Efek dari Metformin dan Letrozole pada Endometriosis dan Perbandingan Dua Penatalaksanaan Obat tersebut Pada Hewan Uji Coba Mencit

Abstrak

Pendahuluan

Tujuan kita untuk menyelidiki efek metformin dan letrozole pada eksperimental dengan

menginduksi endometriosis pada tikus percobaan.

Metode

Bentuk surgical implant endometriosis, 38 tikus dibagi random dalam 4 kelompok (grup control,

8 tikus) tidak diberi obat. Grup 2 (Metformin, 10 tikus), diberi 100 mg/ Kg/hari metformin oral.

Grup 3(Metformin, 10 tikus), 200 mg/Kg/hari metformin oral. Grup 4 (Letrozole, 10 tikus), 0,1

mg/Kg/hari letrozole oral. Semua tikus menerima pengobatan selama 4 minggu kemudian dilihat

ukuran implant dan skor adhesi. Skor histopatologi implant dipotong endometriotik untuk

diperiksa yang patologi.

Hasil

Area utama implant endometriotik sama dengan semua grup sebelum pengobatan. Namun

ditemukan hasil yang signifikan (44,50 ± 23, 37, 5,90 ± 2,37, 4,30±1,33, 6,90±3,72 mm2, p <

0,05). Efek telah terbandingkan antara kelompok-kelompok pengobatan. Secara histopatologi

skor implant paling rendah setelah 100 mg/Kg/hari metformin. Metformin menurunkan adhesi

yang terberat.

Kesimpulan

Metformin dan letrozole disebabkan regresi statistic yang signifikan pada implant

endometriosis. Efek metformin pada jaringan endometriotik setidaknya sebanding dengan

letrozole.

Endometriosis didefinisikan sebagai adanya fungsi lapisan endometrium dengan kelenjar

dan stroma rongga uterin sehingga terinduksi reaksi kronik. Inflamasi dan ditandai dengan rasa

nyeri pelvis dan infertilitas. Secara morfologi, endometriosis ditandai dengan proliferasi.

Infiltrasi dan adhesi yang berat disekitar jaringan. Menurut penelitian, secara pathogenesis

dirumuskan dari factor anatomi hormonal, imunologi dan generik. Walaupun begitu etropatologi

belum ditemukan secara jelas. Namun endometriosis diterima sebagai kondisi yang tergantung

dari estrogen karena terlihat selama masa reproduksi dan setelah menopause. Aromatase adalah

enzim utama untuk mengkonversi steroid ke estrone dan estradiol dan aktifitas endometriosis.

Kondisi lain, tampak ekspresi lain menyimpang dari aromatase dan stimulasi dari inflamasi

sekitar selama progresi penyakit. Oleh karena itu, terapi medis sering bertujuan pada estrogen

yang rendah dan status inflamasi.

Letrozole adalah nonsteroid, potensi tinggi dan toleransi baik dalam inhibisi system

aromatase sebagai lini kedua pada pengobatan kanker payudara pada wanita post menopause.

Enzim aromatase dihadirkan dalam sel granulose ovarial, jaringan perifer seperti kulit jaringan

adipose dan implant endometriotik. Produksi estrogen local oleh implant dapat dikontribusikan

ke progress endometriosis selama pengobatan dengan analog GNRH, dimana menginhibisi

peroduksi estrogen. Letrozole sebagai generasi ketiga aromatase inhibitor dan itu menekan

produksi estrogen 10 kal dan sistematik dan efektif dalam pengobatan endometriosis dan

berhubungan dengan nyeri kronis pada pelvic dalam usi reproduksi wanita.

