BAB IPENDAHULUAN I.1. Latar BelakangMikroorganisme dapat berkembang biak dengan alami atau dengan bantuan manusia.Mikroorganisme yang dikembangkan oleh manusia diantaranya melalui substrat yang disebut media, pada saat melakukan pembuatan media hal yang harus diperhatikan ialah bekerja secara aseptik.Bekerja secara aseptik bisa meliputi sterilisasi. Sterilisasi yaitu suatu proses untuk mematikan semua organisme yang dapat menjadi kontaminan. Cara tersebutdigunakan untuk menghancurkan, menghambat pertumbuhan mikroorganisme dan menyingkirkan mikroorganisme. Metode yang diterapkan untuk mensterilisasikan media dan alat-alat ialah dengan pemanasan.Jika panas digunakan bersama-sama dengan uap air disebut sterilisasi basah (menggunakan autoklaf),sedangkan jika tanpa uap air disebut sterilisasi kering (menggunakan oven).Pada praktikum kali ini metode yang dipakai ialah sterilisasi basah dengan autoklaf, autoklaf adalah alat untuk memsterilkan berbagai macam alat danbahan yang menggunakan tekanan 15 psi (1,02 atm) dan suhu 1210C. Sedangkan media yang akan kita buat dalam praktikum ini adalah media PW ( Pepton Water ). Adapun praktikum ini perlu untuk dilakukan agar mahasiswa dapat memahami cara pembuatan media dengan metode sterilisasi basah.

I. 2. Maksud dan Tujuan PercobaanI. 2.1 Maksud PercobaanAdapun maksud dari percobaan ini ialah untuk mengetahui cara pembuatan media dan sterilisasi basahI. 2.2 Tujuan PercobaanPercobaan ini bertujuan agar mahasiswa dapat melakukan pembuatan media (Pepton Water) dan sterilisasi basahI. 3. Prinsip PercobaanPepton water (PW) ditimbang, dilarutkan, dimasukan ke tabung reaksi, kemudian dimasukkan ke dalam autoklaf selanjutnya disterilkan pada suhu 121o Cselama 15-30 menit.

