A. Isolasi Mikrobia

merupakan proses pemisahan mikrobia dari lingkungannya di alam dan

menumbuhkannya sebagai biakan murni dalam medium buatan

harus diketahui cara-cara penumbuhan mikrobia pada media

biakan dan syarat-syarat yang diperlukan (faktor nutrisi dan kebutuhan

oksigen)

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam isolasi mikrobia:

1. sifat-sifat spesial mikrobia yang diisolasi

2. Tempat hidup atau asal mikrobia

3. Medium pertumbuhan yang sesuai

4. Cara menanam dan inkubasi mikrobia

5. Cara menguji mikrobia hasil isolasi (biakan murni)

6. Cara memelihara mikrobia hasil isolasi agar tetap berupa biakan murni

Isolasi Bakteri

a. Cara goresan (streak plate method)

suspensi bahan yang mengandung bakteri, digoreskan pada

medium agar (Nautrien agar) dalam petridish. Inkubasikan sehingga

pada bekas goresan tumbuh koloni-koloni bakteri. Lakukan isolasi

lebih lanjut untuk masing-masing koloni yang tumbuh.

b. Cara taburan (pour plate method)

inokulasikan medium agar yang sedang mencair pada suhu 500C

dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri. Tuangkan

secara bersamaan ke dalam petridish. Inkubasikan sehingga

tumbuh koloni-koloni bakteri. Isolasi lebih lanjut koloni bakteri yang

diinginkan

Isolasi Khamir/yeast

a. Cara goresan dan taburan

sama dengan isolasi bakteri, hanya media agar yang digunakan berupa

PGY (potato glucose yeast) atau PDA (potato dextrose agar)

b. Menggunakan mikro manipulator

satu sel khamir diambil dan dimasukkan ke dalam medium, sehingga

pertumbuhannya hanya berasal dari satu sel saja. Untuk mengetahuinya

digunakan mikroskop yang dilengkapi dengan mikromanipulator

Isolasi Jamur

a. Cara pengenceran dan penaburan (dilution plate method)

b. Cara isolasi dengan spora dari satu sporangium

c. Cara perkecambahan dari satu spora

d. Cara biakan dalam tanah – air (soil water culture)

B. Sreening

Seleksi untuk mendapatkan mikrobia yang potensiil untuk

proses fermentasi (industri) dan memisahkannya dari mikrobia yang

tidak berguna untuk proses produk

a. Seleksi awal

hanya menentukan mikrobia yang dapat menghasilkan suatu

produk, tetapi belum memperhatikan kemampuannya untuk

berproduksi secara kualitatif

b. Seleksi lanjut

hasil seleksi awal/primer digunakan untuk memilih mikrobia yang

potensiil untuk proses industri secara kuantitatif

Pada tahap sreening dilakukan identifikasi dan determinasi biakan murni

hasil isolasi yang meliputi:

Morfologi individual

(ukuran, bentuk, ada/tidak spora, reaksi pengecatan dll)

Morfologi koloni

(bentuk, ukuran, warna, tekstur koloni dll)

Sifat biokimia faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan

(perubahan KH, hidrolisa lemak/protein, reduksi unsur-unsur,

pembentukan pigmen)

Patogenitas

Dll

Pengujian Kualitatif:

a. Mikrobia penghasil enzim amilase

mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan pada petridish berisi pati

+ agar, inkubasikan

gores dan masukkan ke dalam tabung reaksi, + larutan Iod

apabila dalam tabung reaksi terbentuk warna biru kehitaman

maka mikrobia menghasilkan enzim amilase

b. Mikrobia penghasil enzim lipase

mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan dalam pertidish berisi

tributirin + agar, inkubasikan

koloni bakteri digores, jika sekitar goresan terbentuk warna

terang berarti ada enzim lipase

c. Mikrobia penghasil enzim protease

mikrobia hasil isolasi ditumbuhkan dalam media yang

mengandung 1% skim + agar, inkubasikan.

koloni bakteri digores, jika sekitar goresan berwarna terang

berarti mengandung enzim protase

Pengujian Kuantitatif:

