LAPORAN MINGGUAN

BIOLOGI DAN MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA

Disusun Oleh:

Nama : Andi Tri Saputra

NIM : 1209065039

Kelompok : 6

Asisten : Wanda Merry Dedintha

LABORATORIUM REKAYASA LINGKUNGAN

FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS MULAWARMAN

SAMARINDA

2013

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Banyak sekali populasi mikroba di sekitar kehidupan. Ratusan spesies mikroba

menghuni bermacam-macam bagian tubuh manusia, termasuk mulut, saluran

pencernaan, dan kulit. Jumlah mikroba ini sangat luar biasa banyaknya. Sebagai contoh,

sekali bersin dapat menyebarkan beribu-ribu mikroorganisme. Satu gram tinja dapat

mengandung jutaan bakteri. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam

berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang

rumit ini, atau biakan campuran, menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai

biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari

satu sel induk (Michael, 2008).

Dalam praktikum kali ini kita akan mengetahu bagaimana cara suatu medium itu dibuat

agar dapan mengembangbiakan mikroorganisme dengan baik. Juga bagaimana untuk

menjadi medium pengembangbiakan itu steril atau bebas dari segala mikroba baik

pathogen maupun tidak (Indan, 2003).

Dasar makanan yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah medium yang

mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa makanan,

atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Maka dari itu, pada praktikum kali juga

akan mencoba untuk membuat makanan yang baik untuk pengembangbiakan bakteri.

(Dwidjoseputro, 1985)

1.2 Tujuan Percobaan

a. Mengetahui pengertian sterilisasi dan bagaimana prosesnya

b. Mengetahui pengertian medium dan bagaimana cara pembuatannya

c. Mengetahui apa itu autoclave dan bagaimana cara kerjanya

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

Menurut Agus (1994), sterilisasi adalah setiap proses (kimia atau fisik) yang membunuh

semua bentuk hidup terutama mikroorganisme. Sedangkan menurut Indan (2003), steril

(Suci Hama) artinya bebas dari segala mikroba baik pathogen maupun tidak. Tindakan

untuk membuat suatu benda menjadi steril disebut sterilisasi.

Cara-cara Sterilisasi:

1. Pembersihan

Pembersihan benda-benda atau permukaan tubuh akan mengurangi jumlah mikroba

sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya infeksi. Misalnya, cuci tangan dengan

sabun dan dibilas dengan air mengalir sebelum melakukan operasi.

2. Sinar Matahari, Sinar Ultraviolet, Sinar-X, dan Sinar-Gamma

Sinar ultraviolet dalam sinar matahari bersifat germicida, dapat membunuh bakteri

bentuk vegetatif maupun bentuk spora, walaupun untuk membunuh bentuk spora

waktunya harus lebih lama. Karena itu, menjemur pakaian, tempat tidur, alat-alat makan

ataupun benda-benda lainnya, penting untuk membunuh mikroba, terutama mikroba

pathogen. Sinar ultraviolet juga digunakan untuk desinfeksi air. Sinar ultraviolet

digunakan untuk sterilisasi ruang bedah, ruang industri farmasi di mana obat-obat steril

dimasukkan ke dalam vial atau ampul, juga ruangan industri makanan di mana bahan-

bahan makanan dimasukkan ke dalam kaleng. Walaupun sinar ultraviolet sangat ganas

terhadap mikroba, tetapi daya tembusnya kurang, sehingga hanya dapat matikan

mikroba-mikroba yang terdapat pada permukaan saja.

Sinar-X dan sinar gamma dapat membunuh mikroba karena merusak DNA dan

menyebabkan ionisasi komponen sel lainnya. Radiasi dengan sinar-X atau sinar gamma

sering digunakan untuk sterilisasi benda-benda yang tidak tahan suhu tinggi, misalnya

pompa suntik dari plastik, obat-obatan, alat-alat operasi. Selain untuk sterilisasi dalam

bidang kesehatan, radiasi tidak digunakan secara rutin karena mahal dan berbahaya.

Dalam bidang industri, radiasi dengan sinar gamma sering digunakan untuk sterilisasi

daging. Karena sinar ini memiliki daya tembus tinggi, maka radiasi dapat dilakukan

setelah dagingnya dikemas. Sebagai sumber sinar gamma yang sering digunakan dalam

industri adalah Cobalt-60.

3. Pendinginan

Suhu rendah menyebabkan pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba terhenti. Cara

ini dipakai untuk mengawetkan bahan makanan yang mudah membusuk, misalnya

daging karena pada suhu rendah ini, bahan makanan itu tidak akan dirombaknya. Pada

suhu -20°C (suhu lemari pendingin pada umumnya) mikroba tidak bisa merombak

makanan sehingga tidak terjadi pembusukan. Beberapa bakteri pathogen mati pada suhu

0°C. Misalnya: Neisseria gonorrhoea, Treponema pallida.