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

II. 1. Teori UmumII. 1.1 SterilisasiSterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, jika ditumbuhkan di alam suatu medium tidak ada jasad renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992). Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoclave uap yang mulai diangkat dengan menggunakan uap air jenuh pada suhu 121C selama 15 menit. Adapun alasan digunakannya suhu 121C itu disebabkan oleh tekanan 1 atm pada ketinggian permukaan laut. Autoclave merupakan alat yang essensial dalam setiap laboratorium mikrobiologi, ruang sterilisasi di rumah-rumah sakit serta tempat-tempat lain yang memproduksi produk steril. Pada umumnya (tidak selalu) autoclave dijalankan padaa tekanan kira-kira 15-16 per (5 kg/cm2) pada suhu 121. Waktu yag diperlukan untuk sterilisasi bergantung pada sifat bahan yang disterilkan, tipe wadah dan volume bahan. Misalnya 1000 buah tabung reaksi yang masing-masing berisi 10 ml medium cair dapat disterilkan dalam waktu 10-15 menit pada suhu 121C, sedangkan jumlah medium yang sama bila ditempatkan dalam wadah 10 wadah berukuran 1 liter akan membutuhkan 1 liter akan membutuhkan waktu 20-30 menit paa suhuyang sama untuk menjamin tercapainya sterilisasi. (Pelczar dan Schan, 1986)Dibawah ini beberapa istilah yang banyak dipakai dalam menjelaskan efek dari beberapa bahan kimia dan fisik terhadap mikroorganisme:1) Sterilisasi adalah proses untuk mematikan semua bentuk kehidupan mikroorganisme, termasuk spora.2) Desinfeksi adalah proses mematikan sebagian dari mikroorganisme patogen.3) Bahan Bakterisid adalah bahan yang merusak bakteri.4) Bahan Germisid atau Disinfektansia adalah bahan yang dapat mematikan mikroorganisme yang dapat menyebabkan penyakit.5) Bahan Bakteristatik adalah bahan yang mencegah terjadinya multiplikasi pertumbuhan bakteri.6) Antiseptik adalah bahan yang dipakai untuk mencegah sepsis atau purifikasi dengan membunuh mikroorganisme atau mencegah pertumbuhan mikroorganisme tersebut. Biasanya bahan ini digunakan untuk dipakai pada jaringan hidup.7) Dekontaminasi adalah proses menghilangkan sebagian mikroba dari benda atau kulit untuk menghilangkan kontaminasi.Pematian mikroorganisme mendasari metode kerja mikrobiologi dan pengawetan bahan makanan. Pembebasan suatu bahan dari mikroorganisme hidup atau stadium istirahatnya disebut sterilisasi. Kalau sesuatu larutan tidak steril atau yang sudah ditanami kuman, tanpa dikehendaki dicemari oleh mikroorganisme, peristiwa ini disebut kontaminasi atau pencemaran. Pentingnya penggunaan alat-alat laboratorium yang bersih dapat lebih ditekankan lagi. Semua alat kaca haruslah dalam keadaan bersih. Cara membersihkan tabung reaksi yaitu dengan menggunakan air aquadest setelah itu dikeringkan dengan menggunakan lap halus tetapi cara melapnya hanya bagian luarnya saja. Steril akan didapatkan melalui sterilisasi, sedang cara sterilisasi yang utama adalah:1) Sterilisasi secara fisik, misalnya dengan pemanasan, penggunaan sinar bergelombang pendek seperti sinar X, sinar gamma, sinar ultra violet dan sebagainya.2) Sterilisasi secara kimiawi, misalnya dengan penggunaan disenfeksi larutan alkohol, larutan formalin, larutan AMC (campuran asam khlorida dengan garam Hg) dan sebagainya.3) Sterilisasi secara mekanik, misalnya dengan menggunakan saringan atau filter. Sterilisasi bisa dilakukan secara kimiawi dan fisika. Berdasarkan mekanisme kerjanya zat anti-mikroba, maka sterilisasi kimiawi bisa diklasifikasikan atas 3 golongan, yaitu:1) Golongan zat yang menyebabkan kerusakan membran sel.2) Golongan zat yang menyebabkan denaturasi protein.3) Golongan zat yang mampu mengubah grup protein dan asam amino yang fungsional. Sterilisasi fisik bisa diklasifikasikan sebagai:1) Sterilisasi dengan panas.2) Sterilisasi dengan pembekuan.3) Sterilisasi dengan radiasi.4) Sterilisasi dengan ultrasonik dan vibrasi sonik.5) Sterilisasi dengan cara filtrasi.Sterilisasi Secara Kimia, dapat dilakukan dengan cara Sterilisasi Gas, digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Gas yang biasa digunakan adalah etilen oksida dalam bentuk murni atau campuran dengan gas inert lainnya. Gas ini sangat mudah menguap dan sangat mudah terbakar. Merupakan agen alkilasi yang menyebabkan dekstruksi mikroorganisme termasuk sel-sel spora dan vegetatif. Sterilisasi dilakukan dalam ruang atau chamber sterilisasi. Sterilisasi menghasilkan bahan toksik seperti etilen klorohidrin yang menghasilkan ion klorida dalam bahan-bahan. Digunakan untuk sterilisasi ala-alat medis dan baju-baju medis, bahan-bahan seperti pipet sekali pakai dan cawan petri yang digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Residu etilen oksida adalah bahan yang toksik yang harus dihilangkan dari bahan-bahan yang disterilkan setelah proses sterilisasi, yang dapat dilakukan dengan mengubah suhu lebih tinggi dari suhu kamar. Juga perlu dilakukan perlindungan terhadap personil dari efek berbahaya gas ini. Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan.Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas. Mekanisme aksi etilen oksida dianggap menghasilkan efek letal terhadap mikroorganisme dengan mengalkilasi metabolit esensial yang terutama mempengaruhi proses reproduksi. Alkilasi ini barangkali terjadi dengan menghilangkan hidrogen aktif pada gugus sulfhidril, amina, karboksil atau hidroksil dengan suatu radikal hidroksi etil metabolit yang tidak diubah dengan tidak tersedia bagi mikroorganisme sehingga mikroorganisme ini mati tanpa reproduksi.Sterilisasi Secara Fisika, dapat dilakukan dengan cara: 1) Pemanasan Keringa) Udara Panas OvenBahan yang karena karakteristik fisikanya tidak dapat disterilisasi dengan uap destilasi dalam udara panas-oven.Yang termasuk dalam bahan ini adalah minyak lemak, paraffin, petrolatum cair, gliserin, propilen glikol. Serbuk steril seperti talk, kaolin dan ZnO, dan beberapa obat yang lain. Sebagai tambahan sterilisasi panas kering adalah metode yang paling efektif untuk alat-alat gelas dan banyak alat-alat bedah. Ini harus ditekankan bahwa minyak lemak, petrolatum, serbuk kering dan bahan yang sama tidak dapat disterilisasi dalam autoklaf. Salah satu elemen penting dalam sterilisasi dengan menggunakan uap autoklaf atau dengan adanya lembab dan penembusannya ke dalam bahan yang telah disterilkan. Sebagai contoh, organisme pembentuk spora dalam medium anhidrat tidak dibunuh oleh suhu sampai 121oC (suhu yang biasanya digunakan dalam autoklaf bahkan setelah pemanasan sampai 45 menit). Untuk alasan ini, autoklaf merupakan metode yang tidak cocok untuk mensterilkan minyak, produk yang dibuat dengan basis minyak, atau bahan-bahan lain yang mempunyai sedikit lembab atau tidak sama sekali.Selama pemanasan kering, mikroorganisme dibunuh oleh proses oksidasi. Ini berlawanan dengan penyebab kematian oleh koagulasi protein pada sel bakteri yang terjadi dengan sterilisasi uap panas. Pada umumnya suhu yang lebih tinggi dan waktu pemaparan yang dibutuhkan saat proses dilakukan dengan uap di bawah tekanan. Saat sterilisasi di bawah uap panas dipaparkan pada suhu 121C selama 12 menit adalah efektif. Sterilisasi panas kering membutuhkan pemaparan pada suhu 150C sampai 170C selama 1-4 jam. Oven digunakan untuk sterilisasi panas kering biasanya secara panas dikontrol dan mungkin gas atau elektrik gas.b) Minyak dan penangas lainBahan kimia dapat disterilisasi dengan mencelupkannya dalam penangas yang berisi minyak mineral pada suhu 162oC.larutan jenuh panas dari natrium atau ammonia klorida dapat juga digunakan sebagai pensterilisasi. Ini merupakan metode yang mensterilisasi alat-alat bedah.Minyak dikatakan bereaksi sebagai lubrikan, untuk menjaga alat tetap tajam, dan untuk memelihara cat penutup.c) Pemijaran langsungPemijaran langsung digunakan untuk mensterilkan spatula logam, batang gelas, filter logam bekerfield dan filter bakteri lainnya. Mulut botol, vial, dan labu ukur, gunting, jarum logam dan kawat, dan alat-alat lain yang tidak hancur dengan pemijaran langsung. Papan salep, lumping dan alu dapat disterilisasi dengan metode ini.

