KROMATOGRAFI LAPISAN TIPIS (KLT) DANKROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI (KCKT)

DARI SOLASODIN, AD DAN ADDJulia Kantasubrata, Loyniwati, Jamilah dan A.T. Karossi

Puslitbang Kimia Terapan - LlPIJalan Cisitu - Sangkuriang, Bandung 40135

INTISARI

Metoda KLT dan KCKI telah digunakan untuk memisahkansolasodin, 4-androstene-3,17-dione (AD) dan 1,4-androsta-diene-3,17-dione (ADD) yang dihasilkan dari biokonversi solasodin menggunakanMycobacterium phlei DSM 43286. Dalam usaha menghemat pemakaianbahan pada proses pemisahan dengan KCKI, maka kondisi pemlsahanpada KCKT dapat dicari melalui metoda KLT. Telah dicoba untukmenggunakan dua macam interaksi kromatografi yaitu kromatografi [asanormal menggunakan silika sebagai fasa diam dan kromatografi fasaterbalik dengan jenis fasa diam CIS' Untuk kromatografi fasa normal,ternyata solasodin yang mempunyai nilai Rf relatif kecil, masih belumdapat terelusi keluar dari kolom, sedangkan pada kromatografi fasaterbalik solasodin baru dapat terelusi keluar dari kolom setelahdigunakan bufer tris sebagai salah satu komposisi eluen. Pelarut yangdapat dipilih sebagai eluen untuk pemisahan ini terbatas pada jenispelarut yang mempunyai UV-Cm-OJJ relatif rendah, karena deteksisolasodin dilakukan pada panjang gelombang 205 nm. Batas deteksiminimum 4-androstene-3,17-dione (AD) dan 1,4-androstadiene-3,17-dione (ADD) yang diukur pada panjang gelombang 240 nm berturut-turutadalah 0,92 ng dan 1,54 ng, sedangkan jumlah terkecil senyawa solasodinyang dapat dideteksi pada panjang gelombang 205 11m adalah 3,39 IIg.

Detektor diodearray dapat digunakan untuk mengkonfirmastkan puncaksenyawa yang terbentuk dalam proses blokonversi tersebut.

ABSTRACT

Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance LiquidChromatography (HPLC) have been used to separate solasodlne, 4-androstene-3,17-dione (AD) dan 1,4-androstadiene-3,17-dione (ADD)resulted from bloconversion process of solasodlne using Mycobacteriumphlei DSM 43286. III order to minimize the consumption of materials, theseparation condition of HPLC could be looked for through TLC method.Two kinds of chromatographic interaction i.e. normal phase and reversedphase chromatography using respectively silica and CIS as stationaryphase have been tried. III normal phase chromatography, there are stilldifficulties for eluting solasodine from silica column, since solasodine hasrelatively low Rj value. While in reversed phase chromatography,solasodine could be eluted from CIS column, only if the mobile phase isbuffered. The selection of solvent systems for this separation should alsoconsider the relatively low UV-Cut-Off of individual solvent, sincedetection of solasodine requires operation at 205nm. The minimum limitdetection which is measured at 240 11m was found to be 0.92 ng AD and1.54 ng ADD, while the smallest amount of solasodine which could bedetected at 205 nm was 3.39 ng. Diode array detector could be used forconfirming the solute peaks produced ill bioconverslon process.

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

PENDAHULUAN

Sehubungan dengan studi biokonversi solasodin untukmenghasilkan AD dan ADD, dibutuhkan suatu metodapemisahan dari solasodin dan hasil biokonversinya, Untukkeperluan ini, metoda KCKT merupakan pilihan yang tepatkarena metoda tersebut dapat mencakup metoda pemisahandan penentuannya baik secara kualitatif maupun kuantitatif.

Untuk mendapatkan kondisi pemisahan yang optimalpada KCKT, dapat digunakan KLT yang relatif lebih cepatdan murah. KLT memiliki mekanisme pemisahan kompo-nen yang sama dengan KCKT. Data retensi yang diperolehdari pelat KLT dapat dipindahkan dan digunakan padakolom KCKT. Dengan demikian dimungkinkan mencarikondisi pemisahan pada KCKT melalui KLT, karenamemang jenis fasa diam dan fasa gerak pada kedua jeniskromatografi ini serupa (1,2,3,4,5).

