KROMATOGRAFI

Kromatografi adalah suatu metode analitik untuk pemurnian dan pemisahan senyawa-

senyawa organic,dan anorganik. Metode ini berguna untuk fraksionasi campuran kompleks

dan pemisahan untuk senywa-sentawa yang sejenis. Pada tahun 1941 Martin dan Synge

mengembangkan kromatogrfi partisi sedangkn Gordon menemukan kramotografi kertas.

Kromatografi partisi terutama dilakukan pada kromatografi kertas.

Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya menjadi komponen-

komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja berdasarkan prinsip yang sama. Seluruh

bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau cairan yang didukung pada

padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan

membawa komponen-komponen dari campuran bersama-sama. Komponen-komponen yang

berbeda akan bergerak pada laju yang berbeda pula. Dalam kromatografi kertas. Fase diam

adalah kertas serap yang sangat seragam. Fase gerak adalah kertas serap yng sangat sesuai.

Di tahun 1903 Tswett menentukan teknik kromotgrafi. Tnik ini bermanfaat sebagai

cara untuk menguraikan campuran. Dalam kromotgrafi, komponen-komponen terdistribusi

dalam du fase. Salah satu fase diam. Transef massa antara fase bergerak dan fase diam terjadi

bila molekul-molekul campuran serp pada permukan partikel-partikel atau terserap did lm

pori-pori partikel tau terbagi ke dalam sejumlah cairn yang terikat pada permukan atau di

dalam pori. Ini adalah sorpsi (penyerapkan). Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut

tertentu di dalam kolom tau lapisan tipis zat penyerap secara langsung berhubungann dengan

bagian molekul-molekul tersebut did lam fase bergerak dan fase diam. Jika perbedaan gerak

sepanjang kolom dengan laju yang tergantung pada karekteristik masing-masing penyerapan.

Jika di pisahkan terjadi masing-masing komponen keluar dri kolom pada interval waktu yang

berbeda, mengingat bahea proses keseluruhannya dalah fenomena migrsi secra diferensial

yng dihasilkan oleh tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase gerak. (S.M.Khopkar)

1.1. Kromatogram Kertas

kromatografi kertas adalah salah satu hal pertama yang pernah anda kerjakan dalam bidang

kimia untuk pemisahan, misalnya campuran dari pewarna-pewarna yang menyusun warna

tinta tertentu. Ini merupakan contoh yang mudah, mari memulai dari hal itu.

Anggaplah anda mempunyai tiga pena biru dan akan mencari tahu dari tiga pena itu, yang

mana yang digunakan untuk menulis sebuah pesan. Sampel dari masing-masing tinta

diteteskan pada garis dasar pinsil pada selembar kromatografi kertas. Beberapa pewarna larut

dalam jumlah yang minimum dalam pelarut yang sesuai, dan itu juga di teteskan pada garis

yang sama. Dalam gambar, pena ditandai 1, 2 dan 3 serta tinta pada pesan ditandai sebagai

M.

Kertas digantungkan pada wadah yang berisi lapisan tipis pelarut atau campuran pelarut yang

sesuai didalamnya. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis pada bercak

diatasnya. Gambar berikutnya tidak menunjukkan terperinci bagaimana kertas di gantungkan

karena terlalu banyak kemungkinan untuk mengerjakannnya dan dapat mengacaukan gambar.

Kadang-kadang kertas hanya digulungkan secara bebas pada silinder dan diikatkan dengan

klip kertas pada bagian atas dan bawah. Silinder kemudian ditempatkan dengan posisi berdiri

pada bawah wadah. .Alasan untuk menutup wadah adalah untuk meyakinkan bahwa

astmosfer dalam gelas kimia terjenuhkan denga uap pelarut. Penjenuhan udara dalam gelas

kimia dengan uap menghentikan penguapan pelarut sama halnya dengan pergerakan pelarut

pada kertas.Karena pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen yang berbeda

dari campuran tinta akan bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan

berdasarkan pada perbedaan bercak warna.

Ditinjau dari sistem pelarut yamg digunakan dalam kromatografi partisii, dikenal tiga

kategori sebagai: a. fase dan berair. (aqueous), b. fase diam pelarut organic hidrofilik, dan c.

fase diam pelrut organic hidrofobik seperti digunakan dalam RPPC.