Tabel 1. Hasil pengobatan dan perbandingan pada beberapa kelompok penelitian

Variabel Kelompok

1 (control)

Kelompok

2 (100 mg

metformin)

Kelompok

3 (200 mg

metformin)

Kelompok

4

(Letrozole)

Nilai P

Jumlah tikus

percobaan

8 10 10 10

Perkiraan

luas

permukaan

implant

(mm2)

sebelum

pemberian

obat

Sesudah

pemberian

obat

43,15 ±

19,27a

44,5±23,37a

45,50 ±

10,68a

5,90 ±

0,73b

46,80 ±

0,81a

4,30 ±

1,33b

48,80 ±

9,55a

6,90 ±

3,72b

>0,05

>0,05

Skor

histopatologi

dari implant

2,5 ± 0,53a 1,10 ±

0,73b

2,00 ±

0,67a,b

2,20 ±

1,22a

<0,05

Tingkat

adhesi

2,12 ± 0,35 ab

2,20 ± 0,63 a,b

1,90 ±

0,73a

2, 70 ±

0,48 b

<0,05

Keparahan

adhesi

0,87± 0,23 a 2,20

±0,39b

0,45 ±

0,28b

0,80 ±

0,25a

<0,05

Total skor

adhesi

2 ± 0,46a,b 2,6 ± 0,84 a,b

2,35 ± 0,97 a

3,5 ± 0,70 b

<0,05

Perbedaan statistic yang signifikan tidak tampak – terjadi pada setiap kelompok.

Semua data diatas diuji dengan α = 0,050 : 0,566 sampai 1000.

Dan 4 dibandingkan dengan kelompok control, tidak ada perbandingan statistic yang

signifikan antara kelompok-kelompok ini. Contoh dapat dilihat dari skor histology implant

endometriosis yang ditunjukkan gambar 2. Secara luasnya, tingkat keparahan dan total skor

adhesi yang terjadi karena implant diukur secara local setelah laparatomi ketiga. Seperti terlihat

pada tabel 1, sekor keparahan adhesi berkurang secara signifikan pada kelompok dengan

penggunaan metformin dibandingkan pada kelompok dengan pengobatan dan control latrazole.

Meskipun perbedaan yang signifikan secara statistic ditemukan antara kelompok 3 dan 4

sementara diskor total adhesi, tidak ada perbedaan statistic yang signifikan antara kelompok 3

dibanding dengan kelompok control atau kelompok 2.

Diskusi

Penanganan endometriosis selalu digunakan untuk mengurangi produksi endogen steroid.

Medroxyprogesterone acetat, danazol, kontrasepsi oral dan GNRH-a efektif untuk mengurangi

gejala nyeri yang berhubungan dengan endometriosis dan juga efektif untuk regresi dari lesi

endometriotik. Biasanya, efek didapati dari pemakaian jangka panjang dan recurensi setelah

pengobatan tinggi. Sehingga, tidak ada keuntungan untuk infertilitas yang berhubungan dengan

endometriosis. (Hoges et al, 2000). Sebelumnya, agen baru yang mana untuk menangani fertilitas

dengan efek samping. Pengobatan seharusnya lebih efektif menggunakan terapi hormonal.

GnRH analog, yang mana mensupresi produksi dari estrogen ovarium, yaitu pengobatan

yang sering digunakan untuk endometriosis berat. Akhirnya pengobatan menghasilkan 50%

penurunan symptom pada wanita dengan moderate & severe endometriosis. Recurensi dari nyeri

pelvic tinggi yaitu sekitar 75 % setelah 5 tahun follow up. Pengobatan GnRH agonis jangka

panjang tidak bermanfaat karena efek samping yang berhubungan dengan hypoestrogenic state,

paling sering bone loss (pierce et al, 2000). Letrozole juga mempunyai efek samping yang sama

yaitu menghasilkan kondisi hipoestrogen. Oleh karena itu, tidak ada study yang membahas efek

dari metformin pada wanita dengan endometriosis, terapi metformin mungkin lebih bermanfaat

untuk mengurangi efek samping yang serius.

