UJI STABILITAS TANAMAN TEMBAKAU (Nicotiana

tabacum) TRANSGENIK KULTIVAR SR1 YANG

MENGANDUNG GEN Gα PADA GENERASI T2

ELINA MARGANI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN

SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Uji Stabilitas Tanaman

Tembakau (Nicotiana tabacum) Transgenik Kultivar SR1 yang Mengandung Gen

Gα pada Generasi T2 adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing

dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.

Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun

tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan

dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor.

Bogor, September 2016

Elina Margani

NIM G34120063

ABSTRAK

ELINA MARGANI. Uji Stabilitas Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum)

Transgenik Kultivar SR1 yang Mengandung Gen Gα pada Generasi T2. Dibimbing

oleh SUHARSONO dan ARIS TJAHJOLEKSONO.

Protein Gα memiliki peranan penting dalam berbagai proses pertumbuhan

dan perkembangan tumbuhan. Gen Gα dari kedelai kultivar Slamet yang

dikendalikan oleh promoter kuat 35SCaMV yang dipautkan dengan gen nptII

penyandi resisten terhadap kanamisin telah berhasil diintroduksikan ke genom

tanaman tembakau (Nicotiana tabacum) SR1 dengan menggunakan Agrobacterium

tumefaciens. Penelitian ini bertujuan menganalisis stabilitas integrasi gen Gα di

bawah kendali promoter kuat 35SCaMV pada tanaman tembakau kultivar SR1

transgenik. Uji segregasi dilakukan dengan menanam biji tembakau transgenik

generasi T1 dan T2 dan nontransgenik pada media MS yang mengandung kanamisin

50 mg/L. Khi-kuadrat digunakan untuk menganalisis segregasi di dalam populasi

T1 dan T2. Analisis Khi-kuadrat menunjukkan bahwa gen nptII tanaman tembakau

di dalam tanaman transgenik generasi kedua (T1) diwariskan kepada generasi ketiga

(T2) mengikuti pola pewarisan Mendel dengan perbandingan 3:1. Hasil analisis ini

menunjukkan bahwa terdapat satu salinan gen nptII yang terpaut dengan gen G

di dalam genom tanaman transgenik. Pemberian 1.6 mM Al selama 72 jam pada

media kultur menunjukkan bahwa akumulasi Al pada akar tanaman transgenik lebih

rendah dari pada tanaman nontransgenik. Hal ini memberikan indikasi bahwa

Gαberperan mencegah masuknya Al ke dalam akar sehingga tanaman menjadi

toleran terhadap cekaman aluminium.

Kata kunci: Agrobacterium tumefaciens, aluminium, gen Gα, gen nptII, promoter

35SCaMV

ABSTRACT

ELINA MARGANI. Stability Test of Tobacco Plants (Nicotiana tabacum)

Transgenic SR1 Cultivar which Contain Gα Genes in T2 Generation . Supervised

by SUHARSONO and ARIS TJAHJOLEKSONO.

Gα protein has an important role in the growth and development of plants. Gα

genes of soybean cv. Slamet controlled by a strong promoter 35SCaMV linked to

nptII gene encoding for kanamycin resistance was successfully introduced into the

genome of tobacco plant (Nicotiana tabacum) SR1 using Agrobacterium

tumefaciens. The aim of this research was to analyze the stability of the integration

of Gα gene under the control of 35SCaMV promoter in transgenic tobacco plants

cv. SR1. The segregation analysis was conducted by planting seeds of transgenic

tobacco T1 and T2 generation and nontransgenic tobacco SR1 on MS medium

containing of 50 mg/L kanamycin. Chi-square was used to analysis the segregation

in T1 and T2 population. Chi-square analysis show that nptII gene is inherited from

second generation (T1) transgenic plants to third generation (T2) following the

Mendelian inheritance pattern with a ratio of 3:1. This pattern showed that the

transgenic plants contain one copy of nptII gene linked to Gα gene in the genome.

Addition of 1.6 mM Al for 72 hours in the culture media showed that accumulation

Al in the roots of transgenic plants was lower than that of nontransgenic ones. This

indicated that Gα plays an important role in preventing the entry of Al into the root

cells, so the plant become tolerant to Al stress.

Keywords: Agrobacterium tumefaciens, aluminum, Gα gene, nptII gene, 35SCaMV

promoter

Skripsi

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains

pada

Departemen Biologi

UJI STABILITAS TANAMAN TEMBAKAU (Nicotiana

tabacum) TRANSGENIK KULTIVAR SR1 YANG

MENGANDUNG GEN Gα PADA GENERASI T2

ELINA MARGANI

DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2016

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas

segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang

dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Januari 2016 ini ialah

pewarisan genetika, dengan judul Uji Stabilitas Tanaman Tembakau (Nicotiana

tabacum) Transgenik Kultivar SR1 yang Mengandung Gen Gα pada Generasi T2.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku

pembimbing pertama dan Dr Ir Aris Tjahjoleksono selaku pembimbing kedua atas

arahan, waktu, kesabaran yang disediakan dan semua ilmu yang diberikan. Terima

kasih kepada Dr Ir Sulistijorini, MS selaku dosen penguji atas saran dan

masukannya sehingga tulisan ini menjadi lebih baik lagi.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Almarhumah Ibu Dr Ir Utut Widyastuti,

MSi yang telah membimbing selama penulis melakukan penelitian. Masukan,

saran, bimbingan serta kasih sayang yang telah beliau berikan begitu berarti untuk

penelitian. Terima kasih penulis sampaikan kepada Penelitian Unggulan Pusat

(PUP) atas nama Dr Ir Utut Widyastuti, MSi dengan judul “Analisis Functional

Genomic Gen Gα pada Tanaman Kedelai yang mendapat Cekaman Abiotik Akibat

Perubahan Iklim” yang telah mendanai penelitian ini.

