksi pembuluh darah. Vasodilasi terjadi

saat suhu tubuh naik, sehingga lebih banyak panas tubuh yang dikeluarkan

dengan darah. Vasokonstriksi terjadi saat suhu tubuh turun, sehingga lebih

sedikit panas yang keluar dari tubuh. Dalam pengaturan pH, digunakan

berbagai buffer dalam plasma dan eritrosit. Plasma memiliki buffer

NaHCO3/H2CO3 dan Na2HPO4/NaH2PO4, sedangkan eritrosit memiliki

buffer KHb/HHb dan KHb-O2/HHb-O2. Hati juga berperan dalam

mensekresi asam atau alkali tergantung pH darah. Kadar glukosa diatur

dalam darah dengan aksi-reaksi yang melibatkan insulin dan glukagon.

Saat kadar glukosa dalam darah naik, insulin akan disekresi untuk

mengubah glukosa menjadi glikogen untuk disimpan. Di sisi lain, saat

kadar glukosa turun, glukagon disekresi untuk mengubah glikogen

menjadi glukosa. Untuk tekanan darah, terdapat mekanisme sekresi renin

yang menginisiasi pembentukan vasokonstriktor yang menaikkan tekanan

darah saat tekanan darah turun dari nilai optimum. Saat tekanan darah

meningkat, jantung akan mensekresi hormon atrial natriuretic yang

menurunkan tekanan darah.

3. Bagaimana dampak alkohol dan obat terlarang dalam darah?

Konsumsi alkohol berlebih dapat menyebabkan berbagai dampak

buruk pada kondisi tubuh. Alkohol dan obat terlarang yang dikonsumsi

didistribusikan ke seluruh tubuh dalam darah. Alkohol dan obat terlarang

berdampak sangat burut terutama pada kesehatan organ hati. Hati bertugas

melakukan metabolisme alkohol dan substansi berbahaya lain. Dengan

tingginya konsumsi alkohol atau obat terlarang, hati harus bekerja lebih

keras untuk menetralisir toksisitas alkohol dan obat-obatan tersebut.

6

Akibatnya, dapat muncul penyakit hati seperti pembengkakan hati dan

cirrhosis atau luka pada hati. Organ yang terkena dampak berikutnya

adalah jantung. Konsumsi alkohol atau obat terlarang akan menyebabkan

detak jantung menjadi lebih cepat sehingga tekanan darah naik. Detak

jantung yang abnormal ini juga dapat mengakibatkan serangan jantung.

Keberadaan kedua substansi ini dalam tubuh juga menginisiasi sekresi

neurotransmiter dopamin yang mengatur pergerakan, emosi, dan perasaan

bahagia. Hal ini mengakibatkan ketergantungan pada alkohol dan obat-

obatan ini.

4. Apa yang dimaksud dengan Gas Chromatography dan apa kegunaannya?

GC (Gas Chromatography) yang biasa disebut juga Kromatografi

gas (KG) merupakan teknik instrumental yang dikenalkan pertama kali

pada tahun 1950-an. GC merupakan metode yang dinamis untuk

pemisahan dan deteksi senyawa-senyawa organik yang mudah menguap

dan senyawa-senyawa gas anorganik dalam suatu campuran

Perkembangan teknologi yang signifikan dalam bidang elektronik,

komputer, dan kolom telah menghasilkan batas deteksi yang lebih rendah

serta identifikasi senyawa menjadi lebih akurat melalui teknik analisis

dengan resolusi yang meningkat.

GC menggunakan gas sebagai gas pembawa/fase geraknya.

Ada 2 jenis kromatografi gas, yaitu :

1. Kromatografi gascair (KGC) yang fase diamnya berupa cairan yang

diikatkan pada suatu pendukung sehingga solut akan terlarut dalam fase

diam.

2. Kromatografi gas-padat (KGP), yang fase diamnya berupa padatan dan

kadang-kadang berupa polimerik.(4)

7

Gambar 2 Gas Chromatography

(Sumber: http://lansida.blogspot.com/2010/06/gc-kromatografi-gas)

5. Bagaimana rancangan dari alat Gas Chromatography?

Gambar3. Rancangan Gas Chromatography

(Sumber: http://lansida.blogspot.com/2010/06/gc-kromatografi-gas)

Keterangan :

1. Kontrol dan penyedia gas pembawa

2. Ruang suntik sampel.

3. Kolom yang diletakkan dalam oven yang dikontrol secara termostatik

4. Sistem deteksi dan pencatat (detektor dan recorder)

5. Komputer yang dilengkapi dengan perangkat pengolah data

8

6. Bagaimana mekanisme Gas Chromatography?

1. Fase gerak

Fase gerak pada GC juga disebut dengan gas pembawa karena

tujuan awalnya adalah untuk membawa solut ke kolom, karenanya gas

pembawa tidak berpengaruh pada selektifitas. Syarat gas pembawa

adalah: tidak reaktif; murni/kering karena kalau tidak murni akan

berpengaruh pada detektor; dan dapat disimpan dalam tangki tekanan

tinggi (biasanya merah untuk hidrogen, dan abu-abu untuk nitrogen) 4).

