GUNTUR SETIAJI-FST.pdf
Transcript of GUNTUR SETIAJI-FST.pdf
KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
MINYAK HASIL EKSTRAKSI BIJI HONJE
(Etlingera elatior)
GUNTUR SETIAJI
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2014 M / 1435 H
KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
MINYAK HASIL EKSTRAKSI BIJI HONJE (Etlingera elatior)
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
Oleh:
GUNTUR SETIAJI
109096000031
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI (UIN) SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2014 M / 1435 H
PERNYATAAN
DENGAN INI SAYA MENYATAKAN BAHWA SKRIPSI INI ADALAH
HASIL KARYA SENDIRI YANG BELUM PERNAH DIAJUKAN SEBAGAI
SKRIPSI ATAU KARYA ILMIAH PADA PERGURUAN TINGGI ATAU
LEMBAGA MANAPUN.
Jakarta, Oktober 2014
Guntur Setiaji NIM. 109096000031
ABSTRAK GUNTUR SETIAJI, Karakterisasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Minyak Hasil Ekstraksi Biji Honje (Etlingera elatior) di bawah bimbingan DEDE SUKANDAR dan SITI NURBAYTI
Karakterisasi senyawa antioksidan dari minyak hasil ekstraksi biji honje (Etlingera elatior) telah dilakukan. Biji honje yang berasal dari Pangandaran, Jawa Barat, diekstraksi menggunakan metode sokletasi dengan pelarut n-heksan dan dietil eter, uji aktivitas antioksidan dengan metode TBA (Thiobarbituric acid) serta karakterisasi dengan GCMS, Spektrofotometer UV, dan FTIR. Sokletasi menggunakan pelarut n-heksan menghasilkan rendemen sebesar 2,75% sedangkan menggunakan pelarut dietil eter sebesar 1,94%. Hasil uji aktivitas antioksidan menunjukkan nilai IC50 dari minyak biji honje hasil sokletasi dengan pelarut n-heksan adalah 92,11 ppm, sedangkan hasil sokletasi dengan pelarut dietil eter adalah 122,45 ppm. Karakterisasi menggunakan GCMS menunjukkan tiga senyawa dengan persen area tinggi yang diduga bersifat antioksidan yaitu, oktadek-9-asam enoat (31,25%), asam askorbat-2,6-diheksadekanoat (12,55%) dan eukaliptol (4,46%). Pemisahan minyak biji honje hasil sokletasi dengan pelarut n-heksan menggunakan KLT diperoleh 3 isolat, di mana isolat 2 memiliki % inhibisi tertinggi yaitu 33,89%. Karakterisasi isolat 2 menggunakan spektrofotometer UV-Vis menunjukkan adanya gugus kromofor C=O pada λmaks 272,73 nm serta analisis FTIR menunjukkan adanya gugus –CH2– alifatik (2924,22 dan 2856,23 cm-1), gugus fungsi C=O (1746,67 dan 1715,89 cm-1), –CH3 alifatik (1459,64 dan 1377,53 cm-1), C–O alkohol (1239,96; 1163,46; dan 1119,39 cm-1), dan –CH2– (722,62 cm-1).
Kata kunci: Antioksidan, Etlingera elatior, GCMS, TBA (Thiobarbituric acid)
ABSTRACT GUNTUR SETIAJI, Characterization and Antioxidant Activity Assay of Extracted Oil from Etlingera elatior under the guidance of DEDE SUKANDAR and SITI NURBAYTI
Characterization of antioxidant compound from Etlingera elatior seed oil has been studied. E. elatior seed which came from Pangandaran, West Java, was extracted using soxhlet method in hexane and diethyl ether, the antioxidant activity was investigated using TBA (Thiobarbituric acid) assay, and characterization was performed using GCMS, UV Spectrophotometre, and FTIR. Soxhletation using hexane as solvent produce 2.75% yields, while using diethyl ether produce 1.94% yields. The result of antioxydant assay showed IC50 value of E. elatior seed oil that extracted by hexane is 92.11 ppm, while diethyl ether one is 122.45 ppm. The result of GCMS analysis indicated three chemical compounds with high percent area were estimated as antioxidant with octadec-9-enoic acid (31.25%) constituting the bulk of the oil from Etlingera elatior, followed by ascorbic acid-2,6-dihexadecanoic (12.55%) and eucalyptol (4.46%). TLC result of E. elatior seed oil that extracted by hexane showed 3 spot, which second spot has highest % inhibition value, at 33.89%. UV characterization of second spot indicated chromophore group C=O conjugated at λmaks at 272.73 nm and FTIR anlysis indicated –CH2– aliphatic (2924.22 and 2856.23 cm-1), C=O function group (1746.67 and 1715.89 cm-1), –CH3 aliphatic (1459.64 and 1377.53 cm-1), C–O alcohol (1239.96; 1163.46; and 1119.39 cm-1), and –CH2– (722.62 cm-1). Keywords: Antioxidant, Etlingera elatior, GCMS, TBA (Thiobarbituric acid)
viii
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirabbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat
Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis
dapat menyelesaikan penulisan dan penyusunan skripsi yang berjudul
“Karakterisasi dan Uji Aktivitas Antioksidan Minyak Hasil Ekstraksi Biji Honje
(Etlingera elatior)”. Shalawat dan salam semoga senantiasa tercurahkan kepada
Nabi Muhammad SAW beserta keluarga, para sahabatnya, dan para pengikutnya
yang selalu menjalankan Sunnahnya sampai hari kiamat.
Penulisan dan penyusunan skripsi ini dapat terselesaikan tidak lepas dari
bantuan berbagai pihak, maka pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima
kasih kepada:
1. Bapak Drs. Dede Sukandar, M.Si selaku Pembimbing I yang telah
membimbing dan membantu penulis dalam penelitian serta penulisan skripsi
ini serta selaku Ketua Prodi Kimia Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif
Hidayatullah Jakarta.
2. Ibu Siti Nurbayti, M.Si selaku Pembimbing II yang telah memberikan
bimbingannya dalam menyelesaikan penulisan dan penyusunan skripsi ini.
3. Bapak Dr. Agus Salim, M.Si selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
4. Ibu Yusraini Dian Inayati Siregar, M.Si dan Bapak Adi Riyadhi, M.Si selaku
penguji.
ix
5. Seluruh dosen Kimia FST UIN yang telah memberikan ilmu dan
pengetahuannya kepada penulis.
6. Seluruh Laboran di Laboratorium Kimia dan Pangan yang telah membantu
penulis selama penelitian berlangsung.
7. Kedua orang tua penulis, yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan
baik secara moril maupun materil kepada penulis.
8. Teman-teman penelitian Kimia Bahan Alam yang telah memberikan
informasi dan sharing ilmu selama melakukan penelitian, penulisan dan
penyusunan skripsi ini.
9. Teman-teman Kimia angkatan 2009 yang telah memberikan motivasi kepada
penulis.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini
masih banyak terdapat kesalahan dan kekurangan. Oleh karena itu, kritik dan
saran yang bermanfaat untuk kesempurnaan penulisan skripsi ini sangat penulis
harapkan. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi penulis secara
khusus dan bermanfaat serta dapat memberikan pengetahuan bagi para
pembacanya.
