I. PENDAHULUAN

I.1 LATAR BELAKANG

Kimia analitik adalah cabang ilmu kimia yang berfokus pada analisis

material untuk mengetahui komposisi, struktur, dan fungsi kimiawinya. Secara

tradisional, kimia analitik dibagi menjadi dua jenis, kualitatif dan kuantitatif.

Analisis kualitatif bertujuan untuk mengetahui keberadaan suatu unsur atau

senyawa kimia, baik organik maupun anorganik, sedangkan analisis kuantitatif

bertujuan untuk mengetahui jumlah suatu unsur atau senyawa dalam suatu

cuplikan.

Kimia analitik modern dikategorisasikan melalui dua pendekatan, target

dan metode. Berdasarkan targetnya, kimia analitik dapat dibagi menjadi kimia

bioanalitik, analisis material, analisis kimia, analisis lingkungan, dan forensik.

Berdasarkan metodenya, kimia analitik dapat dibagi menjadi spektroskopi,

spektrometri massa, kromatografi dan elektroforesis, kristalografi, mikroskopi,

dan elektrokimia.

Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur

yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa- fasa ini

membentuk suatu lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan yang

lainnya merupakan cairan yang merembes lewat atau melalui lapisan yang

stasioner. Fasa stasioner/diam dapat berupa zat padat atau suatu cairan, dan fasa

gerak dapat berbentuk cairan ataupun gas. Maka semua jenis kromatografi yang

dikenal, terbagi menjadi empat golongan: cair-padat,gas-padat, cair-cair, dan gas-

cair (Day dan Underwood, 2002). Fase diam akan menahan komponen campuran

sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang

mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang

mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Sekarang ini,

kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu campuran senyawa.

Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam,salah satu jenisnya adalah

HPLC( High Performance Liquid Chromatography) atau dapat disebut

KCKT(Kromatografi cair kinerja tinggi).  HPLC didefinisikan sebagai

kromatografi cair yang dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara

kimia pada penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase

gerak yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai

tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan

waktu yang relative singkat. HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan

yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam

suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan;

bioteknologi; polimer; dan industri- industri makanan. Dalam makalah ini akan

dijelaskan beberapa keterangan tentang penggunaan HPLC ( High Performance

Liquid Chromatography).

I.2 RUMUSAN MASALAH

Berdasarkan latar belakang diatas , maka permasalahan yang akan dibahas

makalah ini adalah :

a. Apa yang di maksud dengan HPLC ?

b. Bagaimana prinsip kerja dari HPLC ?

c. Apa saja komponen utama dari HPLC?

d. Apa saja jenis – jenis injector pada HPLC?

e. Apa saja jenis – jenis detector pada HPLC?

I.3 TUJUAN

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah :

a. Untuk mengetahui pengertian dari HPLC.

b. Untuk mengetahui prinsip kerja dari HPLC.

c. Untuk mengetahui komponen – komponen utama dalam HPLC.

d. Untuk mengetahui jenis – jenis injector pada HPLC.

e. Untuk mengetahui jenis – jenis detector pada HPLC.

II. PEMBAHASAN

II.1 Pengertian HPLC ( High Performance Liquid Chromatography).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut

dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun

1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan

yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam

sediaan farmasetik. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang

lebih dikenal dibandingkan dengan kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT)

merupakan teknik analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun

kuantitatif yang banyak digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik

didih tinggi yang tidak dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.

Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya

yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2

komponen yang berbeda fasanya (fasa diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari

fasa diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion,

atau polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair

dengan aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan

pada temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fase (gerak dan diam).

Migrasi dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya,

maka komponen dengan distribusi tinggi pada fase diam akan bergerak lebih

perlahan didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang

distribusinya rendah.

Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor

kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram

menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi

komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja

sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode

yang  tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan

kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-

senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-

protein dalam cairan fisiologis;menentukan kadar senyawa aktif obat, produk

hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan

farmasi. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure

(tekananrendah), dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai

satuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas

karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendin

gin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong,

jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak

terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan

pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi

bleeding. Temperatur  pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam

kolom konstan sehingga KD tetap.

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) atau High Pressure Liquid

Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia.