4. Pemanasan

Umumnya bakteri bentuk vegetatif, mati dalam waktu 5 — 10 menit pada suhu 65°C,

hal ini sama saja, baik bakteri yang mampu berbentuk spora maupun tidak. Sedangkan

bentuk spora perlu waktu lebih lama, misalnya bentuk spora Clotridium botulinum pada

suhu 100°C, mati dalam waktu 5 jam. Pemanasan dapat mematikan bakteri, karena

menggumpalkan (koagulasi) protoplasmanya (protein). Koagulasi protoplasma ini akan

lebih cepat bila terdapat lebih banyak air. Karena itu, sterilisasi dengan uap air panas

akan lebih cepat bila dibandingkan dengan menggunakan udara panas kering. Menurut

Agus (1994) panas juga membunuh bakteri karena mendenaturasi protein, terutama

enzim-enzim dan membran sel. Bentuk spora Clostridium botulinum dengan uap air

panas suhu 120°C, mati dalam waktu 10 menit, sedangkan dengan udara panas kering

suhu 120°C mati dalam 120 menit.

Macam-macam Cara Sterilisasi dengan pemanasan

a. Pemanasan Dalam Nyala Api

Di laboratorium mikrobiologi, cara ini dipakai untuk membuat steril jarum inokulasi,

pipet dan sebagainya. Dalam kehidupan sehari-hari, misalnya membakar peniti sebelum

dipakai mengeluarkan duri atau nanah. Cara ini dapat pula dipakai untuk mensterilkan

pisau operasi dalam keadaan darurat. Benda yang terkontaminasi karena telah

berhubungan dengan penderita atau hewan yang terinfeksi, sering kali dibakar untuk

menghilangkan sumber penularan penyakit.

b. Pemanasan dengan Udara Panas (Dry Heat Oven)

Cara ini dipakai untuk membuat steril alat-alat dari gelas seperti tabung reaksi, cawan

petri, botol dan alat-alat dari katun. Dengan cara ini pemanasan dilakukan sampai suhu

170°C selama 1 jam atau 140°C selama 2 jam. Bila ada bahan dari katun, suhu jangan

lebih dari 180°C karena akan terbakar. Juga pada pendinginannya, bila suhu oven belum

mencapai 100°C; oven jangan dulu dibuka sebab alat-alat dari gelas akan pecah karena

pendinginan yang mendadak.

c. Merendam Dalam Air Mendidih (Menggodok)

Merendam dalam air mendidih (menggodok) adalah cara yang mudah, murah, dan

cukup efektif sebagai tindakan desinfeksi. Cara ini sudah lama dikerjakan orang. Air

mendidih pada tekanan 1 atm, suhunya 100°C. Dengan menggodok ini bentuk vegetatif

akan mati dalam waktu 5 — 15 menit sedangkan bentuk spora akan mati dalam waktu 1

— 6 jam. Cara ini banyak digunakan untuk membuat steril jarum dan pompa suntik atau

alat-alat operasi asalkan dipastikan bahwa alat tersebut tidak berhubungan dengan

sumber-sumber spora, seperti debu tanah. Lama penggondokan dengan cara ini adalah

15 — 30 menit dan akan lebih baik bila ditambahkan 1 — 3% Na2CO3, karena

mempunyai daya untuk menghancurkan dinding spora. Dengan cara ini kita tidak

melakukan sterilisasi karena mungkin masih terdapat spora. Dalam kehidupan sehari-

hari cara menggodok dipakai untuk desinfeksi botol susu dan dotnya untuk minum bayi.

d. Pemanasan dengan Uap Air yang Mengalir

Prinsipnya sama dengan dandang untuk menanak nasi. Cara ini pertama kali dilakukan

oleh Robert Koch. Suhu uap air pada tekanan barometer 76 mmHg adalah 100°C.

Dengan cara ini juga hanya membunuh bakteri bentuk vegetatif. Di laboratorium cara

ini dipakai untuk membuat steril tabung reaksi, object-glass atau cawan petri, untuk

mematikan mikroba pathogen, sebelum alat-alat tersebut dicuci agar tidak

membahayakan. Lamanya pemanasan adalah 1 jam, sedangkan untuk membunuh

bentuk spora perlu waktu 2 — 16 jam.

e. Dengan Uap Air yang Ditekan

Alatnya disebut autoclave. Cara ini paling baik karena suhu yang dicapainya tinggi dan

air untuk koagulasi protein terdapat banyak. Dengan alat ini, besarnya tekanan uap air

yang diperlukan dapat diatur. Makin besar tekanan uap airnya, makin tinggi pula suhu

yang dicapainya. Lamanya pemanasan bergantung pada tekanan tekanan uap yang

dipergunakan, serta besar dan macamnya benda yang akan disterilkan. Pada tekanan uap

2 atm di mana suhu yang dicapai 120°C, lama pemanasannya cukup selama 10 — 20

menit. Dengan cara ini, baik bentuk vegetatif maupun spora akan mati, sehingga

mencapai steril sempurna.

f. Cara Sterilisasi Benda-benda yang Tidak Tahan Suhu Tinggi

Obat suntik, air susu atau perbenihan bakteri bila dipanaskan terlalu tinggi, akan

menjadi rusak. Untuk benda-benda seperti itu, Pasteur dan Tyndall telah menciptakan

cara sterilisasi khusus yang disebut Pasteurisasi dan Tyndallisasi.

