LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGANPEMERIKSAAN AIRMetode Most Probable Number

KELOMPOKEki Noerfitriyani1306368053Amrina Rosyada1306368034

Tanggal Praktikum: 09 - 12 November 2015Asisten Praktikum: Tiara HadilTanggal disetujui:Nilai:Paraf Asisten:

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI LINGKUNGANPROGAM STUDI TEKNIK LINGKUNGANDEPARTEMEN TEKNIK SIPILFAKULTAS TEKNIKUNIVERSITAS INDONESIADEPOK2015PEMERIKSAAN AIRA. TujuanTujuan praktikum Pemeriksaan Air adalah untuk mengetahui tingkat pencemaran koliform terutama oleh kotoran (feaces) di lingkungan perairan Danau Ulin dengan pengambilan sampel di inlet danau menggunakan metode Most Probable Number (MPN).B. Dasar Teori1. Pemeriksaan AirPemeriksaan air dapat diartikan sebagai proses pengecekan kualitas dan tingkat pencemaran pada suatu perairan yang dilakukan dengan memeriksa jenis mikroorganisme yang terdapat didalamnya. Pemeriksaan air yang dilakukan secara mikrobiologis dilakukan untuk menentukan kualitas dari suatu perairan. Pemeriksaan air penting untuk dilakukan karena air merupakan penopang kehidupan yang utama untuk semua makhluk hidup. Pencemar biologis yang terdapat dalam air dapat berupa mikroorganisme pathogen atau penghasil racun. Pemeriksaan biologis dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui derajat pencemaran dari suatu perairan. Pencemaran suatu perairan dapat ditandai dengan kehadiran dari mikroorganisme kelompok koliform. Kelompok mikroba koliform merupakan semua Gram negatif berbentuk batang yang tidak membentuk spora serta mampu memfermentasi laktosa dengan pembentukan asam dan gas pada suhu 37C dalam waktu kurang dari 48 jam. Dalam pemeriksaan mikroorganisme koliform diklasifikasikan menjadi dua jenis, yaitu mikroorganisme kelompok koliform fekal dan kelompok non fekal. Koliform non fekal bersumber dari hewan dan tanaman yang telah mati seperti Enterobacter aerogenes, dan koliform fekal brasal dari kotoran manusia dan hewan seperti Escherichia coli. Escherichia coli selain dianggap sebagai Gram negatif, tidak membentuk spora, dan dapat memfermentasikan laktosa dengan menghasilkan asam dan gas pada suhu 44,5C dalam waktu kurang dari 48 jam dan juga menghasilkan indol di dalam air pepton yang berisi triptofan dan tidak dapat menggunakan natrium sitrat sebagai sumber karbon.Untuk mengetahui jumlah kelompok mikroorganisme koliform dalam sampel air dapat dengen menggunakan metode Most Probable Number (MPN) atau bisa juga dsebut sebagai Jumlah Perkiraan Terdekat (JPT). Prinsip dari metode tersebut adalah dengan fermentasi laktosa oleh mikroorganisme koliform dalam waktu 24 jam yang jika positif koliform maka akan menunjukkan tanda keruh yang berarti mikroorganisme menghasilkan asam dan terdapat gas yang tertangkap oleh tabung Durham dalam tabung reaksi. Mikroorganisme koliform memiliki kemampuan untuk menguraikan laktosa sebagai sumber karbon, sedangkan kelompok mikroorganisme yang terdapat dalam usus lainnya tidak memiliki kemampuan tersebut. Uji kualitatif koliform terdiri dari tiga tahapan, yaitu uji penduga, uji penguat, dan uji pelengkap.a. Uji Penduga (Presumtive Test)Uji penduga merupakan uji pendahuluan untuk menentukan ada atau tidaknya kehadiran mikroorganisme koliform yang didasarkan dengan terbentuknya asam dan gas karena fermentasi laktosa oleh kelompok mikroba koliform. Terbentuknya asam dapat dilihat dari kekeruhan yang dihasilkan pada media laktosa, dan terbentuknya gas dapat dilihat dengan adanya gelembung udara yang tertangkap dalam tabung Durham. Tabung reaksi dinyatakan positif jika terbentuk gas sebanyak 10% atau lebih dari volume dalam tabung Durham. Jika inkubasi dalam waktu 24 jam dengan temperatur 37C menunjukkan hasil negatif, maka dilanjutkan hingga 24 jam. Jika dengan waktu inkubasi selama 48 jam tidak terbentuk gas dalam tabung Durham maka tabung reaksi dihitung sebagai hasil negatif. b. Uji Penguat (Confirmed Test)Hasil tabung positif yang didapatkan dari uji penduga selanjutnya dilakukan inolukasi dengan menggunakan jarum ose ke tabung reaksi berisi media Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGLB). Selanjutnya tabung reaksi diinkubasikan pada suhu 37C selama 48 jam. Sedangkan untuk pengujian koliform fekal dilakukan dengan inkubasi pada suhu 44,5C selama 24 jam. Pembentukan gas dalam tabung Durham menunjukkan hasil positif. Media dan suhu inkubasi digunakan untuk membiakkan mikroba. Konsentrasi mikroba koliform dapat dilihat dengan