2. Ruang suntik sampel

Lubang injeksi didesain untuk memasukkan sampel ecara cepat

dan efisien. Desain yang populer terdiri atas saluran gelas yang kecil

atau tabung logam yang dilengkapi dengan septum karet pada satu

ujung untuk mengakomodasi injeksi dengan semprit (syringe). Karena

helium (gas pembawa) mengalir melalui tabung, sejumlah volume

cairan yang diinjeksikan (biasanya antara 0,1-3,0 L) akan segera

diuapkan untuk selanjutnya di bawa menuju kolom.

Pada dasarnya, ada 4 jenis injektor pada kromatografi gas, yaitu:

a. Injeksi langsung (direct injection), yang mana sampel yang

diinjeksikan akan diuapkan dalam injector yang panas dan 100

% sampel masuk menuju kolom.

b. Injeksi terpecah (split injection), yang mana sampel yang

diinjeksikan diuapkan dalam injector yang panas dan

selanjutnya dilakukan pemecahan.

c. Injeksi tanpa pemecahan (splitness injection), yang mana

hampir semua sampel diuapkan dalam injector yang panas dan

dibawa ke dalam kolom karena katup pemecah ditutup; dan

d. Injeksi langsung ke kolom (on column injection), yang mana

ujung semprit dimasukkan langsung ke dalam kolom.

Teknik injeksi langsung ke dalam kolom digunakan untuk

senyawa-senyawa yang mudah menguap; karena kalau penyuntikannya

melalui lubang suntik secara langsung dikhawatirkan akan terjadi

peruraian senyawa tersebut karena suhu yang tinggi atau pirolisis.

9

3. Kolom

Kolom merupakan tempat terjadinya proses pemisahan karena di

dalamnya terdapat fase diam. Oleh karena itu, kolom merupakan

komponen sentral pada GC. Ada 3 jenis kolom pada GC yaitu kolom

kemas (packing column) , kolom kapiler (capillary column), dan kolom

preparative (preparative column).

4. Detektor

Komponen utama selanjutnya dalam kromatografi gas adalah

detektor. Detektor merupakan perangkat yang diletakkan pada ujung

kolom tempat keluar fase gerak (gas pembawa) yang membawa

komponen hasil pemisahan. Detektor pada kromatografi adalah suatu

sensor elektronik yang berfungsi mengubah sinyal gas pembawa dan

komponen-komponen di dalamnya menjadi sinyal elektronik. Sinyal

elektronik detektor akan sangat berguna untuk analisis kualitatif

maupun kuantitatif terhadap komponen-komponen yang terpisah di

antara fase diam dan fase gerak.

5. Komputer

Komponen GC selanjutnya adalah komputer. GC modern

menggunakan komputer yang dilengkapi dengan perangkat lunaknya

(software) untuk digitalisasi signal detektor dan mempunyai beberapa

fungsi antara lain:

Memfasilitasi setting parameter-parameter instrumen seperti: aliran

fase gas; suhu oven dan pemrograman suhu; serta penyuntikan

sampel secara otomatis.

Menampilkan kromatogram dan informasi-informasi lain dengan

menggunakan grafik berwarna.

Merekam data kalibrasi, retensi, serta perhitungan-perhitungan

dengan statistik.

Menyimpan data parameter analisis untuk analisis senyawa

tertentu.

7. Apa prinsip kerja dari Gas Chromatography?

10

Derivatisasi merupakan proses kimiawi untuk mengubah suatu

senyawa menjadi senyawa lain yang mempunyai sifat-sifat yang sesuai

untuk dilakukan analisis menggunakan kromatografi gas (menjadi lebih

mudah menguap). Alasan dilakukannya derivatisasi:

Senyawa-senyawa tersebut tidak memungkinkan dilakukan analisis

dengan GC terkait dengan volatilitas dan stabilitasnya.