Jakarta, Oktober 2014
Penulis
x
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii
DAFTAR ISI .......................................................................................................... x
DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii
DAFTAR TABEL ............................................................................................... xv
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xvi
BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1
1.1. Latar Belakang ................................................................................................. 1
1.2. Rumusan Masalah ............................................................................................ 3
1.3. Hipotesis .......................................................................................................... 4
1.4. Tujuan Penelitian ............................................................................................. 4
1.5. Manfaat Penelitian ........................................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5
2.1. Honje (Etlingera elatior) ................................................................................. 5
2.1.1. Taksonomi Honje .................................................................................. 6
2.1.2. Morfologi Honje ................................................................................... 6
2.1.3. Manfaat Honje ...................................................................................... 8
2.1.4. Kandungan Kimia ................................................................................. 9
2.2. Ekstraksi ......................................................................................................... 11
2.2.1. Ekstraksi Cara Panas ........................................................................... 11
2.2.2. Ekstraksi Cara Dingin ......................................................................... 13
2.3. Radikal Bebas ................................................................................................ 14
xi
2.4. Antioksidan .................................................................................................... 18
2.4.1. Sumber-sumber Antioksidan .............................................................. 18
2.4.2. Mekanisme Kerja Antioksidan ........................................................... 20
2.4.3. Uji Antioksidan Metode Thiobarbituric Acid (TBA) ......................... 21
2.5. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ................................................................... 23
2.5.1. Fase diam KLT ................................................................................... 24
2.5.2. Fase gerak KLT .................................................................................. 25
2.6. Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS) ...................................... 26
2.6.1. Prinsip Kerja GCMS ........................................................................... 26
2.6.2. Instrumentasi GCMS .......................................................................... 27
2.7. Spektrofotometri UV-Vis (Ultraviolet-Visible) ............................................. 30
2.8. Spektrofotometri Infrared (IR) ...................................................................... 33
2.8.1. Gerak Molekul pada Infrared (IR) ..................................................... 34
2.8.2. Daerah Identifikasi pada Infrared (IR) ............................................... 35
2.8.3. Instrumentasi FTIR ............................................................................. 36
BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 38
3.1. Tempat dan Waktu Pelaksanaan .................................................................... 38
3.2. Bahan dan Alat ............................................................................................... 38
3.2.1. Bahan .................................................................................................. 38
3.2.2. Alat ..................................................................................................... 39
3.3. Prosedur Kerja................................................................................................ 39
3.3.1. Ekstraksi Sokletasi .............................................................................. 39
3.3.2. Penentuan Massa Jenis (Densitas) ...................................................... 39
xii
3.3.3. Uji Fitokimia ....................................................................................... 40
3.3.4. Uji Aktivitas Antioksidan ................................................................... 41
3.3.5. Analisis GC-MS .................................................................................. 42
3.3.6. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) .................................................. 43
3.3.7. Analisis Spektrofotometri UV ............................................................ 44
3.3.8. Analisis FTIR ...................................................................................... 44
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 45
4.1. Hasil Determinasi ........................................................................................... 45
4.2. Hasil Ekstraksi Sampel .................................................................................. 45
4.3. Hasil Uji Fitokimia......................................................................................... 46
4.4. Hasil Uji Antioksidan..................................................................................... 49
4.5. Hasil Analisis GC-MS ................................................................................... 51
4.7. Hasil Analisis Spektrofotometri UV .............................................................. 60
4.8. Hasil Analisis FTIR ....................................................................................... 61
4.9. Mekanisme Reaksi Antioksidan..................................................................... 63
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 65
5.1. Kesimpulan .................................................................................................... 65
5.2. Saran ............................................................................................................... 66
DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 67
LAMPIRAN ......................................................................................................... 73
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Peta Penyebaran Honje.......................................................................... 5
Gambar 2. (a) Pohon Honje (b) Buah Honjedan (c) Biji Honje.............................. 7
Gambar 3. Struktur stigmast-4-en-3-on (1) dan stigmast-4-en-6β-ol-3-on (2) ....... 9
Gambar 4. Struktur(E)-ß-Farnesen (3), ß-Pinen (4), Kariofilen (5), 1,1-dodekanadiol diasetat (6), (E)-5-Dodekana (7), Siklododekana (8), Struktur 1-dodekanol (9), 1-tetradekena (10), dan 5-(3-Metil-but-1-eniloksi)-benzena-1,2,4-triol (11) ........................................................ 10
Gambar 5. Ekstraktor Soklet ................................................................................. 12
Gambar 6. Ekstraktor Refluks ............................................................................... 12
Gambar 7. Struktur vitamin C (12), katekin (13), resveratrol (14), flavonoid (15), β-karoten (16), vitamin E (17), polifenol (18), BHA (19), BHT (20), dan TBHQ (21) .................................................................................... 19
Gambar 8. Reaksi antara Asam Linoleat dan Etanol untuk Pembentukan Lipid .. 22
Gambar 9. Reaksi Pembentukan Peroksidasi Lipid .............................................. 23
Gambar 10. Reksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA ...................................... 23
Gambar 11. Skema GCMS .................................................................................... 28
Gambar 12. Skema Spektrofotometer UV-Vis ..................................................... 30
Gambar 13. Reaksi Uji Terpenoid ........................................................................ 47
Gambar 14. Reaksi Uji Mayer .............................................................................. 48
Gambar 15. Reaksi Uji Dragendorff ..................................................................... 48
Gambar 16. Penentuan Waktu Setimbang ............................................................ 49
Gambar 17. Spektrum Hasil Analisis GC Minyak Biji Honje Hasil Ekstraksi n-heksan ............................................................................................. 52
xiv
Gambar 18. Struktur Senyawa eukaliptol (22), oktadek-9-asam enoat (23) dan asam askorbat-2,6-diheksadekanoat (24) .................................... 53
Gambar 19. Hasil Analisis MS Senyawa Eukaliptol ............................................ 53
Gambar 20. Prakiraan Pola Fragmentasi Senyawa Eukaliptol.............................. 54
Gambar 21. Hasil Analisis MS Senyawa Asam Askorbat-2,6-diheksadekanoat .. 55
Gambar 22. Prakiraan Pola Fragmentasi Senyawa Asam Askorbat-2,6- diheksadekanoat ................................................................................ 56
Gambar 23. Hasil Analisis MS Senyawa Oktadek-9-Asam Enoat ....................... 57
Gambar 24. Prakiraan Pola Fragmentasi Senyawa Oktadek-9-Asam Enoat ........ 57
Gambar 25. Struktur Senyawa terpinen-4-ol (25), p-cimen (26), alfa terpineol (27), dan alfa selinen (28) ................................................... 58
Gambar 26. Spot Minyak Biji Honje Ekstrak n-heksan pada KLT dengan Eluen n-heksan : kloroform (5:2) ...................................................... 59
Gambar 27. Spektrum UV Isolat 2 Minyak Biji Honje ........................................ 61
Gambar 28. Spektrum FTIR Isolat 2 Minyak Biji Honje...................................... 61
Gambar 29. Mekanisme Reaksi Antioksidan ......................................................... 64
xv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1. Ringkasan Data Transisi Elektronik ....................................................... 33
Tabel 2. Beberapa Frekuensi Gugus Fungsi pada Inframerah .............................. 36
Tabel 3. Hasil Uji Fitokimia ................................................................................. 46
Tabel 4. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan .............................................................. 50
Tabel 5. Senyawa-senyawa yang Memiliki Aktivitas Antioksidan ...................... 58
Tabel 6. Hasil Uji Antioksidan Isolat Hasil KLT ................................................. 60
Tabel 7. Hasil Analisis Spektrometer Inframerah ................................................. 63
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Honje (Etlingera elatior) ..................... 74
Lampiran 2. Bagan Kerja Penelitian ...................................................................... 75
Lampiran 3. Hasil Sokletasi Biji Honje ................................................................. 76
Lampiran 4. Hasil Uji Antioksidan ........................................................................ 78
Lampiran 5. Optimasi GCMS ................................................................................ 82
Lampiran 6. Komponen Senyawa Minyak Biji Honje Hasil Ekstraksi n-heksan ...... 83
Lampiran7. Foto Hasil Pemisahan KLT ................................................................ 85
Lampiran 8. Dokumentasi Penelitian ..................................................................... 86
1
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Radikal bebas adalah suatu senyawa yang mempunyai elektron tidak
berpasangan, sehingga senyawa ini bersifat sangat reaktif. Di dalam tubuh kita,
radikal bebas terbentuk secara terus menerus, baik melalui proses metabolisme sel
normal, peradangan, kekurangan gizi dan akibat respon terhadap pengaruh dari
luar tubuh, seperti polusi lingkungan yang disebabkan oleh asap rokok, asap
kendaraan bermotor, asap pembakaran pabrik, sinar ultraviolet (UV) dari cahaya
matahari, senyawa kimia, radiasi, dan lain-lain (Vimala, et al., 2003).
Pada keadaan normal, sejumlah kecil radikal bebas dihasilkan di dalam
tubuh untuk melawan peradangan, membunuh bakteri, dan memelihara fungsi
organ tubuh. Namun karena sifat radikal bebas yang sangat reaktif, jumlah radikal
bebas yang berlebihan dapat menggangu keseimbangan tubuh, serta dapat
berperan dalam terjadinya berbagai proses penyakit pada manusia (Arief, 2008).
Dampak reaktivitas senyawa radikal bebas bermacam-macam, mulai dari
kerusakan sel atau jaringan, penyakit autoimun, penyakit degeneratif, hingga
kanker. Namun reaktivitas radikal bebas itu dapat dihambat oleh sistem
antioksidan yang melengkapi sistem kekebalan tubuh. Secara kimiawi,
antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donors) atau
reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi,
dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan bekerja dengan cara
2
mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang bersifat radikal sehingga
aktivitas senyawa tersebut dapat dihambat (Winarsi, 2007).