menghitung tabung reaksi yang menunjukkan reaksi positif terbentuknya asam dan gas dan membandingkannya dengan tabel MPN. Metode MPN digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam sampel yang berbentuk cairan. Jumlah tabung positif dihitung dalam masing-masing seri, dan enumerasi mikroorganisme dapat dilihat dengan membandingkan hasil pada tabel MPN.Terbentuknya gas di dalam medium Lactose Broth dan BGLB tidak selalu menunjukkan jumlah koliform fekal karena ada kemungkinan mikroba lain yang dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk gas seperti bakteri asam laktat dan khamir tertentu. Oleh sebab itu, diperlukan pengujian penguat lainnya dengan menggunakan media agar Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) atau Endo Agar (EA). Media tersebut berupa media selektif yang digunakan untuk mengisolasi keberadaan bakteri target. Dengan menggunakan ose, sampel dari tabung reaksi positif diinokulasikan pada cawan dengan goresan kuadran (streak). Kemudian cawan diinkubasikan pada suhu 37C selama 24 jam. Pada media EMBA, sampel yang positif mengandung koliform fekal ditunjukkan dengan perubahan warna sampel menjadi hijau metalik, sedangkan pada media NA perubahan warna menjadi merah muda metalik.c. Uji Pelengkap (Confirmed Test)Dari pertumbuhan koloni pada cawan agar selanjutnya digunakan dengan uji pelengkap untuk menentukan koliform fekal. Dari koloni yang berwarna pada uji penguat diinokulasikan ke medium laktosa dan medium agar miring Nutrient Agar (NA) dengan menggunakan jarum ose. Kemudian tabung diinkubasi pada suhu suhu 37C selama 24 jam. Bila hasilnya positif mengandung koliform fekal maka akan terbentuk asam dan gas pada medium laktosa, sedangkan dari medum agar miring NA selanjutnya dibuat pewarnaan Gram dimana koliform fekal yaitu Escherichia coli akan menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk membedakan antara bakteri kelompok koliform dan koliform fekal maka pekerjaan dibuat duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu 37C untuk kelompok koliform, dan satu seri diinkubasi pada suhu 44,5C untuk kelompok koliform fekal. Bakteri kelompok koliform tidak dapat berkembang dengan baik pada suhu 44,5C.2. Uji IndolIndol, reagen kovaks, dan reagen indol titik digunakan untuk menentukan reaksi indol dari bakter. Uji indol merupakan pengujian secara kualitatif untuk menentukan memampuan dari bakteri untuk memproduksi indol dengan deaminasi triptofan. Dalam penggunaan metode kovaks kombinasi indol, dalam kehadiran dari media kaya triptofan. Dengan p-Dimethylaminobenzaldehyde pada pH asam dalam alkohol akan memproduksi senyawa merah violet. Sedangkan dalam uji titik kombinasi indol, dalam filter matriks kertas, dan pada pH asam dengan p-Dimethylaminocinnamaldehyde (DMACA) akan memproduksi senyawa biru kehijauan. Reagen indol titik (DMACA) diketahui sangat berguna dalam mendeteksi produksi indol pada anggota dari Enterobacteriaceae dan spesies anaerobik lainnya.Formulasi penyusun dari reagen kovaks indol terdiri dari p-Dimethylaminobenzaldehyde 50 gm, Hydrochloric Acid 37% 250 ml, dan Amyl Alcohol 750 ml. Sedangkan penyusun reagen indol titik terdiri dari p-Dimethylaminobenzaldehyde 10 gm, Hydrochloric Acid 37% 100 ml, dan Deionized Water 900 ml.Prosedur penggunaan reagen kovaks indol adalah dengan menginokulasi tripton atau peptone broth dengan organisme yang akan diuji. Selanjutnya adalah menginkubasi selama 24-48 jam pada suhu 35 derajat celsius, kemudian memasukkan reagen kovaks ke tabung dan dihomogenkan. Jika hasil tabung positif koliform maka akan terdapat lapisan merah pada atas larutan, jika hasil negatif maka tidak berwarna atau berwarna kuning cerah.Prosedur penggunaan reagen indol titik (DMACA) adalah dengan meneteskan beberapa tetes reagen indol titik ke sebuah lapisan kertas filter. Selanjutnya adalah menginokulasi koloni yang berasal dari media non selektif dan telah diinkubasi selama 18-24 jam ke kertas filter. Hasil reaksi positif adalah dengan perubahan warna dari biru menjadi biru kehijauan atau merah violet untuk jenis Providencia alcalifaciens dalam waktu 10 detik. Untuk reaksi negatif maka kertas filter akan tidak berwarna atau merah muda cerah. Untuk pengujian indol jika positif mikroba Escherichia coli pada reagen kovaks indol akan menunjukan perubahan warna merah, sedangkan pada reagen indol titik akan menunjukkan perubahan warna biru.Uji indol digunakan untuk mengidentifikasi dan membedakan antara organisme Gram positif dan Gram negatif. Metode kovaks indol adalah metode yang lebih sensitif dalam mendeteksi indol dibanding dengan uji titik. Namun pengujian ini terbatas pada media yang digunakan. Media berisi glukosa tidak bisa digunakan dalam uji indol karena formasi dari produk akhir asam yang dapat mereduksi produksi indol. Agar Mueller Hinton juga tidak bisa digunakan dalam pengujian ini karena triptofan akan hancur selama hidrolisis asam oleh kasein. Media berwarna seperti MacConkey dan EMB merupakan sumber yang tidak cocok dari inokulum karena potensi terbawanya zat warna dan mengganggu penampilan dari warna indol. 