ISOLASI PROMOTER /3-ACTZN

IKAN NILA Oreochroinis niloticus

ANNA OCTAVERA

SKRIPSI

PROGRAM STUD1 TEIWOLOGI DAN MANAJEMEN AKUAICULTUR

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2008

RINGKASAN

ANNA OCTAVERA. lsolasi Promoter P-Actin Ikan Nila Oreochromis niloticus. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan AGUS OMAN SUDRAJAT.

Promoter merupakan elemen penting untuk pembuatan konstruksi untuk pembuatan ikan transgenik. Promoter yang digunakan untuk mengaktitkan gen yang akan ditransfer akan lebih baik jika menggunakan promoter yang berasal dari spesies yang sama dengan ikan target transgenik. Selain ekspresi gen yang baik, penggunaan pronioter yang berasal dari spesies yang sama memungkinkan penerimaan konsumen terhadap ikan transgenik akan baik pula. Oleh karena itu, dalam rangka pembuatan ikan nila Oreochromis niloticus transgenik dibutuhkan promoter dari ikan nila.

Genom p-actin ikan nila diisolasi dari jaringan hati menggunakan kit Puregene DNA isolation. Setelah itu diamplifikasi dengan PCR dengan primer degenerate yang disusun berdasarkan database gen p-actin dari berbagai spesies ikan di Bank Gen. Primer forward F-BP adalah 5'-GTGWGTGACGCYGGACC AATC-3'. Primer reverse adalah R-BPI (5'-TAGAAGGTGTGRTGCCAGATCT TC-3') dan R-BP2 (5'-TTGCACATRCCRGAKCCGTTGTC-3'). Amplifikasi PCR dilakukan dengan program: pre-denaturasi pada suhu 94'C selama 3 menit; 5 siklus pada suhu 94°C selama 30 detik dan 62OC selama 3 menit; 30 siklus pada suhu 94OC selama 30 detik, 58OC selama 30 detik dan 72OC selama 3 menit; serta 1 siklus pada suhu 72'C selama 3 menit. PCR dilakukan dua kali: PCR peltama menggunakan primer F-BP dengan R-BPI, PCR kedua atau dikenal dengan istilah 17r.rted PCR dengan primer F-BP dan R-BP2 dimana program yang digunakan sama. DNA dipurifikasi dan selanjutnya diligasi ke vektor kloning pGEM-T Easy. Plasmid tersebut ditransformasi ke sel kompeten bakteri E. coli DH5a untuk dikloning. Penyeleksian koloni hasil transformasi dilakukan dengan penambahan antibiotik ampisilin, IPTG dan X-gal pada media seleksi. Koloni kandidat pembawa plasmid adalah koloni yang berwalna putih, selanjutnya plasmid tersebut diisolasi. Kemudian plasmid disekuensing dan hasilnya dianalisis menggunakan software GENETYX versi 7 dan TFBind.

Panjang fragmen DNA hasil PCR yang diperoleh berkisar 1,3 kb. Panjang sekuen promoterp-Actin hasil sekuensing arah forward sekitar 1234 bp, sementara dari arah reverse sekitar 1259 bp. Setelah dilakukan analisis dengan soffivare GENETYX d a ~ i TFBind diketahui bahwa sekuens DNA hasil isolasi memiliki semua elemen penting yang konserf (conserved) untuk promoter P-actin dari ikan. Elemen penting bagi promoter P-actin adalah CCAAT yang terletak pada nt. 16 - 20, CC(A/T)&G atau disebut motif CArG pada nt. 46 - 55 dan boks TATA pada nt. 79 - 83 dihitung dari ujung terminal 5. Motif CArG juga terdapat pada intron I yaitu pada nt. 225 - 234 dihitung dari ujung terminal 3. Selain itu, dari hasil alignment diketahui bahwa posisi dari elemen-elemen penting tersebut adalali konserf seperti dengan sekuensnya. Selanjutnya, berdasarkan kemiripan asam amino gen P-actin ikan nila dengan ikan medaka dan ikan mas didapatkan persentase kemiripan berturut-turut sebesar 94,l 1% dan 85,24 %. Dengan demikian dapat disi~npulkan promoterp-Actin ikan nila telah berhasil diisolasi.

ISOLASI PROMOTER /?-ACTIN

IKAN NILA Oreochromis niloticrrs

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan

pada Fakultas Perikanan dan llmu Kelautan

Institut Pertanian Bogor

Oleh:

Anna Octavera

C14103026

PROGRAM STUD1 TEKNOLOGI DAN MANAJEMEN AICUAKULTUR

FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

2008

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyampaikan bahwa Skripsi yang berjudul:

ISOLASI PROMOTER P-ACTIN IKAN NILA Oreochromis niloticus

adalah benar merupakan hasil karya yang belum diajukan dalam bentuk apa pun

kepada perguruan tinggi manapun. Semua sumber data dan informasi yang berasal

atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain

telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian

akhir skripsi ini.

Bogor, Maret 2008

ANNA OCTAVERA C14103026

Judul

Nama

NRP

: Isolasi Promoter P-Actin Ikan NiIa Oreocl~romis niloiicus

: Anna Octavera

: C14103026

Menyetujui,

Pembimbing I

-

Dr. Alimuddin NIP. 132133953

Pembimbing I1

Drhi=raiat, NIP. 131953476

Tanggal Lulus:

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-

Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam

penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2007 sampai Februari 2008

adalah genetika ikan, dengan judul "lsolasi promoter p-actin ikan nila

Oreochromis niloticus".

Keberhasilan penulis dalam menyelesaikan penelitian ini tidak semata

didapatkan sendiri, melainkan dengan bantuan orang-orang sekitar. Untuk itu

penulis mengucapkan terima kasih kepada:

1. Dr. Alimuddin selaku Pembimbing I yang telah membimbing dan

mengarahkan penulis selama melakukan penelitian sampai dengan

penyusunan karya ilmiah ini.

2. Dr. Agus Oman Sudrajat selaku Pembimbing I1 dan Pembimbing

Akademik yang telah membimbing penulis sejak awal perkuliahan sampai

dengan penyusunan karya ilmiah ini.

3. Ayahanda Jamalis dan Ibunda Aniar serta kakak-kakakku Anita dan

Antoni serta adikku Andri yang telah memberi kasih sayang, doa restu,

dukungan moril dan materil.

4. Lina, Novi, Peggy, Tyas dan mbak Lina serta kepada semua orang yang

tidak bisa disebutkan namanya satu per satu.

Penulis telah berusaha semaksimal mungkin dalam penulisan ini.

Akhirnya, diantara kelebihan dan kekurangannya, penulis berharap skripsi ini

dapat bermanfaat bagi penulis dan para pembaca pada umumnya.

Bogor, Maret 2008

Anna Octavera

DAFTAR RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Sawahlunto, Sumatera Barat tanggal 24 Oktober

1984 dari Ayah Jamalis dan Ibu Aniar. Penulis merupakan anak ketiga dari empat

bersaudara.

Pendidikan formal yang dilalui penulis adalah SDN 02 Payakumbuh,

Sumatera Barat pada tahun 1991-1997 dilanjutkan di SLTPN 1 Payakutnbuh pada

tahun 1997-2000, kemudian SMUN 2 Payakumbuh pada tahun 200 dan lulus

tahun 2003. Penulis melanjutkan pendidikan tinggi di IPB melalui jalur Undangan

Seleksi Masuk Institut Pertanian Bogor pada tahun yang sama dan memilih

program studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya

Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah magang di Taman

Akuarium Air Tawar, Taman Mini Indonesia Indah dan praktek lapang (PL) di

Balai Besar Pengenibangan Budidaya Air Tawar, Sukabumi. Penulis juga pernah

menjadi asisten mata kuliah Fisiologi Reproduksi Ikan semester ganjil 200512006,

Dasar-Dasar Genetika tkan semester genap 200612007 dan koordinator assisten

Casar-Dasar Genetika Ikan semester genap 200712008. Selain itu penulis juga

aktif menjadi pengurus Himpunan Mahasiswa Akuakultur (HIMAKUA) periode

200312004, 200412005, dan 200512006. Penulis juga pernah menjabat sebagai

ketua Unit Kegiatan Mahasiswa (UKM) Taekwondo fPB. Tugas akhir dala~n

pendidikan tinggi diselesaikan dengan menulis skripsi yang berjudul "Isolasi

Promoter /?-Actin Ikan Nila Oreochrornis nilotic~rs".

DAFTAR IS1

Halaman ...

DAFTAR TABEL ................................................................................................ 111

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... iv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... v

I . PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

1 . 1 Latar Belakang .......................................................................................... I

1.2 Tujuan ....................................................................................................... 2

.................................................................................. II . TINJAUAN PUSTAKA 3

..................................................................................................... 2.1 Ikan Nila 3

......................................................................................... 2.2 Promoter b-actin 3

2.3 Ekstraksi DNA Genom .............................................................................. 5

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) ........................................................... 6

2.5 Ligasi .......................................................................................................... 8

2.6 Transformasi dan Seleksi Koloni ............................................................. 10

2.7 Sekuensing ............................................................................................. 11

m . BAHAH DAN METODE .......................................................................... 12

3.1 Waktu dan Tempat ................................................................................... 12

3.2 Prosedur Kerja ...................................................................................... 12

3.2.1 Ekstraksi DNA Genom ............................................................. 12

3.2.2 Amplitikasi DNA dengan Polimerase Chain Reaction (PCR) ........ 13

3.2.3 Elektroforesis .................................................................................. 14

3.2.4 Isolasi DNA dari Gel ...................................................................... 14

3.2.5 Ligasi ke Vektor pGEM-T Easy ..................................................... 15

3.2.6 Transformasi ................................................................................... 15

3.2.7 Seleksi Koloni Bakteri dan Pembuatan Masfer Plate ..................... 15

3.2.8 Isolasi Plasmid ................................................................................ 16

3.2.9 Sekuensing dan Analisis Sekuens .................................................... 18

IV . HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 19

4.1 Hasil .......................................................................................................... 19

4.1.1 Ekstraksi DNA Genom ................................................................... 19

.... 4.1.2 Amplifikasi DNA Kandidat Promoter dan Isolasi DNA dari Gel 20

........................................ 4.1.3 Transformasi dan Seleksi Koloni Bakteri 20

................................................................................. 4.1.4 Isolasi Plasmid 22

........................ 4.1.5 Sekuensing dan Analisis Sekuens Promoter B-actin 22

