KARBOHIDRAT

Yoana Puspita Sari (G84110066)1, Syahrul Mustopa

2, Syaefudin

3

Mahasiswa Praktikum1, Asisten Praktikum

2, Dosen Praktikum

3

Metabolisme

Departemen Biokimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Institut Pertanian Bogor

Bogor

2013

ABSTRAK

Glukosa diperlukan di dalam jaringan adiposa sebagai sumber gliserida-gliserol

berperan dalam mempertahankan kadar intermediet pada siklus asam sitrat di

seluruh jaringan tubuh. Glukosa dibentuk dari senyawa glukogenik yang

mengalami glukoneogenesis. Kadar glukosa darah dapat diukur dengan

menggunakan metode Folin-Wu. Kadar glukosa darah yang telah diketahui dapat

membantu memprediksi metabolisme dalam sel dengan kandungan gula yang

tersedia. Hasil konsentrasi glukosa sebesar 0.0105 mg/ml. Glikogen dapat

diisolasi dari hati, menghasilkan massa 0.5508 gram. Glikogen yang terhidrolisis

oleh enzim, optimum terjadi pada menit ke-15 dengan konsentrasi 8.0821

μmol/mg, sedangkan yang terhidrolisis enzim, optimum pada menit ke-45 dengan

konsentrasi 0.3358 μmol/mg

Kata kunci : glukosa, glikogen, glukoneogenesis, glikogenesis

Pendahuluan

Karbohidrat merupakan salah satu senyawa organik biomakromolekul

alam yang banyak ditemukan dalam makhluk hidup terutama tanaman. Pada

tanaman yang berklorofil, karbohidrat dibentuk melalui reaksi antara

karbondioksida dan molekul air dengan bantuan sinar matahari, disebut

fotosientesis. Karbohidrat merupakan senyawa yang mengandung unsur-unsur C,

H, dan O, terutama terdapat di dalam tumbuh – tumbuhan yaitu kira - kira 75%.

Karbohidrat memegang peranan penting dalam alam karena merupakan sumber

energi utama bagi umat manusia dan hewan yang harganya relatif murah.

Karbohidrat yang dihasilkan adalah karbohidrat sederhana glukosa (Almatsier

2010). Karbohidrat dalam tubuh manusia dan hewan dibentuk dari beberapa asam

amino, gliserol lemak, dan sebagian besar diperoleh dari makanan yang berasal

dari tumbuh-tumbuhan (Susan dan Mikkelsen 2004). Karbohidrat merupakan zat

yang mempunyai sifat aktif optik, sedangkan gliseraldehid (HOCH2-CHOH-

CHO) adalah merupakan induk karbohidrat (Almatsier 2010).

Glukosa digunakan sebagai sumber energi untuk melakukan metabolisme

sel. Umumnya, tingkat gula darah bertahan pada batas-batas rendah sekitar 4-8

mmol/L atau 70-150 mg/dL. Kadar glukosa dalam tubuh makhluk hidup

digunakan untuk memprediksi metabolisme yang terjadi. Jika kandungan glukosa

dalam tubuh berlebih, maka glukosa akan mengalami reaksi katabolisme secara

enzimatik untuk menghasilkan energi. Namun, jika kandungan glukosa tersebut di

bawah batas minimum, maka asam piruvat yang dihasilkan dari proses

katabolisme bisa mengalami proses enzimatik secara anabolisme melalui

glukoneogenesis untuk mensintesis glukosa (Sujarwoto 1993).

Bila konsentrasi glukosa menurun karena dikonsumsi untuk memenuhi

kebutuhan energi tubuh, pankreas melepaskan glukagon yang merupakan hormon

untuk menargetkan sel-sel di hati. Kemudian, sel-sel ini mengubah glikogen

menjadi glukosa melalui proses glikogenolisis. Glukosa dilepaskan ke dalam

aliran darah hingga meningkatkan level gula darah.

Praktikum ini bertujuan mengetahui serta menentukan kadar glukosa

dalam darah dengan metode spektrofotometri dan melakukan pemisahan atau

isolasi suatu makromolekul polisakarida dalam darah hewan.