3. Bioindikator Pencemaran AirBioindikator adalah organisme, penanda kimia, atau proses biologis dimana merubah titik yang bisa digunakan untuk mengobservasi perubahan kondisi lingkungan dan digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur efek dari polutan dalam lingkungan. Bioindikator dapat juga didefinisikan sebagai respons stimulasi antropogenis dalam efek biomolekul, biokimia, dan fisik dalam satu atau lebih tingkat organisme, populasi, komunitas, atau ekosistem dari sistem biologis.a. Mikroorganisme sebagai Bioindikator yang digunakan sebagai bioindikator adalah total koliform fekal seperti Klebsiella, Escherichia, Citrobacter, dan Enterobacter. Koliform merupakan sekelompok bakteri yang digunakan sebagai bioindikator dari adanya polusi oleh kotoran. Adanya bakteri koliform dalam perairan menunjukkan adanya bakteri yang bersifat enteropatogenik atau toksigenik yang umumnya berbahaya bagi kesehatan manusia. Bakteri koliform dibedakan menjadi kelompok koliform fekal seperti Eschericia coli dan kelompok non fekal seperti Enterobacter aerogens. Bakteri yang digunakan sebagai bioindikator sanitasi adalah bakteri Eschericia coli karena bakteri tersebut merupakan bakteri komensalis pada usus manusia dan hewan berdarah panas lainnya dan umumnya bukan merupakan pathogen yang dapat menimbulkan penyakit. Eschericia coli merupakan bakteri Gram negatif berbentuk batang pendek yang tidak membentuk spora dan merupakan organisme yang normal berada dalam usus. Namun, beberapa Eschericia coli ada yang bersifat patogen yaitu serotipe yang masuk ke dalam golongan E. coli Enterohemoragik, E. coli Enteropatogenik, E. coli Enteroinvansif, dan E. coli Enterotoksigenik. Oleh karena itu, keberadaan E. coli dalam perairan dapat menunjukkan bahwa perairan tersebut pernah terkontaminasi oleh kotoran manusia maupun hewan yang mungkin mengandung patogen usus.b. Tanaman sebagai Bioindikator atau ketiadaan dari tanaman atau kehidupan vegetatif dapat memerikan petunjuk penting tentang kesehatan lingkungan, atau berakumulasi dengan logam dari hasil metabolisme, sebagai contoh, total biomassa alga dalam sistem perairan digunakan sebagai ukuran dari polusi organik dan beban nutrisi seperti nitrogen dan fosfor. Tanaman dapat digunakan sebagai alat yang tingkat keefektivan dan sensitivitasnya tinggi untuk menentukan atau memprediksi perubahan lingkungan perairan. Beberapa contoh dari tanaman air yang dapat digunakan sebagai indikator pencemaran air adalah:1) Synechococcus leopoliensis (alga hijau-biru) dan Dunaliella dapat menunjukkan akumulasi polusi logam berat.2) Perubahan dalam keragaman spesies dari fitoplankton dapat digunakan sebagai indikator pencemaran pada perairan, seperti Euglena clastica, Phacous tortus, dan Trachelon anas.3) Charophytes dapat ditimbulkan karena eutrofikasi. Oleh karena itu, tanaman ini sering digunakan sebagai bioindikator dari kualitas air.c. Hewan sebagai BioindikatorPeningkatan atau penurunan dari populasi hewan dapat mengindikasi kerusakan dari ekosistem. Beberapa conoh dari hewan yang digunakan sebagai bioindikator pencemaran air adalah zooplankton seperti Alona guttata, Moscyclopes edex, Cyclips, Aheyella.4. Media Pertumbuhan BakteriMedia selektif atau diferensial digunakan untuk mengisolasi atau mengidentifikasi organisme partikular. Media selektif dapat digunakan oleh beberapa organisme untuk tumbuh, dan menghalangi dari pertumbuhan organisme lainnya. Sebagai contoh, organisme yang dapat memanfaatkan gula dapat dengan mudah dideteksi dengan hanya adanya gula sebagai sumber karbon utama dalam medium. Sedangkan media diferensial digunakan untuk membedakan organisme yang saling terkait. Dikarenakan adanya beberapa zat warna atau baham kimia dalam media, organisme akan memproduksi perubahan karakteristik atau pola pertumbuhan yang dapat digunakan untuk identifikasi. Media