4.2 Pembahasan ............................................................................................... 27

V . KESIMPULAN ......................................................................................... 30

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 31

LAMPIRAN ......................................................................................................... 35

DAFTAR TABEL

Halamao

1. Kuantifikasi DNA genom ikan nila (Oreochromis niloticus) ........................... 19

2. Konsentrasi plasmid yang mengandung fragmen kandidat sekuen promoter

/?-actin ikan nila Oreocrhomis niloricus ............................................................ 22

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 . Ikan nila Oreochromis niloticus .................................................................. 3

2 . Tahapan ke j a PCR (Erlich. 1989) ................................................................... 7

3 . Peta plasmid pGEM-T Easy ............................................................................. 9

4 . Elektroforesis hasil ekstraksi DNA ikan nila .................................................... 19

5 . Elektroforesis DNA has11 PCR kedua dan hasil purifikasinya dari gel agarosa .......... 20

6 . Koloni bakteri transforman ............................................................................... 21

7 . Elektroforesis hasil "cracking" bakteri ............................................................. 21

8 . Sekuens promoter p-actin ikan nila hasil sekuensing dari arah forward ........... 23

9 . Sekuens promoter p-actin ikan nila hasil sekuensing dari arah reverse ............ 24

10 .Alignment sekuens parsial promoter p-actin ikan nila (hasil sekuensing

dari arah forward, F-nila) ................................................................................. 25

1 1 .Alignment sekuens parsial promoter p-actin ikan nila (hasil sekuensing

dari arah reverse, R-nila) ................................................................................. 26

12 . Perbandingan asam amino dari gen j?-actin ikan nila, ikan mas dan ikan

medaka ............................................................................................................ 27

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

1. Penyusunan primer berdasarkan database genp-actin dari berbagai

spesies ikan ....................................................................................................... 36

2. Alat-alat yang digunakan dalam mengisolasi promotera-actin ikan

nila Oreochromis niloticus ............................................................................... 38

3. Hasil sekuensing genom a-actin ikan nila Oreochromis niloticus dari

arah forward ...................................................................................................... 41

4. Hasil sekuensing genom p-actin ikan nila Oreochronzis niloticus dari

arah reverse ....................................................................................................... 42

1.1 Latar Belakang

Promoter adalah sekuens DNA yang terletak di upsfreant suatu gen yang

mengatur transkripsi (Glick & Pasternak, 2003); mencakup waktu, tempat dan

tingkat transkripsi gen. Dengan demikian, promoter dianalogikan sebagai switch

suatu gen. Selanjutnya promoter me~pakan salah satu faktor penentu

keberhasilan pembuatan ikan transgenik nila.

Pada awal pengembangan ikan transgenik, menggunakan promoter dari

mamalia atau virus, namun hasilnya kurang efektif. Kemudian masalah ini

dipecahkan dengan menggunakan promoter yang diperoleh dari spesies yang

sekerabat seperti yang telah dilaporkan oleh Alam et a1.,(1996). Selain tingkat

ekspresi gen yang tinggi, ikan transgenik yang dibuat menggunakan elemen

regulator dari ikan kemungkinan lebih mudah diterima konsumen daripada yang

dibuat menggunakan promoter dari mamalia atau virus (Maclean & Laight, 2000).

Beberapa jenis promoter yang sudah diisolasi dan sudah dicoba pada

beberapa spesies ikan oleh beberapa peneliti, yaitu promoter cytomegalovirus

(CMV) dari virus manusia, elongation factor-la (EF-la) dari ikan medaka /?-

actin dari ikan medaka dan myosin light chrrfn-2 (MY!~-2) dari ikan zebra

(Alimuddin, 2003). Berdasarkan penelitian Alimuddin (2003), pada ikan zebra,

promoter p-actin dan Mylz-2 menunjukan aktivitas lebih kuat dibandingkan EF-

la. Sedangkan CMV menunjukan aktivitas lebih rendah. Hal ini dikarenakan

promoter CMV berasal dari virus manusia dimana ada kemungkinan bahwa tidak

semua elemen cis-acting-nya dikenali oleh faktor trans-acting dari ikan zebra.

Sedangkan promoter lainnya yang berasal dari ikan menunjukan aktivitas yang

tinggi. Selanjutnya promoter p-actin merupakan promoter yang bersifat hozrse-

keeping dimana dalam siklus hidupnya akan selalu aktif. Selain bersifat house-

keeping, p-actin juga mempunyai sifat ubiquitous macket, 1993), dimana

promoter ini akan aktif dimana-mana dan constitutive (Volckaert et al., 1994)

yang berarti bahwa promoter ini bisa aktif tanpa diberikan rangsangan dari luar

seperti suhu dan hormon.

Promoter 8-actin sudah diisolasi dari berbagai macam ikan seperti pada

ikan mas (Liu et al., 1990), ikan zebra (Higashijima et al., 1997), ikan medaka

(Hamada et al., 1998), ikan ntud loach (Noh et al., 2003), dan red sea bream

(Kato et al., 2007). Promoter 8-actin ini sudah banyak dilaporkan dapat aktif pada

spesies yang sama, sekerabat atau berbeda jenis dengan asal promoter, seperti

pada ikan rainbow trout (Yoshizaki, 2001), ikan zebra (Alimuddin et al., 2005),

ikan nila (Kobayashi et al., 2007), ikan lele (Ath-thar, 2007), dan ikan mas

(Purwanti, 2007) yang menggunakan promoter dari ikan medaka. Tetapi,

berdasarkan penelitian Higashijima et ul., (1997) penggunaan promoter p-actin

ikan zebra untuk ikan zebra lebih baik.

Oleh karena itu, dalam rangka pembuatan ikan nila hansgenik dengan

konstruksi gen "all nila" maka dilakukan isolasi promoter &actin dari ikan nila.

Ikan nila merupakan ikan budidaya air tawar yang mempunyai nilai ekonomis

tinggi yang banyak diminati oleh konsumen.

Untuk isolasi promoter, metode yang umum digunakan adalah metode

Vectorette PCR. Tetapi metode ini mempunyai beberapa kekurangan, seperti

harga kit yang cukup mahal dan waktu pengerjaan yang relatif lama. Salah satu

metode altematif yang bisa digunakan untuk isolasi promoter adalah metode

degenerate PCR. Metode ini menggunakan primer mix yang didapat dari

menderetkan informasi sekuen yang konserf dari berbagai spesies ikan. Metode

degenerate biasa digunakan untuk kloning suatu gen. Pada penelitian ini, metode

tersebut digunakan untuk mengisolasi promoter 8-actin dari ikan nila.

1.2 Tujuan

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi promoter /-actin

menggunakan metode degenerate PCR dan melakukan analisis sekuen promoter

p-uctin ikan nila.

Promoter berperan penting dalam pembuatan ikan transgenik. Promoter

mengatur waktu dan tempat ekspresi suatu gen sehingga promoter dianalogikan

sebagai switch suatu gen. Menurut Hacket (1993) promoter ada yang bersifat aktif

dimana-mana (ubiquitous) dan jaringan spesifik. Promoter yang bersifat jaringan

spesifik aktivitasnya lebih lemah dari yang bersifat ubiquitous. Aktivitas promoter

yang bersifat ubiquitous dapat aktif pada setiap cell line sedangkan yang bersifat

jaringan spesifik hanya aktif pada jaringan tertentu. Promoter /?-actin memiliki

beberapa sifat yang terkait dengan aktivitas eiemen-elemennya yaitu constitutive,

ubiquitous dan house keeping (Liu, 1990 dalam Volckaert, 1994). Constitutive

berarti promoter ini dapat aktif tanpa diberikan rangsangan dari luar seperti suhu

dan hormon. Promoter pactin bersifat ubiquitous artinya dapat aktif pada semua

jaringan otot. Sedangkan bersifat house keeping berarti promoter /?-actin dapat

aktif kapan saja bila diperlukan.

Actin merupakan protein yang Sitoskeleton berlimpah dalam sel eukariotik

dan sedikitnya 6 isoform utama telah diidentifkasi dalam vertebrata

(Vandekerckhove & Weber, 1978 dalam Quitschke et al., 1988). /?-actin

merupakan isoform aklin sitoplasmik dan diekspresikan pada kebanyakan sel-sel

non~nuscle eukariotik juga dalam myoblasts undiferensiasi. Selama myogenesis,

ekspresi isoform p-actin menurun dan akhirnya diganti oleh isoform a yang

spesifik daging (Hayward & Schwartz, 1986 dalam Quitschke et al., 1988).

Di dalam promoter terdapat sekuen faktor transkripsi, yaitu elemen yang

menentukan aktivitas promoter. Sekuen faktor transkripsi yang berperan dalam

aktivitas promoter /?-actin adalah boks TATA, boks CCAAT, dan CC(A/T)6GG

atau motif CAffi (Quitschke et al., 1988; Takagi et al., 1994). Motif CAffi berada

pada 2 tempat, yang pertama ada di antara boks TATA dan boks CCAAT

sedangkan yang lain berada di intron 1. Motif CAffi yang terdapat pada intron 1

berfungsi sebagai pemicu (enhancer) aktivitas transkripsi (Liu et al., 1990; Noh et

al., 2003). Boks TATA mempakan elemen yang umum dijumpai pada sekuen

promoter, sebagai tempat melekatnya RNA polimerase pada saat transkripsi RNA

akan berlangsung (Glick & Pasternak, 2003). Secara in vitro penghapusan boks

TATA membuat promoter tidak aktif dan pada in vivo aktivitasnya menurun

(Quitschke et al., 1989). Selanjutnya dikatakan aktivitas promoter p-actin

tergantung pada keberadaan elemen CCAAT, dengan adanya elemen ini berguna

pada tingkat tertinggi transkripsi promoter @tin (Quitschket et al., 1989).

2.3 Ekstraksi DNA Genom

Ekstraksi DNA dilakukan untuk memisahkan genom DNA dari molekul-

molekul lain di dalam satu jaringan yang dilarutkan. Ada dua tahap yang

dilakukan dalam ekstraksi DNA. Tahap pertama adalah menghancurkan sel dan

mengisolasi asam nukleat. Penghancuran sel dilakukan dkngan menambahkan

larutan deterjen pekat seperti sodium dodecyl suphate (SDS). Deterjen ini

bertindak sebagai penghancur inti sel sehingga DNA akan terlepas dan

meningkatkan viskositas larutan, sehingga molekul DNA terlihat lebih nyata.

Deterjen juga bertindak sebagai penghambat aktivitas semua enzim nuklease yang

ada selama proses ekstraksi (Karp, 1984; Brown, 1995). Tahap kedua adalah

pemisahan DNA dari bahan-bahan kontaminan seperti RNA dan protein. Untuk

menghilangkan kontaminasi RNA digunakan enzim ribonuklease (RNase)

sedangkan untuk menghilangkan kontaminasi dari protein digunakan enzim

proteolitik (Proteinase K) pada larutan DNA (Saunders & Parkes, 1999).