Aromatase p-450 adalah enzim kunci untuk biosintesis estrogen yaitu mengkatalisis

konversi dari androstenedione dan testosterone menjadi estrone dan estradiol, ekspresi aromatase

ditemukan pada lesi endometriotic dan pada ectopic endometrium dari wanita yang tidak sakit

(meresman et al, 2005), oleh karena itu, aromatase enzyme inhibitor diharapkan mempunyai efek

pada nyeri yang berhubungan dengan endometriosis, menurunkan ukuran lesi dan mungkin

menaikkan kualitas hidup (nawathi et al, 2008). Study menggunakan letrozole dan norethindrone

asetat pada pasien premenopause dengan refractory endometriosis dilaporkan menandai

mengurangi nyeri dan laparoscopically dan histology endometriosis (ailawadi et al, 2004). 3

study efek dari letrozole pada lesi endometriosis tikus percobaan dan semuanya menurunkan

ukuran dari lesi endometriosis (Iang et al, 2002, Bilotas et al) investigasi yang sama. Study ini

juga menunjukkan bahwa letrozole penyebab regresi dari ukuran implant endometriotic pada

tikus percobaan. Selain into, efek dari letrozole pada formasi adhesi tidak diketahui. Oleh karena

itu, aromatase inhibitor efektif pada pengobatan endometriosis dan mungkin bermanfaat pada

pengobatan infertilitas, mereka mempunyai efek samping yang sama dengan GnRH analog yaitu

menghasilkan kondisi hypoestrogen.

Evaluasi FAS dan caspase-3 dalam lapisan endometrial pada pasien dengan infertilitas idiopatik dan keguguran berulang.

Metformin adalah antidiabetes yang banyak digunakan yang berfungsi untuk

meningkatkan sensitivitas insulin dan untuk pengobatan sindrom ovarium polikistik (PCOS)

dalam kesehatan reproduksi (Lord and Wilkins, 2004). Metformin juga dapat mengurangi

peradangan dan memiliki efek steroidogenesis dalam sel granulose ovarium dan sel teka

(Mansfield et al, 2003: Isoda et al, 2006). Pada penelitian baru-baru ini pada studi vitro

menunjukkan metformin menaikkan respon inflamasi, aktivasi aromatase dan proliferasi sel

stroma, endometrium, setelah dikultur steril (takemura et al, 2007).

Meskipun, hanya ada tiga studi yang mempelajari letrozole pada endometriosis pada

tikkus. Percobaan (faug et al, 2002). Bilatas et al 2009, yildrim et all, 2009), untuk pengetahuan

tidak ada penelitian yang telah dilakukan untuk membandingkan efek metformin dan letrazole

pada induksi pembedahan endometriosis hewan percobaan. Selama itu belum ada penelitian

untuk mengetahui pengaruh metformin pada endometriosis pada tikus percobaan dengan

demikian tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi efek dari metformin dan letrazole

pada endometriosis tikus percobaan.

Bahan & Metode

40 tikus betina wistar albino wistar berumur 8 minggu dengan berat 180-260 gram,

digunakan untuk studi binatang diberi makan libitum dan ditempatkan di kandang dan dipasang

meja yang memiliki lingkungan suhu yang terkendali (22 + 20C), dengan 12 lampu. Prosedur

percobaan oleh peneliti untuk penelitian hewan dilakukan di klinik hewan Cetinsaga dan pusat

penelitian universitas Erciyes, Fakultas Kesehatan. Semua hewan penelitian dijaga ketat sesuai

dengan pedoman komite untuk perawatan manusia.

Berbagai metode induksi endometriosis dalam tikus percobaan sudah dijelaskan.