Terima kasih penulis sampaikan kepada seluruh staf di laboratorium BIORIN

dan Biologi Molekular dan Selular Tanaman, khususnya kepada Mbak Pepi

Elvavina, Ibu Nia Dahniar, Bapak Abdul Mulya, Teh Ara, Pak Asep, Pak Iri, Pak

Yanto dan Bu Retno (staf laboratorium Terpadu Biologi) selaku teknisi yang telah

memfasilitasi dan memberikan bantuan. Terima kasih kepada senior yang telah

membantu mengarahkan, Bu Ifa, Bu Ida, Pak Asri, Pak Ilyas, Mas Nono, Mbak

Nurul, Mbak Nuril, Kak Seni, Kak Yusdar, Kak Hana, dan Kak Lutfi atas semua

ilmu, bimbingan dan kerjasama yang diberikan. Ungkapan terima kasih kepada

teman-teman seperjuangan yang selalu bersedia direpotkan Sasti dan Elsy, sahabat-

sahabat penulis (Ratih, Risa, Mazidah dan Thomson) atas semangat dan

dukungannya. Terima kasih untuk seluruh rekan-rekan Biologi 49 dan rekan-rekan

kontrakan putri Gamapuri 49 (Pramesti, Mela, Ika, Tanti, Maeda) atas dukungan

yang diberikan. Terima kasih tak terlupakan kepada Andi Wisnu N yang telah

bersedia memberikan bantuan, perhatian, dan dukungan serta mendengarkan keluh

kesah selama perjuangan penyelesaian tugas akhir. Ungkapan terima kasih penulis

sampaikan kepada ayahanda dan ibunda tercinta, Nurcahyo dan Sitatun, dan adik

tersayang Rizal Ab’Daan serta seluruh keluarga, atas segala doa, dukungan dan

kasih sayang yang diberikan.

Penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat memberikan

sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, September 2016

Elina Margani

DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL x

DAFTAR GAMBAR x

DAFTAR LAMPIRAN x

PENDAHULUAN 1

Latar Belakang 1

Tujuan Penelitian 2

BAHAN DAN METODE 2

Tempat dan Waktu 2

Bahan 2

Alat 3

Metode 3

Uji Segregasi Gen Gα pada Tembakau Transgenik T2 3

Pengamatan Anatomi Daun Tanaman Transgenik Generasi T1 3

Analisis Kualitatif Kandungan Aluminium pada Akar dengan Pewarna

Hematoksilin 3

HASIL DAN PEMBAHASAN 4

Uji Segregasi Gen Gα pada Tembakau Transgenik Generasi T1 dan T2 4

Pengaruh Cekaman Aluminium terhadap Akumulasi Aluminium pada

Tanaman Transgenik Gα Generasi T2 8

SIMPULAN DAN SARAN 10

Simpulan 10

Saran 10

DAFTAR PUSTAKA 10

LAMPIRAN 13

RIWAYAT HIDUP 14

DAFTAR TABEL

1 Nilai Khi-kuadrat pada uji satu gen bebas pada biji T2 N. tabacum kultivar

SR1 7

DAFTAR GAMBAR

1 Daerah T-DNA dari plasmid rekombinan pGWB402-Gα 3 2 Morfologi a) Tanaman transgenic generasi T1 TGα.1/1 dan b) tanaman

nontransgenik. 5 3 Sayatan melintang daun Nicotiana tabacum transgenik generasi T1 dan

nontransgenik 5

4 Tanaman transgenik generasi T2 pada media MS0 yang mengandung

antibiotik kanamisin 50 mg/L dan tanaman nontransgenik pada media MS0

tanpa kanamisin 6 5 Tanaman generasi T2 yang ditanam pada media MS0 yang mengandung

kanamisin 50 mg/L pada 2 bulan setelah tanam 6 6 Pertumbuhan tanaman transgenik generasi T2 dari biji TGα.1/1 yang

resisten terhadap kanamisin pada media seleksi kanamisin 8 7 Uji histokimia akumulasi Al dengan pewarnaan hematoksilin pada akar

selama 72 jam 9

DAFTAR LAMPIRAN

1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962) 13 2 Komposisi media hara cair modifikasi dari Sopandie et al. (1999) 13

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Protein G merupakan salah satu protein yang berperan dalam transduksi

sinyal. Berdasarkan komposisi dan ukurannya protein G diklasifikasikan menjadi

protein heterotrimerik G dan protein G kecil. Protein heterotrimerik G terdiri atas

subunit α, β, dan γ (Gα, Gβ, dan Gγ). Komplek heterotrimerik tersebut dalam

keadaan inaktif ketika tidak ada sinyal ekstraselular dan berada dalam bentuk trimer

(Ma 1994; Perfus-Barbeoch et al. 2004). Protein heterotrimerik G merupakan

mediator yang mengirimkan sinyal ekstraselular melalui molekul reseptor ke

molekul efektor (Fujisawa et al. 2001). Sinyal ekstraselular berikatan dengan

reseptor yang ada di membran, dan mengaktifkan protein heterotrimerik G.

Aktifnya protein heterotrimerik G menyebabkan terputusnya ikatan Guanin

Diphospat (GDP) yang berikatan dengan Gα menjadi Guanin Triphospat (GTP). Perubahan konformasi tersebut menyebabkan Gα berpisah dengan dimer Gβγ, dan

kembali membentuk trimer saat inaktif (Perfus-Barbeoch et al. 2004).

Aktifnya protein heterotrimerik G dapat meningkatkan ketahanan terhadap

cekaman biotik dan abiotik. Protein Gα telah diketahui terlibat dalam proses

pertumbuhan dan perkembangan tumbuhan, diantaranya brassinosteroid signaling

pada tembakau dan padi (Wang et al. 2006; Oki et al. 2009). Gen Gα telah diketahui

perannya dalam resistensi terhadap patogen (Suharsono et al. 2002), germinasi

polen dan transduksi sinyal ekstraseluler kalmodulin (Ma et al. 1999).