selektif dan diferensial yang digunakan dalam mendiagnosa pencemaran air adalah:a. Lactose BrothLactose Broth digunakan untuk kultivasi Salmonella dan beberapa bakteri koliform yang terdapat dalam produk makanan, maupun perairan. Lactose Broth sering digunakan sebegai media pre-enrichment dalam pemeriksaan air. Pepton dan ekstrak daging yang terkandung dalam media ini memberikan nutrisi esensial untuk metabolisme bakteri. Laktosa memberikan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi oleh koliform. Pertumbuhan dari koliform akan menunjukkan adanya gas dalam uji penduga. Lactose Broth mengandung ekstrak daging, pepton, dan laktosa. Keberadaan dari koliform dapat dideteksi dengan adanya gas dan tabung berubah menjadi keruh setelah inkubasi dalam uji penduga.b. Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGLB)BGLB digunakan untuk pengkayaan nutrisi selektif dalam metode MPN untuk mendeteksi koliform dan fekal koliform. BGLB digunakan untuk uji penduga dan penguat dari bakteri koliform. Oxbile dan Brilliant green akan menghambat pertumbuhan dari bakteri Gram positif termasuk yang dapat memfermentasi laktosa seperti Clostrida. Produksi gelembung gas dari fermentasi laktosa dideteksi dengan kehadirannya dalam tabung Durham yang mengindikasi adanya koliform fekal. Selain koliform non fekal juga dapat tumbuh dalam media laktosa tapi tidak akan menghasilkan gas. BGLB digunakan dalam uji penguat dari hasil uji penduga yang positif yang mengghasilkan gas dalam media Lactose Broth. Pertumbuhan positif dari Escherichia coli dalam media BGLB akan menghasilkan gelembung gas.c. Endo AgarEndo agar adalah sedikit media selektif dan media diferensial yang digunakan untuk isolasi, kultivasi, dan diferensiasi dari mikroorganisme Gram negatif dan biasanya digunakan untuk mendeteksi koliform. Koliform dapat memfermentasi laktosa dan memproduksi koloni berwarna merah muda-merah yang hampir sama dengan warna dari media ini. Sedangkan koloni yang tidak memfermentasi laktosa tidak akan berubah warna atau berwarna kemerah mudaan. Untuk pertumbuhan positif dari Escherichia coli dalam media endo agar akan menghasilkan koloni berwarna merah muda sampai merah dengan lapisan hijau metalik setelah inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 37 C.d. Eosin Methylene Blue (EMB) AgarEMB merupakan media diferensial yang digunakan untuk mendeteksi dan mengisolasi bakteri Gram negatif. Kombinasi dari eosin dan methylene blue digunakan sebegai indikator dan mampu membedakan antara organisme yang memfermentasi laktosa dan yang tidak. Methylene blue digunakan sebagai penghambat dari pertumbuhan bakteri Gram positif. Fermentasi laktosa akan menghasilkan asam dengan pH yang rendah, hal tersebut dapat mempercepat penyerapan warna oleh koloni sehingga menghasilkan warna ungu gelap. Jika dalam media EMB tumbuh Escherichia coli maka akan menghasilkan warna lapisan hijau metalik setelah inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 37 C.e. Nutrient AgarNutrient Agar adalah kultur media yang digunakan untuk pertumbuhan dari berbagai varietas spesies mikroba. Nutrient Agar mengandung pepton, ekstrak daging, dan agar yang dapat memberikan nutrien penting untuk replikasi dari mikroorganisme. Ekstrak daging mengandung substansi larutan air dengan karbohidrat, vitamin, senyawa nitrogen organik, dan garam. Pepton merupakan sumber dari nitrogen organik, asam amino, dan peptida. Nutrient Agar digunakan dalam uji pelengkap, setelah inkubasi selama 24 jam dengan suhu 37 C pertumbuhan Escherichia coli dapat ditandai dengan perubahan koloni yang berwarba putih keabu-abuan.5. Baku Mutu Air BersihStandar baku mutu diperlukan dalam sistem pengolahan air bersih untuk sebagai syarat yang mengatur kualitas air supaya sesuai dengan peruntukkannya. Baku mutu air merupakan batasan konsentrasi makhluk hidup, zat, energi, atau komponen yang harus ada di dalamnya dan konsentrasi unsur pencemar yang ditenggang keberadaannya dalam air. Dalam pengadaan air bersih untuk berbagai keperluan seperti air minum dan keperluan sehari-hari lainnya harus memenuhi persyaratan yang telah ditentukan. Di Indonesia, kualitas air minum harus memenuhi persyaratan yang terdapat dalam Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 492 / Menkes / Per / IV / 2010 tentang Persyaratan Kualitas Air Minum dimana parameter mikrobiologi E. Coli dan Total Bakteri Koliform tidak diperbolehkan berada dalamnya.Tabel 1. Standar baku mutu air minum