Endometriosis adalah induksi pembedahan yang digunakan metode yang dijelaskan oleh Vemon

& Wilson (1985) dengan sedikit modifikasi, karena pengalaman sebelumnya metode ini semua

tikus dibias dengan ketamin hydrochloride dengan dosis 50mg/kg (ketalar flakon, Fecza libasi)

dan 7 mg/kg xylazine hidrochloria (rumpun bayer) secara intraperitoneal. Perut dibuka 5 cm

dengan insisi midline 1 leher rahim diligasi pada kedua persimpangan uterotuba dan ujung

serviks dan diangkat. Jaringan tadi direndam dalam larutan steril. Endometrium yang terkena

dipasang sumbu antiseptic dan 5x5 ml dengan dipotong. Jaringan tersebut kemudian bermuara ke

omentum dan dijahit dengan menggunakan vicril dengan 7,0. Dalam semua tindakan permukaan

endometrium yang berhadap dengan omentum. Lapisan perut ditutup lapis demi lapis

menggunakan vicril 4,0 dan hewan disadarkan dari pengaruh anestesi.

Pada akhir minggu keempat setelah operasi dua tikus mati. 38 tikus yang tersisa dimana

endometriosis dikembangkan yang pembedahan diiperiksa dan luas permukaan implant baik

(panjang x lebar dalam mm). Jaringan difoto dan pengukuran endometriosis dicatat. Setelah

operasi kedua, semua tikus diistirahatkan selama tiga hari. Kemudian tikus secara random dibagi

empat grup. Grup 1 (grup control terdiri 8 tikus) tidak diberikan pengobatan, tetapi diberikan air

4 ml per hari secara oral. Tikus grup 2 (metformin dosis rendah sebanyak 10 tikus), diberikan

100 mg/kg/hari secara oral. Tikus grup 3 (metformin dosis tinggi sebanyak 10 tikus) diberikan

metformin 200mg/kg/hari secara oral. Grup 4 (letrazole 10 tikus) diberikan letrazole sebanyak

letrazole 0,1 mg/kg/hari secara oral, diberikan metformin tablet 1000 mg (Glifor, bilin) dan 2,5

mg letrazole (femera, novardis) hancur dan tersuspensi dalam air untuk menghasilkan

konsentrasi 10mg/ml sesuai dengan bobot masing-masing tikus melarutkan obat, ditangguhkan

sampai 4ml dalam air, dapat dimodifikasi dengan pemberian via orogastric tube.

4 minggu setelah selesai dilakukan pengobatan, pada laparatomi ketiga, dilakukan dengan

anestesi ketamin. Panjang dan lebar implant diukur secara makroskopik dan luas permukaan

dihitung kembali. Luas keparahan dari perlengketan dibagian operasi implant endometriosis

dievaluasi oleh ahli patologi yang sama dengan cara winded manner, dengan menggunakan

system penilaian yang sudah ditetapkan (Lirsy et all, 1987). Menurut system adesi, tingkat adesi

ditetapkan sebagai berikut: 0, tidak ada adesi, 1. 25% dari daerah perlukaan, 2. 50% dari area

trauma, 3. Seluruh permukaan. Fraksional skore diberikan untuk tingkat perlengketan antara

kelas atas berat adesi diukur sebagai berikut: 0 tidak ada pemisahan, 0,5 sedikit resisten

(moderate). 1 diperlukan diseksi tajam. Total grade aditif memberikan penilaian adesi dari 0-4

yang mewakili luas dan tingkat keparahan, pengukuran ini dievaluasi dilakukan oleh 1 operator

penelitian Bilin.

Hasil

38 dari 40 tikus, endometriosis implant terbentuk pada awal perawatan medis, luas

permukaan dari implant rata-rata endometriosis comparable di keempat grup (Table I). Namun,

dalam pengobatan rata-rata implant dalam semua kelompok lebih kecil daripada grade control

(table I).