Antioksidan akan bertindak sebagai pemburu radikal bebas dan
menghambat peroksidasi lipid dan radikal bebas lain pada proses mediasi, oleh
karena itu antioksidan mampu melindungi tubuh manusia dari beberapa penyakit
yang disebabkan oleh reaksi radikal bebas (Arora dan Chandra, 2011)
Senyawa antioksidan yang sering digunakan dalam industri pengolahan
pangan adalah senyawa antioksidan sintetis seperti butylated hydroxyanisole
(BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), propil galat (PG), ethoxyquin (EQ),dan
tert-butyl hydroquinone (TBHQ). Namun beberapa penelitian menemukan bahwa
penggunaan BHA dan BHT yang berlebihan dapat menjadi agen karsinogenik
penyebab penyakit kanker (Błaszczyk, et al., 2013).
Kondisi demikian mendorong penggunaan antioksidan alami yang aman
dikonsumsi bagi manusia. Beberapa jenis bahan pangan dapat menjadi sumber
antioksidan alami, misalnya rempah-rempah, teh, kakao, biji-bijian misalnya biji
atung (Parinarium glabemmum Hassk.) (Sarastani, et al., 2002), serealia, umbi-
umbian seperti umbi akar ginseng Jawa (Talinum trianguiare Wild.) (Estiasih dan
Kurniawan, 2006), sayur-sayuran dan daun-daunan seperti daun suji (Pleomele
angustifolia N.E. Brown) (Prangdimurti, et al., 2006). Menurut Pratt dan Hudson
(1990), antioksidan alami banyak terdapat dalam tanaman dan komponen tersebut
terkandung pada seluruh bagian tanaman seperti akar, daun, bunga, biji, batang,
kulit, ranting, dan buah.
3
Salah satu tanaman sumber antioksidan alami adalah tanaman honje
(Etlingera elatior). Menurut Antoro (1995), pada rimpang ditemukan senyawa
alkaloid, flavonoid dan minyak atsiri yang bertindak sebagai antioksidan.
Tampubolon, et al., (1983) menyebutkan bahwa honje mengandung senyawa
bioaktif seperti polifenol, alkaloid, flavonoid, steroid, dan saponin yang diduga
memiliki potensi sebagai antioksidan.
Hasil penelitian Jaafar, et al., (2007) menunjukkan adanya beberapa jenis
minyak atsiri pada daun, batang, bunga, dan rimpang tanaman ini masing-masing
0,0735%, 0,0029%, 0,0334%, dan 0,0021%. Ekstraksi dilakukan dengan metode
hidrodistilasi, dan dianalisis dengan menggunakan alat GCMS (Gas
Chromatography Mass Spectrometre). Hasil penelitian (Sukandar, et al., 2010)
menunjukan bahwa ekstrak air bunga honje memiliki aktivitas antioksidan dengan
nilai IC50 sebesar 61,6497 ppm.
Namun demikian penelitian mengenai karakterisasi minyak biji honje
belum pernah dilakukan. Hal inilah yang melatarbelakangi dilakukannya
penelitian ini, sebagai langkah untuk mengetahui potensi minyak biji honje
(Etlingera elatior) yang diduga memiliki aktivitas antioksidan.
1.2. Rumusan Masalah
1. Bagaimana aktivitas antioksidan minyak biji honje (Etlingera elatior) hasil
ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan dan dietil eter dengan menggunakan
metode TBA (thiobarbituric acid)?
4
2. Bagaimanakah karakteristik senyawa antioksidan dari minyak biji honje
(Etlingera elatior) yang memiliki aktivitas antioksidan paling baik
berdasarkan analisis GCMS, Spektrofotometri UV, dan FTIR?
1.3. Hipotesis
1. Minyak biji honje (Etlingera elatior) hasil ekstraksi menggunakan pelarut n-
heksan dan dietil eter memiliki aktivitas antioksidan.
2. Senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan dalam minyak biji honje
(Etlingera elatior) hasil ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan dan dietil
eter adalah senyawa golongan terpenoid.
1.4. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui aktivitas antioksidan minyak biji honje (Etlingera elatior) yang
diperoleh melalui proses sokletasi menggunakan pelarut n-heksan dan pelarut
dietil eter.
2. Mengidentifikasi senyawa yang yang memiliki aktivitas antioksidan yang
terkandung dalam minyak biji honje (Etlingera elatior).
1.5. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa minyak biji
honje (Etlingera elatior) hasil ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan dan dietil
eter memiliki potensi sebagai antioksidan, serta pemanfaatannya sebagai
antioksidan alami.
5
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Honje (Etlingera elatior)
Honje atau kecombrang merupakan tanaman suku Zingeberaceae genus
Nicolaia atau Etlingera yang terdistribusi di Asia Tenggara sampai ke Asia
Selatan dan Australia. Honje umumnya tersebar secara alami di Malaysia dan
Indonesia (Jawa dan Sumatera) tetapi tanaman ini secara luas ditanam sebagai
tanaman tropis untuk tanaman hias dan aromatik (Ibrahim dan Setyowati, 1999).
Menurut Emonocot (2010), honje merupakan tumbuhan endemik di Indonesia
(Jawa, Sumatera, dan Kalimantan), Malaysia, Thailand, dan sudah disebarkan ke
berbagai daerah lain seperti Indonesia bagian timur (Sulawesi, Maluku, dan
Papua), Filipina, sebagian Tiongkok, Puerto Rico, Honduras, Trinidad dan
Tobago, serta daerah lainnya. Adapun peta penyebaran honje menurut Emonocot
(2010) dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Peta Penyebaran Honje (Emonocot, 2010)
6
Honje mempunyai nama latin Etlingera elatior. Honje memiliki beberapa
nama latin yang lain, seperti Nicolaia speciosa Horan, Nicolaia elatior Horan,
Phaeomeria magnifica, speciosa, P. intermedia Valet (Tampubolon, et al., 1983).
Nama-nama lain di daerah tempat tanaman ini tumbuh yaitu kecombrang (Jawa
Tengah), honje (Sunda), kalo (Gayo), puwa kijung (Minangkabau), katinbung
(Makasar), salahawa (Seram), dan petikala (Ternate), (Hidayat dan Hutapea,
1991). Di Negara lain, dikenal dengan nama xiang bao jiang (Tiongkok),
gingembre aromatique (Perancis), boca de dragon (Spanyol), kantan (Malaysia),
kaa laa (Thailand), dan ginger bud/torch ginger (Inggris).
2.1.1. Taksonomi Honje
Menurut Hidayat dan Hutapea (1991), tanaman honje (E. elatior) memiliki
taksonomi sebagai berikut.
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Ordo : Zingiberales
Famili : Zingiberaceae
Genus : Etlingera
Spesies : Etlingera elatior
2.1.2. Morfologi Honje
Tanaman honje atau kecombrang merupakan tanaman tahunan yang
berbentuk semak dengan tinggi 1-3 m. Tanaman ini mempunyai batang semu,
tegak, berpelepah, membentuk rimpang, dan berwarna hijau. Daunnya tunggal,
7
lanset, ujung dan pangkal runcing tetapi rata, panjang daun sekitar 20-30 cm dan
lebar 5-15 cm, pertulangan daun menyirip, dan berwarna hijau (Gambar 2.a).
Bunga Honje merupakan bunga majemuk yang berbentuk bongkol dengan
panjang tangkai 40-80 cm, panjang benang sari ± 7, 5 cm dan berwarna kuning.
Putiknya kecil dan putih. Mahkota bunganya bertaju, berbulu jarang dan
warnanya merah jambu. Buah honje berbentuk kotak atau bulat telur dengan
warna kuning atau merah jambu (Gambar 2.b). Bijinya kecil dan berwarna coklat
(Gambar 2.c). Akarnya berbentuk serabut dan berwarna kuning gelap
(Syamsuhidayat, 1991).
(a)
(b) (c)
Gambar 2. (a) Pohon Honje (b) Buah Honjedan (c) Biji Honje (Petani Muda Bogor, 2014)
8
2.1.3. Manfaat Honje
Honje merupakan salah satu tanaman rempah yang sejak lama telah
dikenal dan dimanfaatkan manusia sebagai obat-obatan. Menurut Hidayat dan
Hutapea (1991), honje dapat dimanfaatkan sebagai pemberi citarasa pada
masakan, seperti urap, pecel, dan masakan lain. Honje juga dimanfaatkan sebagai
obat-obatan berkaitan dengan khasiatnya, yaitu sebagai penghilang bau badan dan
bau mulut. Penelitian pada rimpang honje telah mengungkapkan khasiat tanaman
ini sebagai antitumor dan antioksidan (Habsah, et al., 2005).
