LEMBAGA PENELITIAN PENGOBATAN TRADISIONAL CINA RRC RUMAH SAKIT GUANG AN MEN - Beijing

BALAI PENELITIAN ILMU PENGOBATAN DASAR Peneliti: Wang Lei Lu Xin Xia Chen Yu Ying Wu Zhi Kui

PENELITIAN DAYA ANTI PERTUMBUHAN DAN PENYEBARAN KANKER PADA JAMU No. 2 DAN No. 3

Dampak Pada Aktivitas Kegiatan Pembentukan Pembuluh Darah (Angiogenesis) Pada Selaput Alantoik Embrio Telur Ayam (CAM / Chick Allantoic Membrane)

Pembentukan pembuluh darah (angiogenesis) adalah salah satu masalah hangat dewasa ini di dunia internasional. Angiogenesis mengacu pada tingkat kemajuan pertumbuhan penyebaran persemaian pembuluh darah kapiler dari pembuluh darah asal. Munculnya, penyebarannya, dan infiltrasi kanker adalah tergantung pada pembentukan pembuluh darah baru (neogenesis), oleh karena itu, penemuan obat yang mempunyai fungsi penghambatan angiogenesis telah menjadi titik berat penelitian anti kanker / tumor. Tugas penelitian ini menggunakan Selaput Alantoik Telur Ayam (CAM) yang sudah dikeram sehingga berbentuk embrio, untuk meneliti dampak pengaruh anti kanker dari Jamu No. 2 dan Jamu No. 3 terhadap pembentukan pembuluh darah baru, dan mendalami model mekanisme daya anti kanker / tumornya.

BAHAN DAN CARA I. Bahan Obat 1. Jamu No. 2 dan Jamu No.3, masing-masing sebagai sediaan tunggal (ramuan asal

Indonesia) berbentuk cairan pekat hasil penyarian / ekstraksi secara tradisional, yakni menggunakan cara penggodogan. Godogan Jamu No. 2 mengandung 0,645 gram bahan baku obat per ml, sedangkan Godogan Jamu No. 3 mengandung 0,467 gram bahan baku obat per ml.

2. Sebagai bahan pembanding (kontrol) dipergunakan serbuk tulang rawan ikan hiu dalam

kapsul yang berasal dari produksi perusahaan Cadylad Amerika. Ketiga macam obat tersebut diencerkan dengan cairan destilasi saline normal sebanyak 4 mg/ml, 2 mg/ml, dan 1 mg/ml untuk setiap macam obat, dan yang masing-masing telah ditambahkan obat yang diteliti sebanyak 4 ug/20 ml, 2 ug/20ml, 1 ug/20 ml.

II. Cara Pengujian 1. Penyiapan Media Model pembentukan Pembuluh Darah (Vasoaktif) pada CAM dari 60 butir bibit telur

ayam Lai Hang yang telah dikeram lebih dari 90 % jadi, disuci-hamakan dengan 0,1 %

bromogeramine selama 3 menit, setelah itu telur tersebut diletakkan di atas nampan telur dengan sudut kemiringan 45° (bagian telur yang berongga udara menghadap ke atas), lalu diperam pada suhu 37 °C + 0,2 °C dengan kelembaban 60 % dalam inkubator kedap air dan bersuhu tetap/konstan. Selama 7 hari, setiap pagi dan malam hari, telur-telur tersebut dibalik satu kali (setiap hari adalah 24 jam penuh).

Dengan menggunakan lampu teropong pada telur tersebut, pada selaput chorio-allantoik telur ayam, dipilih luasan sebesar 1 X 1 Cm yang berjarak 1 Cm dari bayangan kepala embrio ayam, lalu kulit telur pada bagian berongga udara dilubangi dengan jarum, setelah itu dalam keadaan suci hama, dengan mempergunakan cogwheel alat kedokteran gigi, ke dalam rongga telur tersebut dimasukkan udara untuk membuat rongga udara buatan, lalu ditutup dengan plester bening (selotip). Akhirnya, telur-telur tersebut dimasukkan kembali ke dalam kotak pengeram yang kedap air dan bersuhu tetap tersebut untuk melanjuti pengeraman.

2. Pengelompokan dan Penataan Ke 60 telur berbenih tersebut dibagi ke dalam 4 kelompok. Setiap kelompok mengandung

12 butir, yaitu kelompok Kontrol Normal, kelompok Obat Jamu No. 2, kelompok Obat Jamu No. 3, kelompok Serbuk Tulang Rawan Ikan Hiu.