Rata-rata permukaan implant sama pada semua grup pengobatan. Penurunan luar

permukaan implant endometriosis karena perawatan medis yang signifikan pada grup kedua (dari

45,50 + 10,68 sampai 590 + 237 mm2, p<0,05). Grup tiga (dari 46,80 + 6,81 sampai 430 + 1,33

mm2, p<0,05) dan grup 4 (dari 48,80 + 955 sampai 6,90 + 372 mm2, p<0,05) dibandingkan

dengan grup control (dari 43,12 + 17,27 sampai 995 + 23,37 mm2, p<0,005). Lihat contoh

implant endometriosis yang ditunjukkan pada gambar.

Nilai rata-rata dari pemeriksaan histology dari implant pada akhir pengobatan lebih

rendah dari grup 2, jika dinbadingkan dengan grup control dan grup 4 (tabel I). Disisi lain, tidak

ada perbedaan signifikan secara statistic antara grup metformin meskipun skor histopatologi

lebih rendah pada grup tiga.

Implan kemudian dipotong dan ditetapkan formalin 10% dari pemeriksaan histopatologi

endometriosis diformalin tetap focus yang tertanam dalam blok Parafin. Dipotong pada tebal

~5mm (4 pemotongan/sampel). Diwarnai dengan hematosiklin & eosin dan diperiksa dibawah

mikroskop cahaya. Ahli patologi menilai sampel terhadap grup pengobatan sel epitel yang

persisten dalam endometrium implant semikuantitatif dievaluasi sebagai berikut: 3 lapisan epitel

terawat, 2 lapisan epitel yang mendesak dan infiltratleukosit. 1 lapisan epithelium yang tipis

(hanya sel epitel), dan 0 tidaksel epitel. Evaluasi ini dilakukan terhadap endometriosis tikus

(Keenan et al 1999).

Dari ilmu sosio dilakukan analisis statistic dengan menggunakan paket statistic dengan versi 11.0

(SPSS.inc Chicago, 11 USA). Tidak terdistribusi secara variable normal metric yang dianalisis

oleh test Kruskal wallis dan tes Mann whitrey. Luas permukaan rata-rata dari implant

endometriosis antara grup sama (sebelum dan sesudah pengobatan kesehatan). Apakah analisis

oleh Wilcoxon’s test signed rank P<0,005 dianggap signifikan secara statistic. Perbandingan satu

cara Anova. Nilai-nilai dinyatakan sebagai rata-rata + standar deviasi kecuali pernyataan lain.

DAFTAR PUSTAKA

1. Ailawadi RK, Jobanputra S, Kataria M, Gurates B, Bulun SE. Treatment of

endometriosis and chronic pelvic pain with letrozole and norethindrone acetate: a pilot

study. Fertil Steril 2004;81:290–296.

2. Atay V, Cam C, Muhcu M, Cam M, Karateke A. Comparison of letrozole and

clomiphene citrate in women with polycystic ovaries undergoing ovarian stimulation. J

Int Med Res 2006;34:73–76.

3. Attar E, Bulun SE. Aromatase and other steroidogenic genes in endometriosis:

translational aspects. Hum Reprod Update 2006;12:49–56.

4. Bilotas M, Meresman G, Stella I, Sueldo C, Baran˜ao RI. Effect of aromatase inhibitors

on ectopic endometrial growth and peritoneal environment in a mouse model of

endometriosis. Fertil Steril 2009, doi:10.1016/j.fertnstert.2009.08.058.

5. Bulun SE, Zeitoun K, Takayama K, Noble L, Michael D, Simpson E, Johns A, Putman

M, Sasano H. Estrogen production in endometriosis and use of aromatase inhibitors to

treat endometriosis. Endocr Relat Cancer 1999;6:293–301.

6. Bulun SE, Imir G, Utsunomiya H, Thung S, Gurates B, Tamura M, Lin Z. Aromatase in

endometriosis and uterine leiomyomata. J Steroid Biochem Mol Biol 2005;95:57–62.

7. Fang Z, Yang S, Gurates B, Tamura M, Simpson E, Evans D, Bulun SE. Genetic or

enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J Clin

Endocrinol Metab 2002;87:3460–3466.