2) Panas lembaba) Uap bertekananStelisisasi dengan menggunakan tekanan uap jenuh dalam sebuah autoklaf.Ini merupakan metode sterilisasi yang biasa digunakan dalam industri farmasi, karena dapat diprediksi dan menghasilkan efek dekstruksi bakteri, dan parameter-parameter sterilisasi seperti waktu dan suhu dapat dengan mudah dikontrol dan monitoring dilakukan sekali dalam satu siklus yang divalidasi.b) Uap panas pada 100 oCUap panas pada suhu 100oC dapat digunakan dalam bentuk uap mengalir atau air mendidih. Metode ini mempunyai keterbatasan penggunaan uap mengalir dilakukan dengan proses sterilisasi bertingkat untuk mensterilkan media kultur.c) Pemanasan dengan bakterisidPemanasan ini menghadirkan aplikasi khusus dari pada uap panas pada 100oC.adanya bakterisida sangat meningkatkan efektifitas metode ini. Metode ini digunakan untuk larutan berair atau suspensi obat yang tidak stabil pada temperatur yang biasa diterapkan pada autoklaf.d) Air mendidihPenangas air mendidih mempunyai kegunaan yang sangat banyak dalam sterilisasi jarum spoit, penutup karet, penutup dan alat-alat bedah. Bahan-bahan ini harus benar-benar tertutupi oleh air mendidih dan harus mendidih paling kurang 20 menit.Setelah sterilisasi bahan-bahan dipindahkan dan air dengan pinset yang telah disterilisasi menggunakan pemijaran.Untuk menigkatkan efisiensi pensterilan dari air, 5 % fenol, 1-2% Na-carbonat atau 2-3% larutan kresol tersaponifikasi yang menghambat kondisi bahan-bahan logam.3) Cara bukan panasa) Sinar ultravioletSinar ultraviolet umumnya digunakan untuk membantu mengurangi kontaminasi di udara dan pemusnahan selama proses di lingkungan. Sinar yang bersifat membunuh mikroorganisme (germisida) diproduksi oleh lampu kabut merkuri yang dipancarkan secara eksklusif pada 253,7 nm.b) Aksi letalKetika sinar UV melewati bahan, energi bebas ke elektron orbital dalam atom-atom dan mengubah kereaktivannya. Absorpsi energi ini menyebabkan meningginya keadaan tertinggi atom-atom dan mengubah kereaktivannya. Ketika eksitasi dan perubahan aktivitas atom-atom utama terjadi dalam molekul-molekul mikroorganisme atau metabolit utamnya, organisme itu mati atau tidak dapat berproduksi. Pengaruh utamanya mungkin pada asam nukleat sel, yang diperhatikan untuk menunjukkan lapisan absorpsi kuat dalam rentang gelombang UV yang panjang.c) Radiasi pegionRadiasi pengion adalah energi tinggi yang terpancar dari radiasi isotop radioaktif seperti kobalt-60 (sinar gamma) atau yang dihasilkan oleh percepatan mekanis elektron sampai ke kecepatan den energi tinggi (sinar katode, sinar beta).Sinar gamma mempunyai keuntungan mutlak karena tidak menyebabkan kerusakan mekanik, namun demikian, kekurangan sinar ini adalah di hentikan dari, mekanik elektron akselerasi (yang dipercepat) keuntungan elektron yang dipercepat adalah kemampuannya memberikan output laju doisis yang lebih seragam.II. 1.2 MediaMikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunannya dengan kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam anorganik ditambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganisme lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya (Volk,1993).Kelangsungan hidup dan pertumbuhan mikroorganisme tergantung pada nutrisi yang tersedia dan lingkungan pertumbuhan yang menguntungkan. Di dalam laboratorium, persiapan gizi yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme disebut media (tunggal, sedang) (Prescott, 2002). Media dapat digolongkan berdasarkan bentuk, susunan kimianya, dan fungsinya. Berdasarkan bentuknya terdiri dari media padat, media semi padat, dan media cair. Salah satu yang digunakan dalam pembuatan media kali ini adalah pepton water ( Air Pepton). Pepton adalah hasil pemecahan protein sehingga bakteri sudah dipermudah, tidak usah mengeluarkan energi untuk memecahkan protein menjadi pepton. Pepton oleh bakteri akan diuraikan menjadi asam amino, kemudian diserap untuk digunakan sebagai sumber energi dan membangun sitoplasma. NaCl diperlukan untuk memberikan tekanan osmotik tertentu. Bila pembenihan dibuat tanpa NaCl ataupun dengan NaCl berkadar tinggi, pertumbuhan bakteri akan berkurang sampai terhenti. Air diperlukan untuk semua reaksi dalam makhluk hidup. Bahan makanan yang dbutuhkan mikroorganisme dibagi menjadi tujuh golongan yaitu air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron, sumber mineral, faktor tumbuh, dan sumber nitrogen (Pujiati, 2012). Bahan-bahan untuk membuat media pertumbuhan terdiri dari beberapa bahan, antara lain :1) Bahan Dasara. Air (H2O) atau Aquades, sebagai pelarut.b. Agar, sebagai pemadat media. 2) Nutrisi atau zat makanana. Sumber karbon dan energi, yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atao anorganik sesuai dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.b. Sumber nitrogen, mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain. c. Vitamin-vitamin, yang bisa didapatkan dari berbagai tumbuhan maupun hewan seperti wortel, kentang, tauge, dan lain-lain.(Pujiati, 2012).

