EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

Diajukan untuk memenuhi salah satu tugas mata kuliah Kimia Pemisahan

Dosen : Dr. Sumar Hendayana, M.Sc.

Disusun Oleh :

Irma Rahmawati, S.Pd.

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA

2013

EXCLUSION CHROMATOGRAPHY

A. Prinsip Dasar Kromatografi Eksklusi

Exclusion Chromatography (EC) yang bisa disebut juga Size Exclusion Chromatography

(SEC), Gel Permeation Chromatography (GPC), atau Gel Filtration Chromatography (GFC),

merupakan metode  kromatografi yang menggunakan partikel berpori untuk memisahkan

molekul dengan  ukuran yang berbeda. Teknik SEC pertama kali ditemukan oleh Grant Henry

Lathe  dan Colin R. Ruthven. Teknik ini unik karena proses pemisahannya didasarkan pada

ukuran molekul dari sampel. Molekul besar pada sampel akan dipisahkan dengan molekul yang

kecil dalam sampel.

Pada teknik ini, pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat

kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalam jaringan dan ditahan dalam

fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar, tidak

dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa ditahan. Akibatnya, molekul yang

lebih besar terelusi dari kolom molekul cepat dan lebih kecil kemudian, yang secara efektif

macam molekul berdasarkan ukuran. Ini adalah prinsip pemisahan kromatografi eksklusi

ukuran1.

Gambar A.1 Ilustrasi prinsip dasar kromatografi eksklusi2

Fase diam yang digunakan dapat berupa silica atau polimer yang bersifat berpori (porus),

sehingga solut dapat melewati porus tersebut (lewat diantara partikel), atau berdifusi melalui fase

1 Size Exclusion Chromatography. 2011. http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/lib/lctalk/55/55intro.html2 http://en.wikipedia.org/wiki/Size-exclusion_chromatography

1

diam. Sedangkan fase gerak pada kromatografi ini tidak berpengaruh, sehingga pelarut yang

berlainan yang mempunyai daya mensolvasi yang sama menghasilkan hasil yang sama. Sedikit

banyak fase gerak pada kromatografi ekslusi ini serupa dengan gas pada kromatografi gas dalam

hal fungsinya yang hanya sebagai medium netral yang memungkinkan molekul solut memasuki

fase diam3.

1. Pemilihan Kolom

Pemilihan ukuran pori kemasan pada umumnya bergantung pada molekul solut yang

akan dipisahkan. Sering sampel ukurannya sangat beragam (berat molekul berbeda-beda) dan

dengan satu ukuran pori saja tidak memadai untuk memisahkan semua jenis molekul. Beberapa

mungkin dieksklusi seluruhnya dari pori (K=0) dan terelusi sebagai satu puncak dengan volum

mati (V0), sedangkan yang lain berpermeasi ke semua pori (K=1) dan terelusi sebagai satu

puncak dengan volum permeasi total (V0 + Vp). Sedangkan molekul yang lainnya lagi

berpermeasi ke pori secara selektif, bergantung pada ukuran relative dan terelusi dengan volum

retensi (VR) yang dinyatakan oleh persamaan4 ;

VR = V0 + KVp

Oleh karena itu, prinsip kromatografi eksklusi lainnya adalah terjadinya pemisahan molekul

polimer sesuai dengan volume hidrodinamiknya ketika sampel diinjeksikan ke dalam  kolom.

Gambar A.2 Kolom Kromatografi Eksklusi Ukuran

Setiap kemasan ekslusi-ruang yang berbeda ukuran porinya mempunyai kurva

kalibrasi sendiri. Batas eksklusi dan rentang kerja berat molekul pada gambar dibawah ini tidak

didefinisikan secara tajam karena distribusi pori kemasan kolom tidak sempit. Distribusi pori

3 Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB.4 Idem no 3

2

pada kemasan menentukan kemiringan kurva kalibrasi. Jika distribusi pori besar, kurva

mempunyai kemiringan yang tajam. Jadi, rentang kerja berat molekul besar, tetapi akan

menghasilkan daya pisah rendah pada senyawa-senyawanya yang ukuran molekulnya hampir

sama. Jika distribusinya sempit, kurva lebih mendatar, jadi rentang kerja berat molekul akan

lebih kecil, tetapi daya pisah molekul yang ukurannya hampir sama akan meningkat5.

Gambar A3 (a) Kurva kalibrasi dan (b) kromatogramnya untuk kromatografi eksklusi6

Kemasan untuk kromatografi eksklusi dapat dikelompokkan menjadi 3 golongan :

a. Gel Setengah Kaku

Bahan ini biasanya berupa gel yang dipakai dalam pelarut organic, seperti aseton,

tetrahidrofluran, dan sebagainya. Contoh dari golongan ini adalah gel TSK dan gel Styragel

yang digunakan untuk memisahkan cuplikan polimer rumit, seperti karet dan plastic.