Metode Praktikum

Praktikum materi Karbohidrat dilakukan di Laboratorium Biokimia pada

hari Jumat, tanggal 15 November 2013 pukul 13.00-16.00 WIB.

Alat-alat yang diguanakan dalam praktikum ini antara lain tabung reaksi,

penangas air, pipet volumetric, erlenmeyer, bulb hitam, gelas piala, spektrometer,

batang pengaduk, kertas saring, tabung Folin Wu, kertas saring, sentrifuse, kaca

arloji, dan kuvet.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini antara lain cairan filtrat

darah bebas protein, kupritartat, fosfomolibdat, akuades, Na-wolframat 10%,

H2SO4 0.67 N, standar glukosa, homogenat hati, TCA 10%, etanol 95%, buffer K-

fosfat 0.5 M pH 6.9, NaCl, K2HPO4 1 M, amilase, etil eter.

Penentuan Glukosa Darah (Metode Folin Wu). Darah dipipet 1 ml ke

dalam erlenmeyer dan ditambahkan 7 ml akuades, 1 ml Na-Wolframat, dan 1 ml

H2SO4. Setelah dicampurkan, kemudian disaring dengan kertas saring. Tabung

Folin-Wu sebanyak tiga buah diisi. Tabung a diisi dengan filtrat dan kupritartat

masing-masing sebanyak 1 ml. Tabung b diisi masing-masing 1 ml standar

glukosa dan kupritartat. Tabung c diisi dengan akuades dan kupritartat masing-

masing 1 ml. Ketiga tabung dipanaskan hingga mendidih selama 8 menit. Setelah

didinginkan, diencerkan lagi dengan 7 ml akuades dan ditambahkan 1 ml

fosfomolibdat pada setiap tabung. Absorbansi ketiga tabung dibaca pada panjang

gelombang 660 nm.

Isolasi Glikogen. Homogenat hati sebanyak 30 ml dicampur dengan 19 ml

TCA 10% dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan

didekantasi ke dalam gelas ukur. Kemudian 2 ml etanol 95% ditambahkan ke

dalam ekstrak TCA dan didiamkan sampai endapan berflokulasi. NaCl

ditambahkan dan dimasukkan ke dalam waterbath sampai larutan tersebut

terbentuk endapan. Suspensi yang terjadi di dalam tabung dipindahkan ke dalam

tabung sentrifus dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 3 menit.

Supernatan yang terbentuk dibuang dan residu dilarutkan ke dalam 5 ml air suling

dan dipresipitasi lagi dengan 2 ml etanol 96% untuk sentrifus selanjutnya.

Endapan dicuci dengan 3 ml etanol absolut dan 3 ml etil eter dan dikeringkan di

dalam kaca arloji, kemudian disimpan.

Hidrolisis Glikogen dengan Enzim. Larutan glikogen sebanyak 2 ml

dipipet ke dalam gelas kimia yang sudah berisi 1 ml buffer K-fosfat 0.5 M pH 6.9

dan 1 ml NaCl 0.2 M, diencerkan dengan akuades hingga volume 18 ml. Larutan

didiamkan pada suhu ruang selama lima menit. Sebanyak 0.5 ml larutan tersebut

dididihkan selama 1 menit, kemudian ditambahkan akuades hingga volume 5 ml.

Larutan enzim amilase yang berasal dari saliva ditambahkan sebanyak 2 ml dan

dibiarkan dalam waterbath. Menit ke-3, campuran diambil sebanyak 0.5 ml ke

dalam tabung reaksi, kemudian dididihkan lagi selama 1 menit dan ditambahkan

akuades hingga volume 5 ml. Pengambilan sampel diulangi pada menit ke 6, 9,

12, dan 15. Kadar glukosa dihitung dengan metode Folin-Wu.