Menurut Sukandar et, al., (2010), ekstrak air bunga kecombrang memiliki
aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 61,65 μg/mL dan memiliki
kemampuansebagai antibakteri terhadap S. aureus dan E. coli. Selain itu, hasil
analisis GCMS pada penelitian yang sama mengungkapkan senyawa yang bersifat
antioksidan dari ekstrak air bunga kecombrang adalah senyawa golongan fenolik.
Hasil studi lain menunjukkan fakta yang lebih mengejutkan karena
ternyata tanaman ini dapat dipakai untuk mengobati penyakit-penyakit yang
tergolong berat yaitu kanker dan tumor. Senyawa kimia stigmast-4-en-3-on (1)
dan stigmast-4-en-6β-ol-3-on (2) (Gambar 3) dari rimpang tanaman ini terbukti
mempunyai sifat menghambat pertumbuhan tumor berdasarkan EBV-EA (Epstein
Barr Virus Early Antigens) assay. Senyawa-senyawa tersebut juga bersifat
sitotoksik terhadap kultur sel kanker CEM-SS (LC50 4 μg/mL) dan MCF-7 (LC50
6,25 μg/mL) berdasarkan MTT (Methyl Thiazole Tetrazolium) assay sehingga
direkomendasikan untuk dapat dipakai sebagai obat atau campuran obat anti
kanker (Habsah, et al., 2005).
9
O
H
H
H
(1) (2)
Gambar 3. Struktur stigmast-4-en-3-on (1) dan stigmast-4-en-6β-ol-3-on (2)
2.1.4. Kandungan Kimia
Honje atau kecombrang merupakan tanaman suku Zingeberaceae dengan
kandungan kimia daun, batang, bunga, dan rimpang mengandung saponin dan
flavonoida, selain itu rimpangnya juga mengandung polifenol dan minyak atsiri
(Hidayat dan Hutapea, 1991). Berdasarkan screening fitokimia yang dilakukan
Naufalin, et al. (2005) ditemukan bahwa bunga honje mengandung alkaloid,
flavonoid, polifenol, steroid, dan saponin.
Hasil penelitian oleh Jaafar, et al. (2007) pada daun, batang, bunga, dan
rimpang tanaman ini menunjukkan adanya beberapa jenis minyak essensial yang
bersifat bioaktif. Ekstraksi minyak essensial dilakukan dengan metode
hidrodistilasi sedangkan analisisnya menggunakan alat GC-MS (Gas
Chromatography Mass Spectrometer). Berdasarkan penelitian ini terungkap
bahwa terdapat kandungan minyak essensial pada daun sebesar 0,0735%, pada
bunga sebesar 0,0334%, pada batang sebesar 0,0029%, dan pada rimpang sebesar
0,0021%. Komponen utama minyak essensial pada daun adalah β-farnesen (3)
(27,9%), β-pinen (4) (19,7%), dan kariofilen (5) (15,36%), pada batang adalah
1,1-dodekanadiol diasetat (6) (34.26%) dan (E)-5-dodekana (7) (26.99%),
OH
O
H
H
H
10
sedangkan pada bunga dan akar adalah 1,1-dodekanadiol diasetat (6) (24.38% dan
40.37%) serta siklododekana (8) (47.28% dan 34.45%) (Gambar 4).
Sementara itu penelitian (Sukandar, et al., 2010) menunjukkan ekstrak air
bunga honje yang dianalisis dengan GC-MS memiliki tiga senyawa utama yaitu
1-dodekanol (9), 1-tetradekena (10), dan 5-(3-Metil-but-1-eniloksi)-benzena-
1,2,4-triol (11) (Gambar 4).
(3) (4) (5)
O
O
O
O
(6) (7)
OH (8) (9)
OH
HO
OH
O
(10) (11)
Gambar 4. Struktur(E)-ß-Farnesen (3), ß-Pinen (4), Kariofilen (5), 1,1-dodekanadiol diasetat (6), (E)-5-Dodekana (7), Siklododekana (8), Struktur 1-dodekanol (9), 1-tetradekena (10), dan 5-(3-Metil-but-1-eniloksi)-benzena-1,2,4-triol (11)
11
2.2. Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses pengambilan komponen kimia yang larut dalam
bahan atau sampel dengan menggunakan pelarut seperti air, alkohol, eter, dan
aseton (pelarut ekstraksi tidak boleh saling bercampur). Pemisahan komponen
terjadi atas dasar kemampuan kelarutan yang berbeda dari komponen-komponen
yang terdapat di dalam campuran (Harborne, 1987). Beberapa metode yang
digunakan untuk melakukan proses ekstraksi, yaitu:
2.2.1. Ekstraksi Cara Panas
1. Sokletasi
Sokletasi merupakan ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang
umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi secara kontinu
dan jumlah pelarutnya terbatas dan relatif konstan dengan adanya pendingin balik
(Gambar 5) (Ditjen POM, 1997). Penarikan komponen kimia yang dilakukan
dengan cara serbuk simplisia ditempatkan dalam selongsong yang telah dilapisi
kertas saring sedemikian rupa. Cairan penyari dipanaskan dalam labu alas bulat
sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi molekul-
molekul cairan penyari yang jatuh ke dalam selongsong menyari zat aktif di dalam
simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan
akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi.
Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan di sifon tidak berwarna. Ekstrak yang
diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan (Sudjadi, 1986).
Kelebihan metode sokletasi yaitu, dapat mengekstraksi sampel dengan
sempurna, karena dalam metode ini penyarian dilakukan beberapa kali atau secara
kontinu da
Namun m
yang mud
2. Reflu
Re
didihnya,
dengan ad
proses pa
ekstraksi
senyawa-s
an dalam ke
metode ini ti
ah rusak ak
Gam
uks
efluks meru
selama wak
danya pend
ada residu
sempurna.
senyawa yan
Gamb
eadaan pana
idak dapat
kibat panas (
mbar 5. Ekstr
upakan ek
ktu tertentu
dingin balik
pertama sa
Metode i
ng tidak tah
bar 6. Ekstr
as, selain itu
digunakan
(Heinrich, e
raktor Sokle
kstraksi den
dan jumlah
k (Gambar
ampai 3-5
ini tidak d
han panas (D
raktor Reflu
u pelarut ya
untuk men
et al., 2012)
et (Winefor
ngan pelar
h pelarutnya
6). Umumn
kali sehing
dapat digu
Ditjen POM
uks (Riley, e
ang digunak
ngekstrak se
).
rdner, 2003)
rut pada t
a terbatas da
nya dilakuk
gga dapat t
nakan untu
M, 1997).
et al., 2014)
kan lebih se
enyawa-sen
)
temperatur
an relatif ko
kan pengula
termasuk p
uk mengek
)
12
edikit.
nyawa
titik
onstan
angan
proses
kstrak
13
2.2.2. Ekstraksi Cara Dingin
1. Maserasi
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan
dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari dan pada umumnya
dilakukan pada temperatur ruang. Cairan penyari akan menembus dinding sel atau
masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif tersebut akan
larut karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel
dengan di luar sel. Larutan yang lebih pekat (di dalam sel) didesak keluar sel,
masuk ke dalam larutan di luar sel. Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi
keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Keuntungan
cara penyarian ini adalahcara pengerjaan dan peralatan yang diusahakan
sederhana dan mudah digunakan. Maserasi juga dapat digunakan untuk
mengekstrak senyawa-senyawa yang tidak tahan panas karena tidak dilakukan
pemanasan. Akan tetapi hal tersebut mengakibatkan proses ekstraksi yang kurang
sempurna (Ditjen POM, 1997) (Raaman, 2006).
2. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai
sempurna yang umumnya dilakukan pada temperatur ruang. Prosesnya dilakukan
dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi
dalam bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori. Cairan penyari
dialirkan dari atas ke bawah melalui simplisia tersebut. Cairan penyari akan
melarutkan zat aktif dalam sel-sel simplisia yang dilalui sampai keadan jenuh.
Gerakan ke bawah disebabkan oleh karena gravitasi, kohesi, dan berat cairan di
14
atas dikurangi gaya kapiler yang menahan gerakan ke bawah. Aliran cairan
penyari menyebabkan adanya pergantian larutan sehingga ekstraksi berlangsung
lebih optimal dibandingkan dengan maserasi. Akan tetapi proses tersebut
membutuhkan waktu yang lama (Ditjen POM, 1997) (Raaman, 2006).