Dalam proses eksiraksi, proses sentrifugasi sangat berperan penting dimana

sentrikgasi akan menyebabkan sairan DNA terletak di lapisan atas larutan. DNA

yang sudah terpisah dari kontaminasi RNA dan protein dipindahkan dari

microtube. Dengan proses sentrifugasi juga asam nukleat diendapkan dari larutan

supernatan dengan penambahan etanol dingin. Setelah proses sentrifugasi, pellet

DNA yang terbentuk dilarutkan kembali dengan buffer yang mengandung

Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (Saunders & Parkes, 1999) atau Steril

Destillation Water (SDW).

Penghitungan jumlah ekstraksi DNA yang dihasilkan dilakukan dengan

meliat hubungan DNA dengan absorbansi optikalnya pada panjang gelombang

260 nm dimana 1 mg DNA mempunyai daya absorbansi sebesar 20 unit

(Saunders & Parkes, 1999). Brown (1990) dalam Ekasari (1999) menyebutkan

rasio absorbansi 260 nml280 nm yang kurang dari 1,8 menunjukkan bahwa hasil

ekstraksi telah terkontaminasi oleh protein atau fenol.

2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR merupakan suatu metode in vitro yang digunakan untuk mensintesis

sekuen DNA tertentu dengan menggunakan dua primer ~Iigonukleotida yang

menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA (Erlich,

1989). Kesederhanaan dan tingginya tingkat kesuksesan amplifikasi sekuen DNA

yang diperoleh menyebabkan teknik ini semakin luas penggunaannya (Saiki et al.,

1988 dalam Wahyudi, 2001).

Menurut Erlich (1989) pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses

replikasi DNA in vivo, yaitu dengan adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi)

utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru

(extension) oleh DNA polimerase dari arah 5' ke 3'. Hanya saja pada teknik PCR

tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secara singkat, teknik PCR

dilakukan dengan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer

oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), enzim termostabil Taq

DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan

menurunkan suhu campuran secara beruiang selama beberapa jam sampai

diperoleh jumlah sekuen DNA yang diinginkan.

Proses PCR memerlukan sejumlah siklus untuk menpmplifikasi suatu

sekuen DNA spesifik. Setiap siklus terdiri atas :iga :aha?, yaitu denaturasi,

annealing (hibridisasi), dan ekstensi (polimerasi). Denaturasi dilakukan pada suhu

90-95"C, sehingga terjadi pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal

DNA yang menjadi cetakan (template) tempat penempelan primer dan te~npat

kerja DNA polimerase. Selanjutnya, suhu diturunkan untuk penempelan primer

oligonukleotida pada sekuen yang kompiementer pada molekul DNA cetakan.

Tahap ini disebut annealing. Suhu campuran diturunkan sampai mencapai -55°C

atau sesuai melting temperatzrre (Tm) dari primer o!igonukleotida (Glick &

Pastemak, 2003). Selama tahap ini, primer berpasangan dengan sekuen

komplementernya di dalam DNA cetakan. Primer oligonukleotida melekat pada

masing-masing utas tunggal DNA dengan arah yang berlawanan; satu primer

melekat pada ujung utas DNA sense, sedangkan primer yang lain melekat pada

ujung utas DNA antisense. Tahap selanjutnya adalah tahap ekstensi yang

dilakukan pada suhu 72°C. Suhu ini merupakan suhu optimum untuk kerja enzim

Taq DNA polimerase. Pada tahap ini enzim Taq DNA polimerase mengkatalis

reaksi penambahan mononukleotida pada primer yang sesuai dengan utas DNA

komplemen yang berada di sebelahnya. Hasil amplifikasi DNA yang dihasilkan

tergantung dari berapa siklus yang pakai. Contohnya jika siklusnya 20 maka

amplifkasi PCR yang dihasilkan adalah 220 (Erlich, 1989). Tahapan kerja PCR

secara singkat digambarkan dalam Gambar 2.

Gambar 2. Tahapan kerja PCR; 1. Tahap denaturasi; 2. Tahap annealing; 3 . Tahap ekstensi (P: Polimerase); 4. Perkembangan pada siklus selanjutnya (Erlich, 1989)

Degenerate PCR mempunyai banyak kesamaan dengan PCR biasa.

Perbedaan utamanya adalah primer spesifik pada PCR biasa diganti dengan

primer mix. Primer mix disusun berdasarkan kemiripan struktur gen dalam suatu

famili. Koelle (1996) menyebutkan dengan menderetkan sekuen nukleotida dari

sejumlah nukleotida yang berhubungan akan dapat ditemukan bagian nukleotida

yang konserf (conserved). Berdasarkan informasi tersebut dapat ditemukan motif

nukleotida yang konserf yang dapat digunakan sebagai titik awal pembuatan

primer degenerate PCR. Kode nukleotida pada primer mix ini adalah R=A+G,

Y=C+T, M=A+C, K=G+T, W=A+T, S=CG, B=C+G+T, D=A+G+T, H=A+C+T,

V=A+C+G, N=A+C+G+T (http//boneslab.chembio.ntnu.no). Pada penelitian ini

menggunakan primer yang didesain berdasarkan database di Bank Gen (Lampiran

1). Database yang digunakan meliputi genp-actin dari ikan mas (no. Aksesi Bank

Gen: M24113), ikan nila (no. Aksesi Bank Gen: AY 116536), ikan medaka (no.

Aksesi Bank Gen: S74868), ikan Mylopharyngodonpiceus (no. Aksesi Bank Gen:

AY289135), dan ikan Megalobrama amblycephala (no. Aksesi Bank Gen:

AY170122).

2.5 Ligasi

Menurut Voet & Voet (1994) ligasi merupakan pemasukan sekuens DNA

yang mengandung gen yang diinginkan ke dalarn elemen genetik yang dapat

bereplikasi sendiri (vektor), seperti plasmid. Enzim yang mengkatalis reaksi ini

adalah DNA ligase. Enzim ini dapat mengkatalisis pembentukan ikatan

fosfodiester pada DNA utas ganda antara ujung basa 3' dan ujung fosfat 5'. Jellis

enzim ligase yang sering digunakan adalah T4-DNA Ligase yang dapat

menyambung kembali DNA plasmid yang terbuka setelah dipotong oleh

endonuklease restriksi. Pada proses penyambungan ini dapat juga disisipkan

potongan DNA yang lain sehingga diperoleh plasmid rekornbinasi yang baru

(Smith, 1985 dalarn Asikin, 2003). Proses ligasi ini menghasilkan produk yang

disebut DNA rekombinan.

Vektor ekspresi adalah DNA rekombinan pang membawa transgen yang

diinginkan dan sekuen regulator yang menentukan dimana, kapan dan tingkatan

mana transgene akan diekspresikan. Sejauh ini vektor yang dipakai adalah

plasmid yang dapat mereplikasi ke tingkat 500-2000 salinan per sel Escherichia

coli (Hacket, 1993). Plaslnid merupakan suatu molekul yang dapat bereplikasi

sendiri (self-replicating), terdiri atas utas ganda DNA yang berbentuk sirkular

(Glick & Pasternak, 2003). ICemampuannya untuk bereplikasi sendiri dan tidak

bergantung pada kromosom inang disebabkan oleh adanya titik awal replikasi

pada plasmid (origin of replication; orl]. Plasmid pada umumnya mengandung

satu atau lebih gen yang menyandi ketahanan (resisten) terhadap antibiotik,

sehingga sel inang yang mengandung plasmid dapat bertahan dalam lingkungan

yang mengandung antibiotik tertentu, misalnya ampisilin, kanamisin, tetrasiklin

dan kloramfenikol. Hal ini dapat digunakan untuk membedakan (menyeleksi)

bakteri yang mengandung plasmid atau tidak (sebagai selectable marker) (Brown,

1995). Selain itu plasmid juga mengandung cloning site, yaitu sekuen yang

mengandung situs restriksi untuk memasukkan insersi tanpa mengganggu fungsi

plasmid secara keselumhan (Feinbum, 1998 dalam Hadi, 2004). Pada penelitian

ini digunakan plasmid p ~ ~ M @ - ~ Easy yang bemkuran sebesar 3015 bp dan peta

plasmid pf3EMm-T Easy dapat dilihat pada Gambar 3. Plasmid p ~ ~ ~ @ - ~ Easy

berasal dari plasmid PGEM@-sz~(+) yang dipotong dengan EcoR V dan ditalnbah

gugus timin di kedua ujungnya. Plasmid pGEMm-T Easy mempakan plasmid

sirkular terbuka memiliki dua buah ori dan gen ketahanan terhadap ampisilin

( ~ m p ~ ) serta mengandung multi cloning site. Karena memiliki kelebihan Timin

yang menggantung di ujung terbuka plasmid (T overhang) plasmid ini sering

dipakai sebagai vektor dari produk PCR yang selalu terdapat kelebihan Adenin

(A) pada ujungnya, sehingga penempelan gen insert tidak perlu menggunakan

enzim restriksi. Selain itu, plasmid p ~ ~ ~ @ - ~ Easy termasuk plasmid high copy

number yang cocok untuk menyimpan gen insert dalam suatu inang (bakteri).

Gambar 3. Peta plasmid p ~ ~ ~ @ - ~ Easy (Promega)

2.6 Transformasi dan Seleksi Koloni

Transformasi merupakan proses pemasukan hasil ligasi dari plasmid

rekombinan ke dalam sel kompeten (Old & Primrose, 1994). Sel kompeten adalah

sel yang telah memperoleh perlakuan kimiawi atau perlakuan fisik tertentu yang

meningkatkan kemampuan sel tersebut untuk dapat dimasuki oleh plasmid

(Hanahan, 1983 dalam Darmawan, 2004). Introduksi plasmid rekombinan ke

dalam sel bertujuan agar dapat mengalami replikasi (penggandaan).

Bertambahnya jumlah vektor rekombinan menyebabkan DNA yang tersisip juga

mengalami replikasi.

Sel kompeten yang sering digunakan adalah Escherichia coli DH5a yang

merupakan salah satu galur yang sering digunakan sebagai inang. Bakteri E. coli

dapat tumbuh dengan mudah sampai 2-5 x 10' seVml media kultur, 1 ml sel

bakteri dapat memproduksi lebih dari loi3 plasmid rekombinadml. Kemampuan

untuk memperoleh salinan rekombinan DNA yang tak terbatas dalam bentuk yang

murni membuat pekerjaan transgenik jadi mungkin (Hacket, 1993).