Hidrolisis Glikogen dengan Asam. Larutan glukosa dipipet ke dalam

tabung reaksi sebanyak 2 ml dan ditambah 2 ml HCl 4 N. Setelah dikocok, 0.5 ml

larutan tadi dicampur ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 2.5 ml K2HPO4.

Larutan tersebut diencerkan sampai 10 ml. Sisa tabung larutan glikogen-HCl

dipanaskan di dalam penangas air. Setelah 15 menit pertama, larutan glikogen tadi

dipipet 0.5 ml ke dalam 2.5 ml K2HPO4, diencerkan hingga volume 10 ml. Ulangi

pada menit ke-30 dan 45. Larutan blanko dibuat dengan ditambahkannya 7.5 ml

akuades dalam 2.5 ml K2HPO4 1 M. Kadar glukosa dihitung dengan metode

Folin-wu.

Hasil dan Pembahasan

Metode yang banyak digunakan untuk perhitungan glukosa darah

bergantung pada kemampuan glukosa untuk mereduksi suatu larutan tembaga

alkali. Uji glukosa darah pada praktikum ini menggunakan metode

spektrofotometri yang merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi

radiasi elektromagnet. Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan Hukum

Lambert-Beer, yaitu bila cahaya monokromatik melalui suatu media, maka

sebagian cahaya tersebut diserap, sebagian dipantulkan, dan sebagian lagi

dipancarkan. Perubahan warna yang terjadi diamati dengan menggunakan panjang

gelombang 660 nm.

Tabel 1 Penentuan glukosa darah dengan metode Folin-Wu Bahan A terukur A terkoreksi [glukosa]

(mg/ml)

[glukosa]

rata-rata

(mg/ml)

blanko 0.237 - - -

Standar glukosa 1.585 1.348 1.0000 -

Filtrat 0.378 0.141 0.1046 0.0105

Contoh perhitungan:

Standar glukosa = 0.1 mg/ml

Absorbansi terkoreksi = absorbansi filtrat – absorbansi blanko

= 0.378 – 0.237

= 0.141

[glukosa darah] =

x [glukosa] standar

=

x 0.1 mg/ml

= 0.0105 mg/ml

Istilah gula darah analog dengan jumlah atau kadar glukosa di dalam

darah. Glukosa yang dialirkan melalui darah merupakan sumber energi utama

dalam metabolisme tubuh. Konsentrasi gula darah diatur secara ketat oleh tubuh

dan kegagalan pengaturan gula darah ini dapat menyebabkan penyakit diabetes

mellitus (Witasari et al. 2009). Metode Folin-Wu merupakan metode untuk

membuat filtrat darah yang bebas protein dengan mengendapkan protein oleh

asam tungstat. Selain metode folin-wu, penentuan glukosa darah dapat dilakukan

dengan metode enzimatik, metode kondensasi gugus amin, metode reduksi,

metode pemisahan glukosa. Endapan dapat terjadi akibat adanya kombinasi anion

asam dengan bentuk kationik dari protein. Metode Folin-Wu memiliki beberapa

keuntungan, diantaranya adalah membutuhkan pelarut yang mudah didapatkan,

filtrat yang terbentuk lebih netral, dan proses filtrasi lebih cepat (Susan dan

Mikkelsen 2004). Larutan yang dibutuhkan untuk metode ini antara lain

kupritartat, fosfomolibdat, standar glukosa, asam sulfat, akuades, dan Na-

wolframat. Fungsi penambahan akuades adalah mengencerkan darah sehingga

protein dalam darah akan larut oleh akuades. Penambahan Na-wolframat dapat

mengendapkan protein yang terlarut dalam air. Asam sulfat dapat berfungsi

sebagai pencipta suasana asam dan katalisator untuk mempercepat reaksi

pengendapan protein. Kupritartat digunakan untuk membentuk warna biru ketika

ditambahkan pereaksi fosfomolibdat, karena larutan ini mengandung asam laktat

dan ion Cu+. Pemanasan selama 8 menit dapat mempercepat terjadinya reaksi.