Untuk meningkatkan batas deteksi dan bentuk kromatogram. Beberapa

senyawa tidak menghasilkan bentuk kromatogram yang bagus (misal

puncak kromatogram saling tumpang tindih) atau sampel yang dituju

tidak terdeteksi, karenanya diperlukan derivatisasi sebelum dilakukan

analisis dengan GC.

Meningkatkan volatilitas, misal senyawa gula. Tujuan utama

derivatisasi adalah untuk meningkatkan volatilitas senyawa-senyawa

yang tidak mudah menguap (non-volatil). Senyawa-senyawa dengan

berat molekul rendah biasanya tidak mudah menguap karena adanya

gaya tarik-menarik inter molekuler antara gugus-gusug polar

karenanya jika gugus-gugus polar ini ditutup dengan cara derivatisasi

akan mampu meningkatkan volatilitas senyawa tersebut secara

dramatis.

Meningkatkan deteksi, misal untuk kolesterol dan senyawa-senyawa

steroid.

Meningkatkan stabilitas. Beberapa senyawa volatil mengalami

dekomposisi parsial karena panas sehingga diperlukan derivatisasi

untuk meningkatkan stabilitasnya.

Meningkatkan batas deteksi pada penggunaan detektor tangkap

elektron (ECD).

2.2 Tugas 2

Bila Anda hendak menggunakan GC/MS dalan analisis darah

1. Parameter apa saja yang harus Anda ketahui?

Parameter adalah hal-hal yang dapat menggambarkan karakteristik objek

yang diamati. Dalam analisis darah dengan menggunakan GC/MS, parameter

11

adalah hal-hal yang dapat menggambarkan kandungan alkohol dan obat-obat

terlarang dalam darah. Beberapa parameter yang penting dijelaskan sebagai

berikut.

Konsentrasi Alkohol dalam Darah

Konsentrasi alkohol dalam darah merupakan parameter yang sangat

penting untuk menganalisis kandungan alkohol dalam darah. Masing-masing

zat biasanya terkandung dalam darah dalam jumlah tertentu. Kelebihan atau

kekurangan jumlah zat dapat memberikan indikasi terjadinya masalah. Untuk

analisis sampel darah, konsentrasi alkohol yang melebihi rentang kewajaran

menunjukkan bahwa orang tersebut berada dalam pengaruh alkohol.

Penentuan konsentrasi zat, khususnya alkohol, dapat dilakukan dengan

menggunakan salah satu dari dua cara berikut:

1. Metode Calibration with Standards

Pada metode ini, sejumlah larutan standar zat alkohol yang diketahui

konsentrasinya dilewatkan pada kolom pemisah dan detektor GC/MS.

Kemudian, dibuat hubungan grafik antara tinggi puncak atau luas area di

bawah kurva dengan konsentrasi larutan standar. Grafik yang dihasilkan

adalah garis lurus; persamaan linear yang didapatkan digunakan untuk

menentukan konsentrasi zat pada sampel dengan melihat tinggi puncak atau

area luas di bawah kurva yang terbaca pada detektor.

2. Metode Internal Standard Method

Metode ini merupakan metode yang lebih baik untuk analisis kuantitatif

karena mengurangi ketidakpastian yang muncul pada metode sebelumnya.

Pada metode ini, larutan standar internal diberikan pada sampel yang

dianalisis dan larutan standar yang disiapkan dengan volume yang sama.

Akibatnya, persen larutan pada campuran berbeda-beda. Kemudian, masing-

masing larutan dialirkan pada instrumen analisis GC/MS. Pada detektor, akan

terbentuk dua puncak yang mewakilkan puncak larutan standar/sampel dan

puncak larutan standar internal. Akhirnya, dibuat grafik antara konsentrasi zat

dan perbandingan tinggi puncak atau luas area di bawah puncak untuk larutan

12

standard an larutan standar internal. Garis lurus yang didapatkan digunakan

untuk menentukan konsentrasi zat pada sampel yang tidak diketahui.

Konstanta Distribusi

Konstanta distribusi menggambarkan karakteristik objek untuk terikat

pada fase bergerak dan fase diam pada kolom pemisah yang digunakan. Setiap

senyawa memiliki kosntanta distribusi yang berbeda sehingga besaran ini

dapat digunakan untuk melihat kandungan senyawa dalam darah. Pada

kromatografi, terjadi kesetimbangan zat pada fase diam dan fase bergerak.