(1) Pasteurisasi

Dengan pasteurisasi ini kita tida membuat steril, tetapi hanya membunuh mikroba

tertentu saja. Pasteurisasi dilakukan terhadap air susu juga pada pembuatan anggur.

Suhu yang diberikan dan lamanya pasteurisasi bergantung pada jenis mikroba yang

akan dibunuhnya.

Misalnya pasteurisasi susu. Maksud pasteurisasi susu adalah untuk mematikan bakteri

Mycobacterium tuberculosa. Brucella sp yang sering terdapat di dalam susu. Bakteri ini

mati pada suhu 60°C dalam waktu 15 menit. Pada tindakan pasteurisasi, susu

dipanaskan pada suhu 61,7°C atau 143°F selama 30 menit atau suhu 71,7°C atau 161°F

selama 15 menit. Dengan demikian, semua Mycobacterium tuberculosa akan mati

kemudian susu tersebut disimpan dalam kamar pendingin agar pertumbuhan mikroba

yang masih terhambat.

(2) Tyndallisasi

Dengan Tyndallisasi kita membuat steril suatu benda secara fraksi (sebagian-sebagian).

Cara ini dilakukan untuk membuat steril benda-benda yang tidak tahan suhu lebih dari

100°C. Caranya: Hari pertama, benda yang akan disterilkan dipanaskan dengan uap air

yang mengalir (100°C) selama 30 menit. Kemudian, dimasukkan ke dalam inkubator

selama 24 jam. Hari kedua, pemanasan dan pengeraman diulangi lagi. Hari ketiga

diulangi untuk ketiga kalinya dan sterilisasi dianggap selesai.

Maksud pemanasan secara ini, yaitu mula-mula dimatikan bentuk vegetatifnya. Setelah

itu, benda yang akan disterilkan dieramkan selama 24 jam untuk memberi kesempatan

kepada bentuk sporanya untuk berubah ke bentuk vegetatifnya yang akan dimatikan

pada pemanasan berikutnya.

5. Dengan Pengeringan

Air sangat penting untuk kehidupan mikroba, terutama karena mikroba mengambil

makanan dari luar dalam bentuk larutan. Pengeringan akan menyebabkan larutan di

sekeliling mikroba menjadi hipertonis, sehingga air ke luar dari sel mikroba dan

mikroba mati. Gangguan tekanan osmotik ini akan diperhebat bila ditambahkan garam

dan bumbu-bumbu, seperti halnya pada pembuatan ikan asin atau dendeng. Cara ini

bukanlah tindakan sterilisasi, melainkan pengawetan, karena dengan pengeringan ini

hanya menyebabkan berhentinya pertumbuhan dan perkembangan mikroba.

Beberapa bakteri yang akan segera mati karena pengeringan misalnya Neisseria

gonorrhoea dan Neisseria meningitidis, sedangkan Streptococcus pyogenes dan

Mycobacterium tuberculosis dapat tahan sampai berminggu-minggu.

6. Dengan penyaringan (Filtrasi)

Filtrasi dipergunakan untuk membuat steril cairan atau larutan yang thermolabil (mudah

rusak karena pemanasan), seperti serum, enzim, atau antibiotika. Contoh filter antara

lain:

Filter Seitz dibuat dari asbest

Filter Berkefeld dibuat dari diatomea

Filter Chamberland dibuat dari porcelain

Filter-filter ini mempunyai pori-pori yang sangat halus (0,1 — 0,2µm) sehingga

filtratnya bebas dari bakteri. Dengan filtrasi, tidak dapat membuat cairan steril

sempurna karena filtratnya masih mungkin mengandung virus, sebab virus akan lolos

pada saringan tersebut.

7. Dengan Menggunakan Zat Kimia

Desinfektan dibagi dalam beberapa golongan, yaitu:

a. Golongan phenol dan turunannya

Misalnya: phenol, cresol, hexylresorcinol, dan hexachlorophene. Larutan phenol 2 —

5% dipakai sebagai desinfektan pada sputum, urine, feses atau alat-alat terkontaminasi.