2.3. Radikal Bebas
Menurut Soeatmaji (1998), yang dimaksud radikal bebas (free radical)
adalah suatu senyawa atau molekul yang mengandung satu atau lebih elektron
tidak berpasangan pada orbital luarnya. Adanya elektron yang tidak berpasangan
menyebabkan senyawa tersebut sangat reaktif mencari pasangan, dengan cara
menyerang dan mengikat elektron molekul yang berada di sekitarnya. Radikal
bebas memiliki reaktivitas yang sangat tinggi. Hal ini ditunjukkan oleh sifatnya
yang segera menarik atau menyerang elektron di sekelilingnya. senyawa radikal
bebas juga dapat mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal. Target utama
radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur
DNA termasuk karbohidrat. Serangan radikal bebas terhadap molekul
sekelilingnya akan menyebabkan terjadinya reaksi berantai, yang kemudian
menghasilkan senyawa radikal baru.
Menurut Winarsi (2007), tahapan reaksi pembentukan radikal bebas mirip
dengan rancidity oxidative, yaitu melalui 3 tahapan reaksi berikut.
1. Tahap inisiasi, yaitu awal pembentukan radikal bebas.
M++ + H2O → M+++ + OH- + •OH
R1-H + •OH → R1• + H2O
15
2. Tahap propagasi, yaitu pemanjangan rantai radikal
R2-H + R1• → R2• + R1-H
R3-H + R2• → R3• + R2-H
3. Tahap terminasi, yaitu bereaksinya senyawa radikal dengan radikal lain atau
dengan penangkap radikal, sehingga potensi propagansinya rendah.
R1• + R1• → R1-R1
R2• + R1• → R2-R1
R2• + R2• → R2-R2
Zat radikal bebas yang terlalu banyak dapat menyebabkan terjadinya
tekanan oksidatif (oxidative stress) di dalam tubuh. Tekanan oksidatif adalah
suatu keadaan dimana tingkat reactive oxygen intermediate (ROI) yang toksik
melebihi pertahanan antioksidan endogen. Keadaan ini mengakibatkan kelebihan
radikal bebas, yang akan bereaksi dengan asam nukleat seluler, protein, dan
lemak, sehingga terjadi kerusakan lokal dan disfungsi organ tertentu. Lemak
merupakan biomolekul yang rentan terhadap serangan radikal bebas (Arief, 2006).
Beberapa akibat yang ditimbulkan oleh radikal bebas, antara lain:
1. Kerusakan DNA
Kerusakan sel akibat reaktivitas senyawa radikal mengawali timbulnya
berbagai penyakit degeneratif seperti kanker, infeksi, rheumatoid, liver, dan aging.
Keadaan ini terjadi karena interaksi senyawa oksigen reaktif dengan DNA
mengawali terbentuknya DNA adduct selama proses replikasi, yang berakibat
terjadinya mutasi DNA. Kerusakan DNA ditunjukkan oleh bagian gula dan basa
16
yang mudah teroksidasi sehingga menyebabkan degradasi dan hancurnya single-
strand (Winarsi, 2007).
2. Kerusakan protein
Protein dan asam nukleat lebih tahan terhadap radikal bebas dari pada
polyunsaturated fatty acid (PUFA), sehingga kecil kemungkinan dalam terjadinya
reaksi berantai yang cepat. Serangan radikal bebas terhadap protein sangat jarang
kecuali bila sangat ekstensif. Hal ini terjadi hanya jika radikal tersebut mampu
berakumulasi (jarang pada sel normal), atau bila kerusakannya terfokus pada
daerah tertentu dalam protein. Salah satu penyebab kerusakan terfokus adalah jika
protein berikatan dengan ion logam transisi (Droge, 2002).
3. Peroksidasi lemak
Membran sel kaya akan sumber polyunsaturated fatty acid, yang mudah
dirusak oleh bahan-bahan pengoksidasi, proses tersebut dinamakan peroksidasi
lemak. Hal ini sangat merusak karena merupakan suatu proses berkelanjutan. Dari
ketiga biomolekul ini, lemak merupakan biomolekul yang sangat rentan terhadap
serangan radikal bebas karena memiliki ikatan π (rangkap) yang terdelokalisasi.
Proses reaksi serangan radikal terhadap lemak berlangsung melalui beberapa
tahapan, yaitu secara inisiasi, propagasi, dan terminasi (Droge, 2002).
Salah satu hasil produk degradasi lemak adalah malondialdehid (MDA).
Malondialdehid (MDA) secara luas banyak digunakan sebagai salah satu indikator
peroksidasi lipid yang dapat ditentukan dalam suatu pengukuran dengan
menggunakan asam tiobarbiturat (Winarsi, 2007).
17
Tidak selamanya radikal bebas berbahaya. Tubuh menghasilkan radikal
bebas karena radikal bebas juga memiliki manfaat bagi tubuh, yaitu untuk
membunuh patogen yang menginvasi tubuh. Radikal bebas menjadi berbahaya
jika jumlahnya berlebihan dan lebih banyak dari antioksidan yang berada di dalam
tubuh, hal ini akan menyebabkan kerusakan oksidatif. Tubuh dilengkapi dengan
sel-sel inflamasi seperti sel granulosit, monosit, dan makrofag, yang dapat
memproduksi senyawa-senyawa yang bersifat oksidan. (Winarsi, 2007).
Berikut beberapa contoh peranan radikal bebas sebagai senyawa oksigen
reaktif dan senyawa nitrogen reaktif yang secara fisiologis berperan sebagai
regulator dalam metabolisme.
1. Anion superoksida berperan dalam kemotaksis bakteri.
2. Senyawa oksigen reaktif berperan dalam proses bakterisidal dan bakteriolisis
normal. Seperti diketahui, senyawa oksigen reaktif jugfa disintesis sel fagosit
melalui jalur NADP oksidase, seperti radikal O2 dan H2O2 yang berperan
sebagai pembunuh bakteri (bakterisidal). Oleh sebab itu seseorang yang
kekurangan NADP oksidase akan mudah mengalami inflamasi berulang.
3. Radikal O2 memiliki sifat vasokonstriktor pada otot halus atau dalam
fibroblas.
4. Senyawa oksigen reaktif berperan dalam sintesis DNA karena aktivitas
ribonukleotida reduktase (yang mengubah ribosa menjadi doksiribosa) sangat
bergantung pada senyawa oksogen reaktif.
5. Senyawa oksigen reaktif berperan dalam kapasitasi spermatozoid sehingga
keberadaannya sangat berfungsi dalam fertilisasi.
18
2.4. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menghambat radikal bebas
sehingga antioksidan dapat mencegah penyakit-penyakit yang dihubungkan
dengan radikal bebas seperti karsinogenesis, kardiovaskular, dan penuaan
(Gutteridge dan Halliwell, 2000). Arti lainnya, antioksidan adalah senyawa yang
dapat melawan dan menetralisir radikal bebas dan memperbaiki kerusakan
oksidatif pada molekul biologis (Vimala, et al., 2003).
2.4.1. Sumber-sumber Antioksidan
a) Antioksidan alami
Antioksidan alami berasal dari tumbuhan yang sering dikonsumsi dan
telah diisolasi. Antioksidan yang terdapat dalam tumbuhan mengandung vitamin
C (12), katekin (13), resveratrol (14), flavonoid (15), β-karoten (16), vitamin E
(17), dan polifenol (18) (Gambar 7) (Hernani dan Rahardjo, 2006).
b) Antioksidan sintetik
Antioksidan sintetik diizinkan penggunaannya dalam makanan untuk
menjaga mutu dan dari perubahan sifat kimia makanan akibat proses oksidasi
yang terjadi terutama pada waktu penyimpanan. Beberapa contoh antioksidan
sintetik yang diijinkan penggunaanya secara luas diseluruh dunia untuk digunakan
dalam makanan adalah Butylated Hidroxyanisol (BHA) (19), Butylated
Hidroxytoluene (BHT) (20), dan Tert-Butylated Hidroxyquinon (TBHQ) (21)
(Gambar 7). Antioksidan tersebut merupakan antioksidan yang telah diproduksi
secara sintetis untuk tujuan komersial (Buck, 1991).