Sel E. coli kompeten dibuat dengan merendam sel dalam larutan CaC12

yang berfungsi menahan DNA yang akan dimasukkan ke dalam sel sehingga

DNA masih melekat pada permukaan luar sei, belum ditranspor ke sitoplasma.

Pemasukkan DXA ke dalam se! kompeten distimulasi oleh peningkatan

temperatur lingkungan sel sampai 42°C. Teknik transformasi ini disebut kejutan

panas (heat shock). Teknik ini sederhana dan tidak memerlukan peralatan khusus

(Brown, 1995).

Sel inang yang membawa DNA sisipan dapat diketahui dengan penanda

seleksi, yaitu berupa sifat ketahanan terhadap antibiotik. Bakteri yang membawa

plasmid rekombinan (mengandung DNA sisipan) akan resisten terhadap antibiotik

tertenhi dai; yang bukan plasmid rekcrnbinan akan mati. Plasmid p ~ ~ ~ a D - ~ Easy

yang digunakan pada penelitian ini mengandung penanda seleksi ampisilin

( ~ m ~ ~ ) . Sel inang yang membawa plasmid rekombinan yang membaya DNA

sisipan atau tidak, dapat diseleksi dengan penambahan X-gal (5-broino-4-chloro-

3-indolyl-8-D-galactopyranoside) dan IPTG (isopropil thiogalaktosida) pada

media tumbuh, sehingga memberikan koloni benvarna biru dan putih (Suharsono,

2000). Gen LacZ pada vektor kloning yang menyandi P-galactosidase akan

mengubah molekul X-gal dari tidak berwama menjadi molekul berwama biru.

Gen Lac2 diinduksi oleh IPTG. Apabila gen LacZ tersisipi oleh molekul DNA

lain, maka LacZ tidak dapat diekspresikan, sehingga sel yang mengandung sisipan

tidak mampu merubah X-gal menjadi biru.

2.7 Sekuensing

Informasi mengenai sekuens DNA sangat diperlukan pada penelitian DNA

rekombinan. Informasi ini sangat membantu terutama jika DNA rekombinan

tersebut akan diekspresikan menjadi protein melalui vektor ekspresi. Sekuens

nukleotida dari suatu fragmen DNA dapat ditentukan menggunakan prosedur

kimia yang dikembangkan oleh Alan Maxam dan Walter Gilbert atau

menggunakan prosedur enzimatik yang dikembangkan oleh Fred Sanger (Glick &

Pastemak, 2003). Kedua metode ini berbeda dalam teknik yang digunakan untuk

menyusun tangga oligonukleotida. Metode kimia menggunakan reaksi kimia

spesifik bagi tiap b a a untuk memotong DNA berlabel, sedangkan metode

enzimatik menggunakan DNA polimerase untuk mensintesis DNA berlabel yang

komplementer dengan DNA cetakan (Ausubel et al., 1999 dalam Hadi, 2004).

Metode Sanger mengalami modifikasi yang memiliki sensitivitas dan efektivitas

analisis yang lebih baik dari metode Sanger tanpa modifikasi. Metode yang sudah

dikembangkan ada yang menggunakan gel dan kapiler. Dalam pengerjaannya

metode kapiler lebih cepat dan sensitif jika dibandingkan dengan metode gel

(Hashimoto et al., 2003).

111. BAHAN DAN METODA

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Desember 2007 sampai Februari

2008 di Laboratorium Pengembangbiakan dan Genetika Ikan, Departemen

Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian

Bogor.

3.2 Prosedur Kerja

Tahapan kerja untuk mengisolasi promoter 8-actin adalah ekstraksi DNA

genom, amplifikasi DNA dengan PCR dan elektroforesis, isolasi DNA dari gel,

ligasi ke pGEM-TEasy, transformasi ke bakteri E. coli, seleksi koloni kandidat

pembawa plasmid, isolasi plasmid dari bakteri, sekuensing dan selanjutnya analisa

sekuens.

3.2.1 Ekstraksi DNA Genom

Jaringan yang digunakan untuk ekstraksi DNA adalah hati ikan nila. Hati

ditimbang dengan berat 20-25 mg dan dimasukkan ke dalam microfzibe 1,5 mL.

Setelah itu ditambahkan 400 p1 Cell Lysis Solution (Gentra, Minneapolis, USA)

dan 2 pL Proteinase K (20 mg/ml) menggunakan micropipette (Lampiran 2A),

divorteks (Lampiran 2B) dan diinkubasi menggunakan Dry Thernu, Unit

(Lampiran 2C) pada suhu 55°C selama 1 malam (overnight). Sampel dibiarkan

pada suhu ruang selama 10 menit setelah itu ditambahkan 2 & RNAse (4 mg/mL)

dan diaduk dengan hati-hati dengan cara membolik-baiik microtube. Inkubasi

pada suhu 37°C selama 60 menit dan disimpan dalam es (on ice) selama 5 menit.

Ditambahkan 200 pL Protein Precipitation Solzition (Gentra, Minneapolis, USA),

disentrifuse (Lampiran 2D) dengan kecepatan 12.000 rpm selama 15 menit.

Supematan dipindahkan ke dalam microtube 1,5 mL barn yang diisi dengan 300

pL Isopropanol, lalu diaduk sebanyak 50x dengan hati-hati. Disentrifuse dengan

kecepatan 12.000 Tin selama 10 menit. supernatant dibuang dan ditambahkan

300 pL Etanol 70% dingin. Disentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 10

menit, supernatan dibuang, pellet DNA dikeringudarakan sampai etanol benar-

benar kering. Setelah kering ditambahkan 50 pL ion exchange water dm DNA

disimpan dalam freezer (suhu -20°C) untuk digunakan pada proses selanjutnya.

DNA hasil ekstraksi dilihat kualitas d m kuantitasnya dengan melakukan

analisa kemurnian dan kandungan DNA dengan menggunakan spektrofotometer

GeneQuant (Lampiran 2E) dan elektroforesis. Absorbansi diukur pada panjang

gelombang 260 (12~1) nm. Kemurnian DNA diketahui dengan melihat ratio DNA

pada perbandingan absorbansi panjang gelombang 260 nm dengan panjang

gelombang 280 nm. Kandungan DNA ditentukan dari pengukuran pada 1 2 ~ ) .

Selanjutnya dilakukan elektroforesis pada gel agarose 0,7%.

3.2.2 Amplifikasi DNA dengan Polimerase Chain Reaction (PCR)

Amplifikasi DNA hasil ekstraksi dilakukan dengan menggunakan

Polimerase Chain Reaction (PCR) (Lampiran 2F). Primer untuk PCR didesain

berdasarkan database yang ada di Bank Gen. Primer forward F-BP adalah 5'-GT

GWGTGACGCYGGACCAATC-3'. Primer reverse adalah R-BPI (5'-TAGAAG

GTGTGRTGCCAGATCTTC-3') dan R-BP2 (5'-TTGCACATRCCRGAKCCGT

TGTC-3') dimana W = A + T; R = A + G; Y = C + T; K=G+T. PCR dilakukan

dua kali; PCR pertama menggunakan primer F-BP dengan R-BPI, PCR kedua

atau dikenal dengan istilah nested PCR dengan primer F-BP dan R-BP2. Reaksi

PCR yang digunakan, yaitu dengan volume 10 pL yang mengandung 1 pL LA

Buffer; 1 pL dNTPs mix; 1 pL MgCI2, 1 WL (1 pmol) masing-masing primer; 0,05

pL LA Taq polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan); 1 pL DNA genomik hasil

pengenceran lox dan sisanya adalah air steril hasil destilasi (SDW). Amplifikasi

PCR dilakukan dengan program: pre-denaturasi pada suhu 94OC selama 3 menit; 5

siklus pada suhu 94°C selama 30 detik dan 62OC selama 3 menit; 30 siklus pada

suhu 94OC selama 30 detik, 5S°C selama 30 detik dan 72'C selama 3 menit; serta

1 siklus pada suhu 72'C selama 3 menit. Pengecekan hasil amplifikasi PCR

dilakukan dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7%. Produk PCR

pertama diencerkan 10x sebeluin digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR

kedua dimana program PCR kedua sama dengan yang pertama.

3.2.3 Elektroforesis

Gel agarose 0,7% dibuat dimulai dengan melarutkan serbuk gel agarose

sebanyak 0,14 gram dalan 20 mL larutan tris boric EDTA (TBE) yang

mengandung etidium bromida (0,Ol g/mL). Kemudian dipanaskan dalam

microwave @ampiran 2G) sampai larutan menjadi berwama bening, larutan

tersebut didiamkan sampai hangat lalu dituangkan ke dalam cetakan yang sudah

terpasang sisir pembuat sumur (Lampiran 2H). Kemudian gel dibiarkan sampai

membeku. Setelah itu sisir dilepaskan dan padatan gel dimasukkan ke dala~n bak

elektroforesis (Lampiran 21) yang berisi buffer TBE.

Sample DNA sebanyak 1 pL dicampurkan dengan 1 pL loading buffer, lalu

dimasukkan ke dalam sumur yang terdapat dalam gel dengan menggunakan

micropipette. Setelah itu 3 pL marker DNA dimasukkan ke dalam sumur di dekat

sumur sample. Bak elektroforesis ditutup dan listrik dialirkan dengan tegangan

200 Volt dan kuat arus 70 mA. Lalu DNA akan bermigrasi dari kutub negative ke

positif. Setelah Bromophenol blue bermigrasi sampai tiga per empat bagian dari

panjang gel, aliran listrik dihentikan. Lalu gel diangkat dan dilepaskan dari

cetakannya. Kemudian keberadaan DNA dilihat dengan ultraviolet illuminator

jang sudah terhubun~ ke komputer (Lampiran 25).

3.2.4 Isolasi DNA dari Gel

Isolasi DNA dari gel ini menggunakan GeVPCR DNA Fragments

Extraction Kit (Geneaid Biotech, Bade city, Taiwan). Hasil PCR sebanyak 9 pL

dielektroforesis, kemudian gel dipotong pada bagian yang terdapat pita DNA

dengan panjang yang sesuai yaitu 1,3 kb lalu gel ditimbang dan dimasukkan ke

dalam nzicrotube 1,s mL. Selanjutnya ditambahkan DF buffer sebanyak 500 pL

dan di inkubasi pada suhu 55 "C selama 15-20 menit. Selama inkubasi, setiap 2-3

menit microtube dibolak-balik. Setelah gel hancur, larutan dipindahkan ke dalam

DF Colurnn dan disentrifuse dengan kecepatan 12.000 rpm selama 30 detik,

supernatan dibuang. Setelah itu ditambahkan 600 pL wash buffer yang sudah

ditambah Etanol 70%, disentrifuse 12.000 rpm selama 30 detik dan supernatan

dibuang. Disentrifuse lagi selama 3 menit untuk meyakinkan benar-benar bersih.