Virus dan bakteri bentuk spora, lebih tahan lama terhadap phenol dibandingkan dengan

bakteri bentuk vegetatif. Daya germicida phenol akan berkurang pada suhu rendah dan

bila ada sabun. Orang yang pertama kali menggunakan phenol (carbolic acid) sebagai

desinfektan adalah Joseph Lister (1827 — 1912), seorang ahli bedah Inggris. Phenol

juga dipakai sebagai desinfektan standar untuk mengukur kekuatan desinfektan lainnya.

Prinsip daya kerja phenol adalah mendenaturasikan protein.

b. Alkohol

Ethyl alkohol (CH3CH2OH) merupakan desinfektan yang paling sering dipakai. Untuk

desinfektan kuliat, digunakan kadar ethyl alkohol 70%. Daya kerjanya yaitu

mengkoagulasikan protein dan menarik air sel.

c. Yodium

Yodium merupakan germicida tertua. Kurang baik kelarutannya dalam air. Lebih baik

kelarutannya dalam alkohol atau dalam larutan KJ atau NaJ. Preparatnya disebut

yodium tincture yang dapat berupa NaJ 2% ditambah Yodium 2%, dilarutkan dalam

ethanol 70%; atau yodium 7% ditambah KJ 5% dilarutkan dalam larutan ethanol 83%

atau yodium 5% dilarutkan dalam larutan KJ 10% dalam air. Preparat yang lain adalah

betadine yang banyak digunakan untuk membersihkan luka dan tindakan antiseptik

pada kulit sebelum pembedahan. Betadine terdiri atas preparat yodium dan detergent.

Berbeda dengan yodium tincture, betadine tidak menimbulkan rasa sakit sehingga lebih

disukai, terutama bagi anak-anak. Yodium merupakan baktericida yang paling kuat,

bahkan bersifat sporisida, fungisida dan virusida. Diduga daya kerjanya karena yodium

berikatan dengan protein sel.

d. Preparat Klor

Banyak dipakai untuk desinfeksi air minum, misalnya calcium hypochlorite (kaporit).

Daya kerjanya berdasarkan proses oksidasi.

e. Logam-logam Berat dan Senyawanya

Penggunaannya karena logam berat memiliki kecenderungan yang besar sekali untuk

berikatan dengan protein sel. Logam-logam tersebut adalah Hg, Ag dan Cu.

Preparat Hg : HgCl2; HgCl; HgO, Mercurochrome

Ag : AgNO3; Ag laktat; Ag pikrat

Cu : CuSO4

CuSO4 dipakai untuk desinfeksi kolam renang karena selain sebagai baktericida juga

dapat membunuh ganggang (algae) dalam larutan 2/1.000.000.

f. Zat Warna

Misalnya gentian violet, terutama menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan

fungi (jamur). Zat warna lainnya misalnya: malachite green, brilliant green, acriflavin.

Acriflavin digunakan untuk tindakan antiseptik pada selaput lendir dan pengobatan luka.

Daya kerja zat warna ini karena berikatan dengan protein bakteri.

g. Sabun dan Detergent Sintesis

Sabun adalah ikatan antara Natrium atau Kalium dengan asam lemak tinggi dan bersifat

germicida walaupun tidak begitu kuat, misalnya terhadap Pneumococcus dan

Streptococcus, sedangkan bakteri-bakteri lain lebih tahan. Sabun juga menyebabkan

menurunnya tegangan permukaan, sehingga mikroba mudah lepas dari kulit atau

pakaian. Berbagai zat yang bersifat germicida sering ditambahkan pada sabun.

h. Senyawa Ammonium Quarterner

Misalnya: Zephiran, phemerol.

i. Oksidator

Misalnya: H2O2; KMnO4. Sering dipakai untuk mencuci luka.

j. Aerosol

Aerosol adalah zat kimia sebagai antimikrobial yang disemprotkan ke udara sehingga

membentuk butiran-butiran halus (1 — 2 mikron) dan tetap tersuspensi dalam udara

untuk waktu yang cukup lama. Dipergunakan untuk desinfektan ruangan. Zat yang

sering dipakai adalah: prophylene glycol; ethylen glycol; triethylene glycol.

k. Dengan Fumigasi

Yang sering dipakai adalah formaldehyde dan ethylene oxida. Formaldehyde hanya

berbentuk gas pada konsentrasi tinggi dan suhu agak tinggi, sedangkan pada suhu kamar

zat tersebut berbentuk padat. Cara fumigasi ini digunakan untuk desinfeksi suatu

ruangan setelah selesai ditempati penderita suatu penyakit menular, misalnya bekas

ruangan penderita pest paru-paru.

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-

zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang

dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan

isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media

pertumbuhannya. Media biakan adalah bahan atau campuran bahan yang dapat

digunakan untuk membiakkan mikroorganisme, karena memiliki daya duang yang

tinggi terhadap tumbuhan dan perkembang biakkannya (Dian, 2012).

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang

disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan

mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan

kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme

dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam

anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime

lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium

ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya. Akan tetapi yang terpenting

medium harus mengandung nutrien yang merupakan substansi dengan berat molekul

rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah degradasi dari nutrien dengan

molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus memenuhi kebutuhan dasar

makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.