Ion Al3+ merupakan bentuk yang paling toksik bagi tanaman. Cekaman Al

dapat menurunkan integritas membran, menginduksi pembentukan peroksidasi

lipid dan kalosa sehingga menghambat pertumbuhan perpanjangan akar primer

(Yamamoto et al. 2001). Cekaman Al juga mampu menginduksi beberapa gen yang

berperan dalam sistem pertahanan tumbuhan. Gen Gα diduga terlibat dalam sistem

pertahanan tersebut (Asmann 2002).

Kedelai kultivar Slamet dan Lumut merupakan tanaman yang tahan dan peka

terhadap cekaman Al (Anwar et al. 2000). Cekaman Al 1.4 mM dan 1.6 mM

meningkatkan ekspresi gen Gα dan menghambat perpanjangan akar pada kedelai

kultivar Slamet (Mashuda 2006). Kedelai kultivar Slamet memiliki satu salinan gen

Gα di dalam genom dan telah berhasil diisolasi dan dikloning pada vektor pGEMT-

Easy (Suharsono 2006). Hartini (2008) telah melakukan pendekatan reserve genetic

untuk menonaktifkan gen Gα pada kedelai kultivar Slamet dengan menggunakan

irradiasi sinar gamma. Kandidat mutan Gα hasil irradiasi diseleksi berdasarkan

fenotip stomata menutup pada siang hari (Perfush-Barbeoch et al. 2004) dan kerdil

(Fujisawa et al. 1999). Seleksi mutan gen Gα yang stabil telah dilakukan hingga

generasi ke enam (Limbong 2010; Fajri 2011). Mutasi tersebut menghasilkan dua

nomor tanaman mutan cDNA gen Gα yang berasal dari kultivar Slamet yaitu M1

dan M2 (Fajri 2011).

Pemberian mastoparan 30 µM yang merupakan aktivator gen Gα yang

diberikan selama 8 sampai 24 jam bersamaan dengan cekaman aluminium dapat

memperbaiki kerusakan jaringan sel yang diakibatkan oleh cekaman aluminium

pada kultivar peka Lumut (Suharsono 2006). Hasil penelitian analisis fungsional

gen Gα dengan menggunakan mutan yang kehilangan gen Gα menunjukkan bahwa

2

mutan Gα dari kultivar Slamet yang toleran cekaman asam dan pH rendah menjadi

tidak toleran. Hal ini memberikan indikasi adanya pengaruh kuat kehilangan Gα

menyebabkan perbedaan sifat toleran terhadap cekaman aluminium dan asam pada

tanaman mutan dibandingkan tipe liarnya (Widyastuti dan Suharsono 2015).

Analisis fungsi cDNA gen Gα dari kedelai kultivar Slamet dapat diketahui

dengan melakukan ekspresi berlebih gen tersebut pada tanaman model Nicotiana

tabacum kultivar SR1. Vektor ekspresi biner pGWB402-Gα telah berhasil dirakit

dengan cara Recombination Cloning menggunakan enzim LR clonase. Gen Gα dari

kedelai kultivar Slamet dikendalikan oleh promoter kuat 35SCaMV yang telah

berhasil diintroduksikan ke dalam genom N. tabacum SR1 dengan menggunakan

Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Fajri 2014). Ekspresi gen Gα yang dikontrol

oleh promoter kuat 35SCaMV meningkat tanpa adanya aktivitas eksternal berupa

cekaman biotik maupun abiotik. Untuk mendapatkan tanaman homozigot yang

membawa gen Gα maka perlu dilakukan uji stabilitas integrasi gen Gα pada

generasi berikutnya.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan menganalisis stabilitas integrasi gen Gα di bawah

kendali promoter kuat 35SCaMV pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum)

kultivar SR1.

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu

Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium

BIORIN (Biotechnology Research Indonesian – The Netherlands) Pusat Penelitian

Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB, Laboratorium Terpadu

Departemen Biologi IPB, dan Laboratorium LIPI Cibinong. Penelitian dimulai dari

bulan Januari sampai dengan Juli 2016.

Bahan

Bahan tanaman yang digunakan adalah biji dari tanaman transgenik

Nicotiana tabacum kultivar SR1-Gα generasi T1 dan T2 dan biji tanaman

nontransgenik Nicotiana tabacum. Ekspresi gen Gα diatur dengan kendali promoter

kuat 35SCaMV dan disisipkan bersama dengan gen penanda seleksi nptII (Gambar

1) pada daerah T-DNA plasmid pGWB402 (Fajri 2014). Bahan lain yang digunakan

adalah media Murashige and Skoog (MS) sebagai media pertumbuhan tanaman in

vitro dan media MS mengandung kanamisin konsentrasi 50 mg/L sebagai media

seleksi, kloroks, tween 80, air steril, media hara kultur air, dan larutan 1.6 mM Al,

pewarna hematoksilin 0.2% (b/v).

3

Gambar 1 Daerah T-DNA dari plasmid rekombinan pGWB402-Gα. RB: right

border, LB: left border, 35S-P: promoter 35SCaMV, Gα: gen penyandi

protein Gα dari kedelai kultivar Slamet, NPTII: neomycin

phosphotransferase II, nos: nopaline synthase (Digambar ulang dari

Fajri (2014)).

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, Laminar Air

Flow (LAF), alat tanam (pinset, gunting, scalpel), autoklaf, botol kultur, pH meter,

mikroskop cahaya, mikroskop stereo, mikrotom beku, aerator, dan tray semai.