Setelah itu, DF Colurtzn dipindahkan ke microtube 1,5 mL, ditambahkan SDW

sebanyak 30 pL. ke pusat DF Column, disentrifuse 12.000 rpm selama 2 menit.

Supematan yang merupakan DNA, disimpan untuk digunakan pada proses

selanjutnya.

3.2.5 Ligasi ke Vektor pGEM-T Easy

Fragmen DNA hasil purifikasi dari gel diligasi dengan vektor kloning

pGEM-T Easy (Promega, WI, USA). Volume total reaksi yaitu 13 pL. terdiri dari

4 pL lamtan DNA; 1 pL pGEM-T Easy; 6,5 pL 5x buffer ligasi, dan 1 pL enzim

T4 DNA ligase (Takara Bio, Shiga, Japan). Inkubasi dilakukan selama 2 jam

pada suhu ruang, kemudian inkubasi dilanjutkan semalaman di refrigerator (suhu

sekitar 4'C).

3.2.6 Transformasi

Hasil reaksi ligasi digunakan dalam proses transformasi; suatu proses

memasukkan plasmid b e ~ p a vektor kloning yang mengandung fragmen DNA

insersi ke dalam bakteri E. coli DH5a. Transformasi ini dilakukan di laminar air

flow (Lampiran 2M). Sebanyak 6,5 pL hasil reaksi ligasi dicampur ke dalam

microtube berisi 100 pL sel kompeten. Transfonnasi dilakukan dengan cara

kejutan panas suhu 42'C selama 50 detik. Microlube disimpsn on-ice selama 2-3

menit, setelah itu ke dalam microtube ditambahkan larutan SOC (1,2 g

polypeptone, 0,3 g yeast extract, 0,035 g NaCI, 0,011 g KCI, 600 pL MgClz IM,

600 pL MgS04 IM, dan 60 pL glucose 2M dalam 60 mL SDW) sebanyak 900

L . Selanjutnya microtube berisi bakteri hasil transformasi diinkubasi di dalam

shaker (Lampiran 2K) pada suhu 37°C selama 1,5 jam. Kemudian 100 pL bakteri

disebar di atas cawan agarosa 2xYT (1,6% polypeptone, 1% yeast extract, 0,5%

NaCl dan 1,5% agarosa dalam SDW) yang mengandung IPTG, X-gal dan

ampisilin (disingkat menjadi 2xYT (I, X, A)). Inkubasi di dalam inkubator

(Lampiran 2L) pada suhu 37OC selama 14 jam.

3.2.7 Seleksi Koloni Bakteri dan Pembuatan "Master Plate"

Seleksi koloni bakteri yang membawa plasmid insersi dilakukan dengan

metode "cracking". Koloni bakteri benvarna putih yang tumbuh dalam cawan

agarosa diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke dasar microtube

volume 1,5 mL untuk "cracking", dan dilanjutkan dengan menggoreskan tusuk

gigi tersebut ke dalam cawan agarosa 2xYT-A,I,X untuk membuat "master plate".

"Master plate" mempakan cawan agarosa yang mengandung setiap koloni bakteri

yang dianalisa dengan cracking, yang mempakan sumber koloni bakteri untuk

tahap penelitian berikutnya. Master plate diinkubasi pada suhu 37OC sekitar 8

jam. Ke dalam tabung mikro yang berisi bakteri ditambahkan 10 pL buffer

cracking (0,2 g saccharosa, 40 pL NaOH 5M, 50 pL SDS 10% dan sisanya SDW

sehingga volume lamtan menjadi 1 mL), 10 pL lamtan EDTA lOmM dan sekitar

2 pL 6x buffer loading DNA berisi KC1 4 M dengan perbandingan volume 1:l.

Setelah diinkubasi sekitar 5 menit, dilakukan sentrifuse pada kecepatan 13.000

rpm selama 15 menit. Sebanyak 10 pL supematan yang terbentuk digunakan

untuk elektroforesis menggunakan gel agarosa 0,7%. Untuk mengetahui koloni

bakteri yang membawa DNA insersi dalam plasmid digunakan koloni bakteri bim

sebagai kontrol.

Koloni putih dari masing-masing bakteri yang membawa plasmid dengan

insersi diambil menggunakan tusuk gigi steril dan dioleskan ke microtube 1,5 mL

dan dilanjutkan dengan pembuatan master plate agarosa 2xYT (I, X, dan A).

Master plate diinkubasi pada suhu 37OC sekitar 8 jam. Ke dalam microtztbe berisi

bakteri ditambahkan 10 pL buffer cracking (0,2 g saccharosa, 40 pL NaOH 5 M,

50 pL SDS 10% dan sisanya SDW hingga lamtan menjadi 1 mL), 10 pL larutan

EDTA 1 M dan sekitar 2 pL 6x buffer loading berisi KC1 1 M dengan

perbandingan volume 1:l pada tutup bagian dalam microtube. Setelah diinkubasi

sekitar 5 menit dilakukan spin down, vortex dan sentrifuse pada kecepatan 13.000

rpm selama 5 menit. Sebanyak 10 pL supernatan yang terbentuk dielekhoforesis

dengan gel agarosa 0,7%.

3.2.8 Isolasi plasmid \ )

Koloni bakteri yang membawa DNA insersi diambil dari "master plate"

menggunakan tusuk gigi steril dan disentuhkan ke media cair 2xYT yang

mengandung ampisiiin dalam tabung kultur berbentuk "L" untuk diperbanyak.

Inkubasi bakteri menggunakan shaker dilakukan pada suhu 37'C selama sekitar

18 jam.

Isolasi plasmid dilakukan menggunakan kit FlexiPrep (Arnersham

Biosciences, NJ, USA) dengan prosedur sesuai manual. Bakteri dari setiap tabung

kultur dituang ke dalam microtube 1,5 mL. Bakteri diendapkan dengan cara

sentrifuse pada kecepatan 13.000 rpm sekitar 30 detik, supernatan dibuang dan ini

dilakukan sampai bakteri di media kultur habis. Ke dalam microtube berisi pelet

bakteri ditambahkan larutan I sebanyak 200 pL, dilanjutkan dengan vorteks

hingga semua pelet bakteri lepas dari dasar tabung. Kemudian ditambahkan

larutan 11 sebanyak 200 pL, microlube dibolak-balik sekitar 10 kali hingga

terbentuk seperti benang pada saat membuka tutup microtzibe. Setelah itu

ditambahkan larutan 111 sebanyak 200 pL. Microtube dibolak-balik hingga

terbentuk gumpalan-gumpalan putih, dilanjutkan dengan sentrifuse pada

kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit pada suhu ruang. Supernatan dipindahkan

ke microtube yang barn, disentrifuse sekali lagi pada kecepatan dan lama waktu

yang sama dengan sebelumnya. Supernatan dipindahkan ke microtube berisi

isopropanol 420 pL. Divorteks seiama sekitar 1 menit, dan dilanjutkan dengan

inkubasi pada suhu ruang selama 10 menit. Kemudian dilakukan sentrifuse pada

kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Setelah isopropanol dibuang dengan

bantuan aspirator, ke dalam tabung mikro berisi pelet DNA ditambahkan

Sephaglas sebanyak 150 pL, divorteks selama 1 menit dan dilanjutkan dengan

sentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Supernatan dibuang dan ke dalam

microtube ditambahkan larutan wash buffer sebanyak 200 pL, divorteks selama 1

menit dan kemudian disentrifuse 13.000 rpm selama 30 detik. Larutan wash

buffer dibuang dan diganti dengan etanol70% dingin sebanyak 300 pL, divorteks

selama 1 menit dan kemudian disentrifus 13.000 rpm selama 30 detik. Setelah

selnua etanol dibuang, microtube dibiarkan kering udara selama sekitar 30 menit.

Plasmid DNA dilarutkan menggunakan SDW sebanyak 30-50 pL, divorteks dan

microtube berisi plasmid dibiarkan selama 5 menit di suhu ruang. Sentrifuse

dilakukan pada suhu ruang dengan kecepatan 13.000 rpm selama 1-2 menit.

Supernatan yang berisi plasmid DNA dipindahkan ke microtube yang baru.

Sebanyak 1 pL hasil isolasi digunakan untuk elektroforesis. Konsentrasi DNA

diukur menggunakan mesin DNA/RNA Gene Quant.

3.2.9 Sekuensing dan Analisis Sekuen

Plasmid yang telah diisolasi dikirim ke Department of Marine Biosciences,

Tokyo University of Marine Science and Technology, Tokyo, Jepang untuk

disekuensing. Sekuensing dilakukan menggunakan mesin ABI PRISM 3100-

Avant Genetic Analyzer (Lampiran 2N).

Urutan nukleotida yang diperoleh dari hasil sekuensing dianalisis dengan

menggunakan software GENETYX versi 7 untuk menganalisa kemiripan

nukleotida dengan ikan lain. Selanjutnya software TFBind digunakan untuk

menganalisa faktor-faktor transkripsi promoter p-actin yang dimiliki oleh ikan

nila.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil

4.1.1 Ekstraksi DNA Genom

Ekstraksi DNA genom dari hati ikan nila telah berhasil dilakukan dengan

kuantifikasi berdasarkan spehofotometer (Tabel 1) dan pengecekan kualitas

berdasarkan elektroforesis pada gel agarose 0,7% (Gambar 4).

Tabel 1. Kuantifikasi DNA genom ikan nila (Oreochrornis niloticus) hasil

ekstraksi

* DNA

Gambar 4. Elektroforesis hasil ekstraksi DNA ikan nila. M adalah marker DNA 2- Log Loadder (BioLabs Inc., New England). NI adalah sampel DNA ikan nila 1 dan N2 adalah sampel DNA ikan nila 2.

Berdasarkan Tabel 1 di alas didapatkan konsentrasi DNA dengan msio

1,664 dan 1,805. Hasil ini menunjukan bahwa sampel N2 lebih baik dibandingkan

sampel N1. Hasil yang serupa juga ditunjukan pada elektroforesis yaitu terdapat

sinear di bawah pita DNA N1. Namun demikian, kualitas DNA tersebut masih

layak digunakan untuk proses amplifikasi PCR.

4.1.2 Amplifikasi DNA Kandidat Promoter dan Isolasi DNA dari Gel

Hasil ekstraksi selanjutnya diamplifikasi dengan PCR dan produk PCR

dielektroforesis menggunakan gel agarose 0,7% (Gambar 5). Fragmen DNA yang

terlihat memiliki panjang sekitar 1,3 kb dan diduga sebagai sekuen promoter p- actin. Fragmen tersebut dipurifikasi menggunakan kit dan selanjutnya

dielektroforesis kembali (Gambar 5).