Dicari mula-mula kondisi pemisahan untuk kromato-grafi fasa normal menggunakan pelat silika. Kondisipemisahan KLT yang memberikan hasil cukup baik diapli-kasikan pada KCKT menggunakan kolom silika. Masihditemukan kendala mengenai proses elusi dan deteksisenyawa solasodin pada kromatografi fasa normal (6).Pengukuran solasodin dengan sinar UV harus dilakukanpada panjang gelombang relatif rendah (205 nm). Apabiladikaitkan dengan penggunaan peralatan KCKT, pengukur-an menggunakan detektor UV pada daerah panjanggelombang yang relatif rendah ini akan menimbulkanpermasalahan. Hal ini disebabkan karena banyak pelarutorganik yang umum digunakan sebagai eluen menyerappada daerah panjang gelombang tersebut. Pelarut organikyang paling aman untuk digunakan pada daerah panjanggelombang tersebut adalah asetonitril, yang mempunyaiUV-Cut-Off yang relatif rendah yaitu 195 nm (7).

Dengan latar belakang permasalahan diatas, padapenelitian ini dicoba dikembangkan pemisahan solasodin,AD dan ADD pada kromatografi fasa terbalik, mengguna-kan campuran asetonitril/air sebagai eluen. Keuntungantambahan dalam penggunaan kromatografi fasa terbalik iniadalah biaya analisa yang relatif murah, karena mengguna-kan jenis pelarut yang jauh lebih murah dibandingkandengan yang digunakan pada kromatografi fasa normal.

61

Komposisi pe1arut yang digunakan pada kromatografi fasaterbalik ini mengandung air dengan persentase yang relatifbesar, sehingga biaya analisa menjadi relatif rendah. Hal inimenjadi penting mengingat akan digunakannya KCKTsebagai metoda untuk memantau secara rutin berlangsung-nya kemajuan proses biokonversi solasodin (8).

Mengingat besar kemungkinan didalam contoh campur-an hasil fermentasi terdapat pula senyawa-senyawa lainyang mempunyai \. sama atau . hampir sarna denganAD/ADD, maka tidaklah cukup apabila identifikasi senya-wa hanya dilakukan dengan cara membandingkan t, .yangdiperoleh. Identitas senyawa dapat diketahui dengan lebihjelas, antara lain dengan membandingkan spektrum serapansenyawa tersebut dengan standar, menggunakan detektordiodearray. Apabila spektrum serapan dari senyawa yangdikonfirmasikan sama dengan spektrum serapan standarAD/ADD, maka dapat diduga bahwadalam campuran hasilfermentasi tersebut memang terbentuk AD dan ADD.Sebaliknya apabila spektrum serapan keduanya tidak sama,maka berarti puncak yang dihasilkan pada kromatogramcontoh campuran hasil fermentasi bukan berasal darisenyawa AD dan ADD, tetapi kebetulan mempunyai t,sama dengan t, AD atau t, ADD.

BAHAN DAN METODA

Bahan yang digunakanStandar Solasodin, Solanesol, 4-androstene-3,17-dione

(AD), 1,4-androsta-diene-3,17-dione (ADD), berasal dariSIGMA. Pel at analitik adalah Silika GF254 (EM 5554) danRP-18254 (EM 15865). Kolom yang digunakan terdiri darikolom Silika u-Porasil WATERS, kolom u-Bondapak CI8WATERS, kolom Zorbax SIL dan Zorbax ODS. Pelarutyang digunakan sebagai komposisi eluen diperoleh dariE.MERCK. Larutan bufer tris dibuat dengan melarutkansejumlah trisrhidroksl-metiljaminornetana (SIGMA T-1503) dalam air hingga konsentrasi 1 M. Sejumlah volumelarutan 1 Mini diencerkan hingga mencapai konsentrasiyang diinginkan dan pH diatur dengan larutan HCl 0,1 Mhingga mencapai nilai pH 7 ± 0,1.

Peralatan yang digunakanPerala tan KLT terdiri dari pipa kapiler, templet, bejana

kromatografi, a1at penyemprot, lampu UV dengan panjanggelombang 254 nm dan 366 nm. Satu unit peralatan KCKTterdiri dari: Pompa BECKMAN 110B, Detektor UVBECKMAN M163 dengan panjang gelombang yang dapatdiatur pada daerah pengukuran UVNIS dan IntegratorSPECTRA PHYSICS 4290. Satu unit peralatan KCKTSHIMADZU LC 6A lengkap dengan detektor":JdearraySPD M6A, Komputer IBM dan Printer P 5300.