Sumber: Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 492 / Menkes / Per / IV / 2010Sedangkan berdasarkan Peraturan Pemerintah Nomor 82 Tahun 2001 tentang Pengelolaan Kualitas Air dan Pengendalian Pencemaran Air, badan air diklasifikasikan menjadi empat kelas yang didasarkan pada parameter mikrobiologi sebagai berikut:a. Kelas I, yaitu air yang dapat digunakan untyk bahan baku air minum atau peruntukkan lainnya dengan persyaratan mutu air yang sama.b. Kelas II, yaitu air yang dapat digunakan untuk prasarana dan sarana rekreasi air, budidaya ikan tawar, peternakan, dan pertanian.c. Kelas III, yaitu air yang dapat digunakan untuk budidaya ikan tawar, peternakan, dan pertanian.d. Kelas IV, yaitu air yang dapat digunakan untuk mengairi pertanian.Tabel 2. Standar baku mutu air

Sumber: Peraturan Pemerintah Nomor 82 Tahun 20016. Aplikasi Pemeriksaan Air pada Bidang Teknik LingkunganPemeriksaan air dalam bidang Teknik Lingkungan dapat dimanfaatkan dalam pengolahan air bersih dan air limbah. Dalam pengolahan air bersih, pemeriksaan air dengan parameter koliform digunakan untuk memeriksa sumber air baku yang digunakan sehingga dapat dipilih pengolahan yang sesuai supaya menghasilkan air bersih yang memenuhi persyaratan. Sedangkan dalam pengolahan air limbah, pemeriksaan air dilakukan pemeriksaan pada limbah sehingga dapat ditentukan instalasi pengolahan air limbah yang tepat terutama dengan pengolahan biologis yang memanfaatkan mikroorganisme sebagai dekomposer alami, dan juga untuk memeriksa efluen yang dihasilkan supaya memenuhi standar sehingga tidak mencemari perairan.C. Alat dan Bahan1. Uji Pendugaa. Sampel air inlet Danau Ulinb. 5 buah tabung reaksi berisi tabung durham dan media Lactose Broth ganda sebanyak 5 mlc. 10 buah tabung reaksi berisi tabung durham dan media Lactose Broth tunggal sebanyak 5 mld. 1 buah pipet 5 ml, 0.5 ml, dan 0.05 ml sterile. 2 buah pipet tip 5 ml, 1 buah pipet tip 0.5 ml, 1 buah pipet tip 0.05 mlf. Pembakar spiritusg. Alkoholh. Inkubator dengan suhu 37C2. Uji Penguata. 15 buah tabung reaksi berisi tabung durham dan medium BGLB sebanyak 5 mlb. Semua tabung reaksi pada uji penduga yang menunjukkan hasil positifc. Cawan petri berisi endo agard. Cawan petri berisi EMBe. Inkubator dengan suhu 37 Cf. Jarum oseg. Pembakar spiritush. Alkohol3. Uji Pelengkapa. Cawan petri berisi EMB yang menunjukkan adanya koloni berwarna hijau metalikb. Cawan petri berisi endo agar yang menunjukkan adanya koloni berwarna merah muda metalikc. 2 buah tabung reaksi berisi Nutrien Agar miringd. Jarum osee. Pembakar Spiritus4. Uji Indola. Sampel air inlet Danau Ulinb. 15 buah tabung reaksi berisi media LMXc. 1 buah pipet 5 ml, 0.5 ml, dan 0.05 ml sterild. 2 buah pipet tip 5 ml, 1 buah pipet tip 0.5 ml, 1 buah pipet tip 0.05 mle. Inkubator dengan suhu 37 Cf. Larutan Kovaks Indol