M 1 2

Gambar 5. Elektroforesis DNA hasil PCR kedua untuk purifikasi DNA (1) dan hasil purifikasinya dari gel agarosa (2). M adalah marker DNA 2-Log Loadder (BioLabs Inc., New England). Angka di sebelah kiri gambar adalah ukuran fragrnen marker DNA. Tanda kepala panah (4) di sebelah kanan gambar menunjukkan DNA target dari hasil PCR dan purifikasinya.

4.1.3 Transformasi dan Seleksi Koloni Bakteri

Hasil transformasi terlihat dengan adanya koloni bakteri benvama putih

dan biru (Gambar 6) pada media kultur yang mengaudung antibiotik. Selanjutnya

untuk memhuktikan kebenaran koloni putih membawa insersi plasmid kandidat

promoter dilakukan cracking dengan pengecekan pada gel agarosa 0,7% (Gambar

6). Ukuran pita DNA plasmid koloni putih yang membawa insersi lebih besar

dibandingkan dengan koloni biru yang digunakan sebagai kontrol (Gambar 7).

Koloni Putih Koloni Biru

Gambar 6. Koloni bakteri transforman; Koloni Biru, Koloni yang tidak membawa insersi; Koloni Putih, Koloni yang membawa insersi; Lingkaran Merah, Koloni yang diambil untuk "cracking" dan dikultur untuk diisolasi plasmidnya

Gambar 7. Elektroforesis hasil cracking bakteri koloni b e m a biru (K) dan yang putih (no. 1-10). Tanda kepala panah (4 ) di sebelah kanan gambar menunjuMtan ukuran plasmid DNA dari bakteri biru, sedangkan tanda minus (-) untuk bakteri dengan plasmid yang mengandung DNA insersi.

Berdasarkan elektroforesis hasil cracking, dapat dilihat ada perbedaan

dam11 DNA antara koloni biru dan koloni putih. Posisi koloni biru sekitar 3 kb

sedangkan koloni putih berada di atas koloni biru sekitar 1,3 kb sehingga panjang

total koloni sekitar 4.3 kb.

4.1.4 Isolasi Plasmid

Koloni putih (no. 4, 5, 7, dan 10 pada "master plate") diambil

menggunakan tusuk gigi steril untuk dikultur di media cair, kemudian plasmidnya

diisolasi dan selanjutnya dilakukan pengukuran konsentrasi DNA. Konsentrasi

DNA dapat dilihat pada Tabel 2.

Tabel 2. Konsentrasi DNA plasmid yang mengandung hgrnen kandidat sekuen

promoter p-actin nila Oreochromis niloticus

Seperti yang telah disebutkan sebelumnya, rasio yang mendekati 1,8

tergolong bersih yang bebas dari kontaminan dan kurang dari 1,8 berarti ada

indikator kontaminasi. Untuk itu, plasmid yang dijadikan cetakan untuk

sekuensing dipilih no 4 dan no 7, karena dilihat dari rasionya kedua plasmid ini

mendekati angka 1,s.

4.1.5 Sekuensing dan Analisa Sekuen Promoter p-aciin

Plasmid (no. 4) yang telah diisolasi selanjutnya disekuensing sehingga

didapatkan sekuens seperti pada Gambar 8 dan Lampiran 3. Sekuensing

dilahkan dari arah forward dan reverse menggunakan primer "T7-BS" (5'-TTG

TAATACGACTCACTATAGGGCGAA-3') atau DyeT-R (5'-GGAATTGTGA

GCGGATAACA-3') (Alimuddin et al., 2007).

5 ' - GTG AGT GAC GCC GGA CCA ATC AGG AGG CGC AAT TCC GAA AGT TTA CCT TTT ATG GCT AGA GCC AGG CAA CCG GCT GAG TAT AAA AAA CAA GCG CCC ACA GCT AAC GGA TTC ACT CTG AGC GCC GTC ACA CTC ACA GCT TGT GCG GGA TAT CAT TTG CCT G M ACC GTT TCC CTT A M GCG AkA AGC CCC CCA CCC AAA GGT AAG GAG ACG GAG AAA TCC TTA TTT ATA GAT TCT TAT TTT AGG ATG m AT MG TAA A- ACG AGC TGA TTT GTT TAT TTT ATG TAA ACA TGG ATG AAT TTA TTC ACT TTA ATG CAA ACT GTC GTC GGG GAC CAC GCG GTT CTT TGT CTT CGC AAG AAT TGT ATT GAT TGT TAA ACA GCA GTA TCT GTA TCT TGT GCT TGG CTT TTT TAA AAC GAG GAA CGG TTA TGA CTG CAG ACA AGT TCA TTA GCG CTG CTG CTG CGA TTC ACA GGT GCT rn GGA TGG AGC CGG CTT CTA GTA AAT GGC GTC CTA TGA m AAT GGT TGC GCT AAA ACC m GTT TGT CAC CGT GTA GTC GTG CAC m m TTT TGT TTT m TTT TTT GTA GGA TTG TGG TGA CAC TTG GGA m GAT ccc AGG CAG GAT ACT TTG AAG CGG GTT TCC GAG TTG AGG CTG TCT GGA TCC CGG CTG CTC CCT TTG TGC FCC CGA TGC GGC GGG GTG TGA CCT ACT TTA GCA TAT TAG CCT AGC CAC ATC ATG CTA GCA CGC CCT TTT AGA rn GCA GCA GTT GCA GTT TTA AGT CTC TCT CGG TTT ATC CTG GAT ACT CCC ACA CAC GGC m TAA AGG ATG AAT TAC TTT TO r r ~ TAT TTT AAC m AAT CTG GGG GTC AGG m ATA AGG CCT TGC AGT TAA AAA GGA TAG AAA GGG ACT AGG CTT TTT TCT TTT TCC TTA AAG GTG GAT AAA CTG GAT TTA ATA GGC TTC AAG GTG GAA TGG AAT GGT TCC TGG ATC CTG GTT CAG GTC TTT TTC m ATA TGG TGG ACC 8 4 ~ GGA AAT TGA axi AAA TTG GGC AAT CAT CCG TCC TGG ATT CGG TCC CAC TCT CGG AGA AAG GGC GGT GGC TTT TCA GGA AAT GGA T I C ACC TAG TTC AGG CCC CTT GGG GGA CCG TTC ATG GAG TTC GGC ATA GGT TCA ATT ATG GCC AAC TTC CTT TCT CAA TAA AAC CTA GCT TTC CAT AAT TTA GGT AAT ccc GCA GAG AAC m CAT - 3 '

Gambar 8. Sekuens promoter /3-actin ikan nila hasil sekuensing dari arah fonvard. Warna biru merupakan elemen penting promoter yaitu CCAAT, CArG (CC(A/T)6GG), d m boks TATA. CCAAT yang terletak pada nt. 16 - 20 dihitung dari ujung terminal 5, CC(A/T)6GG pada nt. 46 - 55 dihitung dari ujung terminal 5 d m boks TATA. Warna merah merupakan daerah ekson 1.

Dilihat dari arah fonvard, sekuen promoter 8-actin memiliki elemen

penting promoter yaitu CCAAT, CAffi (CC(A/T)6GG), dan boks TATA. CCAAT

yang terletak pada nt. 16 - 20 dihitung dari ujung terminal 5, CC(A/T)&G pada

nt. 46 - 55 dihitung dari ujung terminal 5 dan boks TATA. Pada sekuen ini juga

terdapat ekson 1 (huruf merah). Dari arah reverse (Gambar 9), terdapat motif

CArG pada nt. 225 - 234 dihitung dari ujung terminal 3. Pada sekuen ini terdapat

juga intron 1 dan ekson 2 dimana pada ekson 2 terdapat kodoli awal (ATG,

digarisbawahi)

5 ' - C A A C ~ C A G G ~ G G C ~ T A G M T A A G G A A G C ~ A C T T T T C T A 45 ATT AAA A M TGG GCG TCC TAA TGA AGT TAA TGG GTG GCG CCT AAA ACC 93 GGG GTT TTT TGT w CCG GGG TTA TGT TCC GTG CAC AGT TTT TTT m 1 4 1 AGT TTT TTT TTT TTT TTG TAA GGA ATT TGT GGG TGA CCk CCT TGG GAT 189 TTG ,w ccc MG GCA GGA TM, CTT GGA AGC GGG TTT CCG AGT TGA AGC 237 TGT TCT GGA TCC CGA CTG CTC CCT T T T GTG CGC CCC GAT TGC GGA CGG 285 GGT GTG ACC CTA CTT T P A GCA T A A T T A K C CTA GGC CAC ATT CAA L 9 C 333 TA& GCA CGC CCT TTA Gi\7 TTG CAG CAG TTG CAG T T T TAA AGT CTC T O 381 CGT TTP, TCC TGG ATA CTC CCA CAC kCG CTT T T A A h \ G / i i GI'A T T A CTT 429 TCT T T T AT? TCU: CCT AAT CTG GTG TCA GTT T A T i iAA GGC TTG CAG T M 477 M b , 1.GA TAG M G GAC TAG CTT T T C T T T T C : T W AGG TGA TA.4 ACT GAT 525 TI+. TAG CTC AAG TGA ATG i i i i T GTC CTG ATC TGT TTI\ GTC TTT TCT TAT 573 ATG TGA c/iji AGA AAT GAG GAA ATT GCA PAT c.4 TCG CCT GAT crjr CCA 621 CTC CGA GAR ~ n s GCG TGG CTT TCA GGA mi GGR TCA CCA GTC ARG CGC 669 TTG TG4 C m TTC ATG AGT CGG CAT AAG TTC ATT kTG fAi: O T CCC l T C 717 TG4 T W ACT AGC T T C AAT b.TT AAG TAA TCG CAG ACT TCA TCT T T T TTA 765 AZIC GTC TCG TCG TGT GCA ATG PAT GAG TGT GCT GCT GCA TGA CGC AGT 8 1 3 GAT ATT CGC TCA AAG GAC TTG GAA GGT TCA TAA hAG CGA GCG TGA TTA 861 AGC AAC AGT GGG /&GG GCG CTG GTT G I G ACG ATA GTA iWi\ CGA AGG GAG 909 TGG TCT GTC GGC TAG TCT GTA ATG TGG A i 7 GTT CCT T T i TTT TCT CGC 957 CGT GCG TTG CCG CTC TGG CGT CGC GCC ACG CGC CGG TAG C t G CAA rSCiC 1 0 0 5 TGC TCA a m CCG PAC CAT GTC c r r ATA TGG TM TM CAG AAC GCA GCG 1 0 5 3 CCA CTT CCT TTT GTC TGG CTT ACT CGG AAT G I G CGG CAC GAG CTC CTC 1101 CTi; GCG GCC GAG CTC GTG hciC T T C CGC TAG T T A ACIX GGA AGT AGA K C 1149 GGA ATG GCC GCA GGC TTG AGT GCT *AT CTT T T T T T T CTT TAT CTT TAA 33.97 CAG T T C &GC G e G A .AGA TGA AAT CEC CGC ACT GGT TGT T G i i W. CGG 1245 C T C CGG CAT GTTG CA - 3' 1259

Gambar 9. Sekuens promoter 8-actin ikan nila hasil sekuensing dari arah reverse. Warna bii merupakan elemen penting promoter yaitu CArG (CC(AI'T)~GG) pada nt. 225 - 234 dihitung dari ujung terminal 3. Yang digarisbawahi merupakan kodon awal (ATG), warna orange merupakan daerah intron 1 d m warna hijau merupakan daerah ekson -

Selanjutnya dilakukan analisa sekuens dengan rnenggunakan software

GENETYX untuk mengetahui elemen penting yang konserf (consewed) untuk

promoter a-actin dari ikan. Alignment sekuens parsial promoter p-actin ikan nila

dengan ikan mas (no. Aksesi Bank Gen: M24113), ikan medaka (no. Aksesi Bank

Gen: S74868), ikan megalobrama (no. Aksesi Bank Gen: AY170122) dan ikan

mylopharyngodon (no. Aksesi Bank Gen: AY289135) ditunjukkan pada gambar

di bawah ini.