19
OH
OH
HO
OO
HO
(12) (13)
O
O (14) (15)
(16)
O
HO
OH
HO
O OH
OHO
O
OHO
OH
HO
O O
OH
OH
OH
HO
(17) (18)
OH
OCH3
C(CH3)3
OH
OCH3
C(CH3)3(H3C)3C
OH
OH
C(CH3)3
(19) (20) (21)
Gambar 7. Struktur vitamin C (12), katekin (13), resveratrol (14), flavonoid (15), β-karoten (16), vitamin E (17), polifenol (18), BHA (19), BHT (20), dan TBHQ (21)
O
OH
OHHO
OH
OH
HO
OH
OH
20
2.4.2. Mekanisme Kerja Antioksidan
Antioksidan dalam menghambat jalannya reaksi oksidasi dapat melalui
beberapa cara, yaitu mekanisme donor proton, radical scavenger, oxygen
quencher, inhibisi dengan enzim, dan sinergis (Gordon, 1990).
Peranan antioksidan khususnya antioksidan fenolik dalam peroksida lipid
dapat digambarkan sebagai berikut:
ROO• + AH → ROOH + A•
RO• + AH → ROH + A•
R• + AH → RH + A•
HO• +AH → H2O + A•
Pada reaksi tersebut antioksidan (AH) bertindak sebagai donor hidrogen,
di mana hidrogen tersebut akan berikatan dengan radikal bebas (ROO•, RO•, R•,
dan HO•) dari lemak atau minyak sehingga membentuk senyawa yang stabil.
Pemberian atom hidrogen ini juga merupakan tahap awal dari mekanisme
antioksidan melalui radical scavenger (pemerangkap radikal). Radikal baru yang
terbentuk yaitu A• dapat langsung bergabung dengan radikal-radikal lain
membentuk senyawa yang tidak reaktif. Beberapa contoh radical scavenger
adalah Vitamin C (12), β-karoten (16), vitamin E (tokoferol) (17), BHA (19), dan
BHT (20) (Winarsi, 2007).
Berdasarkan fungsinya, antioksidan dikelompokkan menjadi antioksidan
primer dan antioksidan sekunder.
21
1. Antioksidan primer
Antioksidan primer yaitu antioksidan yang dapat bereaksi dengan radikal
lipid lalu mengubahnya ke bentuk yang lebih stabil. Antioksidan primer bekerja
untuk mencegah terbentuknya reaksi berantai radikal bebas dengan melepaskan
hidrogen sehingga tidak mampu lagi untuk bereaksi. Contohnya adalah enzim
SOD (Superoxide Dismutase) yang berfungsi sebagai pelindung sel dalam tubuh
serta mencegah proses peradangan karena radikal bebas. Antioksidan primer
seperti enzim SOD (Superoxide Dismutase), enzim katalase, dan enzim glutation
peroksidase. (Gordon, 1990).
2. Antioksidan sekunder
Antioksidan sekunder berfungsi menangkap senyawa radikal serta
mencegah terjadinya reaksi berantai. Antioksidan sekunder seperti vitamin C,
vitamin E, β-karoten, bilirubin, albumin, asam eritrobat (D-isomer asam askorbat)
dan garam sodiumnya, dilauril tiopropionat (Gordon, 1990).
2.4.3. Uji Antioksidan Metode Thiobarbituric Acid (TBA)
Metode TBA digunakan untuk mengetahui tingkat peroksidasi lipid. Pada
pH rendah dan suhu tinggi (100°C), ikatan malondialdehid–TBA akan berubah
menjadi kompleks MDA-TBA berwarna merah muda yang dapat diukur pada
panjang gelombang 532 nm (Naphade, et al., 2009). Senyawa tiga karbon
malondialdehid (MDA) adalah produk dekomposisi utama karbonil pada proses
autooksidasi dari lipid tak jenuh.
Menurut Jiun (2007), asam linoleat adalah suatu asam lemak yang
memiliki gugus fungsi –COOH. Campuran asam linoleat dan etanol dalam larutan
22
sampel akan membentuk ester (minyak atau lemak) yang dilakukan secara sintetik
dan berfungsi sebagai sampel lipid (Gambar 8).
CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH + C2H5OH
Asam linoleat Etanol
CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOC2H5 + H2O
Lipid Air
Gambar 8. Reaksi antara Asam Linoleat dan Etanol untuk Pembentukan Lipid (Jiun, 2007)
Asam linoleat yang bereaksi dengan etanol akan menghasilkan lipid.
Oksidasi lipid akan membentuk radikal peroksida (Gambar 9). Pada asam linoleat,
reaksi inisiasi terjadi pada C11, membentuk radikal karbon. Atom H diambil dari
asam linoleat menghasilkan radikal bebas. Jika radikal bebas sudah terbentuk,
radikal ini akan bereaksi dengan O2 membentuk radikal peroksil dan selanjutnya
dapat mengambil H dari molekul tak jenuh yang lain untuk menghasilkan peroksil
dan dan radikal bebas baru. Reaksi terjadi secara terus–menerus atau disebut pula
sebagai reaksi berantai (Deman, 1997). Reaksi terminasi terjadi ketika radikal
peroksil bereaksi dengan senyawa antioksidan. Produk yang dihasilkan berupa
hidroperoksida dan radikal antioksidan yang stabil (Poedjiadi, 2007).
23
LOO .
Rantai panjang asam lemak tak jenuh (LH)
RR
Radikal peroksil
CH3CH3
OO•
LH
X
Radikal bebasXH
O2
CH3CH3
OOH
L
Hidroperoksida lemak
CH3 CH•
CH3
L
CH3CH• CH3
Peroksida siklik
Penataan ulang
L
CH3CH3
O O
O O
H HMalondialdehid
+
Gambar 9. Reaksi Pembentukan Peroksidasi Lipid (Singh, et al., 2001)
Deteksi spektrofotometer dari senyawa kompleks MDA-TBA telah
digunakan secara luas pada oksidasi makanan dan jaringan biologi. Prinsip dasar
dari metode ini adalah reaksi yang terjadi antara 1 molekul MDA dengan 2
molekul TBA sehingga menghasilkan senyawa kompleks MDA-TBA berwarna
merah muda, yang dapat diukur dengan spektrofotometer (Tokur, et al., 2006).
Reaksi pembentukan kompleks MDA-TBA dapat dilihat pada Gambar 10.
NH
NH
O
S O O O
H H
N
N
OH
S OH N
NH
OH
OH
SH
2 + + 2H2O
Gambar 10. Reksi Pembentukan Kompleks MDA-TBA (Sugiman, 2000)
2.5. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan teknik pemisahan yang banyak
digunakan dalam proses pemurnian dan identifikasi senyawa kimia pada tanaman
obat. Prinsip KLT adalah pemisahan komponen berdasarkan distribusinya pada
24
fase diam dan fase gerak. Komponen yang memiliki interaksi lebih besar terhadap
fase diam akan tertahan lebih lama. Sebaliknya, komponen yang memiliki
interaksi lebih kecil terhadap fase diam akan bergerak lebih cepat. Fase diam yang
umum digunakan pada KLT adalah silika gel, alumina, kieselguhr, dan selulosa
(Adnan, 1997).
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan
lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan
yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih
sederhana dan dapat dikatakan bahwa hampir semua laboratorium dapat
melaksanakan setiap saat secara cepat (Gholib dan Rohman, 2007).
Beberapa keuntungan kromatografi lapis tipis antara lain: kromatografi
lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis; identifikasi pemisahan
komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi, atau dengan
radiasi menggunakan sinar ultra violet; dapat dilakukan elusi secara menaik
(ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi; dan
ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang akan
ditentukan merupakan bercak yang tidak bergerak (Gholib dan Rohman, 2007).
2.5.1. Fase diam KLT
Fase diam yang digunakan dalam KLT merupakan penyerap berukuran
kecil dengan diameter partikel antara 10-30 µm. Semakin kecil ukuran rata-rata
25
partikel fase diam dan semakin sempit kisaran ukuran fase diam, maka semakin
baik kinerja KLT dalam hal efisiensinya dan resolusinya. Penyerap yang paling
sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi
yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorpsi. Lapisan tipis yang digunakan
sebagai penyerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin
penukar ion, gel ekslusi, dan siklodekstrin yang digunakan untuk pemisahan kiral.
Beberapa penyerap KLT serupa dengan penyerap yang digunakan pada KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi). Kebanyakan penyerap dikontrol keteraturan
ukuran partikel dan luas permukaannya (Gholib dan Rohman, 2007).
2.5.2. Fase gerak KLT
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan
mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling
sederhana adalah campuran dua pelarut organik karena daya elusi campuran
kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat
terjadi secara optimal Gholib dan Rohman, 2007). Berikut adalah beberapa
petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT
merupakan teknik yang sensitif.