D. Cara Kerja1. Pengenceran SampelMemasukkan 0,5 ml sampel ke dalam erlenmeyer berisi 49,5 ml NaCl dan dihomogenkan

Mengambil 0,5 ml sampel

Membersihkan tangan dan meja kerja dengan alkohol 70%

2. Uji PendugaMenginokulasikan sampel dengan cara:a. 5 ml ke 5 tabung reaksi berisi media LB Gandab. 0,5 ml ke tabung reaksi berisi media LB tunggalc. 0,05 ml ke tabung reaksi berisi media LB tunggalDIHOMOGENKAN

Mengingkubasi sampel selama 24 jam suhu 37C

Positif keruh dan ada gelembung gas pada tabung durham

Negatif tidak ada gelembung gas pada tabung durham

Mencatat hasil pengamatan

3. Uji Penguata. Tahap 1

Menginokulasi ke dalam tabung berisi BGLB 5 mlMengambil 1 ose dari tabung LB yang diduga positifMensterilkan jarum ose yang akan digunakan

Positif keruh dan ada gelembung gas pada tabung durham

Mengingkubasi sampel selama 24 jam suhu 37C

Mencatat hasil pengamatan

Negatif tidak ada gelembung gas pada tabung durham

b. Tahap 2 Menginokulasikan pada cawan berisi endo agar dan cawan berisi EMB

Mengambil 1 ose dari tabung BGLB yang positif dan paling keruhMensterilkan jarum ose yang akan digunakan

Mengingkubasi cawan selama 24 jam suhu 44,5C

Mencatat hasil pengamatan, jika positif E. Coli maka akan membentuk koloni berwarna hijau metalik

4. Uji PelengkapMenginkubasi selama 24 jam dan mengamati serta mencatat bentuk koloniMenginokulasi ke dalam tabung berisi media NA miring dengan pola streakMengambil 1 ose dari biakan berwarna hijau metalikMensterilkan jarum ose yang akan digunakan

5. Uji IndolMenginokulasikan sampel dengan cara:d. 5 ml ke 5 tabung reaksi berisi media LMX Gandae. 0,5 ml ke tabung reaksi berisi media LMX tunggalf. 0,05 ml ke tabung reaksi berisi media LMX tunggalDIHOMOGENKAN