Untuk menelaah bakteri di dalam laboratorium, pertama-tama kita harus dapat

menumbuhkan bakteri tersebut di dalam suatu biakan murni. Untuk melakukannya

haruslah dimengerti jenis-jenis nutrient yang disyartakan oleh bakteri dan juga macam

lingkungan fisik yang mana dapat menyebabkan kondisi yang optimum bagi

pertumbuhannya tersebut. Agar mendapatkan satu spesies saja dalam satu piaraan, maka

perlulah diadakan suatu piaraan murni. Menurut Dwidjoseputro (1985), piaraan murni

dapat diperoleh dari piaraan campuran. Dan menurut Michael (2008), semua bentuk

kehidupan, dari mikroorganisme sampai kepada manusia mempunyai persamaan dalam

hal persyaratan nutrisi tertentu dalam bentuk zat-zat kimiawi yang diperlukan untuk

pertumbuhan dan fungsinya yang normal.

Media PDA (Potato Dextrose Agar) merupakan medium semisintetik. Media

merupakan tempat dimana terjadi perkembangan organism, organism menyerap

karbohidrat dari kaldu kentang dan gula serta dari agar yang telah dicampur. Hal ini lah

yang menyebabkan mengapa kentang harus dipotong dadu, agar karbohidrat di kentang

dapat di kelar dan menyatu dengan air sehingga menjadi kaldu. Semakin kecil

permukaan maka semakin besar daya osmosirnya (Dian, 2012).

Nutrient agar adalah medium pertumbuhan mikrobiologi umum digunakan untuk

budidaya rutin non-pemilih bakteri. Hal ini berguna karena tetap solid bahkan pada suhu

relatif tinggi. Juga, bakteri tumbuh di nutrient agar tumbuh di permukaan, dan jelas

terlihat sebagai koloni kecil. Dalam kaldu nutrisi, bakteri tumbuh dalam cairan, dan

dipandang sebagai zat pekat, bukan rumpun sejelas dibedakan (Vidi, 2012).

Nutrient Agar (NA) merupakan suatu medium yang berbentuk padat, yang merupakan

perpaduan antara bahan alamiah dan senyawa-senyawa kimia. NA dibuat dari campuran

ekstrak daging dan peptone dengan menggunakan agar sebagai pemadat. Dalam hal ini

agar digunakan sebagai pemadat, karena sifatnya yang mudah membeku dan

mengandung karbohidrat yang berupa galaktam sehingga tidak mudah diuraikan oleh

mikroorganisme. Dalam hal ini ekstrak beef dan pepton digunakan sebagai bahan dasar

karena merupakan sumber protein, nitrogen, vitamin serta karbohidrat yang sangat

dibutuhkan oleh mikroorganisme untuk tumbuh dan berkembang. Medium Nutrient

Agar (NA) merupakan medium yang berwarna coklat muda yang memiliki konsistensi

yang padat dimana medium ini berasal dari sintetik dan memiliki kegunaan sebagai

medium untuk menumbuhkan bakteri (Harry, 2012).

BAB 3

METODOLOGI PERCOBAAN

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum mikrobiologi tentang peralatan, sterilisasi dan pembuatan media

dilaksanakan di Laboratorium Rekayasa Lingkungan. Pada hari Senin tanggal 8 April

2013 pukul 11.00 — 15.00 bertempat di Fakultas Teknik Universitas Mulawarman

Samarinda.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat-Alat

1. Labu erlenmeyer

2. Cawan petri

3. Neraca analitik

4. Magnetic Stirrer

5. Hot plate

6. Oven

7. Medical Sterilizer

8. Spatula

9. Sikat tabung

3.2.2 Bahan-Bahan

1. Aquadest

2. PDA (Potato Dextrose Agar)

3. NA (Nutrient Agar)

4. Sabun cuci

5. Aluminium foil

6. Ekstrak daging

7. Ekstrak kentang

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Sterilisasi Alat

1. Cuci semua alat yang akan disterilkan dengan sabun seperti: labu erlenmeyer dan

cawan petri.

2. Bilas dengan aquadest kemudian keringkan.

3. Setelah itu dikeringkan, lalu dibungkus dengan aluminium foil. Untuk cawan petri

seluruhnya dibungkus dengan aluminium foil, sedangkan untuk labu erlenmeyer

hanya dibagian mulutnya.