8. Fisher SA, Reid RL, Van Vugt DA, Casper RF. A randomized double-blind comparison

of the effects of clomiphene citrate and aromatase inhibitor letrozole on ovulatory

function in normal women. Fertil Steril 2002; 78:280–285.

9. Franks S. Polycystic ovary syndrome. N Engl J Med 1995;333:853–861. Hughes E,

Fedorkow D, Collins J, Vandekerckhove P. Ovulation suppression for endometriosis.

Cochrane Database Syst Rev 2000;2:CD000155.

10. Isoda K, Young JL, Zirlik A, MacFarlane LA, Tsuboi N, Gerdes N, Schonbeck U, Libby

P. Metformin inhibits proinflammatory responses and nuclear factor-kappaB in human

vascular wall cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006;26:611–617.

11. Keenan JA, Williams-Boyce PK, Massey PJ, Chen TT, Caudle MR, Bukovsky A.

Regression of endometrial explants in a rat model of endometriosis treated with the

immune modulators loxoribine and levamisole. Fertil Steril 1999;72:135–141.

12. Kennedy S, Bergqvist A, Chapron C, D’Hooghe T, Dunselman G, Greb R, Hummelshoj

L, Prentice A, Saridogan E, ESHRE Special Interest Group for Endometriosis

Endometrium Guideline Development Group. ESHRE guideline for the diagnosis and

treatment of endometriosis. Hum Reprod 2005;20:2698–2704.

13. Li L, Mamputu JC, Wiernsperger N, Renier G. Signaling pathways involved in human

vascular smooth muscle cell proliferation and matrix metalloproteinase-2 expression

induced by leptin: inhibitory effect of metformin. Diabetes 2005;54:2227–2234.

14. Linsky CB, Diamond MP, Cunningham T, Constantine B, De-Cherney AH, diZerega GS.

Adhesion reduction in a rabbit uterine horn model using an absorbable barrier TC-7. J

Reprod Med 1987;32:17–20. Lord J, Wilkin T. Metformin in polycystic ovary syndrome.

Curr Opin Obstet Gynecol 2004;16:481–486.

15. Lord JM, Flight IH, Norman RJ. Insulin-sensitizing drugs (metformin, troglitazone,

rosiglitazone, pioglitazone, D-chiro-inositol) for polycystic ovary syndrome. Cochrane

Database Syst Rev 2003;3:CD003053.

16. Mansfield R, Galea R, Brincat M, Hole D, Mason H. Metformin has direct effects on

human ovarian steroidogenesis. Fertil Steril 2003;79:956–962. Meresman GF, Bilotas M,

Abello V, Buquet R, Tesone M, Sueldo C. Effects of aromatase inhibitors on

proliferation and apoptosis in eutopic endometrial cell cultures from patients with

endometriosis. Fertil Steril 2005;84:459–463.

17. Mitwally MF, Casper RF. Use of an aromatase inhibitor for induction of ovulation in

patients with an inadequate response to clomiphene citrate. Fertil Steril 2001;75:305–309.

18. Moghetti P, Castello R, Negri C, Tosi F, Perrone F, Caputo M, Zanolin E, Muggeo M.

Metformin effects on clinical features, endocrine and metabolic profiles, and insulin

sensitivity in polycystic ovary syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled

6-month trial, followed by open, long-term clinical evaluation. J Clin Endocrinol Metab

2000;85:139–146.

19. Mohammadzadeh A, Heidari M, Ghoraii HS, Zarnani AH, Ghaffari Novin M, Akhondi

MM, Jarahi AM, Mohammadzadeh F. Induction of endometriosis by implantation of

endometrial fragments in female rats. Iran J Reprod Med 2006;4:63–67.