HPLC termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan

fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini

jika dibandingkan dengan metode lainnya. Kelebihan itu antara lain:

Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran

Mudah melaksanakannya

Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi

Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis

Resolusi yang baik

Dapat digunakan bermacam-macam detektor

Kolom dapat digunakan kembali

Mudah melakukan "sample recovery". Mudah untuk mendapatkan kembali

cuplikan, karena detector pada HPLC tidak merusak komponen zat yang

dianalisis.

Dapat memisahkan zat-zat yang tidak mudah menguap ataupun tak tahan

panas

Banyak pilihan fasa geraknya

Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang

dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit

(uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai

Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa

dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit

berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan

rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa

diam dan rasa gerak pada HPLC memberikan parameter tambahan untuk

mencapai pemisahan yang diinginkan.

Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam

HPLC dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari

bermacam-macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia

dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-

detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll

dapat juga digunakan dalam HPLC

Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom

kromatografi klasik, kolom HPLC dapat digunakan kembali (reusable) .

Banyak analisis yang bisa

dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang

diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan

Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak bisa

dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi

untuk menganalisis psesies ionik. HPLC dengan tipe eksklusi dan penukar

ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.

Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam HPLC

tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang

diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah

dikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan

dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan

prosedur khusus.

II.2 Prinsip Kerja HPLC

Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah

pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase

mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan

eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang mengandung

hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang lebih tinggi akan

tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.

Metode pemisahan umum dalam HPLC tergantung sifat polaritas senyawa

dalam eluat;

a. Fasa Normal •Fasa gerak nonpolar •Fasa diam polar

b. Fasa Terbalik •Fasa gerak polar •Fasa diam nonpolar

Resolusi adalah pengukuran secara fisik suatu pemisahan. Resolusi dapat

ditingkatkan dengan mengoptimasi parameter-parameter HPLC yaitu

retensi,selektifitas, dan efisiensi. Secara praktis parameter- parameter HPLC

tersebt dapat dioptimalkan dengan mengubah:

1. Komposisi dari fase gerak

2. Laju alir

3. Sifat kimia dari fase gerak

4. Jenis kolom Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan

sekaligus kualitatif.

Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan kromatogram sampel

dengan kromatogram baku pembanding berdasarkan waktu retensinya.

Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :

Cx = Ax / Ap X Cp

Keterangan :

A = Peak area = Luas puncak

C = Konsentrasi X = sampel

P = pembanding

Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan

dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar. HPLC yaitu alat yang

berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam (yaitu sebuah

tube dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan

memompa cairan (fase bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel

yang akan dianalisis dijadikan dalam volume yang kecil dari fase bergerak dan

diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika sampel melalui sepanjang

kolom.

Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam organik. Waktu

saat analit keluar dari ujung kolom disebut waktu retensi dan merupakan suatu

karakteristik yang unik dari tiap analit. Penggunaan dari tekanan menaikkan

kecepatan linear memberikan lebih sedikit waktu bagi analit untuk berdifusi, dan

menghasilkan chromatogram. Pelarut yang banyak digunakan yaitu air dan zat-

zat organik seperti metanol. HPLC ini digunakan untuk asam organik, seperti

asam formiat dan asam asetat. Jika sampel mula-mula berbentuk padatan harus

di-distruksi dulu kemudian di-treatment sehingga berupa larutan homogen yang

tidak terdapat endapan lagi dan bening karena syarat sampel yang dapat dianalisa

menggunakan HPLC adalah harus tidak ada endapan dan harus bening.

II.3 Komponen – Komponen utama HPLC

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih

polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada

fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut. 

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari

partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus

dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di

pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis. 

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama

elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama

elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi

bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks

terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)

 Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik

adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering

digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan

fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

2.Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat

sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak.

Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon,

dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan

sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3

mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu

mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit. Tujuan penggunaan

pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses

penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan

bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan

tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa

dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan

dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

3. Injektor

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak

yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik

yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan

keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. 

Posisi pada saat memuat sampel  Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional,yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom

mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel

terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.

Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara

kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil

benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu

gugussilanol(Si-OH).  Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan

menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi

dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang

lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak

digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang

rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi

lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil

(nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang

tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan

karena adanya kandungan air yang digunakan.

 5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor

universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan

tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri

massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit

secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan

elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut

pada kadar yang sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut

pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan

karakteristik detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifita

s (g/ml)

Kisaran

linier

Karakteristik

Absorbansi Uv-vis

Fotometer filter

Spektrofotometer

spektrometerphoto-

diode array

5 x 10-10

5 x 10-10

> 2 x 10-10

104

105

105

Sensitivitas bagus,

paling sering digunakan,

selektif terhadap gugus-

gugus dan struktur-

struktur yang tidak jenuh.

Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat

bagus, selektif, Tidak

peka terhadap perubahan

suhu dan kecepatan alir

fase gerak.

Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat

universal akan tetapi

sensitivitasnya sedang.

Sangat sensitif terhadap

suhu, dan tidak dapat

digunakan pada elusi

bergradien

Elektrokimia

Konduktimetri

Amperometri

10-8

10-12

104

105

Peka terhadap

perubahan suhu dan

kecepatan alir fase gerak,

tidak dapat digunakan

pada elusi bergradien.

Hanya mendeteksi solut-

solut ionik. Sensitifitas

sangat bagus, selektif

tetapi timbul masalah

dengan adanya

kontaminasi elektroda.

6.   Recorder

Recorder berfungsi sebagai sistem pencatat yang mampu menampilakan

kromatogram dengan jelas tepat dan cukup peka. Recorder ini mampu

menampilkan puncak-puncak kromatogram dengan jelas dan tidak terganggu

oleh noise listrik.

Berikut adalah instrument dari alat HPLC :

II.4 Jenis – Jenis Injektor pada HPLC

Cuplikan harus dimasukan kedalam pangkal kolom (kepala kolom),

diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada

dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system

injector, yaitu:

a.       Stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

system tertutup dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena

difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak dipengaruhi.

b.      Septum : septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang

digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja

sampa 60 – 70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-

pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum

injector) dapat menyebabkan penyumbatan.

c.       Loop vaive : tipe injector ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan

menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan

secara manual). Pada posisi load, sampel diisikan ke dalam loop pada kinerja

atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.

Alat untuk memasukan sampel ke dalam system HPLC

Pump Pump

Column Column

INJECT

LOAD

SISTEM SAMPEL LOOP INJEKTOR

Injektor memiliki 6 terminal yang berfungsi sebagai saklar. Pada saat posisi

"LOAD" pompa langsung terhubung pada kolom separasi dan sampel terisi

kedalam stainless steel tube (loop) , pada posisi "INJECT" pompa terhubung

langsung denganstainless steel tube (loop) dan mengalir kedalam kolom

separasi.  Sistem ini memungkinkan untuk membuang sisa kelebihan sampel

yang akan diinjeksikan sehingga diharapkan volume sampel yang masuk

kedalam kolom lebih teliti.

II.5 Jenis –Jenis Detektor pada HPLC

Tinggi Kromatografi cair berperforma (atau kromatografi cair tekanan

tinggi, HPLC) merupakan bentuk kromatografi kolom sering digunakan dalam

biokimia dan analisis kimia untuk memisahkan, mengidentifikasi, mengukur dan

memanjang

HPLC memanfaatkan kolom yang memegang chromatographic bahan

kemasan (tahap tak berubah), sebuah pompa yang bergerak selular fase (s)

melalui kolom, dan detektor yang menunjukkan ingatan waktu

Molecules. Retensi waktu bervariasi tergantung pada interaksi antara keadilan

tahap, yang Molecules yang dianalisis, dan larutan (s) yang digunakan. 

Kromatografi jenis ini menggunakan fase gerak berupa cairan yang dialirkan

dengan tekanan sangat tinggi sedangkan fase diamnya dapat berbagai macam,

tergantung mode kromatografi yang dipilih dalam proses pemisahan. HPLC

mempunyai keunggulan dibanding kromatografi lain, yaitu mempunyai banyak

kolomposisi load

Posisi injectpo

mpa

kolom

sample loop

pompa

pilihan detektor yang dapat digunakan. Detektor merupakan suatu bagian integral

dari sebuah peralatan analitik kromatografi cair yang modern.

Klasifikasi Detektor

Secara garis besar , detektor dalam HPLC dapat dikelompokan :

a. Berdasarkan pengukuran diferensial suatu sifat yang dimiliki baik oleh

molekul sampel maupun fase gerak (bulk property detector).

Detektor dapat dibedakan menjadi :

• Detektor Indeks Bias 

Detektor indeks bias merupakan detektor yang juga luas penggunaannya setelah

detektor ultraviolet. Dasarnya ialah pengukuran perbedaan indeks bias fase gerak

murni dengan indeks bias fase gerak yang berisi komponen sampel, sehingga

dapat dianggap sebagai detektor yang universal pada HPLC. Detektor ini kurang

sensitif dibanding dengan detektor ultraviolet dan sangat peka terhadap

perubahan suhu.