3. Cara Pemberian Obat

Setelah 11 hari pengeraman sejak telur dilubangi tersebut, dalam keadaan suci hama, ke dalam rongga udara buatan dalam telur dimasukan lempengan (yang telah dipersiapkan terlebih dahulu). Ke tengah lempengan pada telur kontrol diberikan 20 ml saline normal yang suci hama, lalu 20 ml cairan obat (yang masing-masing mengandung bahan obat sebanyak 4 ug, 2 ug, I ug) diberikan kepada masing-masing piring lempeng kelompok penelitian. Setiap dosis untuk 4 telur berbenih. Dengan plester bening, rongga udara buatan pada telur ditutup. Telur diletakkan kembali ke dalam kotak pengeram untuk dikeram sampai diperoleh sediaan / sampel.

4. Fiksasi Contohan Setelah dikeram selama beberapa hari, plester bening yang dipergunakan untuk menutupi

lubang pada rongga udara telur berbenih, dibuka, lalu cairan pemantap yakni aseton dalam metanol dengan perbandingan 1 : 1 disuntikkan ke dalam rongga udara, 20 menit kemudian, pada suhu kamar, kulit telur beserta rongga udara dikupas, lalu CAM dikeluarkan dengan forceps dan digelar di atas kertas saring.

HASIL PERCOBAAN PADA PEMBENTUKAN PEMBULUH DARAH SELAPUT ALANTOIK TELUR AYAM

Jamu No. 2 secara signifikan dapat menghambat pembentukan pembuluh darah pada selaput allantoik telur ayam. Ini menunjukkan / mengindikasikan Jamu No. 2 dapat mencegah munculnya / kambuhnya dan penyebaran tumor. Daya Jamu No. 3 tidak terlalu berarti.

HASIL

Pada mikroskop anatomik, diamati perubahan bentuk dari pembuluh darah. Hasilnya terlihat pada gambar berikut: Gambar 1

CAM Normal

Gambar 2

Kontrol Normal CAM (Pembuluh Darah Kapiler tersebar secara luas / lebat)

Gambar 3

Tulang rawan ikan hiu mempunyai daya hambat tertentu pada proses pembentukan pembuluh darah baru. (tampak pembentukan pembuluh darah baru terhambat pada daerah di mana

cairan obat diberikan)

Gambar 4

Jamu No. 3 tidak berpengaruh besar pada pembentukan pembuluh darah baru CAM.

Gambar 5

Jamu No. 2 mempunyai daya hambat yang signifikan pada pembentukan pembuluh darah baru CAM (pada daerah yang diberi cairan Jamu, pembentukan pembuluh darah terhambat,

dan secara jelas tampak penyebaran pembuluh darah berkurang).

Gambar 6

Control CAM

Jamu No. 2 pada CAM mempunyai daya penghambat yang jelas (signifikan)

PENELITIAN PERCOBAAN DAYA ANTI TUMOR DARI GODOGAN JAMU ANTI KANKER No. 2 DAN No. 3

Godogan Jamu Antikanker No. 2 dan No. 3 disarikan dari tumbuh-tumbuhan alamiah untuk bahan pengobatan kanker. Hasil percobaan ini menunjukkan bahwa kedua obat tersebut, terutama Jamu No. 2, mempunyai daya membunuh sel kanker ascites.

BAHAN DAN CARA 1. Binatang Percobaan: Tikus jantan dan betina jenis Kun Ming dengan berat masing-masing 18 - 20 gram, yang

disediakan oleh Pusat Hewan Percobaan Lembaga Penelitian Pengobatan Tradisional Cina RRC.

2. Bahan Obat - Godogan Jamu Antikanker No. 2 mengandung 262 gram bahan obat per 100 ml. - Godogan Jamu Antikanker No. 3 mengandung 187 gram bahan obat per 100 ml. - Obat suntik Cyclophosphamide / CTX (Chemotherapi) yang diproduksi oleh Pabrik

Obat No. 2 Shanghai. Sebelum percobaan dilakukan, digunakan cairan saline normal untuk melarutkan/ mengencerkannya.

3. Jenis Tumor Jenis sel karsinoma Ascites S 180, yang disediakau oleh Balai Materia Medica Cina

Lembaga Penelitian Pengobatan Tradisional Cina RRC. 4. Peralatan Percobaan Mikroskop sederhana. FACS - 420 Flow Cytometer, produksi perasahaan BD Amerika Serikat.