1.2. Teknik Kromotografi Kertas

Proses pengeluaran asam mineral kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan pada kertas

dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung kertas dalam

bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia diletakkan di dalam ruang yang

sudah dijenuhkan dengna iar atau dengan pelarut yamg sesuai. Penjenuhan dapat dilakukan

24 jam sebelum analisis. Terdapat tiga teknik pelaksanaan analisis. Descending adalah salah

satu teknik di mana cairan dibiarkan bergerak memenuhi kertas akibat gravitsi. Pada teknik

ascending; pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler. Nilai Rf harus sama baik pada

descending maupun ascending. Sedangkan yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau

kromatografi kertas sirkuler. Kondisi-kondisi berikut harus diperhatikan untuk memperoleh

nilai Rf yang reprodusibel. Temperatur harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih

dari 0,5 C. Kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer

pelarutnya, agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas.

Dilakukan beberapa pekerjaan yang parallel, Rf nya tidak boleh berbeda lebih dari 0,02.

1.3. Kromatografi Lapisan Tipis

Teknik ini dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorbent dilapiskan pd

lempeng kaca yang bertindak sebagai penunjang fase diam. Fase bergerak akan menyerap

seapnjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi

kolom terbuka.Metode ini sederhana, cepat dalam memisahkan dan sensitive. Kecepatan

pemisahan tinggi dan mudah untuk mempeloleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan.

Pemishan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi

yang akan digunakan. Untuk meneteskan sempel yamg akan dipisahkan digunakan suatu

mikro-syringe (penyutik berukuran mikro). Sampel diteteskan pada salah satu bagian tepi plat

kromatografi (sebanyak 0,01-10 g zat).Pelarut harus nonpolar dan mudah menguap.

Zat-zat berwarna dapat dilihat langsung, tetapi dapat juga digunakan reagent penyemprot

untuk melihat bercak suatu zat. Asam klomat sering digunkan ubtuk zat organic.Untuk

analisis kuantitatif dapat digunakan plot fotodensitometer.Analisanya dapat digunakan

dengan spektrofotometer uV, sinar tampak, IR atau fluorosens atau dengan reaksi kolorimeter

dengan reagent kromogenik.

1.4. Kromatografi Pasangan Ion

Pemisahan sampel-sempel yng mudah terdisosiasi dalam larutan air dapat

dioptimasikan dengan mengatur PH fase diam atau fase bergeraknya. Hal ini akan

menghalangi disosiasi dan zat terlarut terelusisebagai punjak yang lebih tjm. Misalnya

CH3COOH ditambahakan pad pelarut yang digunakan dalam KLT atau kromatografi kertas

untuk memperoleh punjak yang tajam. Demikian juga basa seperti ammonia atau basa

organic dapat ditambahkan untuk mempertajampuncak.

Kromatografi pasangan ion didasarkan pada pembentukan suatu pasangan ion antara

sempel dan fase berfgerak maupun fase diamnya.teknik ini sudah sering digunakan KCBT

untuk pemisahan senyawa ionik. Biasanya silica-gel digunakan sebagai penunjang fase diam

berair yang mengandung ion pengimbang dan buffer. Pelarut lain yang tidak bercampur

digunakan sebagai pengelusi (eluen)

1.5. Prinsip Dasar Kromatografi Partisi Cair-cair

Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu pemisahan dipenggaruhi oleh distribusi sampel

antara fase cair diam dan fase cair bergerk dengan membatasi kemampuan pencampuran. Jika

suatu zat terlarut dikocok dalam sistem 2 pelarut yang tidak bercampur (melarutkan) maka

zat terlrut akan terdistribusi di antara kedua fase dn jika ke setimbangan tercapai, mk

koefesien partisinya (Kd):

Kd = Koefesien zat terlarut pada pelarut A

Koefesien zat terlarut pada pelarut B

Martin dan Synge melakukan teknik ekstraksi cair-cair secara fraksional dengan cara

mengepak kolom silica gel kemudian meletakkan larutan campurannya pda kolom dan

mengelusinya dengan pelarut tidak percampur, sepeti butanol.Cairan yang tertahan did lam

kolom adalah fse diam sedangkan cairan yang bergerak sepanjang kolom adalah fase gerak.

Pemisahan didasarkan pada pemanfaatan perbedaan koefesien partisi zat terlarut, oleh karena

itu teknik ini dikenal sebagai kromatografi partisi.

Teori dasar kromatografi partisi mirip dengan teori destilsi bertingkat.