- Primer fomard - r Motif CArG 7 Mas ! 5n Meoaka 1 . -

0 _. Megalobrama 1 60 Myophabngooon ! c F-ni6 1 i!

Mas 6 1 !I-

Medaka i 1 12') Mega!obrama 6 1 !li

Mfophalyngooon 6: 11: F-nla 6: !::

Uas 176 . . " A !

Medana 178 , : .

Vega oorama 17-1 .. .,; .

Myopnaryngodon 177 .. 3,i . F-n a 131 ? 1?

Gambar 10. Alignment sekuens parsial promoter p-actin ikan nila (hasil sekuensing dari arah forward, F-nila), ikan mas (no. Aksesi Bank Gen: M24113), ikan medaka (no. Aksesi Bank Gen: S74868), iltan megalobrama (no. Aksesi Bank Gen: AY170122) dan ikan mylopharyngodon (no. Aksesi Bank Gen: AY289135). Posisi primer foiward, motif CArG pertama, dan boks TATA ditunjukkan di atas sekuens. Posisi motif CCAAT yang ada alam sekuens primer F, CArG pertama dan boks TATA untuk ikan nila sarna dengan ikan laiiulya dilihat dari ujung terminal 5 (dilihat dari sebelah kiri).

Mega ogrzm3 7se

R-nila 901 Mas 687 -----------------------------*----*---

Medaka 8 65 Megalobrama 658 Myopharyngodon 849

R-nila 9 6 1 GBE]TTC. 0 . T T C ~ T ~ G ~ G 3 . 0 G T ------------------- -- -- .AG i4

,.,b"".\" . .. ,

Megalobrama 97s 1039 Myopharyngodon so 1026

R-nila 1140 Mas 1031 Medata 067 ------------.-.-.----------------------- 967

Megalobrama 1152 Myopharyngodon r 192

Gambar 11. Alignment sekueils parsial promoter /?-actin ikan nila (hasil sekuensing dari arah reverse, R-nila), ikan mas (no. Aksesi Bank Gen: M24113), ikan medaka (no. Aksesi Bank Gen: S74868), ikan megalobrama (no. Aksesi Bank Gen: AY170122) dan ikan nzylopharyngodon (no. Aksesi Bank Gen: AY289135). Motif CArG (CC(A/T)&G), kodon awal (ATG) dan posisi primer reverse ditunjukkan di atas sekuens. Posisi motif CArG kedua untuk ikan nila sedikit berbeda dengan ikan lainnya bila dilihat dari ujung terminal 3 (dari sebelah kanan).

Selanjutnya dengan software GENETIX juga dilakukan analisis kemiripan asam amino gen 8-actin ikan nila dengan ikan lainnya, yaitu ikan mas dan ikan medaka. Kemiripan asam amino ditunjukan pada Gambar 12

~n R-ni la 1:MEDEIAALWDNGSGMC 17 An beta a c t i n mas 1:MDDEIAALWDNGSGMC 17 AA beta act in medaka 1:MDDDIAALWDNGsGMC 17 *~*~*************

Gambar 12. Perbandingan asam amino dari gen p-actin ikan nila, ikan mas dan ikan medaka.* = asam amino yang sama, .= asam amino yang berbeda.

4.2 Pembahasan

Fragment promoter p-actin dari ikan nila telah berhasil diekstraksi dan di

isolasi dengan menggunakan metode degenerate PCR dimana primer yang

digunakan merupakan primer mix. Primer mix ini didapatkan dari mengumtkan

nukleutida yang konserf pada berbagai spesies ikan pada database yang ada di

Bank Gen. Fragment yang berhasil diamplifikasi sekitar 1,3 kb.

Fragmen DNA hasil purifikasi selanjutnya diligasi dengan vektor kloning

pGEM-T Easy, ditransformasi dan bakteri disebar ke dalam media kultur di cawan

Petri. Untuk menyeleksi hasil transformasi digunakan ampisilin, karena vektor

kloning memiliki gen resisten terhadap antibiotik tersebut. Seleksi juga dilakukan

dengan penambahan IPTG dan X-gal pada media agarosa. Keberhasilan

transformasi ditunjukkan dengan adanya koloni putih pada media seleksi. Koloni

putih adalah transforman yang mengandung sisipan fiagmen DNA kandidat

promoter, sedangkan koloni bim adaiah non-transforman. Bakteri yang dapat

hidup pada media seleksi yang mengandung ampisilin adalah bakteri E. coli

DH5a yang mengandung vektor kloning pGEM-T Easy rekombinan. Bakteri ini

tidak mampu menghasilkan 8-galaktosidase karena adanya sisipan fragmen DNA

kandidat promoter pada gen lacZ sehingga X-gal tidak dapat dipotong dan koloni

tetap benvarna putih. Sedangkan koloni yang mengandung pGEM-T Easy non-

rekombinan tidak mengalami penyisipan fragmen DNA kandidat promoter pada

gen lacZ sehingga mampu menghasilkan 8-galakiosidase yang mengubah

molekul X-gal dari tidak benvarna menjadi molekul benvarna biru pada koloni.

Koloni putih yang diduga memhawa insersi DNA dikonfirmasi dengan

"cracking". Untuk mengetahui koloni bakteri yang membawa DNA insersi dalam

plasmid digunakan koloni bakteri biru sebagai kontrol. Hasil elektroforesis

menunjukkan bahwa ukuran plasmid dari bakteri benvama putih lebih besar

dibandingkan dengan kontrol bakteri benvama biru. Hal ini menunjukkan bahwa

bakteri benvarna putih membawa plasmid yang mengandung DNA insersi.

Karena sekuens DNA hasil isolasi relatif panjang, meskipun kemampuan

mesin sekuensing bisa membaca sekuens sampai sekitar 1,2 kb, tidak semua

sekuens nukleotida (nt.) hasil sekuensing pada ujung terminal 3 pada Gambar 7

dan ujung terminal 5 pada Gambar 8 adalah tepat. Sekuens yang diperlihatkan

dalam penelitian ini adalah hasil pembacaan dari masing-masing primer. Untuk

memperoleh semua sekuens promoter p-actin ikan nila dengan tepat, perlu

dilakukan sub-kloning dengan minimal 2 sub-klon yang panjangnya masing-

masing sekitar 400-700 bp.

Berdasarkan hasil sekuensing, didapatkan hasil dari arah fonvard atau dari

kiri dan dari arah reverse atau dari kanan dengan panjang sekuen masing-masing

1234 bp dan 1259 bp. Setelah dilakukan analisa dengan sofiware GENETYX dan

TFBind diketahui bahwa sekuens DNA hasil isolasi memiliki semua elemen

penting yang konserf (conserved) untuk promoter 8-actin dari ikan. Dengan

demikian diduga hasil kloning mempakan sekuens promoter p-actin ikan nila.

Elemen penting bagi promoter $-.zc?in adalah CCAAT yang terletak pada nt. 16 -

20 dihitung dari ujung terminal 5, CC(A/T)6GG atau disebut motif CArG pada nt.

46 - 55 dihitung dari ujung terminal 5 dan nt. 225 - 234 dihitung dari ujung

terminal 3, don boks TATA pada nt. 79 - 83. Selain itu, dari hasil alignment

diketahui bahwa posisi dari elemen-elemen penting tersebut adalah konserfseperti

dengan sekuensnya. Hal ini memperkuat dugaan bahwa hasil kloning merupakan

promoter p-actin ikan nila.

Berdasarkan kemiripan asam amino gen 8-actin ikan nila dengan ikan

lainnya yaitu ikan mas dan ikan medaka didapatkan persentase kemiripan dari

masing-masing ikan. Persentase holnologi gen p-actin ikan nila hasil isolasi

dengan ikan medaka sebesar 94,11% dan dengan ikan mas sebesar 88,24 %,

sehingga dapat disimpulkan bahwa gen yang diisolasi merupakan gen p-actin.

Sekuen DNA yang diisolasi memiliki 2 ekson dan 1 intron. Ekson adalah

bagian utas DNA yang ditranskripsi menjadi messenger RNA (mRNA) dan

ditranslasi menjadi protein (Griffiths et al., 1999). Ekson 1 merupakan sekuen

yang tidak mengkodekan asam amino atau disebut unfranslated region. Ekson 2

merupakan sekuen yang mengkodekan asam amino. Ekson I terdapat pada nt. 108

- 199 pada sekuen dari arah forward. Ekson 2 dimulai dari nt. 1205 pada sekuen

dari arah reverse. Pada Ekson 2 terdapat sekuen awal dimulai transkripsi yaitu

ATG yaitu pada nt. 1209. Intron merupakan bagian utas DNA yang tidak

ditranskripsi menjadi mRNA karena dipotong dan dikeluarkan dari utas DNA

sebelurn proses transkripsi berlangsung (Page & Holmes, 1998). Intron 1 terdapat

pada nt. 159 - 1204 diantara ekson 1 dan ekson 2 pada sekuen dari arah reverse

yang diawali dengan nukleotida G T dan diakhiri nukleotida AG. Nukleotida

GTIAG adalah nukleotida yang selalu dikenali oleh protein spliceosorne.