Untuk zat A, reaksi kesetimbangan yang terjadi diberikan pada Persamaan (1):

A (fase bergerak) = A (fase diam) (1)

Konstanta kesetimbangan ini disebut konstanta distribusi, Kc, yang

dituliskan sebagai berikut:

(2)

dengan (aA)S dan (aA)M adalah aktivitas zat A pada fase diam dan fase

bergerak sedangkan cS dan cM adalah konsentrasi zat A pada fase diam dan

fase bergerak.

Retention Times

Retention times, tR, adalah waktu antara pemasukan sampel dan

kemunculan puncak pada detektor. Retention times dapat menjadi parameter

yang penting untuk menjelaskan karakteristik senyawa dalam darah. Karena

setiap zat memiliki konstanta distribusi yang berbeda, retention times yang

dikaitkan dengan lama sampel berada pada kolom pemisah juga berbeda

walaupun nilainya sama untuk zat yang sama dengan konsentrasi berbeda. Zat

yang memiliki retention times lebih lama menunjukkan zat ini lebih cenderung

terikat pada fase diam.

Gambar 2 memberikan ilustrasi kromatogram campuran yang terdiri atas

dua zat. Pada Gambar 2, salah satu zat (yang memberikan puncak terlebih

dahulu) merupakan zat yang tidak terikat pada fase diam. Retention times zat

ini disebut waktu mati (dead time), tM, dan zat ini hanya berada pada fase

13

bergerak ketike melewati kolom. Untuk zat yang kedua, retention times

dituliskan sebagai:

(3)

di mana tS adalah lama zat menempati fase diam.

Gambar 4 Kromatogram pada Campuran Berisi Dua Zat

(Sumber: Skoog, Douglas A., dkk. Fundamentals of Analitycal Chemistry, 8th

Edition.

Hal. 924)

Laju Migrasi

Laju migrasi adalah laju suatu zat mengalir pada kolom pemisah. Laju

migrasi dapat digunakan sebagai parameter untuk menentukan lama proses

pemisahan diperlukan. Walaupun tidak secara langsung menjelaskan

karakteristik objek, laju migrasi merupakan besaran yang penting diketahui

dalam analisis GC/MS. Laju linear migrasi, v, adalah:

(4)

dengan L adalah panjang kolom dan tR adalah retention times. Sedangkan

kecepatan linearsuatu zat pada fase bergerak, u, adalah:

(5)

Faktor Selektivitas

Faktor selektivitas merupakan parameter yang penting dalam melihat

selektivitas kolom pemisah terhadap zat-zat yang terdapat pada darah yang

dianalisis. Faktor selektivitas, , untuk campuran yang mengandung zat A dan

B adalah:

(6)

14

Dengan B merupakan zat yang lebih tertahan pada fase diam dibandingkan

zat A. Karena itu, nilai selalu lebih dari satu.

(7)

dan nilai ini dapat diperoleh melalui kromatogram sesuai dengan

Persamaan (7):

(8)

Efisiensi Kolom

Efisiensi kolom, walaupun tidak menjelaskan secara langsung karakteristik

senyawa dalam darah, besaran ini sangat penting karena dapat memberikan

kualitas pemisahan campuran pada kolom. Besaran yang menunjukkan

efisiensi kolom adalah tinggi pelat, H, dan jumlah pelat, N. Kata pelat tidak

menunjukkan arti sebenarnya. Kata ini dipakai karena pertama kali digunakan

untuk menjelaskan efisiensi kolom distilasi. Efisiensi kolom ditunjukkan

dengan nilai N yang besar dan nilai H yang rendah. Nilai H adalah:

(9)

Nilai N dapat didapatkan melalui kromatogram menurut rumus:

(10)

dengan W adalah lebar band yang terbaca pada kromatogram yang dapat

dilihat pada Gambar 1. Karena distribusi pada kromatogram biasanya adalah

Distribusi Gaussian, nilai H dipengaruhi oleh standar deviasi, , dan varian,

. Nilai H adalah:

(11)

di mana besar H juga bisa ditulis sebagai jarak L dan L .

Resolusi Kolom

Sama seperti efisiensi kolom, resolusi kolom tidak memberikan gambaran

langsung karakteristik objek yang diamati. Walaupun demikian, besaran ini

memberikan gambaran tentang kualitas pemisahan dalam kolom dan akhirnya

dapat digunakan untuk menggambarkan tingkat keabsahan analisis kualitatif

dan kuantitatif yang dilakukan terhada sampel darah selanjutnya.

15

Resolusi kolom, Rs, didefinisikan sebagai jarak dua puncak yang muncul

pada detektor kromatografi relatif terhadap lebar dasar puncak masing-masing.