Mengingkubasi sampel selama 24 jam suhu 37C

Positif koliform warna sampel biru kehijauan

Negatif Tidak ada perubahan warna

Menghomogenkan larutan

Positif Terbentuk cincin merah di atas larutan

Negatif tidak terjadi perubahan warna

Meneteskan 3-4 tetes kovaks indol

Mencata hasil pengamatan

E. Data Pengamatan1. Uji PendugaPengamatanGandaTunggal 1Tunggal 2

Pertumbuhan bakteri

Pembentukan asam

Pembentukan gas

2. Uji PenguatPengamatanGandaTunggal 1Tunggal 2

Pertumbuhan bakteri

Pembentukan asam

Pembentukan gas

3. Uji Pelengkap

F. Pengolahan Data1. Total Koliform berdasarkan Uji MPN2. Total Koliform berdasarkan Uji IndolG. Analisis1. Analisis PercobaanPraktikum Pemeriksaan Air yang dilakukan pada tanggal 09-12 November 2015 ini bertujuan untuk mengetahui tingkat pencemaran koliform terutama oleh kotoran (feaces) di lingkungan perairan Danau Ulin dengan menggunakan metode Most Probable Number (MPN). Pengambilan sampel dilakukan di inlet danau pada 3 hari sebelum praktikum dengan menggunakan botol penyimpan berwarna gelap dan disimpan di dalam lemari pendingin dengan tujuan supaya sampel tidak terpengaruh oleh faktor luar seperti cahaya matahari dan suhu sampel dijaga dengan tujuan mikroorganisme yang terdapat dalam sampel tidak mati dan tidak mengalami pertumbuhan karena tidak berada di suhu optimumnya. Praktikum ini menggunakan tiga pengujian yaitu, uji penduga, uji penguat, dan uji pelengkap. Pengujian dengan metode MPN ini dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri yang masuk ke dalam golongan koliform yang mampu memfermentasi laktosa dari sampel air. Praktikum dimulai dengan melakukan pengenceran sampel sampai faktor pengenceran 10-2 dengan cara mengambil 0,5 ml sampel dan melarutkannya pada 49,5 ml larutan NaCl. Sampel diencerkan terlebih dahulu karena sampel yang digunakan diduga mengandung banyak mikroorganisme. Untuk uji penduga, pertama praktikan melakukan pemipetan sampel 5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media Lactose Broth ganda sebanyak 5 ml dan tabung Durham, pemipetan 0,5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media Lactose Broth tunggal sebanyak 5 ml dan tabung Durham, dan pemipetan 0,05 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media Lactose Broth tunggal sebanyak 5 ml dan tabung Durham. Tabung Durham berfungsi untuk menangkap gelembung gas yang dihasilkan dari proses metabolisme mikroorganisme. Media Lactose Broth digunakan dalam uji ini karena mengandung nutrisi dalam bentuk pepton untuk mendukung pertumbuhan bakteri. Bakteri koliform mampu memfermentasi laktosa sehingga indikasi adanya bakteri koliform dapat diduga dari pengujian ini dengan adanya gelembung gas dan larutan berubah menjadi keruh. Dalam proses inokulasi, setelah tutup tabung reaksi dibuka maka harus selalu didekatkan dengan pembakar spiritus supaya kondisi septis dan tidak ada bakteri atau kontaminan dari luar yang dapat mempengaruhi sampel. Setelah diinokulasikan kemudian sampel dihomogenkan dan selanjutnya diinkubasi ke dalam inkubator selama 24 jam dengan suhu 37C. Suhu 37C merupakan suhu optimum bakteri koliform untuk dapat bermetabolisme. Setelah 24 jam praktikan mengamati tabung reaksi yang dinilai positif koliform dengan ciri terbentuk gelembung gas dan menjadi keruh, jika dalam 24 jam menunjukkan hasil negatif, maka waktu inkubasi dilanjutkan selama 48 jam dan jika tidak terbentuk gas dalam tabung Durham maka tabung reaksi dinyatakan negatif. Hasil positif menunjukkan adanya bakteri dalam sampel yang dapat memfermentasi laktosa dalam media. Pengujian penguat dilakuakan dengan tujuan untuk memastikan adanya bakteri koliform dalam sampel. Pertama praktikan mensterilkan jarum ose dengan cara membakarnya dengan pembakar spiritus sampai membara, kemudian mencelupkan ke dalam alkohol, dan membakar sebentar untuk menghilangkan alkohol dan diangin-anginkan. Kemudian praktikan mengambil 1 ose dari tabung reaksi berisi medium Lactose Broth yang menunjukkan positif koliform dan kemudian masing-masing diinokulasikan ke dalam tabung berisi media Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGLB). Media BGLB digunakan untuk uji penduga dan penguat dari bakteri koliform. Oxbile dan Brilliant