Mikroskop Konfokal Pemindai Laser (Laser Scanning Confocal) produksi perusahaan MERIDIAN, Amerika Serikat.

5. Pembuatan Model Kanker Ascites S 180 Ascites (cairan busung perut) diperoleh dari hewan yang 7 hari sebelumnya ditanami sel

kanker. Setelah dicampur dengan saline normal, konsentrasinya menjadi 2,5 X 107 sel kanker hidup per ml, lalu sebanyak 0,2 ml yang mengandung kurang lebih 5 X 106 sel kanker hidup, ditanamkan ke dalam rongga perut setiap tikus percobaan.

6. Pengelompokan dan Pemberian Obat Tikus yang telah ditanami sel kanker, secara acak dibagi menjadi 8 kelompok:

a. Kelompok Kontrol (diberikan jumlah saline normal yang sama seperti yang diberikan pada kelompok dosis tinggi); b. Kelompok Jamu No. 2 digabung dengan Cyclophosphamide (68,0 g bahan Jamu / Kg

BB diberikan secara oral dan 10 mg CTX / Kg BB diberikan secara suntikan); c. Kelompok Jamu No. 2 dosis besar (136,0 gram bahan obat / Kg BB); d. Kelompok Jamu No. 2 dosis kecil (68,0 g bahan obat / Kg BB); e. Kelompok Jamu No. 3 digabung dengan Cyclophosphamide (48,6 g bahan Jamu / Kg

BB diberikan secara oral dan 10 mg CTX / Kg BB disuntikkan); f. Kelompok Jamu No.3 dosis besar (97,1 g bahan obat / Kg BB); g. Kelompok Jamu No. 3 dosis kecil (48,6 g bahan obat / Kg BB); h. Kelompok Cyclophosphamide saja (10 mg / Kg BB).

Kelompok Jamu diberikan secara oral, dan Cyclophosphamide disuntikkan secara subkutan. Selurahnya berlangsung 7 hari.

7. Pembuatan Contohan 1. Penentuan Derajat Penghambatan Setelah percobaan selesai, dan diperoleh cairan ascites hewan, lalu cairan itu diencerkan

100 kali dengan saline normal dan diwarnai dengan trypan blue, kemudian dihitung jumlah set kanker dan dihitung derajat penghambatannya.

2. Penentuan Siklus Pembelahan Diri (Mitosis) Sel Tumor Setelah percobaan selesai, diperoleh larutan sel karsinoma Ascites S 180 yang berisi 2

X 106 sel kanker per tabung pengujian, lalu diputare-ndapkan (di-centrifuge), dibilas 2 kali dengan PBS, dan ditambahkan alkohol 70 % pada suhu 4 °C selama lebih dari 30 menit, dan setelah disentrifuge lagi lalu dibilas 3 kali, kemudian diambil endapannya tanpa cairan bening di atasnya. Ditambahkan 500 g/ml RNasc 0,5 ml, dan setelah direndam selama lebih dari 30 menit pada suhu 37 °C, ditambahkan 50 ug/ml PI 1,5 ml, lalu disaring dengan saringan nilon 400 mata, dan akhirnya dianalisis dengan FACS.

3. Pengamatan dengan mikroskop Confokal Pemindaian Laser Setelah dicuci sebanyak 2 kali dengan PBS, sel yang akan ditentukan, diwarnai dengan

PI, lalu terhadap sel kanker Ascites S 180 dari tikus, dilakukan pembayangan pemindaian irisan konfokal dengan mikroskop konfokal pemindaian laser, setelah pengumpulan bayangan konfokal dilakukan oleh papan image profesional, dibuat rekonstruksi 3 dimensi dengan perangkat lunak komputer.

H A S I L 1. Pengaruh Godogan Obat Jamu Antikanker Terhadap Jumlah Sel Kanker

Ascites S 180 Pada Tikus. Dari pengamatan atas jumlah sel kanker pada tikus yang mengandung kanker Ascites S 180, setelah pengobatan, hasilnya menunjukkan bahwa pada kelompok dosis besar Jamu No. 2, kelompok dosis kecil Jamu No. 2, kelompok Jamu No. 2 ditambah cyclophosphamide, kelompok jamu No. 3 ditambah cyclophosphamide, dan kelompok cyclophosphamide saja, terayata jumlah sel kankernya lebih sedikit daripada kelompok kontrol, Ini menunjukkan Jamu No. 2 dan cyclophosphamide mempunyai daya tertentu penghambatan terhadap sel tumor. Daya penghambatan masing-masing adalah sebagai berikut: 36,8 %, 31,2 %, 99,1 %, 98,4 %, 98,5 %. 2. Pengaruh Godogan Obat Jamu Antikanker Terhadap Siklus Pembelahan Sel