1.6. Kromatografi Partisi Cair-cair

Teknik ini terdiri dari suatu kolom yang berisi zt padat penunjang halus di man pda

permukan terdpat pelrut sebagai fase diamnya. Fase keduan, yaitu fase bergerak yang tidak

bercmpur dengan ciran dari fase diamnya akan mengalir sepanjang kolom. Komponen-

komponen yang terpartisi lebih banyak pada fse diam kan berthan lebih lama di dalam kolom

dibndingkan yng lebih banyak terpartisi pada fase gerak.

Zat padat penunjang merupakan suatu materi padat yng berpori-pori dengan menggunakan

ukuran antara 100-300 mesh, dan dapat mengandung sampai 50% berat cairan penunjang.

Kieselguhr, tanah diatome, selulosa dan silica gel paling sering digunakan sebagai zat padat

penunjang. Silika gel dapat mengabsorpsi sampai 70% berat air tanpa cairan terabsorpsi

karena sifatnya sebagai materi yang terserat.

Pada pemisahan pelarut, maka biasanya pelarut hidrofilik bertindak sebagai pelarut

yang berfungsi sebagai fase diam, sedangkan pelarut hidrofobik sebagai fase bergerak.

Pelarut dapat diklasifikasikan berdasarkan ikatan hidrogennya.Pelarut-pelarut dengan sifat

sebagai donor taupun akseptor pasangan electron mempunyai kemampuan untuk membentuk

ikatan hydrogen intermolekuler.

1.7. Kromatografi Ekstraksi Fase Terbalik

Dikenal juga sebagai kromatografi fase terbalik. Sesuai dengan namanya, maka fase

yang digunakan dalam kromatografi prtisi cair-cair adalah terbalik.Ada suatu teknik tertentu

untuk melapisi zat padat penunjang dengan pelarut hidrofobik (materi penoleflon atau

kieselguhr). Zat tersebut dibuat hidrofobik dengan cara mengalirkan uap kloroilan kepadanya.

Dari berbagai pelarut , mka telah diketahui bahwa berbagai pelarut pengsolvsi seperti TBP,

TBPO. TOPO,MIBK, etil asetat, mesitil oksida dapat digunakan sebagai fase hidrofobik.

Demikin juga pelrut-pelarut yang menunjukkan kemampuan ekstraksi dengan pembentukn

pasangan ion seperti: amina-amin berberat molekul tinggi seperti TOA, TIOA. MDOA,TBA,

Amberlit LA-1, LA-2, aliquat 336S, Arquad 6C juga dapat digunkan sebgai fase hidrofobik.

Di akhir-akhir ini ada suatu kecendrungan untuk menggunakan pengkhelat sebagai fase

hidrofobik fase ter balik seperti HdEHP, DNS dan sebagainya.

Dengan menggunakan teknik RPPC (reversed phase pertition chromatografi) atau

kromatografi partisi fase terbalik, pemisahan-pemisahan terbalik ion logam yang tdinya sulit

dilakukan, dapat dilaksanakan dengan mudah. Misalnya dengan fase diam TBP, pemisahan

yang sempurna dapat dilakukan terhadap Besi (III); chrom (VI); germanium (IV);

molybdenum (VI); vanadium (V); emas (III); dan merkuri (II) dari satuan campuran multi

komponen.

Daftar Referensi Curtis, O.F dan Clark,D.G. 1950. An Introduction to Plant Physiology. Mc Graw Hill Book Company, New York. Darmawan, J dan Justika, S. Baharsjah. 1983. Dasar-dasar Fisiologi Tanaman. P.T. Suryandara Utama, Semarang. Dwidjoseputro, D. 1980. Pengantar Fisiologi Tumbuhan. Gramedia, Jakarta. Gritter, R. J. 1991, diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Pengantar Kromatografi . ITB, Bandung. Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia Penentuan Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. ITB, Bandung. Hopkins, W. B. 1995. Introduction to Plant Physiology. John Willey and Sons Inc., New York. Hoste Hman, K. 1995. Cara Kromatografi Preparatif. ITB, Bandung. Lakitan, B. 2000. Dasar-Dasar Fisiologi Tumbuhan. PT. Raja Grafindo Persada, Jakarta. Loveless, A.R. 1991. Prinsip-Prinsip Biologi Tumbuhan untuk Daerah Tropik. P.T. Gramedia, Jakarta. Paul, M. J dan T. K. Pellny. 2002. Carbon metabolite feedback regulation of leaf photosynthesis and development. Journal of Experimental Botany. 54 (382) : 539-547. Tjitrosomo, S. 1985. Botani Umum Jilid II. Penerbit Angkasa, Bandung.