3) Bahan tambahanBahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan tertentu, seperti garam (NaCl) yang digunakan sebagai sumber karbon dan sumber mineral bagi mikroba, gula yang digunakan sebagai sumber karbon.

II. 2. Uraian bahan1. Media PW (Peptonen Water Bacteriological Peptone)Komposisi :Typical analisis (% w/w )-Total nitrogen4,0 g-Amino nitrogen2,6 g-Sodium chloride1,6 gpH (1% solution) 6,3 at 25%2. Metilen Biru Metilen Biru (Ditjen POM, 1979)Nama resmi:Methylthionini ChloridumNama lain:Biru metilenRM / BM:CHCINS.3HO / 373,90Pemerian: Hablur atau serbuk hablur hijau tua, berkilauan seperti perunggu, tidak berbau atau praktis tidak berbau.Stabil diudara; larutan dalam air dan dalam etanol berwarna biru tuaKelarutan:Larut dalam air dan dalam kloroform; agak sukar larut dalam etanolPenyimpanan:Dalam wadah tertutup baik3. Air Suling Nama resmi:Aqua DestillataNama lain:Air suling/aquadestRM/BM:H2O/18,02Pemerian:Cairan jernih, tidak berwarna, tidak berbau, dan tidak mempunyai rasaPenyimpanan:Dalam wadah tertutup baik