Sampel darah yang digunakan untuk pengujian kadar glukosa dalam darah

berasal dari darah ayam. Kadar gula darah normal pada ternak ruminansia

bervariasi, yaitu antara 40-60 mg per 100 ml dan 35-55 mg per 100 ml. Sumber

glukosa darah berasal dari karbohidrat makanan, senyawa glikogenik melalui

glikoneogenesis, dan dari glikogen hati oleh glikogenesis (Witasari et al. 2009)

Hasil pengamatan dan perhitungan menunjukkan bahwa kadar glukosa

yang diperoleh dari darah ayam sekitar 0.1046 mg/ml. Data ini sangat berbeda

jauh dibandingkan dengan literatur yang menyatakan kadar glukosa normal darah

ayam sekitar 0.35-0.55 mg/ml (Murray 2003). Kekurangan kadar glukosa ini

disebabkan oleh aktivitas tubuh, kesehatan, dan faktor genetik.

Tabel 2 Isolasi glikogen Bahan Kadar

Massa glikogen 0.5508 gram

Filtrat homogenat hati 13.5 ml

Contoh perhitungan:

Massa glikogen =

x glikogen terisolasi

=

x 0.34 gram

= 0.5508 gram

Percobaan penentuan kadar glukosa darah, darah yang digunakan harus

bebas dari protein. Keruhnya filtrat menunjukkan masih adanya protein yang

tertingal di dalam filtrat, sehingga perlu dilakukan pemurnian. Percobaan isolasi

glikogen menggunakan hati sebagai organ yang akan dianalisis. Hati yang

digunakan adalah hati ayam. Hati berfungsi sebagai tempat pembentukan glikogen

dari glukosa, sehingga cocok digunakan untuk mengisolasi glikogen (Poedjiadi &

Supriyanti 2007). Hati dipotong kecil-kecil sebelum dihomogenasi bertujuan

mempermudah berlangsungnya reaksi. Selanjutnya, penambahan larutan TCA

10% pada homogenat hati berfungsi untuk melarutkan kandungan protein, lemak,

dan asam nukleat sehingga diperoleh glikogennya saja (Witasari et al. 2009).

Setelah melalui proses sentrifugasi, penambahan larutan etanol 95% berfungsi

untuk mengendapkan glikogen yang terlarut dalam air.

Tabel 3 Hidrolisis glikogen oleh enzim Perlakuan A terukur A terkoreksi [glukosa]

mg/ml

Mol

glukosa

(µ mol)

µ mol

glukosa/mg

glikogen

Blanko 0.000 - - - -

Standar 0.031 0.031 0.1000 1.11 0.0020

Menit ke-3 0.103 0.103 299.0323 3.322.58 6.0323

Menit ke-6 0.095 0.095 275.8065 3.064,52 5.5638

Menit ke-9 0.053 0.053 153.8709 1.709,68 3.1039

Menit ke-12 0.047 0.047 136.4516 1.516,13 2.7526

Menit ke-15 0.138 0.138 400.6452 4.451,61 8.0821

Contoh perhitungan menit ke-3:

Faktor Pengenceran =

= 900

Absorbansi terkoreksi = absorbansi menit ke-3 – absorbansi blanko

= 0.103 – 0.000

= 0.103

[glukosa] sampel =

x [glukosa] standar x FP

=

x 0.1 mg/ml x 900

= 299.0323 mg/ml

Mol glukosa = [ ]

x V sampel x

x 10

6 mol

=

x 2 ml x

x 10

6 µmol

= 3.322,58 µmol

µmol glukosa/mg glikogen =

x

=

x

= 6.0323 μmol/mg

Glikogen terdapat di dalam tubuh manusia dan hewan vertebrata lainnya

sebagai polisakarida cadangan. Glikogen merupakan polimer glukosa yang mirip

dengan amilopektin namun memiliki percabangan yang lebih banyak. Glikogen

terutama disimpan di dalam sel hati dan otot. Berdasarkan Murray et al (2003),

glikogen yang terdapat dalam hati bisa mencapai 6%, sementara di dalam otot

kurang dari 1%. Dalam Murray et al (2003) juga disebutkan bahwa jumlah

glikogen dalam hati dan otot manusia dewasa normal dengan berat 70 kg adalah

sebesar 72 gram dan 245 gram.