Di lakukan untuk mengukur kemampuan mikrobia yang dipilih untuk

keperluan industri

Dilakukan dengan:

a. Menghitung jumlah sel

b. menghitung konsentrasi produk yang dihasilkan

Kultur hasil isolasi dan screening disimpan untuk dipelihara lebih lanjut

kultur yang dipelihara harus memenuhi syarat:

1. Memiliki genetika yang stabil serta tak mudah mengalami mutasi

2. Dapat tumbuh dengan cepat

3. Dapat dipelihara dalam waktu lama

4. Segera membentuk sel vegetatif atau spora sesuai yang diinginkan

5. Memiliki kemampuan sistem protek si diri

Dilakukan untuk mengukur kemampuan mikrobia yang dipilih untuk

keperluan industri

Dilakukan dengan:

a. menghitung jumlah sel

b. Menghitung konsentrasi produk yang dihasilkan

Kultur hasil isolasi dan screening disimpan untuk dipelihara lebih

lanjut kultur yang dipelihara harus memenuhi syarat:

1. Memiliki genetika yang stabil serta tak mudah mengalami mutasi

2. Dapat tumbuh dengan cepat

3. Dapat dipelihara dalam waktu lama

4. Segera membentuk sel vegetatif atau spora sesuai yang

diinginkan

5. Memiliki kemampuan sistem proteksi diri

Pengujian Kuantitatif:

1. Penyimpanan suhu Rendah

a. Penyimpanan dalam agar miring

kultur ditumbuhkan dalam agar miring

simpan dalam refrigerator (5oC) atau freezer (-20oC)

setiap 6 bulan sekali dipindahkan ke media agar miring baru

b. Penyimpanan spora dalam air

spora jamur disuspensikan dalam air destilasi steril

simpan pada suhu 5oC

Penyimpanan /Pemeliharaan Kultur

c. Penyimpanan dengan nitrogen cair

Kultur sel pada fase stasioner disuspensikan dalam larutan

cryoprotective agent (Gliserol 10%)

masukkan dalam wadah bertutup, bekukan dengan nitrogen cair

hingga suhu – 150 s/d – 196oC

selama penyimpanan dapat terjadi kehilangan kemampuan

hidup/viabilitas

permasalahan : biaya tinggi

kerusakan alat karena perlakuan suhu rendah

2. Penyimpanan pada kondisi kering a. Kultur tanah (untuk menyimpan jamur/actinomycetes)

tanah basah steril diinokulasikan dengan kultur jamur

inkubasi beberapa hari sehingga tumbuh jamur

keringkan pada suhu kamar, simpan dalam RH rendah atau refrigerator 50 %

actynomycetes yang dikeringkan, dapat bertahan selama 20 tahun

b. Lyophilization (Liofilisasi/freeze drying)

- merupakan proses pembekuan kultur yang diikuti dengan pengeringan

pada kondisi vacum dengan proses sublimasi sempurna cairan sel

- kultur sel pada fase stasioner disuspensikan dalam medium pelindung

(susu, sodium glutamat, glukosa-pepton)

- beberapa tetes suspensi dimasukkan ke dalam ampul

dibekukan dalam ruang vacum, dilanjutkan pengeringan sehingga terjadi

sublimasi sempurna, ampul

sublimasi = molekul air dalam protoplasma langsung dirubah menjadi uap

air tanpa melalui fase cair

Hasil liofilisasi : sel mikrobia bersifat liofilik (berupa tepung yang

higroskopis)

Dalam lingkungan mikrobiologi dikenal 2 tipe kultur

1. Working Culture

merupakan kultur yang dipakai dalam kondisi tidak

terkontaminasi dan disimpan dalam agar stab/agar slant

preparasi dalam bentuk spora/kultur broth yang disimpan dalam

refrigerator (dikenal juga sebagai kultur stock)

harus dilakukan pengujian secara periodik terhadap µ, produksi,

kontaminasi

2. Primary Culture

merupakan kultur yang disimpan dalam jangka waktu lama dan

digunakan untuk membandingkan atau program seleksi lanjut

preparasi dilakukan dengan tanah steril atau agar broth yang

dilengkapi dengan penutup minyak steril atau disimpan dengan

metode liofilisasi