62

Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pada Pelat SiIikadan CIS

Pada pemisahan ini digunakan pelat silika GF254pelat CI8 yang mengandung indikator fluoresensi. Kompo-sisi pelarut yang digunakan, dicari dari campuran pelyang umum digunakan untuk pemisahan steroid. Apabharga h~ yang diperoleh be1um cukup memadai,dilakukan modifikasi jenis dan komposisi pelarut, didasar-kan pada deret eluotropik pelarut. Pelat hasil elusi mula-mula dilihat dibawah lampu UV pada panjang gel om254 nm. Senyawa AD dan ADD akan tampak sebagai nberwarna ungu. Senyawa solasodin tidak dapat terdetedengan cara ini sehingga untuk .mendeteksinya , pe ~disemprot dengan pereaksi asam sulfat 50% dalam etanSetelah disemprot, pelat kemudian dipanaskan dalam OVOI

80°C selama 10 men it. Senyawa solasodin akan tampazsebagai noda berwarna merah keungu-unguan dan apabpemanasan dilanjutkan hingga ± 25 menit, senyawaakan tampak sebagai noda berwarna hijau, sedangkaz,senyawa ADD sebagai noda berwarna jingga kemerah-merahan.

Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pad a Kolom Silikadan CI8

Hasil pemisahan pada pelat KLT dicoba diaplikaspada kolom KCKT. Modifikasi dari jenis dan komposisapelarut yang digunakan didasarkan pada pelarut ya ~memberikan resolusi pemisahan cukup baik diatas peaDalam melakukan optimasi pemilihan pe1arut, diperha .pula nilai UV-Cut-Off pelarut yang ada hubungannjdengan limit deteksi minimum senyawa. Usaha unmengurangi peristiwa tailing dari puncak solasodin pakromatografi fasa terbalik ditempuh dengan jalan men-campurkan bufer tris kedalam eluen. Apabila dari kromato-gram contoh hasil biokonversi didapatkan puncak senyawyang mempunyai tf sarna dengan t, AD atau ADD, makauntuk contoh yang bersangkutan dilakukan konfmnpuncak menggunakan detektor diodearray. Spekserapan dari senyawa yang diduga AD/ADD dicobsdihimpitkan dengan spektrum serapan standar AD/ADDuntuk melihat apakah memang puncak dengan t, yang saberasal dari senyawa yang identik dengan standar.

HASIL DAN DISKUSI

Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pada Pelat SiJil,;adan CI8

Diperoleb sebeIas macam eluen yang dapat mernbe .resolusi pemisahan cukup baik untuk solasodin, ADADD pada pelat silika seperti tampak pada Tabel 1. Danletak ketiga nod a pada pelat, dapat disusun urutan polaridari ketiga senyawa sebagai berikut: solasodin > ADD >AD.

JKTI VOL 3 - No.2, Desember, 1993

Tabel 1. Pemisahan solasodin,AD dan ADD pada pel at Silika

Jenis dan Komposisi Pelarut

74

Solasodin ADD AD

A. CCI4 - CH3CN - CH30H 5610: 1 1

B. n-Heksana - Aseton 6447 : 53

C. n-Heksana - Isopropanol 5675 : 25

D. Butanol - Toluen - CCI4 261 1: 5

E. Heksana-Etil asetat-Butanol 51642

76 84

71 76

64 73

52 59

79 86

50F. n-Heksana-Butanol-Cl+Clj5 : 3 : 1

74 81

57G. CCI4-Etil asetat-Metanol10: 2 : 1

39 61

H. Toluen-Etil asetat-Etanol10: 4 : 1

30 63 71

I. Toluen-Etilasetat-Metanol10 2 : 1

J. Butanol - CCI41 : 7

29 60 69

26 45 55

K. CCI4-Aseton-Isopropanol

14: 1: 243 64

Pada penggunaan pelat C18, diperoleh 4 macam kompo-sisi pelarut yang dapat memberikan resolusi cukup baikseperti tampak pada Tabel 2. Ternyata dugaan semulabahwa urutan elusi disini akan menjaditerbalik apabiladibandingkan dengan kromatografi fasa normal tidak

Tabel2. Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pada pelat C1S

hRfJenis dan Komposisi Pelarut

Solasodin AD ADD

A. Metanol 36 57 63B. Asetonitril-Metanol 62 70 74

70 30C. Asetonitril-Air 32 56 59

94 :6D. Metanol-Isopropanol-Air 47 53 59

3 2 : 1

sepenuhnya terjadi. Urutan elusi AD dan ADD memangterbalik. Pada kromatografi fasa normal hRf AD > hRf

ADD sedangkan pada kromatografi fasa terbalik h~ AD <h~ADD. Akan tetapi senyawa solasodin tetap mempunyai

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

-

nilai hRf yang paling rendah dengan bentuk noda sedikitberekor. Terbentuknya noda yang berekor pada senyawasolasodin, kemungkinan disebabkan oleh adanya interaksitambahan antara gugus fungsi yang terdapat pada molekultersebut dengan gugus-gugus silanol sisa dari fasa diamatau karena kelarutan solasodin dalam fasa gerak yangdigunakan kurang baik (9).

Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pada Kolom SilikaJenis eluen yang digunakan untuk kolom silika dipilih

dari kumpulan sebelas macam eluen yang dapat mem-berikan resolusi cukup baik diatas pelat silika (Tabel 1).Mula-mula dipilih campurann-heksana-butanol-kloroform(5:3:1), karena campuran ini dapat memberikan harga h~yang cukup memadai yaitu 50. Pada Gambar 1 terlihat

Gambar 1. Eluen: n-heksana-butanol-kloroform (5:3:1).to 3,2.;nenit k'AD 0,19t;. AD 3,8 menit k'ADD = 0,31t;. ADD = 4,2 menit

bahwa k' yang dihasilkan terlalu kecil dan resolusi antarakedua puncak kurang baik. Dalam hal ini e1uen harusdiubah dengan jalan mengusahakan agar kolom silika dapatmenahan lebih lama senyawa AD/ADD. Akan tetapi karenatetap diinginkan agar hRf solasodine > 50, maka pilihanyang mungkin hanya terbatas pada jenis e1uen A, B, C atauE pada Tabel 1. Mengingat bahwa deteksi senyawasolasodin harus dilakukan pada panjang gelombang 205nm, maka dari keempat pilihan diatas, jenis eluen C yaitucampuran n-heksana dan iso-propanol yang paling amandigunakan karena n~ai UV-Cut-OJJ dari kedua pelarut iniberturut-turut adalah 190 dan 205 run. Nilai tersebut relatifrendah apabila dibandingkan dengan nilai UV-Cut-OJJCC14 (265 nm), aseton (330 nm) dan etil asetat (256 nm)yang merupakan salah satu komposisi pe1arut dalam eluenjenis A, B dan E. Untuk campuran pelarut heksana-isopropanol ini mula-mula dicobakan perbandinganheksana-iso-propanol (15:1), dengan maksud agar ADI

63

ADD dapat lebih tertahan didalam kolom. Komposisipelarut ini bersifat relatif tak polar dibandingkan dengankomposisi eluen C. Hasil yang diperoleh tampak padaGambar 2. Temyata harga k' yang dihasilkan terlalu besar

ADD

A B C

•... LOCDt-.. t-.. \D.

-e ~ LO

2,31 LO~ LO

4,58 ~ ('t). ~LOLO -e

AD

Garnbar 2. Eluen: n-heksana-isopropanol (15:1)to 3,85 menit k'ADtr AD 12,75 menit k'ADDt, ADD. = 21,50 menit

dan jarak kedua puncak sangat jauh. Untuk itu komposisipelarut perlu diubah menjadi relatif lebih polar, agar keduapuncak masih mempunyai resolusi yang cukup baik, tetapidengan waktu retensi yang tidak terlalu panjang.Didapatkan komposisi pelarut yang paling optimal adalahn-heksana-isopropanol (85:15), seperti tampak padaGambar 3. Akan tetapi dengan jenis eluen ini, standar

AD ADD

64

Gambar 3. Eluen: n-heksana-isopropanol (85: 15)to 3,5 menit k'ADt, AD 7 menit k'ADDt, ADD = 9,7 menit

1,001,78

solasodin tidak dapat terdeteksi keluar dari kolom, III

pun sudah diusahakan untuk memasang detektorpanjang gelombang 205 nm. Cara penyelesaian _terpikirkan adalah dengan memanfaatkan penggukromatografi fasa terbalik. Pada penentuan limit dekomposisi pelarut diubah menjadi heksana-isopro(75:25), karena unjuk kerja kolom silika yang digun.sudah sedikit berubah. Kromatogram yang dihasilkan papenentuan limit deteksi minimum senyawa AD dan AD.dapat dilihat pada Gambar 4. Terlihat pada kromagram, dari kiri kekanan, jumlah senyawa AD/ADD Y .:diinjeksikan semakin kecil dan limit deteksi AD dan ADyang diperoIeh adalah 0,92 ng AD dan 1,54 ng AD(Gambar 4C).

Gambar 4. Kromatogram pemisahan AD dan ADD yangdihasilkan pada penentuan limit deteksi minimum.Kolom:Silika.Eluen:Heksana-Isopropanol (75:25).Kecepatan aliran eluen: 1 ml/menit.Detektor: UV 240 nm. Sensitifitas Detektor: 8

Konfirmasi Puncak Menggunakan Detektor Diodearray

Telah diuraikan diatas, bahwa temyata untuk kolomsilika, campuran heksana-isopropanol (85:15) dapat mem-berikan hasil yang paling optimal, ditinjau dari segiresolusi, waktu analisa dan nilai UV-Cut-OJJ pelarut,Komposisi pelarut ini 'kemudian digunakan untuk me-mantau terbentuknya senyawa AD dan ADD pada satu sericontoh campuran hasil fermentasi, menggunakan detektordiodearray. Pada kromatogram standar, AD dan ADDterelusi keluar dari kolom dengan waktu retensi berturut-turut 5,16 dan 6,83 menit.