Spliceosolne adalah suatu protein yang memotong intron (Griffiths el al., 1999).

Pada intron I juga terdapat motif CArG yang berfungsi sebagsi enhancer

(pemicu).

Sekuen promoter b-actin ikan nila telah diperoleh. Tahap yang dapat

dilakukan selanjutnya adalah pembuatan konstruksi gen untuk pengujian aktivitas

promoter b-acfin nila. Gen yang dapat digunakan untuk tujuan tersebut adalah gen

GFP, Luc, atau LacZ. Selain itu, untuk tujuan perbaikan fenotip ikan nila, gen

yang dapat digunakan adalah seperti gen untuk meningkatkan laju pertumbuhan

(Devlin et al., 1995), gen untuk meningkatkan daya tahan ikan terhadap penyakit

(Dunham, 2004) dan lain-lain.

V. KESIMPULAN

Promoter p-actin ikan nila telah berhasil diisolasi dengan panjang 1234 bp

dari arah forward dan 1259 bp dari arah reverse. Pada sekuens yang diisolasi

terdapat faktor transkripsi yang biasa ditemukan pada promoterp-actin, yaitu boks

TATA, motif CCAAT dan motif CArG (CC(A1T)aGG).

DAFTAR PUSTAKA

Alam MS, Lavender FL, Iyengar A, Rahrnan MA, Ayad HH, Lathe R, Moriey SD, and Maclean N. 1996. Comparison of the activity of carp and rat P- actin gene regulatory sequences in tilapia and rainbow trout embryos. Mol. Reprod. Dev, 45 : 117-122.

Alimuddin. 2003. Introduction and Expression of foreign A6 desaturase-Like Gene in a teleostean fish. Thesis. Graduate School of Fisheries Science. Tokyo University of Fisheries.

Alimuddin, Yoshiiaki G, Kiron V, Satoh S and Takeuchi T. 2005. Enhancement of EPA and DHA biosynthesis by over-expression of masu salmon A6- desaturase-like gene in zebrafish. Transgenic Research, 14 : 159 - 165.

Alimuddin, Nugrahani W, Aliah RS, Sumantadinata K, Faizal I, Carman 0, dan Yoshizaki G. 2007. lsolasi dan karakterisasi promoter p-actin dari ikan kerapu bebek Cromileptis altivelis. Jurnal Riset Akuakultur, 2(2) : 199 - 209.

Asikin Y. 2003. Isolasi DNA dari lingkungan dan studi transformasi. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian. Institut Pertanian Bogor.

Ath-thar MHF. 2007. Efektivitas promoter p-actin ikan medaka Oiyzias latipes dengan penanda gen hrGFP (Humanized Renilla reniformis Green Fluorescent protein) pada ikan lele Clarias sp. Ketumnan FO. Skripsi. Departemen Budidaya Perairai. Fakultas Perikanan dan Ihnu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Brown TA. 1995. Gene cloning and introduction. London: Chapman & Hall.

Darmawan N. 2004. Isolasi, kloning dan sekuensing gen putatif enzim PQQ glukosa dehidrogenase dari Agrobacteritirn tunzefaciens. Skripsi. Departemen Kimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor.

Devlin RH., Yesaki TY., Donaldson EM, Du SJ and Hew CL. 1995. Production of germline transgenic Pacific salmonids with dramatically increased growth performance. Canadian Journal of Fisheries Aquatic Sciences, 52 : 1376 - 1384.

Dunham RA. 2004. Aquaculture and fisheries biotechnology : genetic approaches. CAB1 Publishing. Cambridge, MA, USA.

Ekasari J. 1999. Isolasi DNA mitokondria (mtDNA) ikan patin Pangasius hypophthaln~us. Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Erlich HA. 1989. PCR technology principles and application for DNA amplification. New York: M Stockton Press.

Glick BR & Pasternak JJ. 2003. Molecular biotechnology: principles and application of recombinant DNA. Thud Edition. A S ~ P ~ ~ S S , washington DC.

Griffiths AFJ, Gelbert WM, Miller JH, and Lewontin RC. 1999. Modem genetic analysis. New York: WH Freeman & company.

Hacket PB. 1993. The molecular biology of transgenic fish. In : Hocachka and mommesen (Eds.). Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, 2:218 - 221.

Hadi SN. 2004. Kloning dan ekspresi daerah determinan "a" gen s virus hepatitis B pada khamir Saccharomyces cerevisiae YRDI5. Skripsi. Departemen Kimia. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor.

Hamada K, Tamaki K, Sasado T, Watai Y, Kani S, Wakamtsu Y, Ozato K, Kinoshita M, Kohno R, Takagi S and Kimura M. 1998. Usefulness of the medaka p-actin promoter investigated using a mutant GFP reporter gene in transgenic medaka Oryzias latipes. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 7 : 173 - 180.

Hashimoto M. 2003. Integration of PCR and cycle sequencing in capillaries: froin human genomic DNA. http://u~~~?~.oxfordjoumaIs.com. Rabu, 23 Januari 2008.

Higashijima S, Okamoto H, Ueno N, Hotta Y and Eguchi G. 1997. High- frequency generation of transgenic zebrafish which reliably express GFP in whole muscles or the whole body by using promoter of zebrafish origin. Developmental Biology, 192 : 289 - 299.

Karp G. 1984. Cell Biology. Thud Edition. Mc Graw Hill, Inc. USA.

Kato K, Takagi M, Tamaru Y, Akiyama S-I, Konishi T, Murata 0 and Kumai H. 2007. Construction of an expression vector containing a p-actin promoter region for gene transfer by microinjection in red sea bream Pagrus major. Fisheries Science, 73: 440-445.

Kobayashi S, Alimuddin, Morita T, Miwa M, Lu J, Endo M, Takeuchi T and Yoshizaki G. 2007. Transgenic nile tilapia Oreochromis niloticus over- expressing growth hormone show reduced ammonia excretion. Aquaculture, 270: 427-435.

Koelle M. 1996. Degenerate PCR. httD://www.dartmouth.edu. Kamis, 9 September 2007.

Liu Z, Moav B, Faras AJ, Guise KS, Kapuscinski AR and Hacket PB. 1990. Functional analysis of elements affecting expression of the p-actin gene of carp. Molecular Cell Biology, 10:3432-3440.

Maclean N & R.J. Laight. 2000. Transgenic fish: an evalution of benefits and risks. Fish fish, 1 : 146 - 172.

Noh JK, Cho KN, Han EH, Kim A, Lee JS, Kim DS, and Kim CG. 2003. Genomic cloning of mud loach Misgirrnus mizolepis (Cypriniformes, Cobitidae) beta-actin gene and usefulness of its promoter region for fish transgenesis. Marine Biotechnology, 5 (3): 244-252.

Old RW & Primrose SB. 1994. Principles of genetic manipulation. Fifth Edition. Oxford: Blackwell Scientific.

Page RDM, Holmes EC. 1998. Molecular evolution a phylogenetic approach. New York: Blackwell Sci, Inc.

Punvanti LI. 2007. Uji efektivitas promoter p-actin ikan medaka Oryzias latipes dengan penanda gen hffiFP (Humanized Renilla reniformis Green Fluorescent protein). Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Quitschke WW, Lin 2-Y, DePoti-Zilli L and Paterson BM. 1989. The p-actin promoter. Journal of Biology and Chemistry, 264: 9539-9546.

Saanin H. 1984. Taksonomi dan kunci identifikasi ikan. Bina Cipta, Bandung. 256 hal.

Saputra A. 2007. Pertumbuhan benih ikan nila hasil Sex Reversal, benih Genetically Male Tilapia dan benih ikan nila YY. Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Saunders GC & Parkers HC. 1999. Analytical molecular biology: quality and validation. Laboratory of the Government Chemistry. Teddinton. UK.

Takagi S, Sasado G, Tamiya G, Ozato K, Wakamatsu Y, Takeshita A and Kimura M. 1994. An efficient expression vector for transgenic ~nedaka construction. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3: 192-199.

Wahyudi TH. 2001. Pengaruh suhu annealing dan jumlah siklus berbeda pada program PCR terhadap keberhasilan isolasi dan amplifikasi mtDNA ikan patin Pangasius hypophthal~nus. Skripsi. Departemen Budidaya Perairan. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor.

Voet D 62 Voet JG. 1994. Biochemistry. Second Edition. New York: Jhon Willey & Sons.

Volckaert FA, Hellemans BA, Galbusera P and Ollevier F. 1994. Replication, expression and fate of foreign dna during embryonic and larval development of the African catfish Clarias gariepinus. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 3(2) : 57 - 69.

Yoshizaki G. 2001. Gene transfer in salmonidae : applications to aquaculture. Suisanzoshoku, 49(2) : 137 - 142.

Lampiran 1. Penyusunan Primer Berdasarkan Database Gen p-actin dari Berbagai

Spesies Ikan

F-RP

grass carp.txc 270 nas.txt 270 neqalobrans.txt 223:- 280

uyopharynaodon.txt 210: 267 rrdal;a.txt 255

grsss carp.txt 271: 330 ~!ss.txt 271: 330 negalobraxa.trt 281: 340 nyopharipngodon.crt 268: 327 red&a.tut 256: 315

grass csrp.cxc 331: 390 UJS.LXC 331: 390 negnlobr4l;h.t~~ 341: 400

~yvph~rjllqodon. cxc 328: 387 rcd&e.cxc 316: 375

mu intrm-exm grass carp.tn 1: 60 anu mro~exon u.cn I: 60 anu mron-exm r@galobrau.tn I: 60 actu utron-erm nyopharyngodon.tn I: 60 antm mtron-exon aedaka.tn I: 60

anin intron-exon grass cq.tn 61: 118 anin intron-exon nas.cxt 61: 118 anin intron-eron ~egalobrau.ta 61: 118 actin intron-exan iyopharyngodon.tn 61: 118 win intron-exon 1edaka.cn 118

Lampiran 2. Alat-Alat yang Digunakan dalam Mengisolasi Promoter pactin nila

Oreochromis niloticus

A. Micropipette dan Tip B. Vortex

C. Dry ThermoUnit D. Sentrifuse

E. GeneQuant F. Mesin Thermocycle VCR)

G. Microwave H. Cetakan & Sisir Pembuat Sumw

I. Bak Elektroforesis J. Ultraviolet Illuminator

K. Shaker

M. Laminar Air Flow

N. Mesin Sekuensing ABI PRISM 3100

Lampiran 3. Hasil Sekuensing Genom p-actin Ikan Nila Oreochromis niloticus

dari arah forward

Lampiran 4. Hasil Sekuensing Genom p-actin Ikan Nila Oreochromis niloticus

dari arah reverse