Metode

Uji Segregasi Gen Gα pada Tembakau Transgenik T2

Biji tembakau tansgenik generasi T1 dan T2 dikeringkan dalam oven (40˚C)

selama 3 hari. Biji disterilisasi dengan Bayclin (5.25% NaClO) 100% selama 5

menit, dan dibilas dengan air steril hingga cairan tidak berwarna coklat. Biji

ditanam pada media MS0 sebagai kontrol dan MS (Lampiran 1) yang mengandung

kanamisin 50 mg/L di dalam cawan petri. Biji dikondisikan dalam suhu optimal

untuk perkecambahan yaitu 23˚C dan pertumbuhannya diamati dan dibandingkan

dengan kontrol setiap minggu. Analisis khi-kuadrat (chi-square) dilakukan untuk

menguji rasio segregasi dari hipotesis pada kecambah T2 tembakau transgenik 35S-

Gα dengan rumus:

χ2 = ∑(𝑜 − 𝑒)2

𝑒

Keterangan:

o : nilai observasi

e : nilai harapan

Pengamatan Anatomi Daun Tanaman Transgenik Generasi T1 Daun tanaman transgenik generasi T1 galur TGα.1/1, TGα.1/3, TGα.1/5 dan

daun tanaman nontransgenik dipotong membentuk persegi. Masing-masing daun

tersebut disayat melintang dengan menggunakan mikrotom beku. Hasil sayatan

dimasukkan ke dalam alkohol 70%. Sayatan daun kemudian diamati di bawah

mikroskop cahaya.

Analisis Kualitatif Kandungan Aluminium pada Akar dengan Pewarna

Hematoksilin

Tanaman transgenik generasi T2 galur TGα.1/1, TGα.1/3 dan TGα.1/5 yang

berumur dua bulan dengan panjang akar yang sama dicuci dengan air mengalir

hingga bersih dan diukur panjang akarnya. Tanaman tersebut ditanam pada bak,

RB 35S-P Gα Tnos

Pnos:NPTII:Tnos

LB

Xba1 BamH1

4

kemudian bak ditempatkan di dalam bak plastik berisi media hara cair modifikasi

dari Sopandie et al. (1996) (Lampiran 2) pH 6.0 selama 48 jam dengan aerasi. Hari

ke-3 (jam ke-0) media diganti dengan media perlakuan yaitu pH 6.0 tanpa cekaman

Al (kontrol), pH 4.0 tanpa cekaman Al, dan pH 4.0 + 1.6 mM AlCl3. Perlakuan

dilakukan selama 72 jam. Setelah 72 jam dilakukan pengambilan tanaman

transgenik dan nontransgenik untuk dilakukan uji histokimia untuk mengetahui

akumulasi aluminium secara kualitatif dengan mencelupkan ujung akar pada

pewarna hematoksilin 0.2% (b/v) lalu dicuci dengan air mengalir. Pengamatan

bagian ujung akar dilakukan di bawah mikrospkop stereo.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Segregasi Gen Gα pada Tembakau Transgenik Generasi T1 dan T2

Penelitian Fajri (2014) menghasilkan tanaman transgenik galur TGα.1. Uji

segregasi dilakukan pada biji generasi T1 dari tanaman transgenik transgenik

generasi T0 yaitu galur TGα.1. Kanamisin merupakan penanda seleksi yang

digunakan pada pembuatan tanaman transgenik hasil transformasi. Tanaman yang

terpapar antibiotik kanamisin akan mengalami penghambatan dalam

pertumbuhannya sehingga dapat menyebabkan kematian pada perkecambahan. Biji

generasi T1 memiliki fenotip kecambah yang tahan dan sensitif terhadap kanamisin.

Semua biji generasi T1 sebanyak 2138 berkecambah pada media MS yang

mengandung kanamisin 50 mg/L. Jumlah kecambah yang tahan (tumbuh) sebanyak

1615 dan sensitif (mati) sebanyak 523. Jumlah kecambah yang tahan dan sensitif

menunjukkan perbandingan 3:1 dengan nilai Khi-kuadrat 0.330. Nilai ini jauh lebih

kecil dibandingkan dengan Khi-kuadrat tabel yaitu 3.841, pada taraf nyata 5%

(Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat satu salinan gen nptII yang terpaut

dengan gen Gα (Gambar 1) dalam genom tanaman N. tabacum transgenik generasi

T1.

Sebanyak delapan tanaman generasi T1 yang tahan terhadap kanamisin

digunakan untuk menghasilkan biji generasi T2. Tanaman transgenik generasi T1

memiliki batang yang lebih tinggi dibandingkan dengan nontransgenik (Gambar 2).

Pengamatan anatomi daun pada tiga tanaman transgenik T1 menunjukkan bahwa

anatomi daun dari tanaman transgenik dan nontransgenik memiliki ukuran sel daun

yang relatif sama (Gambar 3), sehingga diduga perbedaan morfologi yang terjadi

karena gen Gα yang terdapat dalam tanaman transgenik T1 berperan pada

pembentukan brassinosteroid signaling seperti pada tembakau dan padi (Wang et

al. 2006; Oki et al. 2009). Brassinosteroid signaling menimbulkan respon

pembelahan sel, pembengkokan, reproduksi dan perkembangan vaskular, polarisasi

membran dan pompa proton, dan modulasi akibat stres (Clouse et al. 1998).

Biji yang dihasilkan dari tanaman T1 selanjutnya digunakan untuk uji

stabilitas integrasi gen Gα pada generasi T2. Sebanyak lima tanaman dari delapan

tanaman T1 digunakan untuk analisis segregasi pada generasi T2. Biji tembakau

transgenik dan nontransgenik ditanam pada media MS sehingga dapat diketahui

bahwa biji tersebut memiliki viabilitas yang baik karena akar dan daun mampu

tumbuh dengan baik (Gambar 4a). Biji T2 tanaman transgenik N. tabacum kultivar

5

SR1 dan nontransgenik (Gambar 4 b, c, d) mampu berkecambah pada media seleksi

yang mengandung antibiotik kanamisin 50 mg/L. Biji transgenik yang resisten

(tahan) terhadap kanamisin akan tetap tumbuh dengan daun berwarna hijau segar

(Gambar 5a), ukuran dan jumlah daun lebih banyak dibandingkan dengan biji

nontransgenik, sedangkan biji yang sensitif (tidak tahan) terhadap kanamisin

daunnya berwarna kuning dan berukuran lebih kecil (Gambar 5b). Biji

nontransgenik yang awalnya hijau segar akan berubah menjadi berwarna putih

kemudian mati (Gambar 5c).