Pada saat kondisi pemisahan yang sama dipakai untukmenganalisa campuran hasil fermentasi, terlihat darikromatogram (Gambar 5) adanya puncak dengan t, = 5,1 ~menit, yang diduga merupakan puncak AD (t, AD = 5,16menit). Tetapi kemudian apabila spektrum serapan puncak:

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

m.nit

Gambar 5: Kromatogram Contoh Campuran Hasil FermentasiHari kelima (Hs).Kolom: Silika.Eluen: Heksana-Isopropanol (85:15)Detektor: Diodearrayr,AD = 5,16 menitt, ADD = 6,83 menit

yang diduga AD tadi dihimpitkan dengan spektrum serapanstandar AD, terlihat perbedaan yang cukup berarti, sepertitampak pada Gambar 6. Dua perbedaan yang nyata

220

Gambar 6: Spektrum serapan senyawa yang diduga ADdihimpitkan dengan spektrum serapan standar AD.

tersebut adalah: (a) panjang gelombang maksimum standarAD adalah 237 nm, sedangkan panjang gelombangmaksimum senyawa yang diduga AD adalah 232 nm. (b)apabila perbandingan isyarat detektor pada dua panjanggelombang (250 dan 260 nm) dihitung, maka nilaiperbandingan isyarat detektor untuk standar AD akanmempunyai nilai :t 4 kali lebih besar dari nilaiperbandingan isyarat detektor senyawa yang semula didugasebagai AD. Beberapa kemungkinan dapat terjadi disini,antara lain bahwa: (a) Senyawa yang semula diduga ADadalah senyawa antara (intermediate) lain yang sarna sekalibukan AD. (b) Senyawa tersebut adalah AD, akan tetapipuncak AD keluar bersamaan dengan puncak senyawaantara yang lain.

Pada kromatogram contoh campuran hasil fennentasihari keenam (H6)' tampak dua buah puncak dengan t,

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

masing-masing 4,75 dan 9,84 menit (Gambar 7). Karenaperbedaan t, puncak pertama dengan t, AD hanya sekitar 24

tr =~,75 meni t

iAD?•",I,'I t r = 9, 8~ men i t

J~Gambar 7: Kromatogram Contoh Campuran Hasil Fermentasi

Hari keenam (H6)' Kondisi pemisahan sama dengankondisi pada Gambar 4.

detik saja, maka puncak yang pertama dikonfirmasikanlebih lanjut, melalui bentuk spektrum serapannya (Gambar8). Temyata spektrum serapan ini memang sarna denganspektrum serapan puncak yang terdapat pada contoh Hs,dan berbeda dengan spektrum sera pan standar AD.

220 2ea . 270

Gambar 8: Spektrum Serapan puncak yang diduga AD daricontoh campuran hasil fermentasi hari keenam (H6)apabila dihimpitkan dengan spektrum standar AD.

Pada contoh hasil fermentasi hari kedelapan (Hg) dankesembilan (H9)' masih didapatkan puncak dengan t,berturut-turut 5,00 dan 5,05 men it, \ yang mempunyaispektrum sera pan sarna (Gambar 9) '-Clengan spektrumserapan puncak yang terdapat pad a contoh campuran hasil

Gambar 9: Spektrum Serapan puncak yang diduga AD daricontoh campuran hasil fermentasi hari kedelapan (Hg)dan kesembilan (H9)'

65

fermentasi sebelumnya (lIs dan H6)' Pada hari fermentasiyang kesembilan, kandungan senyawa dengan t, = ± 5 me-nit. mulai berkurang, dan timbul puncak baru dengan t,lebih pendek (tanda panah pada Gambar lOB yangtidak nampak pada Gambar lOA).

A

o 3 6 9 12 15

(menit)

B

I

o 3 9 12 15

(menit)

Gambar 10: Kromatogram contoh campuran hasil fermentasiA: Pada Hari kedelapan (Hs)B : Pada Hari kesembilan (H9) Kondisi pemisahan

sarna dengan Gambar 4.

Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pada Kolom CI8

Metanol yang pada pelat C18 dapat memisahkan ADdan ADD, ternyata pada saat dipakai sebagai eIuen untukkolom CI8 tidak dapat memberikan resolusi pemisahanyang cukup baik untuk kedua senyawa tersebut. Untuk itukemudian pelarut dimodifikasi menjadi Metanol-Air(65:35). Dengan campuran pelarut ini AD dan ADD ter-pisah dengan baik, akan tetapi solasodin tertahan totaldalam kolom.