Untuk contoh kromatogram yang diberikan pada Gambar 2, nilai resolusi

kolom diberikan pada Persamaan (12) berikut:

(12)

dengan adalah jarah dua puncak kurva, WA, adalah lebar kurva zat

pertama, WB, adalah lebar kurva zat kedua, adalah retention times zat

kedua, dan adalah retention times zat pertama. Biasanya, semakin besar

resolusi kolom, pemisahan pada kolom semakin baik karena tidak ada zat A

yang tercamput pada zat B, dan sebaliknya.

Gambar 5 Kromatogram untuk Kolom dengan Tiga Resolusi Berbeda

(Sumber: Skoog, Douglas A., dkk. Fundamentals of Analitycal Chemistry, 8th

Edition.

Hal. 937.)

2. Mengapa metoda GC/MS sering digunakan untuk penentuan

kandungan alkohol dan obat-obatan terlarang dalam darah?

Metode GC/MS memiliki beberapa keuntungan disbanding metode

analisis alkohol lainnya yaitu:

Sangat akurat, spesifik dan sensitif dan merupakan prosedur standar

untuk oanalissi alkohol dan senyawa-senyawa volatil lainnya.

Akurat dan spesifik karena teknik ini menghasilkan molecular

fingerprint atau spektrum massa yang unik. Spektrum ini dapat

16

digunakan untuk mengidentifikasi ada atau tidaknya alkohol dalam

sampel. Sensitif karena alkohol dalam darah dapat diketahui

jumlahnya atau kadarnya walaupun dalam kuantitas kecil

Dengan menggunakan analisis darah GC/MS, sampel yang sama

dapet diuji beberapa kali, jika sampel dijaga dengan baik

Waktu yang diperlukan cepat (penentuan alkohol dapat dilakukan

dalam 6-8 menit) bila alat-alatnya dihangatkan secara teratur

3. Dalam analisis komponen, dikenal juga metode HPLC. Apa yang

Anda ketahui tentang alat tersebut?

Pengertian High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC merupakan jenis kromatografi yang menggunakan fase gerak

cair dan fase diam yang terpisah dengan baik. Pada dasarnya metode ini

merupakan pengembangan dari kromatografi kolom. Dengan metode ini,

pelarut diberi tekanan tingg yang dapat mencapai hingga 400 atm

sehingga prosesnya menjadi lebih cepat. Metode ini juga memungkinkan

untuk memakai partikel dengan ukuran yang jauh lebih kecil sehingga

memberikan luas permukaan yang lebih besar untuk interaksi antara fase

diam dan molekul-molekul yang mengalir melewati kolom. Hal ini

memungkinkan pemisahan jauh lebih baik dari komponen-komponen

campuran.

Metode pada HPLC

HPLC dapat dikelompokkan menjadi fase normal (jika fase

diamnya lebih polar dibandingkan dengan fase geraknya) atau fase

terbalik (jika fase diamnya kurang non-polar dibanding dengan fase

geraknya). Selain itu HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan sifat

fasa diam atau berdasarkan mekanisme adsorbsi larutan seperti :

Kromatografi Partisi

Kromatografi Partisi merupakan salah satu metode yang paling sering

digunakan dari semua prosedur kromatografi cair. Metode ini dapat

dibagi menjadi kromatografi cair-cair dan kromatografi fase cairan-

17

terikat. Perbedaan di antara kedua metode ini adalah dari fase diam

mana yang terbentuk oleh bentuk partikel pendukung. Dengan cair-

cair, penyimpanan dilakukan dengan adsorpsi fisik, sementara dengan

fase terikat, ikatan kovalen terlibat.

Kromatografi Adsorpsi

Kromatografi ini berdasarkan penyerapan senyawa analit pada

permukaan fasa diamnya. Fase diamnya berupa silika atau alumina

sedangkan fase geraknya dapat berupa pelarut organik atau campuran

dari pelarut organik. Variabel yang mempengaruhi koefisien partisi

dari analit adalah komposisi dari fase geraknya.

Kromatografi Pertukaran-Ion

Kromatografi ini menggunakan fase diam yang dapat menukar kation

dan anion dengan suatu fase gerak. Kelebihan dari metode ini adalah

kapasitas sampel yang diperlukan hanya sedikit. Senyawa pada fase

diam yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.