Metabolisme glikogen melibatkan dua proses, yaitu glikogenesis dan

glikogenolisis. Glikogenesis merupakan proses biosintesis glikogen, sedangkan

glikogenolisis merupakan proses penguraian atau degradasi glikogen. Witasari et

al. (2003) menyebutkan bahwa degradasi atau penguraian glikogen diawali

dengan reaksi antara enzim fosforilase yang dapat membatasi kecepatan

glikogenesis. Enzim ini spesifik untuk proses pemecahan fosforilasi rangkaian

1→4 glikogen untuk menghasilkan glukosa 1-fosfat. Residu glukosil terminal

pada rantai paling luar molekul glikogen dibuang secara berurutan sampai lebih

kurang ada 4 buah residu glukosa yang tersisa pada tiap sisi cabang 1→6

(Lehninger 1982).

Gambar 1 Struktur glikogen (Haden 1923)

Kandungan karbohidrat dalam glikogen secara kuantitatif dapat diukur

dengan cara hidrolisis enzimatis oleh enzim α-amilase. Enzim α-amilase dapat

menghidrolisis glikogen dengan baik pada suhu sekitar 37 oC atau sama dengan

suhu tubuh manusia (Amerongen 1991). Jika berada pada suhu yang lebih tinggi

atau lebih rendah, enzim ini akan mengalami kerusakan dan tidak dapat

menghidrolisis glikogen (Murray 2003). Reaksi yang terjadi pada proses hidrolisis

glikogen adalah sebagai berikut:

(C6H10O5)n + nH2O nC6H12O6

glikogen glukosa

Percobaan hidrolisis glikogen oleh enzim dengan penambahan larutan

buffer K-fosfat 0.5 M pH 6.9 berfungsi untuk mempertahankan pH agar tetap

asam. Sedangkan penambahan saliva dan inkubasi berfungsi untuk membiarkan

proses hidrolisis terjadi. Begitu juga halnya pada penambahan larutan HCl 4 N

pada percobaan hidrolisis glikogen dengan asam, yaitu untuk membiarkan proses

hidrolisis terjadi (Sujarwoto 1993).

Data pada tabel 3 menunjukkan kadar glukosa yang mendapat perlakuan

dengan enzim amilase, diketahui bahwa pada menit ke-3 hingga menit ke-12,

absorbansi menurun dari 0.103 hingga 0.047, sehingga perolehan µ mol

glukosa/mg glikogen juga menurun dari 6.0323 sampai 2.7526 µmol/mg.

Berdasarkan hasil pengamatan, hidrolisis paling optimal terjadi pada menit ke-15

karena menghasilkan konsentrasi glukosa paling besar, yaitu 8.0821 µmol

glukosa/mg glikogen.

Tabel 4 Hidrolisis glikogen oleh asam Perlakuan A terukur A terkoreksi [glukosa]

mg/ml

Mol glukosa

(µ mol)

µ mol

glukosa/mg

glikogen

Blanko 0.000 - - - -

Standar 0.031 0.031 0.10000 1.1111 0.0020

Menit ke-0 0.102 0.102 13.1613 146.2367 0.2655

Menit ke-15 0.116 0.116 14.9677 166.3078 0.3019

Menit ke-30 0.124 0.124 16.0000 177.7778 0.3228

Menit ke-45 0.129 0.129 16.6452 184.9467 0.3358

Contoh perhitungan menit ke-0 :