Usaha selanjutnya untuk memodifikasi kondisi kroma-tografi dilakukan dengan memperhatikan hal-hal berikutini: (a) Komposisi metanol-air diubah dengan j enis pelarutlain yang mempunyai daya elusi relatif lebih kuat,sedemikian sehingga sola sod in dapat terelusi keluar darikolom, akan tetapi puncak AD dan ADD masih dapatterpisah dengan resolusi yang cukup memadai. (b) Jenispelarut yang akan dipilih hendaknya mempunyai nilai uv-Cut-Off relatif rendah mengingat deteksi solasodin harusdilakukan pada panjang gelombang relatif rendah (205 nm)

Pada Tabel 2 terlihat bahwa apabila dibandingkanterhadap eluen A, penambahan asetonitril ke dalam metanol(eluen B) menghasilkan daya elusi yang lebih kuat. Hal ini

66

dapat terlihat dari nilai hRf solasodin (62) yangbesar. Dengan metanol (eIuen A) hanya dihasilkansebesar 36. Apabila dikaitkan dengan persyaratanbutir b, maka asetonitril merupakan pilihan yangkarena merupakan pelarut yang paling aman untuk dikan pada panjang gelombang pengukuran yangrendah. Akan tetapi hasil percobaan menunjukkan bdengan menggunakan hanya asetonitril sebagai elsolasodin masih beIum dapat terelusi keluar dari kolom.

Crabbe dan Fryer (10) menguraikan beberapa sisola sod in. Senyawa ini bersifat relatif tak polar, tidak Idalam air, tetapi larut dalam alkohol dan beberapa pelnonpolar seperti kloroform dan benzen. Lebih larrjdiuraikan bahwa solasodin merupakan senyawa ya.:bersifat basa lemah, yang dalam media yang bersifat sedasam, akan mudah membentuk ion. Untuk mencegterjadinya bentuk ion, dianjurkan untuk menggunalarutan buffer sebagai salah satu komponen fasa gerak <fa:;menjaga pH eluen didaerah basa. Menambahkan garaz;kedalam fasa gerak dapat pula memberikan efek saltingyang menyebabkan kelarutan dari senyawa dalam fasegerak bertambah besar.

Dengan menggunakan bufer tris 0,01 M sebagai salsatu komponen dalam fasa gerak, puncak solasodin dapaterelusi dan terdeteksi pada panjang gelombang 205 nra,Hanya saja waktu retensi yang dihasilkan masih terlalbesar, sehingga bentuk puncaknya kurang baik, berupapuncak yang berekor. Apabila konsentrasi bufer tnsdiperbesar, dapat dihasilkan waktu retensi solasodin ya _makin kecil seperti terlihat pada Tabel 3. Makin kewaktu retensi solasodin, bentuk puncak yang dihasilkajuga makin baik.

Tabel3. Pemisahan Solasodin, AD dan ADD pada Kolom C18.

t, (menit)Jenis dan Komposisi Pelarut

ADD AD Solascdin

A. Asetoni tril-larutan bufertris 0,01 M 1,15 1,39 19,68

70 30B. Asetonitril-larutan bufer

tris 0,02 M 1,13 1,34 13,1470 30

C. Asetonitril-larutan bufertris 0,03 M 0,98 1,13 10,28

80 20

Dengan kondisi eluen yang terakhir, yaitu campuraasetonitril-larutan bufer tris 0,03 M (80:20), masih dihasil-kan puncak yang sedikit berekor (Gambar 11). Tampaknyaapabila konsentrasi garam dalam larutan bufer makicdiperbesar, ekor dari puncak solasodin dapat menghilang.Akan tetapi hal ini tidak dilakukan karena dikhawatirkakonsentrasi larutan garam yang relatif tinggi akan menye-babkan sebagian garam mengendap dalam kolom dan dapa:merusak paking dari kolom tersebut.

JKTI VOL. 3- No.2, Desember, 1993

•...

U")r-..N0 r-.. f;;..- ,.",." N

ex) .- N

Gambar 11: Kromatogram contoh hasil fermentasi.Kolom: C1SEluen: Asetonitril-larutan bufer tris 0,03 M (80:20)Kecepatan aliran eluen: 4 ml/menitDetektor UV: 240 dan 205 nmt, ADD = 0,98 menitr, AD = 1,13 menit

t, solasodin = 10,28 menit

Akan lebih aman apabila usaha untuk menghilangkanekor puncak solasodin ditempuh denganjalan memperbesarkandungan asetonitril dalam eluen. Telah dicobakan