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf terletak
antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel,
polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi zat terlarut yang
berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit
26
polar seperti dietil eter ke dalam pelarut nonpolar seperti toluen akan
meningkatkan harga Rf secara signifikan.
4. Zat terlarut ionik dan zat terlarut polar lebih baik digunakan campuran pelarut
sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan
tertentu. Penambahan sedikit asam asetat atau amonia masing-masing akan
meningkatkan zat terlarut yang bersifat basa dan asam.
2.6. Gas Chromatography Mass Spectrometry (GCMS)
GCMS adalah teknik analisis yang menggabungkan dua metode analisis
yaitu kromatografi gas dan spektrometrimassa. Kromatografi gas adalah metode
analisis, di mana sampel terpisahkan secara fisik menjadi bentuk molekul-molekul
yang lebih kecil (hasil pemisahan berupa kromatogram). Sedangkan spektrometri
massa adalah metode analisis di mana sampel yang akan dianalisis diubah menjadi
ion-ionnya, dan massa dari ion-ion tersebut dapat diukur berupa spektrum massa
(Hermanto, 2008).
2.6.1. Prinsip Kerja GCMS
Pada GC hanya terjadi pemisahan untuk mendapatkan komponen yang
diinginkan, sedangkan bila dilengkapi dengan MS (berfungsi sebagai detektor)
akan dapat mengidentifikasi komponen tersebut, karena bisa mendapat spektrum
bobot molekul pada suatu komponen yang dapat dibandingkan langsung dengan
library (reference) pada software (Gritter, et al., 1991).
Proses pemisahan pada GC terjadi di dalam kolom (kapiler) melibatkan
dua fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam adalah zat yang ada di dalam
kolom, dan fase gerak adalah gas pembawa (helium atau hidrogen) dengan
27
kemurnian tinggi. Proses pemisahan terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan
alir tiap molekul di dalam kolom. Perbedaan tersebut disebabkan olehperbedaan
afinitas antar molekul dengan fase diam yang ada di dalam kolom. Proses
pendeteksian sampel pada MS diawali dengan diubahnya sampel yang berasal dari
GC menjadi ion-ion gasnya terlebih dahulu. Kemudian ion-ion tersebut
dilewatkan melalui suatu penganalisis massa (mass analyzer) yang berfungsi
secara selektif untuk memisahkan ion dengan satuan massa atom yang berbeda.
Terakhir ion-ion tersebut dideteksi oleh electron multiplier detector (lebih peka
dari detektor biasa) (Lingga, 2004).
2.6.2. Instrumentasi GCMS
Instrumentasi GC yang menggunakan spektrometer massa (MS) sebagai
detektor dapat digunakan untuk memisahkan campuran komponen dalam suatu
sampel, sekaligus mengidentifikasi komponen-komponen tersebut pada tingkat
molekuler. Senyawa-senyawa yang terpisah dari analisis GC akan keluar dari
kolom dan mengalir ke dalam MS, kemudian senyawa-senyawa tersebut
teridentifikasi berdasarkan bobot molekul. Molekul-molekul analat yang bersifat
netral diubah menjdi ion-ion dalam fase gas. Ion-ion yang dihasilkan kemudian
dipisahkan menurut rasio massanya (m/e). Spektrum massa dari analat yang
muncul dibandingkan dengan spektrum pada library MS sehingga akan diketahui
bobot molekul dari analat tersebut (Skoog et al., 2004). Skema GCMS dapat
dilihat pada Gambar 11.
28
Gambar 11. Skema GCMS (Kawana dan Miyagawa, 2011)
Bagian instrumentasi kromatografi gas-spektrometer massa sebagai berikut
(Khopkar, 1990) (Sudjadi, 1986) (Underwood dan Day, 2002):
1. Pengatur aliran gas (Gas Flow Controller). Tekanan diatur sekitar 1-4 atm
sedangkan aliran diatur 1-1000 liter gas per menit. Fase bergerak adalah gas
pembawa, yang paling lazim digunakan adalah He, N2, H2, Ar, tetapi untuk
detektor konduktivitas termal, He lebih disukai karena konduktivitasnya yang
tinggi. Gas pembawa dialirkan lebih dahulu pada suatu silinder berisi
molecular sieve untuk menyaring adanya kontaminasi pengotor.
2. Tempat injeksi sampel (injector). Sampel diinjeksikan dengan suatu mikro
syringe melalui suatu septum karte silikon ke dalam kotak logam yang panas.
Banyaknya sampel berkisar 0,5-10 μL.
3. Kolom kromatografi. tempat berlangsungnya proses kromatografi, kolom
memiliki variasi dalam ukuran dan bahan isian. Ukuran yang umum sepanjang
6 kaki dan berdiameter dalam ¼ inci, terbuat dari tabung tembaga atau baja
tahan karat, berbentuk spiral. Tabung diisi dengan suatu bahan padat halus
29
dengan luas permukaan besar yang relatif inert. Padatan tersebut adalah sebuah
penyangga mekanik untuk cairan. Sebelum diisi padatan tersebut diimpregnasi
dengan cairan yang diinginkan yang berperan sebagai fase stasioner. Cairan ini
harus stabil dan tidak mudah menguap pada temperatur ruang dan harus sesuai
untuk pemisahan tertentu.
4. Interface, Berfungsi untuk mengirimkan sampel dari GC ke MS dengan
meminimalkan kehilangan sampel saat pengiriman.
5. Sumber ion (ion source), tempat terjadinya proses ionisasi dari molekul yang
berupa uap. Molekul tersebut akan kehilangan satu elektron dan terbentuk ion
molekul bermuatan positif. Proses lain, molekul menangkap satu elektron
bermuatan negatif.
6. Pompa vakum (vacuum pump). Pompa vakum tinggi untuk mengurangi dan
mempertahankan tekanan pada MS saat analisis dan pompa vakum rendah
untuk mengurangi tekanan udara luar MS.
7. Penganalisis massa (mass analyzer). Susunan alat untuk memisahkan ion-ion
dengan perbandingan massa terhadap muatan yang berbeda. Penganalisis
massa harus dapat membedakan selisih massa yang kecil serta dapat
menghasilkan arus ion yang tinggi.
8. Detektor. Peka terhadap komponen-komponen yang terpisahkan di dalam
kolom serta mengubah kepekaannya menjadi sinyal listrik. Kuat lemahnya
sinyal bergantung pada laju aliran massa sampel dan bukan pada konsentrasi
sampel gas penunjang.
30
2.7. Spektrofotometri UV-Vis (Ultraviolet-Visible)
Spektrofotometer UV-Vis bermanfaat untuk penentuan konsentrasi
senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah ultraviolet (200-400
nm) atau daerah sinar tampak (400-800 nm). Biasanya cahaya terlihat merupakan
campuran dari cahaya yang mempunyai berbagai panjang gelombang (λ), dari
400-800 nm (Tahir, 2008).
Radiasi elektomagnetik berinteraksi dengan benda berupa berkas sinar
yang disebut foton. Energi setiap foton berbanding langsung dengan frekuensi
radiasi Foton yang memiliki frekuensi (υ) yang tinggi (λ pendek) mempunyai
energi yang lebih tinggi dari pada foton yang berfrekuensi rendah (λ panjang).
Intensitas berkas sinar sebanding dengan jumlah foton yang tak tergantung pada
energi setiap foton. Bila cahaya jatuh pada senyawa maka sebagian dari cahaya
akan diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan struktur dari molekul (Khopkar,
1990). Skema spektrofotometer UV-Vis dapat dilihat pada Gambar 12.
Gambar 12. Skema Spektrofotometer UV-Vis (Owen, 2000)
31
Setiap senyawa mempunyai tingkatan energi yang spesifik. Bila cahaya
yang mempunyai energi yang sama dengan perbedaan energi tereksitasi jatuh
pada senyawa, maka elektron-elektron pada tingkatan dasar dieksitasi ke tingkatan
tereksitasi dan sebagian energi cahaya yang sesuai dengan panjang gelombang
yang diserap. Elektron yang tereksitasikan melepaskan energi dengan proses
radiasi panas dan kembali ketingkatan dasar asal. Karena perbedaan energi antara
tingkat dasar dan tingkat tereksitasi spesifik untuk tiap-tiap bahan atau senyawa,
maka frekuensi yang diserap juga tertentu. Jika foton yang mengenai cuplikan
memiliki energi yang sama dengan yang dibutuhkan untuk menyebabkan
terjadinya perubahan energi, maka serapan dapat terjadi. Kekuatan radiasi juga
diturunkan dengan adanya penghamburan dan pemantulan, namun demikian
pengurangan-pengurangan ini sangat kecil bila dibandingkan dengan serapan
(Sastrohamidjojo, 2001).