Kanker (Mitosis) S 180 Pada Tikus Dengan menggunakan teknik FACS, diamati pengaruh godogan Jamu No. 2 dan No. 3 terhadap siklus pembelahan sel kanker Ascites S 180 pada tikus. Hasilnya menunjukkan bahwa godogan Jamu Antikanker No. 2 dapat menghalangi siklus mitosis sel kanker, membuat sel kanker S 180 berhenti membelah diri pada stadium / tahap Gl dan G2+M; cyclophosphamide membuat pembelahan sel kanker berhenti pada mitosis stadium/tahap Gl dan S (Tabel 2, Gambar 1). Hasilnya menunjukkan godogan Jamu Antikanker No. 2 dapat menghalangi / memblokir / menghambat siklus pembelahan sel kanker (Gambar 4).

Tabel 1. Pengaruh Godogan Jamu Antikanker Terhadap Jumlah Sel Kanker Ascites S 180 Pada Tikus

Kelomp ok

Dosis (Godogan Obat / kg BB)

Jumlah Binatang

(n)

Jumlah Sel Kanker

X±SD

Daya

Hambat

Kontrol

10

1,41 X 10s + 2,69 X107

JamuNo.2 + CTX 68,0+ 0,01

10

1,25 X106 + 9,36 X105 **

99,1

Jamu No. 2 Dosis Besar

136,0

10

8,90 X 107 + 2,65 X106 *

36,8

Jamu No. 2 Dosis Kecil

68,0

10

9,70 X 107 + 8,96 X106 *

31,2

JamuNo.3 + CTX

48,6 + 0,01

10

2,12 X 106 + 8,14X 104 **

98,4

Jamu No. 3 Dosis Besar

97,1

10

1,39 X 108 + 7,70X 107

0,01

Jamu No. 3 Dosis Keeil

48,6

10

1,37 X108 + 2,14 X 107

0,02

CTX

0,01

10

2,11 X106±3,76X 105 **

98,5

Catalan: Tanda (*) mengacu pada hasil Pengujian T dibanding Kontrol: P < 0,05 Tanda (**) P < 0,001 dibanding Kontrol Tabel 2. Pengaruh Godogan Jamu Antikanker Terhadap Jumlah Sel Kanker

Ascites S 180 Pada Tikus

Kelompok

Dosis

(Godogan Obat / kg BB)

Jumlah

Binatang (n)

S i k 1 u s Mitosis (%)

X + SD Gl S G2+M

Kontrol

10

41,67 + 4,93 40,33 + 4,04 16,07 + 3,06

Jamu No. 2 + CTX

68,0 + 0,01

10

43,67 + 7,37 51,67 + 9,24 4,67 ±2,52**

Jamu No. 2 Dosis Besar

136,0

10

45,00 + 6,56 35,67 + 8,96 19,33+4,16

Jamu No. 2 Dosis Kecil

68,0

10

33,37 + 1,15 45,00 + 6,08 21,33 ±5,51

Jamu No.3 + CTX

48,6 + 0,01

10

43 ,67 + 7,02 44,33 ±7,51 1 2,00 ± 7,00

JamuNo.3 Dosis Besar

97.1

10

42,00 + 4,58 42,33 ± 8,02 1 5,67 + 6,43

Jamu No. 3 Dosis Kecil

48,6

10

43,00 + 6,08 42,33 + 3,05 14,67 + 3,21

CTX

0,01

10

25,00 ±11,27 63,67 ±11,72* 11,00 ±2,00

Catalan: Tanda (*) mengacu pada hasil Pengujian T dibanding Kontrol: P < 0,05 Tanda (**) P < 0,001 dibanding Kontrol 3. Perubahan Sel Kanker Ascites S 180 Pada Tikus Setelah Dicekoki Jamu Sel tumor pada kelompok Kontrol mempunyai bentuk yang relatif utuh / intact, dan kekuatan sinar flouresensi yang lebih kuat, sedangkan pada kelompok Jamu, bentuknya mempunyai kecenderangan merusak / terluka, dan mempunyai kekuatan sinar flouresensi yang lemah (Gambar 1-9).