Gambar 2 Morfologi a) Tanaman transgenic generasi T1 TGα.1/1 dan b) tanaman

nontransgenik.

Gambar 3 Sayatan melintang daun Nicotiana tabacum transgenik generasi T1 dan

nontransgenik. a) Nontransgenik, b) Transgenik TGα.1/1, c) Transgenik

TGα.1/3, dan d) Transgenik TGα.1/5.

a b

50 c

m

Epidermis Palisade

a

Epidermis Palisade

c

Epidermis Palisade

b

Epidermis Palisade

d

6

Gambar 4 Tanaman transgenik generasi T2 pada media MS0 yang mengandung

antibiotik kanamisin 50 mg/L dan tanaman nontransgenik pada media

MS0 tanpa kanamisin. a) Transgenik TGα.1/1; b) Transgenik TGα.1/3;

c) Transgenik TGα.1/5; d) Nontransgenik. Tanaman diamati pada umur

2 bulan setelah tanam. generasi T2 di media MS0 yang mengandung

kanamisin 50 mg/L. Tanda panah ( ) menunjukkan biji transgenik

pada media seleksi yang sensitif.

Gambar 5 Tanaman generasi T2 yang ditanam pada media MS0 yang mengandung

kanamisin 50 mg/L pada 2 bulan setelah tanam. a) Kecambah resisten

dengan kotiledon hijau, b) kecambah sensitif dengan kotiledon kuning,

dan c) kecambah tanaman nontransgenik dengan kotiledon putih.

Tanaman T2 memiliki kemampuan berkecambah yang sama ketika

ditumbuhkan pada media seleksi yang mengandung kanamisin dan memiliki

fenotip kecambah yang tahan dan sensitif terhadap kamanisin. Resistensi tanaman

transgenik tersebut disebabkan oleh adanya gen nptII. Gen nptII mengkode enzim

neomycin phosphotransferase II yang secara ekstensif digunakan sebagai gen

N

T

T

N

T

N

T

T

a

N

T

b

T

T

d c

NT T

d

NT T

a

NT

T

b

NT

T

c

a c b a c b

7

penanda seleksi. Enzim neomycin phosphotransferase II memiliki kemampuan

memfosforilasi gugus hidroksi dari kanamisin (Miki dan McHugh 2004).

Kanamisin adalah antibiotik aminoglikosida yang terdiri atas satu deoxystreptamin

dan dua unit glukosamin (Yu et al. 2003). Kanamisin memiliki peran sebagai agen

penyeleksi karena dapat membunuh sel tanaman yang tidak diinginkan melalui

penghambatan pertumbuhan sel tanaman (Zhang et al. 2001). Oleh sebab itu,

tanaman transgenik yang resisten terhadap kanamisin akan tetap tumbuh pada

media seleksi karena adanya gen nptII dalam genom tanaman tersebut.

Hasil analisis segregasi gen nptII dengan uji Khi-kuadrat dengan hipotesis

perbandingan 3 resisten, 1 sensitif terhadap kanamisin menunjukkan bahwa

populasi tanaman tembakau pada generasi T2 mempunyai perbandingan 3:1 untuk

resisten dan sensitif terhadap kanamisin (Tabel 1). Hal ini menunjukkan bahwa

jumlah gen nptII yang terintegrasi ke dalam genom tanaman tembakau transgenik

adalah sebanyak satu salinan. Karena gen nptII dipautkan dengan gen Ga dengan

jarak yang sangat dekat sehingga kedua gen tersebut diwariskan secara bersama-

sama. Hal ini mengindikasikan bahwa gen Ga juga terintegrasi di dalam genom

tembakau secara stabil dan diwariskan kepada generasi berikutnya. Hasil ini sesuai

dengan Liu (1998) yang menyatakan bahwa lokus tunggal dapat dikarakterisasi

berdasarkan pola pewarisan Mendel untuk satu gen. Karena uji resistensi

menunjukkan adanya individu tanaman yang sensitif terhadap kanamisin maka

tetua dari kelima populasi generasi T2 merupakan tanaman transgenik heterozigot

untuk gen nptII.

Tabel 1 Nilai Khi-kuadrat pada uji satu gen bebas pada biji T2 N. tabacum kultivar

SR1

Galur

T1

Total

biji TKc Kc

Resisten

(Tumbuh)

Sensitif

(Mati)

Hipotesisi

(Resisten:Sensitif)

x²

hitung

TGα.1/1 444 192 252 198 54 3:1 1.714

TGα.1/2 431 83 348 250 98 3:1 1.854

TGα.1/3 453 73 380 285 95 3:1 0.000

TGα.1/5 405 68 337 265 72 3:1 2.375

TGα.1/7 665 202 463 342 121 3:1 0.317

x² tabel = 3.841 pada taraf nyata 5%; Tkc: Tidak berkecambah; Kc: Berkecambah.

Tanaman transgenik T2 yang telah berumur dua bulan dipindahkan pada

media MS yang mengandung kanamisin 50 mg/L (Gambar 6) untuk memastikan

bahwa tanaman tersebut benar-benar resisten terhadap kanamisin. Pertumbuhan

tanaman transgenik T2 pada media seleksi kanamisin 50 mg/L menunjukkan

pertumbuhan yang baik dengan kondisi tanaman segar dan daun berwarna hijau.