4. Dimasukkan dalam oven & disterilisasikan dengan suhu 180°C selama 3 jam.

3.3.2 Pembuatan PDA (Potato Dextrose Agar)

1. Disiapkan 500 mL ekstrak kentang

2. Ditimbang 5 gr PDA dan 7,5 gr agar

3. Dituangkan ekstrak kentang ke dalam labu erlenmeyer

4. Dimasukkan PDA dan agar yang sudah ditimbang

5. Dituangkan ke dalam labu erlenmeyer dan dimasukkan stirrer ke dalamnya

6. Ditutup dengan aluminium foil dibagian mulut tabung erlenmeyer kemudian

diletakkan di atas hot plate kemudian magnetic stirrer hingga mendidih

3.3.3 Pembuatan NA (Nutrient Agar)

1. Disiapkan ekstrak daging 500 mL

2. Ditimbang 2,5 gr peptone dan 7,5 gr agar

3. Dituangkan ekstrak daging ke dalam labu erlenmeyer

4. Dimasukkan pepton dan agar yang sudah ditimbang

5. Kemudian labu erlenmeyer dimiringkan, lalu memasukkan stirrer ke dalam labu

erlenmeyer

6. Labu erlenmeyer dipanaskan di atas hot plate hingga mendidih

BAB 4

HASIL PENGAMATAN

4.1 Hasil Pengamatan

Tabel 4.1. jenis dan fungsi alat

No. Nama Alat Fungsi

1. Botol sample Menyimpan sample

2. Botol sample gelap Menyimpan sample tanpa pengaruh cahaya

3. Kawat ose Menginokulasi bakteri

4. Bulp Mengambil cairan

5. Corong Memasukkan bahan

6. Labu erlenmeyer Menampung bahan

7. Cawan petri Media menaruh bahan

8. Kertas saring Memisahkan bahan

9. Pipet Mengambil cairan

10. Neraca analitik Mengukur massa

11. Magnetic stirrer Mengaduk larutan

12. Hot plate Memanaskan

13. Oven Memanaskan alat

14. Medical sterilizer Membunuh mikroorganisme

15. Spatula Mengaduk & mengambil bahan

16. Pinset Mengambil bahan padat

Tabel 4.2. komposisi media

1. PDA (Potato Dextrose Agar) 500 mL ekstrak kentang

5 gr PDA

7,5 gr agar

2. NA (Nutrient Agar) 500 mL ekstrak daging

5 gr peptone

7,5 gr agar

4.2 Pembahasan

Percobaan kali ini mengenai sterilisasi dan pembuatan nutrien untuk mikroba, tujuannya

adalah untuk menciptakan sebuah medium yang steril dan membuat makanan untuk

mikroba. Percobaan dibagi menjadi 3.

Percobaan pertama adalah sterilisasi. Pada percobaan sterilisasi, labu erlenmeyer dan

cawan petri pada awalnya dicuci dengan sabun cuci untuk membunuh mikroba dengan

cara kimia, kemudian dibilas dengan aquadest. Setelah dikeringkan, labu erlenmeyer

dan cawan petri kemudian dibungkus dengan aluminium foil untuk isolasi termal

(penghalang dan reflektifitas), jadi panasnya tidak akan keluar dari dalam labu

erlenmeyer maupun cawan petri yang ingin disterilkan.

Percobaan kedua adalah pembuatan Potato Dextrose Agar (PDA). Pada pembuatan

PDA ini awalnya adalah mencampurkan ekstrak kentang dengan PDA dan agar.

Tujuannya adalah untuk membuat nutrisi untuk mikroba yang mengandung substansi

jaringan tumbuhan yang dapat larut dalam air.Dan agar digunakan sebagai bahan

pemadatan media.

Percobaan ketiga adalah pembuatan Nutrient Agar (NA). Pada pembuatan NA ini

dengan cara mencampurkan ekstrak daging dengan pepton dan agar. Ekstrak sapi

mengandung substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air, meliputi karbohidrat,

senyawa nitrogen organik, vitamin yang dapat larut dalam air, dan garam-garam.

Penambahan pepton untuk sumber utama nitrogen organik; dapat pula mengandung

vitamin dan kadang-kadang karbohidrat, bergantung kepada jenis bahan berkandung

protein yang dicernakan. Dan agar digunakan sebagai bahan pemadatan media.

Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi kesalahan pada saat praktikum adalah :

a. Alat yang digunakan tidak steril

b. Bahan yang digunakan sudah terkontaminasi dengan zat yang lain

c. Kurangnya ketelitian praktikan pada saat melakukan percobaan baik pada saat

penimbangan maupun pada saat titrasi

d. Kurang teliti pada saat membaca volume titrasi

Autoclave adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu

benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121°C, 15 lbs) selama kurang

lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk membunuh

mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu yang tinggi inilah

yang akan membunuh mikroorganisme. Autoklaf terutama ditujukan untuk membunuh

endospora, yaitu sel resisten yang diproduksi oleh bakteri, sel ini tahan terhadap

pemanasan, kekeringan, dan antibiotik. Pada spesies yang sama, endospora dapat

bertahan pada kondisi lingkungan yang dapat membunuh sel vegetatif bakteri tersebut.