JKTI VOL. 3 - No.2, Desember, 1993

komposisi pelarut asetonitril-larutan bufer tris 0,03 M(90:10) sebagai eluen. Dengan komposisi pelarut ini, t,solasodin berubah cukup besar, menjadi hanya 6,22 menit.Akan tetapi resolusi pemisahan AD dan ADD menjadikurang baik. Selanjutnya dilakukan elusi gradien yaitu padaawal elusi digunakan kandungan asetonitril yang relatifrendah, agar AD dan ADD masih dapat mempunyairesolusi yang cukup baik, sedangkan pada akhir elusidiusahakan agar kandungan asetonitril makin besar agarsolasodin dapat terelusi dengan ly relatif kecil dan bentukpuncak relatif sempuma. Kemungkinan melakukan elusigradien ini tidak memberikan harapan, karena kestabilangaris dasar (base line) pada panjang gelombang pengukuranyang relatif rendah (205-240 nm) sangat sulit tercapai.

KESIMPULAN

Telah diperoleh beberapa macam kondisi pemisahansolasodin, AD dan ADD pada pelat silika. Ditemukankendala mengenai proses elusi dan deteksi solasodin padakolom silika. Solasodin ditahan relatif kuat pad a kolomsilika dan be1um berhasil dideteksi keluar dari kolom. Olehsebab itu dicoba dikembangkan pemisahan solasodin, ADdan ADD pada kromatografi fasa terbalik. Te1ah didapat-kan 4 macam komposisi pelarut yang dapat memisahkansolasodin, AD dan ADD pada pelat C1S• Solasodin telahpula berhasil dielusi keluar dari kolom C1S menggunakancampuran asetonitril-larutan bufer tris 0,03 M (80:20)sebagai e1uen, meskipun bentuk puncak yang dihasilkanbelum terlalu sempuma.

Detektor diodearray dapat digunakan untuk mengkon-finnasikan puncak-puncak yang terbentuk dalam campuranhasil biokonversi solasodin. Dari hasil konfinnasi puncak•menggunakan detektor diodearray, dapat diketahui bahwapuncak senyawa yang terelusi ke1uar pada 1. yang sarnadengan 1. AD, temyata bukan senyawa AD. Untuk meng-konfirmasi puncak senyawa tersebut, akan dijajagi ke-mungkinan penggunaan kromatografi preparatif.

UCAPAN TERlMA KASIH

Sebagian dana penelitian ini diperoleh dari ProjekBioteknologi AAECP Phase II, tahun 1990 - 1992. Padapenelitian ini telah digunakan pula peralatan HPLC denganpanjang gelombang pengukuran yang dapat diprogram dariPAU-Biotekllologi ITB. Untuk dapat memulai penelitianini lebih awal, diperoleh standar AD/ADD dari Bapak DrTriadi Basuki, Puslitbang Bloreknologi-Lll'l-Bogor danstandar solasodin dari Bapak Kresna S.A. dan Ibu Arini,P.T. Kimia Fanna, Bandung. Makalah dapat disampaikanpada Seminar Nasional X Perhimpunan, BiokimiaIndonesia, Ujung Pandang 3-4 Juli 1992 atas fasilitas yangdiberikan oleh P3KT-LIPI.

67

PUSTAKA

1. F. Geiss, H. Schlitt, Thin-Layer Chromatography as aPilot Technique for Rapid Column Chromatography(Summary), J. Chromatogr., 82: 5 (1973).

2. E. Soczewinski, T. Dzido, W. Golkiewicz, Comparisonof High Performance Liquid Chromatographic andThin-Layer Chromatographic Data Obtained withVarious Types of Silica, J. Chromatogr., 131: 408-411(1977).

3. S. Hara, Use of Thin-Layer Chromatographic Systemsin High Performance Liquid Chromatographic Separa-tions. Procedure for Systematization and Design of theSeparation Process in Synthetic Chemistry, J. Chro-matogr., 137: 41-52 (1977).

4. E. Soczewinski, T. Wawrzynowicz, Thin-Layer Chro-matography as a Pilot Technique for the Optimizationof Preparative Column Chromatography, J. Chroma-togr., 218: 729-732 (1981).

5. W. Jost, H.E. Hauck, F. EisenbeiB, Thin-Layer Chroma-tography as a Pilot Technique for Transferring Reten-tion Data to HPLC, Kontakte (Dannstadt) 3: 45 (1984).

6. 1. Kantasubrata, Loyniwati, Jamilah, Pemisahan Soldin, 4-Androstene-3,17-dione (AD) dan 1,4-Anstadiene-3,17-dione (ADD) menggunakan kromatograffasa normal dan kromatografi fasa terbalik, lapointern Projek Bioteknologi AAECP, Oktober 1991.

7. L.R. Snyder, J.J. Kirkland, Introduction to ModernLiquid Chromatography, 2nd ed., John Wiley & SINc., New York, (1980), ha1592.