Faktor Pengenceran =

= 40

Absorbansi terkoreksi = absorbansi menit ke-0 – absorbansi blanko

= 0.102 – 0.000

= 0.102

[glukosa]sampel = sampel

standar x CStandarx FP

=

x 0.1 mg/mL x 40

= 13.1613 mg/mL

Mol glukosa = [ ]

x Vsampel x

x 10

6 μmol

=

x 2 mL x

x 10

6 μmol

= 146. 2367 μmol

µmol glukosa/mg glikogen =

x

=

x

= 0.2655 μmol/mg

Telah dijelaskan di atas bahwa glukosa merupakan sumber bahan bagi

proses glikolisis, karena glukosa terdapat dalam jumlah banyak bila dibandingkan

monosakarida lain. Jumlah glukosa yang berlebih akan disimpan dengan

mengubahnya menjadi glikogen dalam hati dan jaringan otot yang disebut proses

glikogenesis. Pembentukan glikogen dari glukosa, baik dalam hati maupun dalam

otot, dapat berlangsung karena adanya UDPG (uridin difosfat glukosa) (Indarti

2011).

Hidrolisis glikogen dengan asam, yaitu untuk membiarkan proses

hidrolisis terjadi secara sempurna. Hidrolisis glikogen dengan asam lebih cepat

terjadi dibandingkan dengan hidrolisis enzim, karena hidrolisis dengan asam dapat

menghidrolisis ikatan α-1,4 glikosidik dan ikatan α-1,6 glikosidik (Sujarwoto

1993).

Berdasarkan hasil pengamatan pada Tabel 4, diketahui bahwa hidrolisis

optimal glikogen oleh asam terjadi pada menit ke-45 karena menghasilkan

konsentrasi paling besar, yaitu 0.3358 µmol glukosa/mg glikogen pada

pengenceran sebesar 40.

Simpulan

Glikogen merupakan polimer glukosa yang mirip dengan amilopektin

namun memiliki percabangan yang lebih banyak. Glikogen terutama disimpan di

dalam sel hati dan otot. Konsentrasi glukosa darah ayam diperoleh sebesar 0.0105

mg/ml. Massa glikogen yang telah diisolasi dari hati ayam didapatkan sebesar

0.5508 gram. Glikogen dapat dihidrolisis dengan enzim ataupun asam. Hidrolisis

glikogen dengan enzim mengalami peningkatan seiring bertambahnya waktu,

sehingga hidrolisis optimum terjadi pada menit ke-15 dengan perolehan

konsentrasi 8.0821 μmol glukosa/mg glikogen. Hidrolisis glikogen dengan asam

juga mengalami peningkatan absorbansi seiring bertambahnya waktu, sehingga

hidrolisis optimum terjadi pada menit ke-45 dengan konsentrasi 0.3358 µmol

glukosa/mg glikogen.

Daftar Pustaka

Almatsier S. 2010. Prinsip Ilmu Gizi. Jakarta (ID): Gramedia Pustaka Utama.

Amerongen AVN. 1991. Ludah dan Kelenjar Ludah: Arti Bagi Kesehatan Gigi.

Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Haden RL. 1923. A Modification of The Folin-Wu Method for Making Protein-

Free Blood Filtrates. The Journal of Biological Chemistry. 937-943.

Indarti DA. 2011. Karakterisasi film nata de coco-benedict secara adsorpsi untuk

sensor glukosa dalam urin. Jurnal Ilmu Dasar 12: 200-209.

Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Maggy Thenawijaya,

penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of

Biochemistry.

Murray RK, Granner DK, Mayes PA, dan Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper

Edisi ke-25. Andry Hartono, penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari:

Harper’s Illustrated Biochemistry.

Poedjiadi A, Supriyanti FT. 2007. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas

Indonesia Press.

Sujarwoto S. 1993. Uji Aktivitas Hipoglikemik dan Uji Fitokimia Daun Eugenis

polyantha wight dan Herba borreria LAEVIS GRISEB. [Skripsi]. Jurusan

Farmasi FMIPA Universitas Padjadjaran.

Susan R, Mikkelsen EC. 2004. Bioanalytical Chemistry. New Jersey. Inc

Hoboken.

Witasari U, Setyaningrum R, Siti Z. 2009. Hubungan tingkat pengetahuan, asupan

karbohidrat, dan serat dengan pengendalian kadar glukosa darah pada

penderita diabetes mellitus tipe 2. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi.

Vol 10:130-138