Hal ini menandakan bahwa tanaman tersebut mengandung gen nptII yang terpaut

dengan gen Gα (Gambar 1).

8

Gambar 6 Pertumbuhan tanaman transgenik generasi T2 dari biji TGα.1/1 yang

resisten terhadap kanamisin pada media seleksi kanamisin.

Pengaruh Cekaman Aluminium terhadap Akumulasi Aluminium pada

Tanaman Transgenik Gα Generasi T2

Perlakuan cekaman diberikan pada tanaman nontransgenik dan tiga galur

transgenik Gα generasi T2 dari biji TGα.1/1, TGα.1/3, dan TGα.1/5. Akumulasi Al

didekteksi dengan pewarnaan menggunakan hematoksilin. Semakin pekat

warnanya, semakin tinggi Al yang dikandungnya. Hematoksilin merupakan

pewarna yang diekstrak dari batang pohon kayu logwood. Oksidasi hematoksilin

membentuk hematein, suatu senyawa yang membentuk kompleks berwarna sangat

kuat dengan ion logam tertentu. Kompleks logam-hematein digunakan untuk

mewarnai inti sel sebelum diperiksa di bawah mikroskop. Metode uji pewarna

hematoksilin (Hematoxylin staining) merupakan salah satu cara untuk mendeteksi

akumulasi Al pada ujung akar. Lapisan terluar ujung akar akan terwarnai

hematoksilin apabila pada ujung akar terdapat Al, karena Al bertindak sebagai alat

pengikat hematein yang merupakan komponen oksida dari larutan hematoksilin.

Akar yang terwarnai oleh hematoksilin menunjukkan bahwa akar tersebut

mengandung Al (Agustina et al. 2006)

Perlakuan cekaman aluminium sebesar 1.6 mM Al selama 72 jam

menyebabkan akumulasi aluminium pada akar tanaman nontransgenik, sedangkan

pada tanaman transgenik tidak terjadi akumulasi aluminium. Hal ini ditunjukkan

dengan semakin berkurangnya warna merah pekat hematoksilin pada 72 jam

perlakuan cekaman pada tanaman transgenik dibandingkan dengan tanaman

nontransgenik. Contoh hasil uji histokimia akumulasi Al pada akar tanaman

nontransgenik dan transgenik generasi T2 dari biji TGα.1/1 dapat dilihat pada

Gambar 7. Perlakuan pH 4 dan pH 6 tanpa Al baik tanaman transgenik maupun

tanaman nontransgenik mempunyai akar yang tidak terwarnai atau sedikit terwarnai

oleh hematoksilin (Gambar 7a dan 7b). Terwarnainya ujung akar yang tidak

mengandung Al pada perlakuan tanpa Al kemungkinan disebabkan oleh pembilasan

ujung akar dengan air yang tidak sempurna sehingga hematoksilin diikat oleh

molekul atau sel akar secara tidak spesifik.

Akar tanaman transgenik TGα.1/1 pada pH 4 + 1.6 mM Al menunjukkan

tidak adanya hematoksilin pada ujung akar (Gambar 7c). Hal ini diduga karena

9

adanya keterlibatan Gα yang mampu meningkatkan konsentrasi Ca2+. Peningkatan

ion Ca2+ tersebut menyebabkan Al yang terakumulasi di dalam sitosol dipompa

keluar sel. Menurut Delhaiz dan Ryan (1995), Al dapat menggantikan kedudukan

ion lain dalam proses metabolisme sehingga metabolisme tumbuhan terganggu.

Akar tanaman nontransgenik dengan pewarnaan hematoksilin menunjukkan adanya

akumulasi aluminium yang lebih tinggi pada pH 4 + 1.6 mM Al sehingga

pertumbuhan akar terganggu.

Gambar 7 Uji histokimia akumulasi Al dengan pewarnaan hematoksilin pada akar

selama 72 jam. a) pH 6, b) pH 4, dan c) pH 4 + 1.6 mM Al. NT)

nontransgenik; TGα.1/1/1, TGα.1/1/2, TGα.1/1/3 dari biji TGα.1/1.

Protein heterotrimerik G meregulasi banyak efektor, di antaranya adenilat

siklase, phosphalipase C dan efektor transducin (Ma 1994). Phospholipase C

menghidrolisis phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate (P1P2) menjadi 2 second

messengers yaitu inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) dan diacyglycerol (DAG). IP3

dapat meningkatkan reseptor membran seperti kanal Ca2+ dan melepas Ca2+ dari

retikulum endoplasma ke dalam sitosol sehingga level Ca2+ meningkat (Becker et

al. 2000). Ca2+ terlibat dalam berbagai proses dasar seperti aliran di dalam

sitoplasma, pembelahan sel, perpanjangan sel, diferensiasi sel, polaritas sel, dan

respon pertahanan stres pada tanaman (Song et al. 2008).

Hasil penelitian Giok (2010) menunjukkan bahwa perlakuan pemberian 1.6

mM Al pada mutan 103 dan 338 dari kedelai Slamet menyebabkan akar tanaman

tersebut pendek dan mempunyai jumlah sel di bagian epidermis sampai korteks

yang rusak lebih banyak dari pada kedelai Kultivar Slamet (kultivar tahan). Hal

tersebut diduga karena mutan 103 dan 338 kehilangan gen Gα. Hasil penelitian

Srimulyati (2007) menunjukkan bahwa pada kedelai Kultivar Lumut yang peka

terhadap Al, pemberian Mastoparan 30 µM terbukti meningkatkan ketahanan

tanaman kedelai terhadap 1.6 mM Al yang ditunjukkan oleh adanya pertambahan

panjang akar, penurunan kandungan Al, kandungan peroksidasi lipid dan

kandungan kalosa, serta peningkatan integritas membran sel akar.