Gambar 1: Kelompok Kontrol yang mengandung kanker

Gambar 2: Kelompok Cyclophospamide

Gambar 3: Kelompok Jamu No. 2 Dosis Besar

Gambar 4: Kelompok Jamu No.2 Dosis Kecil

Gambar 5: Kelompok Jamu No. 2 + CTX

Gambar 6: Kelompok Kontrol yang mengandung kanker

Gambar 7: Kelompok Jamu No. 2 Dosis Besar

Gambar 8: Kelompok Jamu No. 2 Dosis Kecil

Gambar 9: Kelompok CTX saja

K E S I M P U L A N Hasil percobaan menunjukkan bahwa godogan Jamu Antikanker mempunyai daya hambat tertentu terhadap kanker Ascites S 180, terutama Jamu No. 2 yang signifikan. Dari keadaan hewan percobaan, kelompok yang diberi jamu saja dan kelompok yang diberi Jamu ditambah Cyclophosphamide, keadaan umum mereka lebih baik dari kelompok yang diberi Cyclophosphamide saja, dalam hal keadaan kelebatan dan kilapan warna bulunya, hal ini memperlihatkan bahwa godogan Jamu tidak hanya mempunyai daya peluruhan racun Chemotherapi (attenuation) dan kemampuan bersinergi, tetapi juga mempunyai daya tertentu penghambatan terhadap kanker. Hal ini terutama pada Jamu antikanker No .2. Sifat utama dari sel kanker adalah pembelahan sel (mitosis) yang berkesinambungan / terus-meneras, dan senantiasa bergerak maju pesat pada siklus mitosis. Dengan memblokir siklus pembelahaa sel, maka pertumbuhan sel terhambat, dan tercapailah sasaran / tujuan dalam mengatasi tumor. Jamu antikanker No. 2 mempunyai pengaruh penghambatan tumor melalui dampak terhadap siklus mitosis, dan menghentikan pertumbuhan sel kanker pada tahap Gl dan G2+M. sementara cyclophosphamide berpengaruh pada tahap S sampai G2+M. Ini menunjukkan bahwa obat yang berbeda mempunyai fungsi penghambatan yang berbeda terhadap siklus mitosis sel kanker.

Ditinjau dari morfologi, sel tumor mempunyai sinar flourensensi yang melemah pada kelompok Jamu dibanding kelompok Kontrol, dan membran sel mempunyai tanda-tanda merusak, ini memperlihatkan bahwa Jamu Antikanker dapat membuat perubahan morfologi / bentuk pada sel kanker. Untuk mengidentifikasi daya penyembuhan dari kedua Jamu, jika mungkin disarankan untuk melakukan pembuatan indeks kekebalan (imunitas).

PENGUJIAN TOKSISITAS AKUT GODOGAN JAMU ANTIKANKER No. 2 DAN No. 3

Penelitian ini menggunakan 20 ekor tikus sehat jenis Kun Ming yang berasal dari Pusat Hewan Percobaan Lembaga Penelitian Pengobatan Tradisional Cina, RRC, yang berbobot antara 18 — 22 gram, separuh jantan dan separuh lagi betina. Godogan Jamu Antikanker No. 2 dipekatkan sampai 262 g % (bobot bahan obat). Godogan Jamu Antikanker No.3 dipekatkan sampai 187 g % (bobot bahan obat). Jamu-jamu ini diberikan pada tikus melaui pencekokan secara oral, dosisnya adalah 1,31 g / Kg BB, 93,4 g / Kg BB (setara dengan 1 ml / 20 g BB), 3 kali sehari. Dosis ini adalah dosis minum yang terbesar yang dapat diterima / ditolerir oleh tikus. Pengamatan dilakukan selama 7 hari. Hasilnya menunjukkan: pola makan dan minum maupun tingkah lakunya adalah normal, tidak ada gejala keracunan dan tidak ada satu pun tikus yang mati. Dosis itu adalah sebesar 150 kali dosis klinik. Percobaan toksisitas ini menunjukkan bahwa tidak ada gejala keracunan apapun pada pemberian jangka pendek (7 hari) bagi godogan Jamu Antikanker No. 2 dan No. 3 dengan dosis besar yang berlebihan, jadi terbukti aman dan tidak beracun.

Catatan: Orang dewasa diberikan sehari 130,8 g bahan obat (200 ml) Jamu No. 2, dan sehari 93,4 g bahan obat (200 ml) Jamu No. 3.