• Detektor konduktivitas 

• Detektor tetapan dielektrika

b. Berdasar pengukuran suatu sifat yang spesifik dari molekul sampel (disebut

solute property detector). 

Jenis yang kedua ini dibedakan lagi menjadi :

1) Tidak memerlukan adanya pemisahan fase gerak, 

• Detektor-detektor fotometer (uv-vis dan inframerah)

Pada detektor ultraviolet/visibel, deteksi komponen sample didasarkan

pada absorpsi sinar ultraviolet (untuk detektor ultraviolet) dan sinar

tampak (untuk detektor visibel). Detektor ultraviolet merupakan detektor

yang paling luas digunakan karena sensitivitas dan reprodusibelitasnya

yang tinggi serta mudah operasinya. Detektor UV terutama digunakan

untuk pendeteksian senyawa-senyawa organic. Detektor UV dilengkapi

dengan pengatur panjang gelombang sehingga panjang gelombang UV

yang digunakan dapat dipilih disesuaikan dengan jenis cuplikan yang

diukur. Walaupun demikian, biasanya panjang gelombang UV yang

digunakan adalah pada 254 nm karena kebanyakan senyawa organic

menyerap sinar UV pada sekitar panjang gelombang tersebut. 

Detektor fotometer inframerah juga dapat digunakan pada HPLC.

Dengan detektor ini dapat dibuat pola spektrum infra merah dari

komponen sampel sehingga gugus-gugus fungsionalnya dapat diketahui.

• Detektor Polarografi dan radioaktif;

Kedua detector ini dipengaruhi oleh variasi laju aliran..

2) Memerlukan pemisahan fase ferak terlebih dahulu

Termasuk didalamnya FID dan ECD.

Detektor yang digunakan dalam HPLC dibedakan menjadi 3 macam,

yaitu: 

1. Detektor spektrofotometrik 

Detektor spektrofotometri , biasanya dalam daerah ultraviolet, digunakan

secara luas. Idealnya, spektrofotometri yang nyata dengan pemilihan

panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang

maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan

sensitivitas yang sangat baik, sel sample yang biasa akan digantikan

dengan suatu alir untuk melewatkan larutan eluen kolom guna menembus

berkas sample dari peralatan tersebut. Spektrofotometer ultraviolet yang

modern merupakan salah satu detector yang sangat mahal, sehingga

dibutuhkan suatu kompromi. Dibandingkan dengan ribuan dollar yang

harus dikeluarkan untuk spektrofotometer yang hanya bahkan tergolong

kelas dua saja, maka $2500 atau sekitar itu akan mendapatkan sebuah

detector untuk memonitor larutan eluen kolom pada 254 atau 280 nm

(harga-harga tahun 1989). Biaya yang lebih rendah mencerminkan

penggunaan spektrum garis lampu uap merkuri dan bukan suatu sumber

kontinyu dan monokromator, penyaring-penyaring yang sederhana

mengisolasi garis yang diinginkan di dalam spektrum merkuri. 

Pemilihan panjang gelombang yang terbatas itu tampaknya membatasi,

tetapi detektor-detektor sederhana ini bekerja dengan baik pada banyak

kasus. Contohnya, protein yang menyerap semua pada 280 nm akibat

adanya rantai samping asam amino aromatik, dan hampir semua senyawa

aromatik termasuk yang banyak diminati di bidang biologi (yakni: purin,

pirimidin, nukleosida, nukleotida, dan asam nukleat) dapat dideteksi pada

254 nm.

Sensitivitas bervariasi berdasarkan kecocokan antara lain pita absorpsi zat

terlarut dan panjang gelombang detektor yang tersedia dan intensitas pita

dan panjang jalan yang melewati sel detektor, tetapi sebagai pedoman

kasar, detektor ultraviolet akan dapat “melihat” kuantitas nanogram, bisa

kita katakan bahwa susunannya 1000 kali lebih sensitiv daripada detektor

indeks bias. Sebagai tambahan, detektor ini relatif tidak sensitif terhadap

temperatur. 

2. Detektor Fluorometrik 

Detektor-detektor yang didasarkan pada fluroresens sudah semakin biasa.