NT TGα.1/1/1 NT TGα.1/1/2 NT TGα.1/1/3

(a) (b) (c)

10

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Gen Gα di bawah kendali promoter 35SCaMV terintegrasi secara stabil di

dalam genom tanaman Nicotiana tabacum kultivar SR1 transgenik dan diwariskan

ke generasi ketiga mengikuti pola pewarisan Mendel dengan perbandingan 3:1.

Jumlah gen Gα yang terintegrasi ke dalam genom tanaman transgenik Nicotiana

tabacum kultivar SR1 adalah satu salinan gen. Tanaman transgenik yang

mengandung gen Gα mengakumulasi Al lebih sedikit dari pada tanaman

nontransgenik. Hal ini menunjukkan bahwa Gα berperan dalam mencegah

masuknya Al sehingga tanaman toleran terhadap Al.

Saran

Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mendapatkan tanaman

transgenik homozigot. Tanaman homozigot ini akan digunakan untuk uji tantang.

DAFTAR PUSTAKA

Agustina K, Sopandie D, Trikoesoemaningtyas, Wirnas D, Hardaningsih W. Di

dalam: Agustina K, Sopandie D, Trikoesoemaningtyas, Wirnas D,

Hardaningsih W, editor. Distribusi dan Akumulasi Aluminium pada Akar

Sorgum (Sorghum bicolor (L) Moench) melalui Uji Pewarnaan

Hematoksilin [Internet]. [Waktu dan tempat pertemuan tidak diketahui].

Bogor (ID): IPB. hlm 47-52; [diunduh 2016 Okt 4]. Tersedia pada:

https://www.academia.edu/15461737/DISTRIBUSI_DAN_AKUMULASI

_ALUMINIUM_PADA_AKAR_SORGUM_Sorghum_bicolor_L_Moenc

h_MELALUI_UJI_PEWARNAAN_HEMATOKSILIN.

Anwar S, Jusuf M, Suharsono, Sopandie D. 2000. Pengklonan gen yang diinduksi

oleh aluminium pada kedelai. Bioteknol Indonesia. 5(1): 7-16.

Anwar. 1999. Pengklonan gen-gen yang diinduksi oleh aluminium pada kedelai

(Glycine max (L) Merryl). [Disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Assmann SM. 2002. Heterotrimeric and unconventional GTP binding protein in

plant cell signaling. Plant Cell. Supl: S355-S373.

Becker WM, Kleinsmith LJ, Hardin J. 2000. The World of The Cell. 4th Ed.

Madison: The Benjamin/Cummings Publishing Company.

Clouse S, Carolina N, Sasse J. 1998. Brassinosteroids: essential regulator of plant

growth and development. Plant Mol Biol. 49: 427-51.

Delhaiz, Ryan PR. 1995. Aluminium toxicity and tolerance in plant. Plant Physiol.

107: 315-321.

Fajri H. 2011. Identifikasi secara molekuler kandidat mutan Gα dari kedelai kultivar

Slamet berdasarkan mRNA. [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Fajri H. 2014. Rekayasa genetika Nicotiana tabaccum SR1 dengan gen Gα. [Thesis].

Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

11

Fujisawa Y, Kato H, Iwasaki Y. 2001. Structure and function of heterotrimeric G

protein in plant. Plant Cell Physiol. 42(8): 789-794.

Fujisawa Y, Kato T, Ohki S, Ishikawa A, Kitano H, Sasaki T, Asahi T, Iwasaki Y.

1999. Supresion of the heterotrimeric G protein causes abnormal

morphology, including dwarfisme, in rice. Proc Natl Acad Sci. 96: 7575-

7580.

Giok G. 2010. Studi anatomi dan histokimia pada akar kedelai (Glycine max (L.)

Merr) kandidat mutan protein Gα terhadap cekaman aluminium. [Skripsi].

Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Hartini S. 2008. Induksi mutasi dengan irradiasi sinar gamma pada kedelai (Glycine

max (L.) Merrill) kultivar Slamet dan Lumut. [Thesis]. Bogor (ID): Institut

Pertanian Bogor.

Jusuf M. 2001. Genetika I: Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta (ID): CV. Sagung

Seto.

Limbong LM. 2010. Identifikasi molekular kandidat mutan protein heterotrimerik

G subunit α (Gα) dari kedelai (Glycine max (L) Merrill) toleran aluminium

kultivar Slamet. [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

Liu Ben-Hui. 1998. Statistical Genomics: Linkage, Mapping and QTL Analysis.

New York (US): CRC Press LLC.

Ma H. 1994. GTP-binding protein in plants: new members of an old family. Plant

Mol Biol 26: 1611-1636.

Ma L, Xu X, Cui S, Sun D. 1999. The presence of a heterotrimeric G protein and

its role in signal transduction of extracelullar calmodulin in polen

germination and tube growth. The Plant Cell. 11: 1351-1363.

Mashuda. 2006. Ekspresi gen Gα dan GST pada kedelai kultivar Slamet yang

mendapatkan cekanamn aluminium. [Thesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian

Bogor.

Miki B, McHugh. 2004. Selectable marker genes in transgenic plants: applications,

alternatives and biosafety. J Biotechnol. 107: 193-232.

Oki K, Inaba N, Kitagawa K, Fujioka S, Kitano H, Fujisawa Y, Kato H, Iwasaki Y.

2009. Function of the α subunit of rice heterotrimeric G protein in

brassinosteroid signaling. Plant Cell Physiol. 50(1): 161-172.

Perfush-Barbeoch L, Jones AM, Assmann SM. 2004. Plant heterotrimeric G protein

function: insights from Arabidopsis and rice mutants. Plant Biol. 7: 719-731.

Ryan PR, Ditomaso JM, Kochian LV. 1993. Aluminium toxicity in roots: an

investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap. Exp Bot J.

44(259): 437-446.