8. Separation of Solasodine, AD and ADD by the usenormal and reversed phases chromatography; Biocoversion of solasodine by Mycobacterium phlei DS_43286, A Progress Report Submitted to "Sixth Sub-committee Conference on ASEAN-Australia Biotech-nology Project", January 1992, Manila, The Philippines..

9. Melander W., Stoveken, J., Horvath, c., StationaryPhase Effects in Reversed-Phase Chromatography,J. Chromatogr., 199: 35-56 (1980).

10. P.G. Crabbe, C. Fryer, Rapid Quantitative Analysis 0"

Solasodine, Solasodine Glycosides and Solasodiene b.High-Pressure Liquid Chromatography,]. Chromatogr.;187: 101-109 (1980).

Serba-serbi . . . . . • • • . . . . . . . . . . . . Sambungan dari hal 52

setiap tahun dengan harga hampir sama dengan zat-zatkimia curah. Produksi ini kemudian diikuti denganproduksi senyawa-senyawa penguat cita rasa lain sepertiasam aspartat dan nukleotida, dan asam-asam aminoesensial seperti lisin sebagai tambahan makanan ternak.Bangsa Jepang telah menanamkan modal yang besar untukpene1itian dan pengembangan fennentasi asam aminohingga mereka diakui sebagai pelopor dalam bidang ini.

Harga minyak pad a dekade 1950 dan 1960 merupakanfaktor pendorong penelitian industri ke arah produksiprotein sel tunggal (SCP, Single Cell Protein), denganpenekanannya pada hasil-hasil minyak bumi, khususnyametan dan meta nol. Banyak proyek besar dimulai, padaumumnya oleh perusahaan minyak dan kimia multi-nasional, namun hanya sedikit yang mencapai tingkatproduksi. Berbagai kendala dihadapi, misalnya perasaantakut akan residu hidrokarbon yang berbahaya yang dapatterbawa pada hasil SCP, atau kurangnya air pendingin yangcukup di tempat yang tepat seperti Timur Tengah. Naiknyaharga minyak pada 1973/74 tidak memungkinkan negara-negara maju menjalankan roda perekonomian yang sangatbergantung pada harga bahan baku . Di Inggeris, ICI danRank Hovis Me Dougall me1anjutkan proyek ini untukmenghasilkan bahan pakan dan pangan meskipun masadepannya masih kurang jelas.

Beberapa hasil fermentasi mempunyai pasar meskipunkecil, misalnya Bacillus thuringiensis suatu bioinsektisidayang efektif terhadap beberapa pes, dan gam xantan yangmerupakan suatu zat pengemulsi, pengental dan penstabilyang baik. Namun demikian secara umum pengembanganhasil proses biologi tersebut belum terIihat. Sejarah mem-

68

buktikan bahwa proses kimia masih tetap dorninan,khususnya pada produksi etanol serta berbagai pelarut laibeberapa asam organik dan vitamin. Daya tarik biotekno-logi sekarang ini banyak didasari oleh harapan teknol ~dari pada keberhasilan sejarah.

Pada dekade tahun 1970 terjadi tiga peristiwa pen tin;yang sangat berpengaruh pada perkembangan bioteknoloPada akhir 1973 dan 1974, sebagai akibat perang YoKippur harga minyak mentah menjadi empat kali lipat,Pada tahun 1973 itu juga Stanley Cohen dan Herbert Boymenunjukkan bahwa melalui penggunaan gabungan enziraendonuklease dan ligase, DNA dapat dipotong dandisambung kembali dengan susunan yang baru. Kendalayang disebabkan karena galur yang mempunyai sifagenetika terbatas dapat diatasi dengan teknik in vitro. Pada1975 Georges Kohler dan Cesar Milstein menunjukkaproduksi antibodi monoklonal dari fusi sel-sel Iimfosit datumor myeloma.

Kena ikan harga minyak amat menggetarkan ekonomiBarat. Negara-negara penghasil minyak jelas lebihberuntung dibandingkan dengan negara-negara industri datidak akan membiarkan sumber-minyak mereka habisdengan cepat uutuk menyediakan minyak bagi duniadengan harga murah. Reaksi awal dari negara-negara Baraadalah menunjang secara finansial pengembangan berbaga.panel pemanas surya, kincir angin dan kendaraan dengabahan bakar kotoran ayam. Banyak negara, khususnyaAmerika Serikat secara perlahan-Iahau dan tenang mening-katkan program pemerintah untuk pengembangan sumbaenergi alternativ, termasuk di dalamnya adalah prosespencernaan anaerobik, produksi etanol secara fennentas

Bersambung Icehalo -:

JKTI VOL. 3- No.2, Desember, 1993