Sedangkan fase geraknya dapat berupa air atau campuran air dan

alkohol ataupun pelarut organik. Pada kromatografi penukar ion

dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar

garam/kekuatan ionik dan pH-nya. Kenaikan kadar garam dalam fase

gerak menurunkan retensi larutan analit. Hal ini disebabkan oleh

penurunan kemampuan ion sampel dibanding ion fase gerak.

Kromatografi Size-Exclusion (SEC)

Disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan

untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul

>2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau

polimer yang bersifat porus. Molekul analit yang mempunyai berat

molekul yang jauh lebih besar akan terelusi kemudian molekul-

molekul ukuran medium dan terakhir adalah molekul yang berukuran

jauh lebih kecil. Dengan demikian, tidak terjadi interaksi kimia antara

analit dan fase diam seperti pada kromatografi yang lain.

Kromatografi Afinitas

18

Dalam kasus ini, permisahan terjadi karena interaksi-interaksi

biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus

molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi atau

muatan tertentu dari campuran yang sangat kompleks

Instrumen HPLC

G

a

m

b

a

r

6

H

PLC secara skematis

(Sumber: http://www.cem.msu.edu/~cem333/Week16.pdf)

a. Wadah Fase Gerak dan Sistem Perlakuan Pelarut

Perlengkapan HPLC moderen dilengkapi dengan astu atau lebih

wadah kaca atau stainless steel, masing-masing menampung 500 mL

atau lebih pelarut. Perlengkapan lain juga sering terdapat pada alat ini

untuk menyingkirkan embun dan debu dari cairan.

b. Sistem Pompa

Persyaratan untuk pompa kromatografi cairan mneliputi: (1)

tekanan yang mencapai 6000 psi (lb/in2), (2) Bebas getaran, (3) laju

alir berkisar antara 0.1 hingga 10 mL/min, (4) reproduksibilitas alir

0.5% atau lebih baik, dan (5) tahan karat untuk berbagai jenis pelarut.

Yang paling sering digunakan adalah pompa bolak-balik

(reciprocating pump). Keuntungan dari pompa ini adalah volume

internal yang kecil, tekanan output tingkat tinggi (mencapai 10.000

19

psi), sesuai untuk elusi gradien, dan laju alir yang konstan. Alat ini

juga independen untuk kolom tekanan balik dan viskositas larutan.

c. Sistem Injeksi Sampel

Sistem injeksi yang biasa digunakan pada kromatografi cair adalah

injeksi semprotan melalui septum elastomeric. Namun pada prosedur

ini ternyata hanya terbatas untuk tekanan kurang dari 1500 psi

sehingga digunakan injeksi stop-flow dimana aliran pelarut

diberhentikan secara bertahap. Metode pengenalan sample yang paling

sering digunakan pada kromatografi cair adalah didasarkan pada

putaran sampel .

d. Kolom HPLC

Kolom yang digunakan merupakan tabung stainles steel untuk

tekanan tinggi dengan panjang 10-30 cm dan diameter dalam 4-10 mm.

Meskipun terkadang tabung gelas dengan dinding tebal digunakan

untuk aplikasi tekanan rendah (

20

membawa sampel kedalam kolom HPLC. Didalam kolom tersebut

terdapat packing material atau fase diam yang digunakan untuk

melakukan pemisahan. Detektor digunakan untuk mendeteksi dan melihat

senyawa yang sudah terelusi dari kolom HPLC. Sebagian besar senyawa

tidak berwarna sehingga tidak dapat dilhat dengan kasat mata. Fase gerak

keluar dari detektor sebagai buangan, atau diolah lebih lanjut. Saat larutan

analit telah bercampur dengan fase gerak, HPLC memiliki kemampuan

untuk mengumpulkan senyawa murninya yang disebut preparative

chromatography.

Perbandingan HPLC dengan Kromatografi Gas-Cair (GLC)

Ketika kedua merode ini dapat digunakan, GLC memiliki kelebihan

dalam kecepatan dan perlengkapan yang lebih simpel. Pada sisi lain,

HPLC dapat digunakan untuk zat yang mudah menguap (termasuk ion

anorganic) dan zat yang memiliki suhu tidak stabil, sementara

kromatografi gas-cair tidak. Dibawah ini adalah perbandingan secara

umum antara HPLC dengan GLC:

Karakteristik Kedua Metode

- Efisien, tingkat selektifitas tinggi, dapat digunakan secara luas.