20. Nap AW, Groothuis PG, Demir AY, Evers JL, Dunselman GA. Pathogenesis of

endometriosis. Best Pract Res Clin Obstet Gynecol 2004;18:233–244. Nawathe A,

Patwardhan S, Yates D, Harrison GR, Khan KS. Systematic review of the effects of

aromatase inhibitors on pain associated with endometriosis. Br J Obstet Gynecol

2008;115:818–822.

21. Nestler JE, Jakubowicz DJ. Decrease in ovarian cytochrome P450c17 alpha activity and

serum free testosterone after reduction of insulin secretion in polycystic ovary syndrome.

N Engl J Med 1996;335: 617–623.

22. Ozkan S, Murk W, Arıcı A. Endometriosis and infertility. Ann N Y Acad Sci

2008;1127:92–100.

23. Pierce SJ, Gazvani MR, Farquharson RG. Long-term use of gonadotrophin–releasing

hormone analogs and hormone replacement therapy in the management of endometriosis:

a randomized trial with a 6-year follow-up. Fertil Steril 2000;74:964–968.

24. Session DR, Kalli KR, Tummon IS, Damario MA, Dumesic DA. Treatment of atypical

endometrial hyperplasia with an insulin-sensitizing agent. Gynecol Endocrinol

2003;17:405–407.

25. Sharpe-Timms KL. Using rats as a research model for the study of endometrosis. Ann N

Y Acad Sci 2002;955:318–327.

26. Shen ZQ, Zhu HT, Lin JF. Reverse of progestin-resistant atypical endometrial

hyperplasia by metformin and oral contraceptives. Obstet Gynecol 2008;112:465–467.

27. Surrey ES, Hornstein MD. Prolonged GnRH agonist and add-back therapy for

symptomatic endometriosis: long-term follow-up. Obstet Gynecol 2002;99:709–719.

28. Takemura Y, Osuga Y, Yoshino O, Hasegawa A, Hirata T, Hirota Y, Nose E, Morimoto

C, Harada M, Koga K et al. Metformin suppresses interleukin (IL)-1beta-induced IL-8

production, aromatase activation, and proliferation of endometriotic stromal cells. J Clin

Endocrinol Metab 2007;92:3213–3218.

29. Uchiide I, Ihara T, Sugamata M. Pathological evaluation of the rat endometriosis model.

Fertil Steril 2002;78:782–786.

30. Vandermolen DT, Ratts VS, EvansWS, Stovall DW, Kauma SW, Nestler JE. Metformin

increases the ovulatory rate and pregnancy rate from clomiphene citrate in patients with

polycystic ovary syndrome who are resistant to clomiphene citrate alone. Fertil Steril

2001;75:310–315.

31. Vela´zquez E, Acosta A, Mendoza SG. Menstrual cyclicity after metformin therapy in

polycystic ovary syndrome. Obstet Gynecol 1997;90:392–395.

32. Vernon MW, Wilson EA. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat.

Fertil Steril 1985;44:684–694.

33. Vignali M, Infantino M, Matrone R, Chiodo I, Somigliana E, Busacca M, Vigano P.

Endometriosis: novel etiopathogenetic concepts and clinical perspectives. Fertil Steril

2002;78:665–678.

34. Vinatier D, Orazi G, Cosson M, Dufour P. Theories of endometriosis. Eur J Obstet

Gynecol Reprod Biol 2001;96:21–34.

35. Wasan KM, Goss PE, Pritchard PH, Shepherd L, Palmer MJ, Liu S, Tu D, Ingle JN,

Heath M, Deangelis D et al. The influence of letrozole on serum lipid concentrations in

post-menopausal women with primary breast cancer who have completed 5 years of

adjuvant tamoxifen (NCIC CTG MA.17L). Ann Oncol 2005;16:707–715.

36. Yildirim G, Attar R, Ozkan F, Kumbak B, Ficicioglu C, Yesildaglar N. The effects of

letrozole and melatonin on surgically induced endometriosis in a rat model: a preliminary

study. Fertil Steril 2009, doi:10.1016/ j.fertnstert.2009.09.021.