Endospora dapat dibunuh pada suhu 100°C, yang merupakan titik didih air pada tekanan

atmosfer normal. Pada suhu 121°C, endospora dapat dibunuh dalam waktu 4 — 5

menit, di mana sel vegetatif bakteri dapat dibunuh hanya dalam waktu 6 — 30 detik

pada suhu 65°C.

Perhitungan waktu sterilisasi autoklaf dimulai ketika suhu di dalam autoklaf mencapai

121°C. Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian

dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan total

untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121°C untuk waktu 10 — 15 menit.

Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar akan diautoklaf

karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mencapai suhu

sterilisasi. Performa autoklaf diuji dengan indikator biologi, contohnya Bacillus

stearothermophilus. Terdapat tiga jenis autoklaf, yaitu gravity displacement, prevacuum

atau high vacuum, dan steam-flush pressure-pulse. Perbedaan ketiga jenis autoklaf ini

terletak pada bagaimana udara dihilangkan dari dalam autoklaf selama proses sterilisasi.

1. Gravity Displacement Autoclave

Udara dalam ruang autoklaf dipindahkan hanya berdasarkan gravitasi. Prinsipnya

adalah memanfaatkan keringanan uap dibandingkan dengan udara, sehingga udara

terletak di bawah uap. Cara kerjanya dimulai dengan memasukan uap melalui bagian

atas autoklaf sehingga udara tertekan ke bawah. Secara perlahan, uap mulai semakin

banyak sehingga menekan udara semakin turun dan keluar melalui saluran di bagian

bawah autoklaf, selanjutnya suhu meningkat dan terjadi sterilisasi. Autoklaf ini dapat

bekerja dengan cakupan suhu antara 121 — 134°C dengan waktu 10 — 30 menit.

2. Prevacuum atau High Vacuum Autoclave

Autoklaf ini dilengkapi pompa yang mengevakuasi hampir semua udara dari dalam

autoklaf. Cara kerjanya dimulai dengan pengeluaran udara. Proses ini berlangsung

selama 8 — 10 menit. Ketika keadaan vakum tercipta, uap dimasukkan ke dalam

autoklaf. Akibat kevakuman udara, uap segera berhubungan dengan seluruh permukaan

benda, kemudian terjadi peningkatan suhu sehingga proses sterilisasi berlangsung.

Autoklaf ini bekerja dengan suhu 132 — 135°C dengan waktu 3 — 4 menit.

3. Steam-Flush Pressure-Pulse Autoclave

Autoklaf ini menggunakan aliran uap dan dorongan tekanan di atas tekanan atmosfer

dengan rangkaian berulang. Waktu siklus pada autoklaf ini tergantung pada benda yang

disterilisasi.

Prinsip Cara Kerja Autoclave

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoclave lama kelamaan akan

mendidih.

Uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoclave.

Setelah udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup udara/uap ditutup

sehingga tekanan udara dalam autoclave naik.

Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan

timer mulai menghitung waktu mundur.

Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan

turun perlahan hingga mencapai suhu 0°C.

Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah:

Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim

Pelarut organik, seperti fenol

Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi antara lain:

1. Kelembaban

2. Konsentrasi gas

3. Suhu

4. Distribusi gas dalam chamber pengsterilan

Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan

pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua,

harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-

zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.

Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang

dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan

isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media

pertumbuhannya.

Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dan dikembangkan pada suatu substrat yang

disebut medium. Medium yang digunakan untuk menumbuhkan dan

mengembangbiakkan mikroorganisme tersebut harus sesuai susunanya dengan

kebutuhan jenis-jenis mikroorganisme yang bersangkutan. Beberapa mikroorganisme

dapat hidup baik pada medium yang sangat sederhana yang hanya mengandung garam

anargonik di tambah sumber karbon organik seperti gula. Sedangkan mikroorganime

lainnya memerlukan suatu medium yang sangat kompleks yaitu berupa medium

ditambahkan darah atau bahan-bahan kompleks lainnya.

Akan tetapi yang terpenting medium harus mengandung nutrien yang merupakan

substansi dengan berat molekul rendah dan mudah larut dalam air. Nutrien ini adalah

degradasi dari nutrien dengan molekul yang kompleks. Nutrien dalam medium harus

memenuhi kebutuhan dasar makhluk hidup, yang meliputi air, karbon, energi, mineral

dan faktor tumbuh.

Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan media yang sangat umum yang digunakan

untuk mengembangbiakkan dan menumbuhkan jamur dan khamir. Komposisi Potato

Dextrose Agar ini terdiri dari bubuk kentang, dextrose dan juga agar. Bubuk kentang

dan juga dextrose merupakan sumber makanan untuk jamur dan khamir.

Potato Dextrose Agar juga bisa digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme

menggunakan metode Total Plate Count. Perindustrian seperti industri makanan,

industri produk susu dan juga kosmetik menggunakan PDA untuk menghitung jumlah

mikroorganisme pada sample mereka.