- Memerlukan sampel dalam jumlah sedikit

- Kemungkinan tidak merusak sampel

- Mudah disesuaikan untuk analisis kuantitatif

Keuntungan dari HPLC

- Dapat mengakomodasi zat yang mudah menguap dan suhu tidak

stabil

- Dapat digunakan secara umum pada ion anorganik

- Dapat digunakan pada suhu kamar

- Detektor HPLC bersifat peka

- Pelarut bisa dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya

- Memiliki daya pisah yang baik

- Dapat terhindar dari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang

di analisis

21

Keuntungan dari GLC:

- Simpel dan peralatannya tidak mahal

- Cepat

- Resolusi yang tidak tertandingi (dengan kolom kapiler)

- Mudah dihubungkan dengan spektroskopi massa

2.3 Tugas 3

Bagaimana Anda menentukan:

1. Kandungan senyawa etanol dalam sampel darah?

Jawab:

Metode yang digunakan untuk menentukan etanol dalam darah adalah

metode kalibrasi standar. Pada metode kalibrasi standard terdapat larutan

standar zat alkohol yang telah diketahui konsentrasinya dan dilewatkan pada

kolom pemisah dan detektor GC/MS. Kemudian akan dibuat grafik hubungan

antara tinggi puncak dengan konsentrasi larutan standar. Dari grafik tersebut

akan didapatkan persamaan linear untuk mengetahui konsentrasi zat pada

sampel.

Berikut adalah cara menentukan kandungan etanol dalam sampel dengan

menggunakan metode kalibrasi standar

a. Menentukan volum etanol dalam larutan standar dalam persentase

Tabel 1: Persentasi Volum etanol dalam larutan standar (%)

Volume

Etanol/VE

(mL):

Volume n-

Propanol/VP

(mL):

Persentasi Volume Etanol

(%):

0,1 1,9 5

0,2 1,8 10

0,3 1,7 15

0,4 1,6 20

0,5 1,5 25

22

b. Membuat grafik hubungan antara persentase volum etanol dalam larutan

standar dengan tinggi puncak kurva

Tabel 2: Hubungan antara Persentasi Volum dan Tinggi Puncak Kurva

Persentasi Volume Etanol

(%):

Tinggi

Puncak

Kurva

(mm):

5 3.75

10 7.5

15 11.25

20 15

25 18.75

Berdasarkan data diatas maka dapat dicari kurva kalibrasinya dengan

menggunakan least square dimana y adalah tinggi puncak kurva etanol (mm)

dan x adalah persentase volume etanol (%). Berdasarkan least square, maka

akan didapatkan hasil sebagai berikut.

No Xi Yi Xi2 Yi

2 XiYi

1. 5 3.75 25 14.0625 18.75

2. 10 7.5 100 56.25 75

3. 15 11.25 225 126.5625 168.75

4. 20 15 400 225 300

5. 25 18.75 625 351.5625 468.75

75 56.25 1375 773.4375 1031.25

= 0

23

= 0.75

b = y

= 0

y2 =

= 0

Sehingga didapatkan grafik sebagai berikut dengan persamaan y = 0,75x+0

Grafik.1 : Hubungan Tinggi Kurva dengan Persentasi Volum Etanol

Berdasarkan persamaan tersebut maka dapat diketahui kandungan atau

volume etanol dan n-propanol dalam sampel darah jika diketahui tinggi kurva

(y) sebesar 12,5mm maka persentase volume sampel sebesar,

y = 0,75x + 0

x =

=

= 16,67 %

24

Volum sampel total adalah 5L, maka kandungan / volume etanol dan n-

propanol dalam darah adalah,

Volum etanol = 5 x 16,67% = 0,8335 l

Volum n-propanol = 5 L 0,8335 L = 4,1665 L

2. Resolusi Kolom (Rs)?

(1)

dengan adalah jarah dua puncak kurva, WA, adalah lebar kurva zat pertama,

dalam percobaan adalah etanol, WB, adalah lebar kurva zat kedua, dalam

percobaan adalah n-propanol, adalah retention times n-propanol, dan

adalah retention times etanol.

Bila diketahui = 7,2 menit, = 2,4 menit, WA =1,45 menit dan

WB = 3,65 menit.

3. Jumlah piringan rata-rata (N rata-rata)?

Jumlah pelat atau piringan merupakan salah satu besaran yang

menunjukkan efisiensi kolom. Nilai N dapat didapatkan melalui kromatogram

menurut rumus:

(2)

dengan W adalah lebar dasar puncak yang terbaca pada kromatogram dan

adalah retention times.