BAB IIIMETODE KERJA

III. 1 Alat dan BahanIII. 1.1 Alat 1. Alkohol2. Spoit 10 ml3. Beaker glass 250 ml4. Batang pengaduk5. Sendok tanduk6. Oven7. Rak tabung8. Timbangan analitik9. Sendok tandukIII. 1.2 Bahan1. Aquadest2. Pepton water3. Metilen biru

III. 2 Cara KerjaIII. 2. 1 Pembuatan Media1. Ditimbang 1,5 g Pepton Water dan dimasukkan kedalam beker gelas 250 ml.2. Ditambahkan 100 ml aquadest dan dilarutkan dengan menggunakan batang pengaduk, ditambahkan metilen biru dihomogenkan kembali3. Diambil 9 ml larutan PW dengan spoit dan dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditutup tabung reaksi dengan kapas (dilakukan hal yang sama untuk 8 tabung reaksi lainnya)4. Media kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit5. Diangkat dan disimpan dalam lemari pendingin

III. 2. 2 Sterilisasi Basah1. Diisi tempat air autoklaf dengan aquadest 2. Dihidupkan pemanas, ditunggu hingga terjadi penguapan3. Dimasukkan media yang akan disterilkan 4. Tutup autoklaf dipasang dan sekrup-sekrup dikencangkan5. Nyala api kompor dikecilkan hingga saat suhu autoklaf mencapai 121oC dan ditunggu hingga 15 menit kemudian pemanas dimatikan6. Autoklaf ditunggu hingga tekanannya menjadi nol kemudian di buka perlahan-lahan, kemudian dikeluarkan media yang telah jadi

BAB IVHASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil PengamatanNO.Nama Bahan/ AlatMetode Sterilisasi

1.Tabung reaksiSterilisasi dilakukan dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit

2.Labu Erlenmeyer

Sterilisasi dilakukan dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit

3.

Gelas Kimia (Beaker Glass)Sterilisasi dilakukan dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit untuk mendapatkan ekstrak dari bahan

4.Media (Pepton Water)Sterilisasi dilakukan dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit untuk mendapatkan ekstrak dari bahan

IV.2 PembahasanSterilisasibasah adalah metode sterilisasidengan uap air bertekanan. Pensterilisasian menggunakan autoklaf dengan tekanan 2 atm dan suhu 121C. Suhu dan tekanan tinggi yang diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas sehingga didapatkan alat dan media yang steril. Salah satu yang digunakan dalam pembuatan media kali ini adalah Pepton Water ( Air Pepton). Adapun kegunaan media PW disterilkan ialah selain untuk mensterilkan media dari mikroorganisme itu sendiri juga agar zat yang terkandung dalam bahan tersebut benar-benar terekstrak. Dalam pensterilisasian media digunakan metode sterilisasi basah, langkah pensterilisasian di awali dengan dihidupkan pemanas, kemudian dimasukkan aquadest ke dalam autoklaf, Dimasukkan media yang akan disterilkan, tutup autoklaf dipasang dan sekrup-sekrup dikencangkan, nyala api kompor dikecilkan hingga saat suhu autoklaf mencapai 121oC dan ditunggu hingga 15 menit kemudian pemanas dimatikan, Autoklaf ditunggu hingga tekanannya menjadi nol kemudian di buka perlahan-lahan, kemudian dikeluarkan media yang telah jadi

BAB VPENUTUPV.1 KesimpulanAdapun kesimpulan pada praktikum ini ialah, Pepton Water dibuat, dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian disterilkan di autoklaf pada sushu 121o C selama 15 menitV.2 SaranPada saat melakukan praktikum, sebaiknya pratikan betul-betul memperhatikan kesterilan setiap alat dan bahan yang akan digunakan agar mendapat hasil praktikum sesuai yang diharapkan.

DAFTAR PUSTAKADirjen POM.1979.Farmakope Indonesia edisi III. Jakarta : Depkes RIFardiaz, Srikandi.1992.Mikrobiologi Pangan.Departemen Pendidikan dan KebudayaanPAU Pangan dan Gizi.Institut Pertanian Bogor.Pakadang, Dkk. 2015. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Parasitologi. Makassar: Jurusan Farmasi Politeknik Kesehatan Kemenkes Makassar.

Presscott, Harley. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology Fifth Edition. The McGraw-Hill Companies.Pujiati. 2012. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar. Madiun: Ikip PGRI Madiun Press.Volk , W. A & Wheeler. M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Jilid 1 Edisi ke 5. Jakarta: Erlangga.