Nutrient agar adalah medium pertumbuhan mikrobiologi umum digunakan untuk

budidaya rutin non-pemilih bakteri. Hal ini berguna karena tetap solid bahkan pada suhu

relatif tinggi. Juga, bakteri tumbuh di nutrient agar tumbuh di permukaan, dan jelas

terlihat sebagai koloni kecil. Dalam kaldu nutrisi, bakteri tumbuh dalam cairan, dan

dipandang sebagai zat pekat, bukan rumpun sejelas dibedakan. Agar nutrien biasanya

mengandung:

Peptone

Ekstrak daging sapi

Agar

NaCl

Air suling

pH disesuaikan dengan netral (6,8) pada 25 ° C. Kaldu nutrisi dibuat identik, kecuali

menghilangkan agar-agar.

BAB 5

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a. Sterilisasi adalah setiap proses (kimia atau fisik) yang membunuh semua bentuk

hidup terutama mikroorganisme. Cara untuk sterilisasi antara lain:

Pembersihan

Sinar matahari, sinar ultraviolet, sinar-x dan sinar gamma

Pendinginan

Pemanasan

Pengeringan

Dengan penyaringan (filtrasi)

Dengan menggunakan zat kimia

b. Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran

zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya.

Media PDA (Potato Dextrose Agar) merupakan medium semisintetik, merupakan

tempat dimana terjadi perkembangan organisme, organisme menyerap karbohidrat

dari kaldu kentang dan gula serta dari agar yang telah dicampur. Cara pembuatan

PDA (Potato Dextrose Agar) adalah mencampurkan ekstrak kentang dengan PDA

dan agar. Kemudian memanaskannya di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic

stirrer. NA (Nutrient Agar) adalah medium pertumbuhan mikrobiologi umum

digunakan untuk budidaya rutin non-pemilih bakteri. Hal ini berguna karena tetap

solid bahkan pada suhu relatif tinggi. Cara pembuatan Nutrient Agar adalah dengan

mencampurkan ekstrak daging dengan pepton dan agar. Kemudian memanaskannya

di atas hot plate dan diaduk dengan magnetic stirrer.

c. Autoclave adalah alat pemanas tertutup yang digunakan untuk mensterilisasi suatu

benda menggunakan uap bersuhu dan bertekanan tinggi (121°C, 15 lbs) selama

kurang lebih 15 menit. Penurunan tekanan pada autoklaf tidak dimaksudkan untuk

membunuh mikroorganisme, melainkan meningkatkan suhu dalam autoklaf. Suhu

yang tinggi inilah yang akan membunuh microorganisme. Prinsip Cara Kerja

Autoclave:

Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoclave lama kelamaan akan

mendidih.

Uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoclave.

Setelah udara dalam autoclave diganti dengan uap air, katup udara/uap ditutup

sehingga tekanan udara dalam autoclave naik.

Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai, maka proses sterilisasi dimulai dan

timer mulai menghitung waktu mundur.

Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan tekanan dibiarkan

turun perlahan hingga mencapai suhu 0°C.

5.2 Saran

Untuk praktikum berikutnya sebaiknya dilakukan juga pembuatan medium yang lainnya

selain PDA dan NA, karena dengan begitu mahasiswa akan lebih berwawasan dan tidak

hanya terpaku pada PDA dan NA.

Daftar Pustaka

1. Andiga, Harry, “Komposisi Nutrient Agar dan Nutrient Broth dan

Kegunaannya”, http://asalkamutahuaja.blogspot.com/ (Samarinda, April 2013)

2. Agus Syahrurachman, dkk. 1993. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran, Jakarta:

Binarupa Aksara.

3. Dian, Mahardhika, “Autoclave dan Waterbath”, http://dicckha.blogspot.com,

(Samarinda, April 2013).

4. Dwidjoseputro, D. 1985. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang: Penerbit

Djambatan.

5. Entjang, Indan. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi untuk Akademi

Keperawatan dan Sekolah Tenaga Kesehatan yang Sederajat, Bandung:

Penerbit PT. Citra Aditya Bakti.

6. Galung, Firman, “Medium dan Cara Pembuatan Medium”,

http://firebiology07.wordpress.com/, (Samarinda, April 2013).

7. Maisyah, R, “Metode Sterilisasi”, http://rgmaisyah.wordpress.com/, (Samarinda,

April 2013).

8. Sembiring, Dian, “Pembuatan PDA (Potato Dextrose Agar)”,

http://diansembiring17.blogspot.com, (Samarinda, April 2013).

9. Michael Pelczar, dkk. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jakarta: Penerbit

Universitas Indonesia.

Lampiran

Gambar 1: PDA (Potato Dextrose Agar) di atas magnetic stirrer & hot plate.

Gambar 2: NA (Nutrient Agar) di atas magnetic stirrer & hot plate.