Kekurangan utama kemasan partikel besar ini (dp = 35-75 mikrometer) adalah alih massanya

yang rendah. Untuk memperoleh kemasan yang memadai, harus dipakai laju alir yang

rendah, akan tetapi hal ini mengakibatkan waktu analisis yang panjang. Kemasan eksklusi

partikel (dp = 10 mikrometer) telah dikembangkan, sehingga bisa mendorong alih massa

yang cepat dan memungkinkan pemakaian laju alir yang tinggi, sehingga waktu analisis yang

lebih pendek. Partikel kecil dengan pori berukuran kecil meghasilkan daya pisah tinggi, I ni

berarti bahwa berat mokelul yang lebih rendah (1000-100) dapat dipisahkan.7

5 Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB6 Lloyd R. Snyder, Joseph J. Kirkland. 2010. Introduction To Modern Liquid Chromatography, third Edition. Canada : John Wiley & Sons, Inc.7 Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB

3

b. Gel Kemasan Kaku

Kemasan ini hampir selalu dibuat dari kaca atau silica. Keuntungan dari kemasan

ini adalah kekuatannya menghilangkan pembatasan laju aliran karena dapat dipakai pada

tekanan tinggi. Pelarut yang digunakan adalah air dan pelarut organic. Kekurangannya adalah

adanya pengaruh absorban yang sering menyulitkan. Namun, harus diperhatikan bahwa

larutan basa dengan pH > 7,5 harus dihindari, karena dapat melarutkan kaca dan silica. 8

c. Gel Lunak

Bahan kemasan ini contohnya adalah dekstran sambung silang dan sephadex.

Kemasan gel lunak menggembung dalam pelarut air, gel ini berguna untuk memisahkan

senyawa yang larut dalam air, yang rentang berat molekulnya 102 – 2,5.107. Fungsi utama

dari gel lunak adalah untuk memisahkan polimer yang larut dalam air. Gel ini banyak dipakai

dalam pencirian atau pengkarakterisasian protein dan enzim. Kekurangan bahan ini dapat

diuraikan oleh bakteri yang dapat menyebabkan hilangnya kinerja kolom, gel lunak tidak

dapat menahan tekanan > 150 psi dan sangat rapuh.9

2. Pemilihan Fase Gerak

Fasa gerak dipilih untuk meminimalisir interaksi solute dengan permukaan

penyangga, memiliki kemurnian yang tinggi, tidak bereaksi dengan fase diam, tercampurkan

dengan komponen system, pelarutnya baik untuk cuplikan, dapat membasahi permukaan

kemasan dan viskositasnya rendah.

8 Edward L. Johnson dan Robert Stevenson. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Jakarta : Penerbit ITB9 Idem No 8

4

B. Mekanisme Kromatografi Eksklusi

Buffer dipompa melewati kolom oleh alat yang diatur oleh komputer. Saat  campuran

molekul dan ion-ion yang terlarut dalam pelarut diaplikasikan pada ujung  atas kolom, molekul-

molekul yang lebih kecil (dan ion) didistribusikan melalui volume pelarut yang lebih besar

daripada yang tersedia untuk molekul besar. Molekul  yang lebih kecil dari ukuran pori dapat

masuk ke dalam pori dan karenanya  memiliki jalur yang lebih panjang serta waktu transit yang

lebih panjang  dibandingkan molekul besar yang tidak dapat memasuki pori. Seluruh molekul 

yang lebih besar ukurannya dibandingkan ukuran pori, tidak tertahan dan akan dielusi 

bersamaan. Molekul yang dapat masuk ke dalam pori akan memiliki waktu tinggal  rata-rata

dalam partikel, yang bergantung dari bentuk serta ukuran molekulnya.  Karena itu, molekul besar

bergerak lebih cepat melewati kolom, dan dengan inilah  campuran tersebut dapat dipisahkan

menjadi komponen-komponennya. Berikut gambar ilustrasi proses pemisahan dengan

kromatografi ekslusi ukuran ;

Gambar B.1 Ilustrasi Proses Pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Eksklusi

5

C. Kekurangan dan Kelebihan Kromatografi Eksklusi

Kromatografi eksklusi memiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya:

1. Pita-pita sempit.

2. Waktu pemisahan pendek, mudah diramalkan.

3. Waktu pemisahan yang cepat dan hasil yang baik.

4. Tidak terjadi kehilangan cuplikan selama reaksi pemisahan.

5. Hanya terjadi sedikit masalah dalam deaktivasi kolom.

6. Frekuensi tajam dan sensitivitas baik.

7. Bebas dari kehilangan sampel, pelarut tidak berinteraksi dengan fase stasioner.

8. Variasi larutan dapat diaplikasikan tanpa menganggu proses filtrasi

Kromatografi eksklusi juga memiliki kelemahan, yaitu :

1. Kapasitas terbatas

2. Tidak dapat digunakan untuk cuplikan yang mempunyai ukuran hampir sama.

3. Prinsip pemisahan tidak seperti kromatografi lain.

Kekurangan yang paling menonjol adalah kapasitas puncak yang terbatas. Ini berarti

hanya ada sedikit pita yang dapat dihubungkan dengan kromatogramtotal, karena kromatogram

cukup pendek semua senyawa terelusi sebelum total. Pada kromatografi eksklusi jarang terlihat

lebih dari enam pita pada satu kromatogram. Ini berarti bahwa kromatografi eksklusi biasanya

tidak dapat memisahkan secara sempurna suatu cuplikan kompleks, tanpa pemisahan lebih lanjut

dengan metode lain.