green akan menghambat pertumbuhan dari bakteri Gram positif sehingga yang tumbuh adalah bakteri Gram negatif yang mampu memfermentasi laktosa. Pengerjaan inokulasi harus selalu dilakukan dekat pembakar spiritus dan jarum ose harus disterilkan setiap penggunaan untuk masing-masing tabung. Setelah semua tabung Lactose Broth positif selesai diinokulasikan ke dalam tabung BGLB, kemudian tabung diinkubasi ke dalam inkubator dengan suhu 37C selama 24 jam. Suhu ini dipilih karena bakteri koliform dapat bermetabolisme. Setelah 24 jam kemudian praktikan memeriksa tabung yang memberikan reaksi positif dengan adanya gelembung gas. Selanjutnya jumlah tabung yang positif dari uji penguat dihitung perkiraan jumlah koloni per 100 ml dengan menggunakan tabel MPN.Terbentuknya gas dalam media Lactose Broth dan BGLB tidak selalu menunjukkan jumlah koliform karena ada kemungkinan terdapat mikroba lainnya yang mampu memfermentasi laktosa dengan membentuk gas. Oleh karena itu, uji penguat dilakukan juga dengan media agar Eosin Methylene Blue Agar (EMBA) dan Endo Agar (EA). Penggunaan media tersebut dikarenakan mampu mengisolasi keberadaan bekteri koliform. Dalam uji ini, pertama praktikan mensterilkan jarum ose, kemudian mengambil 1 ose dari tabung BGLB yang positif dan paling keruh. Selanjutnya adalah menginokulasikan ose pada cawan berisi media endo agar dan cawan berisi media EMB dengan pola streak dimana bakteri diinokulasikan dengan tidak terputus. Selanjutnya kedua cawan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 44,5C. Penggunaan suhu ini adalah untuk mendeteksi keberadaan bakteri E. coli dalam sampel karena bakteri tersebut aslinya berada di dalam kolon hewan berdarah panas. Membedakan antara E. coli dan lainnya dengan menggunakan medium berwarna adalah warna bakteri E. coli tergantung pada mediumnya karena E. coli memiliki enzim yang dapat mensubstrat zat warna. Untuk pertumbuhan positif dari Escherichia coli dalam media endo agar akan menghasilkan koloni berwarna merah muda sampai merah dengan lapisan hijau metalik. Sedangkan pada media EMB positif tumbuh Escherichia coli maka akan menghasilkan warna lapisan hijau metalik.Selanjutnya adalah dilakukan uji pelengkap, yaitu dengan mengisolasi dan mengkultivasi bakteri di dalam media Nutrient Agar. Dari pertumbuhan yang dihasilkan cawan kemudian praktikan mengambil dengan jarum ose yang telah disterilkan pada bagian ujung pola streak dengan tujuan bakteri yang terambil sedikit dan dapat mudah diamati morfologinya. Kemudian praktikan menginokulasikan ose ke dalam tabung reaksi berisi NA miring dengan pola streak dan menginkubasi tabung selama 24 jam. Pertumbuhan Escherichia coli dapat ditandai dengan perubahan koloni yang berwarba putih keabu-abuan.Selain menggunakan metode MPN, dalam praktikum ini juga digunakan metode uji indol untuk menentukan koliform dalam sampel. Uji indol digunakan untuk mengidentifikasi dan membedakan antara organisme Gram positif dan Gram negatif. Pertama praktikan melakukan pemipetan sampel 5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media LMX ganda sebanyak 5 ml, pemipetan 0,5 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media LMX tunggal sebanyak 5 ml, dan pemipetan 0,05 ml dan menginokulasikannya ke dalam 1 seri tabung berisi 5 buah tabung dengan media LMX tunggal sebanyak 5 ml. Kemudian tabung diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. Jika tabung positif koliform maka larutan akan berubah menjadi biru kehijauan dan jika negatif koliform maka tidak da perubahan warna. Untuk menguatkan keberadaan koliform dalam sampel, setelah diinkubasi kemudian praktikan meneteskan reagen kovaks kedalam tabung dan dihomogenkan. Jika hasil tabung positif koliform maka akan terdapat lapisan merah pada atas larutan, jika hasil negatif maka tidak berwarna atau berwarna kuning cerah.2. Analisis Hasil3. Analisis KesalahanH. Kesimpulan dan Saran1. Kesimpulan2. SaranI. Daftar PustakaLane, W. McCoy. Indole Test Reagents. Hardy Diagnostics. Santa Maria, CA. 1998.Jain, Akanksha et.al. Exploring Biodiversity as Bioindicators for Water Pollution. Department of Botany Banaras Hindu University. Varanasi. 2010.J. Lampiran1. Bagan Salah2. Bagan Benar3. Lembar Data Pengamatan