Song W, Zhang Z, Shao H, Guo X, Cao H, Zhao H, Fu Z, Hu X. 2008. Relationship

between calcium decoding elements and plant abiotic-stress resistance. Biol

Sci. 4(2): 116-125.

Sopandie D, Jusuf M, Hamim, Supiatno. 1996. Fisiologi dan genetik daya adaptasi

kedelai terhadap cekaman kekeringan dan pH rendah dengan Al tinggi.

Laporan Riset Unggulan Terpadu (RUT I).

Srimulyati T. 2007. Keterlibatan protein heterotrimerik Gα terhadap cekaman

aluminium pada kedelai (Glycine (L) Merryl) melalui uji histokimia

[Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.

12

Suharsono U, Fujisawa Y, Tsutomu K, Iwasaki Y, Satoh H, Shimamoto K. 2002.

The heterotrimeric G protein α subunit acts upstream of the small GTPase

Rac in disease resistance of rice. Proc Natl Acad Sci. 99: 13307-13312.

Suharsono UW. 2006. Analisis gen penyandi protein heterotrimerik G subunit α

yang terlibat dalam sistem toleransi tanaman kedelai terhadap cekaman

aluminium [laporan akhir hibah bersaing XII]. Bogor (ID): Lembaga

Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat, Institut Pertanian Bogor.

Wang L, Xu YY, Ma QB, Li D, Xu ZH, Chong K. 2006. Heterotrimeric G protein

alpha subunit is involved in rice brassinosteroid response. Cell Res. 16: 916-

922.

Widyastuti U, Suharsono. 2015. Analisis Functional genomic Gen G pada

tanaman Kedelai yang mendapat Cekaman abiotik akibat perubahan iklim.

Laporan Penelitian Perguruan Tinggi. RISKTEK-Dikti.

Yamamoto et al. 2001. Lipid peroxidation is an early symptom triggered by

aluminum, but not the primary cause of elongation inhibition in pea roots.

Plant Physiol. 125: 199-208.

Ye F, Signer ER. 1996. RIGS (repeat-induced gene silencing) in Arabidopsis is

transcriptional and alters chromatin configuration. Proc Natl Acad Sci. 93:

10881-10886.

Yin Z, Plander W, Malepszy S. 2004. Transgene inheritance in plants. J Appl Genet.

45: 127-144.

Yu TA, Shyi-Dong Y, Jiu-Sherg Y. 2003. Comparison of the effects of kanamycin

and geneticin on regeneration of papaya from root tissue. Plant Cell, Tissue

Organ Cult. 74: 169-178.

Zhang BH, Fang L, Zhi-Hong L, Hong-Mei W, Chang-Bing Y. 2001. Effects of

kanamycin on tissue culture and somatic embryogenesis in cotton. Plant

Growth Regu. 33: 137-149.

13

LAMPIRAN

Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashige dan Skoog 1962)

Kategori Bahan Konsentrasi dalam media (mg/l)

Hara makro

NH4NO3

KNO3

MgSO4.7H2O

KH2PO4

CaCl2.2H2O

FeSO4.7H20

Na2EDTA

1650

1900

370

170

440

27.8

37.3

Hara mikro

H3BO2

MnSO4H2O

ZnSO4.7H2O

KI

NaMoO4.7H2O

CuSO4.5H2O

CoCl2.6H2O

6.2

16.9

8.6

0.83

0.25

0.025

0.025

Vitamin

Niacin

Pyridoxine

Thiamin

Glycine

Myo-Inositol

0.5

0.5

0.4

2

100

Sukrosa 30 g/l

pH 5.8

Lampiran 2 Komposisi media hara cair modifikasi dari Sopandie et al. (1999)

Bahan Konsentrasi dalam media

Ca(NO3)2.4H2O

NH4NO3

MgSO4.7H2O

KH2PO4

MnSO4.H2O

CuSO4.5H2O

ZnSO4.7H2O

H3BO3

(NH4)2Mo7O24.4H2O

Fe-EDTA

0.375 mM

0.250 mM

0.100 mM

0.100 mM

5 µM

0.2 µM

1 µM

5 µM

1 µM

5 µM

14

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Purworejo pada tanggal 09 Oktober 1994, merupakan

anak pertama dari dua bersaudara pasangan Bapak Nurcahyo dan Ibu Sitatun.

Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD N 2 Pangenrejo pada tahun 2006,

menyelesaikan pendidikan menengah pertama di SMP N 1 Purworejo pada tahun

2009, dan pendidikan menengah atas di SMA N 7 Purworejo pada tahun 2012.

Penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Institut Pertanian Bogor (IPB) Jurusan

Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.

Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa kegiatan

kampus. Penulis terlibat aktif dalam kegiatan Organisasi Mahasiswa Daerah

(OMDA) Purworejo, serta aktif terlibat dalam kepanitiaan Masa Perkenalan

Fakultas (MPF) tahun 2014 dan Masa Perkenalan Departemen (MPD) tahun 2014.

Penulis pernah mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) bidang

Kewirausahaan tahun 2014 dengan judul “ROKUGGI: Roti Isi Berbahan Dasar

Tepung Sukun (Artocarpus communis) sebagai Alternatif Pengganti Tepung

Gandum”. Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar dan asisten

praktikum Pengantar Genetika Molekuler tahun 2016. Penulis mengikuti kegiatan

Studi Lapang di Hutan Pendidikan Gunung Walat dengan judul “Bakteri Penghasil

Senyawa Bioaktif yang Diisolasi dari Tanah dan Daun Beberapa Tumbuhan Asal

Gunung Walat” dan Praktik Lapang di Balai BPOM Jakarta Timur dengan judul

“Manajemen Pengujian Sampel Obat Tradisional dan Suplemen Laboratorium

Teranokoko Balai Besar Pengawas Obat dan Makanan di Jakarta”.