Kekurangan kedua adalah tidak dapat memisahkan senyawa-senyawa yang mempunyai

ukuran hampir sama. Perbedaan pada kromatografi eksklusi adalah prinsip pemisahan yang

berbeda dengan yang digunakan metode kromatografi lain. Konsep faktor pemisahan α, dan

factor kapasitas k’ tidak bisa digunakan. Susunan fasa gerak juga relative tidak penting pada

kromatografi eksklusi. Pengelompokkan berbagai penggunaan kromatografi eksklusi biasanya

dibagi dalam dua teknik yaitu teknik filtrasi gel (pelarut air) dan kromatografi permeasi gel

(pelarut organik).

6

D. Aplikasi Kromatografi Eksklusi

Aplikasi analitik kromatografi eksklusi meliputi estimasi berat molekul, pemantauan atau

karakterisasi pelipatan dan agregasi protein, dan menentukan interaksi reseptor-ligan. Kecepatan

dan kondisi elusi yang lembut membuat kromatografi eksklusi merupakan metode yang nyaman

untuk proses cepat isolasi biopolimer, dengan perolehan kembali massa yang tinggi dan aktivitas

biologis. Kromatografi eksklusi dapat digunakan terhadap suatu cuplikan yang larut dan

penggunaan utama kromatografi gel biasanya dalam salah satu dari tiga hal ini.

Pertama, kromatografi gel sangat berguna untuk untuk pemisahan spesies dengan berat

molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. Selain dari resolusi dari setiap makro

molekuler seperti protein dan asam nukleat, kromatografi gel dapat digunakan untuk

mendapatkan distribusi berat molekul dari polimer sintetis. Kedua, campuran sederhana dapat

dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu

memiliki berat molekul yang sangat berbeda. Untuk hal ini dapat dilakukan dalam jumlah besar.

Ketiga, kromatografi gel sangat cocok untuk kerja awal, pemisahan eksplorasi dari cuplikan yang

tak diketahui. Pemisahan ini memberikan gambaran isi cuplikan, sehingga dapat  diketahui

dengan cepat apakah cuplikan itu memiliki berat molekul rendah atau berat molekul tinggi.

Kromatografi eksklusi dapat digunakan untuk analisis campuran molekul dengan berat

molekul yang berbeda seperti pemisahaan rafinosa, maltose, dengan menggunakan sephadex

pada pH 7,0, laju aliran 5 ml/jam dengan H2O sebagai eluen. Pemisahan molekul- molekul

dengan berat molekul sama dapat juga dilakukan dengan pemilihan yang tepat tipe gel dan tinggi

kolomnya. Pengeluaran garam (desalting) adalah salah satu pemisahan yang meliputi

pembebasan garam dan senyawa berberat dengan molekul makro.

Gambar C.1 Kromatogram Ekslusi dari Resin Epoxy

7

o Column: 5 m silica 25 cm x 4.9 mmo Mobile phase: tetrahydrofuran + 1% H2Oo Flow rate: 1 cm3min-1

o Detector: UV absorption, 254 nmo Sample: 1 l Epikote 1001 dalam

tetrahydrofuran (Epikote 1001 adalah resin epoxy sintetis dengan massa molekul relatif rata-rata 900)

Gambar. C.2 dibawah ini menunjukkan penentuan residu pestisida dalam sampel lemak

ayam, dan merupakan contoh bagaimana eksklusi dapat digunakan untuk membersihkan sampel

kompleks. Pertama, sampel bebas pestisida lemak dijalankan pada keadaan kosong, kemudian

yang kosong ini dibubuhi dengan pestisida untuk menentukan volume retensi mereka. Ketika

sampel disuntikkan, eluen yang mengandung pestisida dikumpulkan. Pelarut diuapkan, residu

dilarutkan dalam asetonitril dan pestisida kemudian dipisahkan pada kolom fase terbalik

Gambar C.2 (i) sampel Lemak, kosong dan dibubuhi dengan pestisida (ii) sampel mengandung pestisida Lemak (Kolom: 100 A -styragel (stirena-divinil resin benzena microparticulate), 122 cm x 7,8 mm, Fase

gerak: trichloromethane, Laju alir 2 cm3 min-I, Sampel: 100 l lemak ayam dalam trichloromethane). (iii) pemisahan fasa reverse residu pestisida (Kolom: 10 m C-18, 30 cm x 4 mmFase gerak:

CH3CN/H2O 60:40, laju alir 2 cm3 min-I, Detector: UV penyerapan, 254 nm. Peaks: 1 simazine 2 atrazin 3 propazine).10

10 Sandy, Lindsay. 1987. High Performance Liquid Chromatography Analytical Chemistry by Open Learning. London : John Willey and Sons Inc. Hal 130-132

8