Jenis yang paling serbaguna mampu menghasilkan eksitasi variable yang

terus menerus di sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang

lebar dengan memanfaatkan sebuah sumber kontinyu dan monokromator,

biasanya penyaring-penyaring yang sederhana digunakan untuk

mentransmisikan emisi pendaran pada foto detektor sambil menahan

radiasi eksitasinya. Versi yang lebih murah menggunakan penyaring pada

sisi eksitasi maupun sisi emisi dan memanfatkan sumber dengan panjang

gelombang eksitasi yang lebih terbatas. Banyak senyawa dapat dideteksi

dengan fluoresens, termasuk diantaranya banyak pencemar lingkungan,

seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, dan yang diminati dalam bidang

biologi, seperti vitamin, obat-obatan dan neurotransmitter. Kadang-

kadang fasa bergerak melewati suatu reaktor pasca kolom dimana

komponen-komponen sample nonfluoresensnya dikonversikan menjadi

turunan berpendar. Suatu contoh yang paling terkenal adalah

pendeteksian asam-asam amino pada tingkat subnanogram setelah reaksi

dengan reagen fluoresamin (fluorescamin). 

3. Detektor Elektrokimia 

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik

(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya

digunakan untuk mendeteksi solute-solut yang dapat mengalami reaksi

redoks baik senyawa organic maupun anorganik.

Pada detektor ini, larutan eluen dari kolom memasuki sebuah sel di mana

larutan tersebut mengalir di atas permukaan sebuah elektroda yang diberi

potensial pada suatu harga, dimana komponen-komponen smpel

mengalami reaksi transfer electron. Pendeteksian jenis ini telah

digunakan, misalnya untuk neurotransmitter dan metabolisme mereka di

dalam ekstra selular dari jaringan otak hewan percobaan, senyawa-

senyawa seperti dopamin, norepinefrin, serotonin dan asam homovanilik

menghasilkan arus oksidasi pada elektroda karbon mirip yang diberi

potensial +0,60 V vs. Sebuah elektroda referensi perak-perak klorida.

Elektroda referensi pada umumnya melewati semacam jembatan garam.

4. Desain detector

Desain detektor sangat penting. Apabila volumenya mati, termasuk

hubungannya dengan kolom, harus sangat kecil, dan larutan harus

mengalir dengan lancar melewati alat itu tanpa pencampuran yang

turbulen. Pada umumnya, volume detektor hanya sebesar beberapa

mikroliter.

5. Pemilihan detektor 

Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang

umumnya didasarkan pada persyaratan sebagai berikut :

a. cukup sensitive

b. stabilitas dan keterulangan tinggi

c. respon linear terhadap solute

d. waktu respon pendek sehingga tidak bergantung kecepatan alir

e. relibilitas tinggi dan mudah digunakan

f. tidak merusak cuplikan.

Dari berbagai macam detector yang ada detektor indeks bias merupakan

satu-satunya detektor pada HPLC yang universal, tetapi kurang sensitiv

dan sangat peka tehadap perubahan suhu. Detektor ultraviolet dengan

panjang gelombang yang variabel merupakan pilihan yang paling baik

bagi sekelompok besar obat-obatan. Dalam hal-hal yang sangat spesifik

dapat digunakan detektor-detektor fluorometer dan elektrokimia.

III. PENUTUP

III.1 KESIMPULAN

1. HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan dengan

memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang

distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak yang dipaksa mengalir

dengan laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga

menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative

singkat.

2. Prinsip dasar HPLC (High Performance Liquid Chromatografi) adalah

pemisahan senyawa-senyawa berdasarkan kepolaran, dimana terdapat fase

mobile (gerak) dan fase stasioner (diam). Fase mobilenya adalah sampel dan

eluen yang bercampur, dan fase stasionernya adalah silika gel yang

mengandung hidrokarbon. Sehingga senyawa yang memiliki kepolaran yang

lebih tinggi akan tertahan pada fase stasioner yang bersifat polar.

3. Komponen-komponen utama dari HPLC yaitu :

a. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

b. Pompa

c. Injektor

d. Kolom dan Fase diam

e. Detektor

f. Rekorder

4. Jenis – Jenis Injektor dalam HPLC :

a. Stop flow

b. Septum

c. Loop vaive

5. Jenis – jenis detector pada HPLC :

a.  Detektor spektrofotometrik 

b. Detektor Fluorometrik 

c. Detektor Elektrokimia