Bila diketahui lebar dasar puncak untuk etanol, WA, adalah 1.45 menit dan

waktu retensi etanol adalah 2.4 menit, maka nilai NA untuk larutan etanol

adalah:

Sedangkan diketahui pula lebar dasar puncak untuk n-propanol, WB, adalah 3,65

menit dan waktu retensi n-propanol adalah 7,2 menit, maka nilai NB untuk

larutan n-propanol adalah:

25

Berdasarkan nilai NA dan NB yang didapatkan, maka Nilai rata-rata N, Navg,

adalah:

4. Tinggi piringan (H) dalam m?

Tinggi piringan, H, dihitung dengan rumus

(3)

dengan L adalah panjang kolom.Dengan menggunakan hasil percobaan bahwa

panjang kolom sebelum perubahan resolusi kolom adalah 30 m dan N1 adalah 53,

maka tinggi piringan (H) adalah:

m

5. Panjang kolom bila resolusi kolom menjadi 1.5?

Nilai resolusi kolom, Rs, juga dapat dituliskan dengan menggunakan

Persamaan (33):

(4)

dengan adalah faktor selektivitas untuk campuran dan adalah retention

factor untuk zat yang lebih terikat pada fase diam. Apabila pada percobaan

resolusi kolom diubah menjadi 1,5, maka sesuai Persamaan (4), nilai N berubah

sedangkan nilai dan tetap karena larutan yang dianalisis tidak berubah.

Karena itu, Persamaan (4) dapat diubah menjadi:

(5)

Dengan hasil percobaan bahwa adalah 1,882, N1 adalah 53, dan

adalah 1,5, nilai N2 adalah:

Panjang kolom setelah perubahan resolusi kolom, L, dapat dihitung dengan

menggunakan Persamaan (3). Tinggi piringan, H, tidak berubah, yakni 0,566 m.

26

Substitusi nilai ini dengan Persamaan (3) menghasilkan panjang kolom setelah

perubahan resolusi kolom, L2, adalah:

m

6. Waktu elusi senyawa etanol pada kolom yang telah diperpanjang?

Waktu retensi atau waktu elusi adalah waktu antara pemasukan sampel

dan kemunculan puncak pada detektor. Zat yang memiliki waktu retensi yang

lebih lama meunjukkan zat ini lebih cenderung pada fasa diam.

(6)

Pada saat panjang kolom diubah, nilai , kB, H, dan kecepatan linear pada fase

bergerak, u, tetap. Akibatnya, Persamaan (6) dapat diubah menjadi:

(7)

Dengan nilai untuk etanol adalah 2,4 menit, adalah 1,882, dan

adalah 1,5 maka didapatkan hasil , adalah:

menit

27

BAB III

KESIMPULAN

Beberapa kesimpulan yang dapat diperoleh dari uraian jawaban soal di

atas adalah:

1. GC/MS merupakan dua teknik yang berkaitan satu sama lain; GC

berfungsi memisahkan zat pada campuran sedangkan MS merupakan

detektor untuk melihat massa jenis senyawa dalam campuran.

2. GC menghasilkan kromatogram yang dapat digunakan untuk mengetahui

konsentrasi sampel yang dianalisis.

3. GC/MS dapat digunakan pada analisis kandungan alkohol dalam darah

karena, salah satunya, alkohol bersifat volatil.

4. Analisisi kandungan alkohol pada darah dengan teknik GC/MS sangat baik

karena lebih murah, efisien, dan tidak harus diulang untuk mendapatkan

hasil yang valid.

5. Beberapa parameter penting dalam analisis GC/MS, diantaranya: resolusi

kolom, jumlah piringan rata-rata, tinggi piringan, waktu elusi, konsentrasi

zat, dan massa jenis zat.

28

DAFTAR PUSTAKA

Chang, Raymond. 2004. Kimia dasar konsep-konsep inti. Jakarta: Erlangga

Day, R.A, dan A.L. Underwood. 1986. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta:

Erlangga

Skoog, Douglas A, Donald M.West dan F. James Holler. 1978. Fundamental of

Analytical Chemistry. London: Saunders College Publishing

Khopkar S.M. 2010. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press

Anonim, Liquid Chromatography (Chapter 28),

http://www.cem.msu.edu/~cem333/Week16.pdf

Anonim, HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY HPLC,

http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html

Campbell. 2000. Biologi. Jakarta: Erlangga

http://www.recovergateway.org/substance-abuse-resources/drug-addiction-

effects/ (diakses pada tanggal 24 November 2014 pukul 21.00)

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-

explorer/learning-center/plasma-blood-protein/blood-basics.html (diakses

pada tanggal 24 November 2014 pukul 21.00)