Menurut Gholib dan Rohman (2007), penyerapan (absorpsi) sinar UV dan
sinar tampak pada umumnya dihasilkan oleh eksitasi elektron-elektron ikatan,
akibatnya panjang gelombang pita yang mengabsorpsi dapat dihubungkan dengan
ikatan yang mungkin ada dalam suatu molekul. Ada tiga macam proses
penyerapan energi ultraviolet dan sinar tampak, yaitu: (1) penyerapan oleh transisi
elektron ikatan dan elektron anti ikatan; (2) penyerapan oleh transisi elektron d
dan f dari molekul kompleks; dan (3) penyerapan oleh perpindahan muatan.
Transisi-transisi elektronik yang terjadi di antara tingkat-tingkat energi di dalam
suatu molekul ada 4, yaitu transisi sigma – sigma anti ikatan (σ→σ*); transisi n –
sigma anti ikatan (n→σ*); transisi n – phi anti ikatan (n→π*); dan transisi phi –
phi anti ikatan (π →π*).
32
1. Transisi σ→σ*
Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan energi
sinar yang frekuensinya terletak di antara UV vakum (kurang dari 180 nm),
contoh: Metana, yang hanya mempunyai jenis ikatan -C-H, mempunyai pita
serapan elektron sigma pada panjang gelombang 125 nm.Jenis transisi ini (σ→σ*)
terjadi pada daerah ultraviolet vakum sehingga kurang begitu bermanfaat untuk
analisis dengan cara spektrofotometri UV-Vis.
2. Transisi n→σ*
Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung
atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang
diperlukan untuk transisi jenis ini lebih kecil dibanding transisi σ→σ* sehingga
sinar yang diserapun mempunyai panjang gelombang lebih panjang, yakni sekitar
150-250 nm. Kebanyakan transisi ini terjadi pada panjang gelombang kurang dari
200 nm.
3. Transisi n→π* dan transisi π →π*
Untuk kemungkinan terjadinya jenis transisi ini, maka molekul organik
harus mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga ikatan rangkap
dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang diperlukan. Jenis transisi ini
merupakan transisi yang paling cocok untuk analisis sebab sesuai dengan panjang
gelombang antara 200-700 nm, dan panjang gelombang ini secara teknis dapat
diaplikasikan pada spektrofotometer.
Beberapa gugus kromofor dan panjang gelombang maksimum telah
dijabarkan oleh Supratman pada tahun 2010 (Tabel 1).
33
Tabel 1. Ringkasan Data Transisi Elektronik (Supratman, 2010)
Contoh Transisi Elektronik λmax (nm) ɛmax Etana σ→σ* 135 Air n→σ* 167 7000
Metanol n→σ* 183 500 1-Heksanatiol n→σ* 224 126 n-Butil iodida n→σ* 257 486
Etilen π→π* 165 10000 Asetilen π→π* 173 6000 Aseton π→π* ~150
n→σ* 188 1860 n→π* 279 15
1,3-Butadiena π→π* 217 21000 1,3,5-Heksatriena π→π* 258 35000
Akrolein π→π* 210 11500 π→π* 315 14
Benzena Aromatik π→π* ~180 60000 Aromatik π→π* ~200 8000 Aromatik π→π* 255 215
Stiren Aromatik π→π* 244 12000 Aromatik π→π* 282 450
Toluen Aromatik π→π* 208 2460 Aromatik π→π* 262 174
Asetofenon Aromatik π→π* 240 13000 Aromatik π→π* 278 1110
n→π* 319 50 Fenol Aromatik π→π* 210 6200
Aromatik π→π* 270 1450
2.8. Spektrofotometri Infrared (IR)
Spektrofotometer infrared atau inframerah merupakan suatu metode yang
mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada pada
daerah panjang gelombang 0,75-1,000 μm atau pada bilangan gelombang 13.000-
10 cm-1. Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang, maka daerah
infrared dapat dibagi menjadi tiga bagian yaitu: daerah inframerah dekat,
34
pertengahan, dan daerah inframerah jauh. Berdasarkan pembagian daerah
spektrum elektromagnetik tersebut di atas, daerah panjang gelombang yang
digunakan pada alat spektrofotometer inframerah adalah pada daerah inframerah
pertengahan, yaitu pada panjang gelombang 2,5-50 μm atau pada bilangan
gelombang 4.000-200 cm-1 (Khopkar, 1990).
2.8.1. Gerak Molekul pada Infrared (IR)
Menurut Taufiq (2007), setiap senyawa pada keadaan tertentu mempunyai
tiga macam gerak, yaitu gerak translasi (perpindahan dari satu titik ke titik lain),
gerak rotasi (berputar pada porosnya) dan gerak vibrasi (bergetar pada
tempatnya). Selain gerak, setiap molekul juga memiliki harga energi tertentu. Bila
suatu senyawa menyerap energi dari sinar inframerah, maka tingkatan energi di
dalam molekul itu akan tereksitasi ke tingkatan energi yang lebih tinggi. Sesuai
dengan tingkatan energi yang diserap, maka yang akan terjadi pada molekul itu
adalah perubahan energi vibrasi yang diikuti dengan perubahan energi rotasi.
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi
molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
1. Streching (vibrasi regang/ulur): vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi
perpanjangan atau pemendekan ikatan.
2. Bending (vibrasi lentur/tekuk): vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan
sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan.
Bending juga ada dua macam yaitu in plane bending (tekuk pada bidang)
dan out of plane bending (tekuk tidak pada bidang). In plane bending dibagi
menjadi dua yaitu scissoring (gerakan gunting) dan rocking (seperti kursi
35
goyang). Out of plane bending juga dibagi menjadi dua yaitu wagging (bergoyang
ke depan dan ke belakang) dan twisting (memutar) (Panji, 2011).
2.8.2. Daerah Identifikasi pada Infrared (IR)
Harborne (1987), menyebutkan bahwa daerah pada spektrum inframerah
di atas 1200 cm-1 menunjukkan pita spektrum atau puncak yang disebabkan oleh
getaran (vibrasi) ikatan kimia atau gugus fungsi dalam molekul yang dianalisis,
sedangkan daerah di bawah 1200 cm-1 menunjukkan pita yang disebabkan oleh
getaran seluruh molekul, dan karena kerumitannya dikenal sebagai daerah sidik
jari.
Vibrasi yang digunakan untuk identifikasi adalah vibrasi bengkokan,
khususnya goyangan (rocking), yaitu yang berada di daerah bilangan gelombang
2000-400 cm-1, karena di daerah antara 4000-2000 cm-1 merupakan daerah khusus
berguna untuk identifikasi gugus fungsional. Daerah ini menunjukkan absorbsi
yang disebabkan oleh vibrasi regangan, sedangkan daerah antara 2000-400 cm-1
seringkali sangat rumit, karena vibrasi regangan maupun bengkokan
mengakibatkan absobrsi pada daerah tersebut. Pada daerah 2000-400 cm-1 tiap
senyawa organik mempunyai absorbsi yang unik, sehingga daerah tersebut sering
juga sebut sebagai daerah sidik jari (fingerprint region). Meskipun pada daerah
2000-400 cm-1 menunjukkan absorbsi yang sama, pada daerah 2000-400 cm-1 juga
harus menunjukkan pola yang sama sehingga dapat disimpulkan bahwa dua
senyawa adalah sama (Underwood dan Day, 2002).
Beberapa gugus fungsi dan bilangan gelombang (cm-1) telah diungkapkan
oleh Underwood dan Day (1986) (Tabel 2).
36
Tabel 2. Beberapa Frekuensi Gugus Fungsi pada Inframerah (Underwood dan Day, 2002)
Gugus Fungsi Nama Gugus Fungsi Daerah Serapan (cm-1) OH Alkohol 3580-3650
Ikatan-H 3210-3550 Asam 2500-2700
NH Amina 3300-3700 CH Alkana 2850-2960
Alkena 3010-3095 Alkuna 3300 Aromatik ~3030
C≡C Alkuna 2140-2260 C=C Alkena 1620-1680
Aromatik ~1600 C=O Aldehida 1720-1740
Keton 1675-1725 Asam 1700-1725 Ester 1720-1750
C≡N Nitril 2000-2300 NO2 Nitro 1500-1650
2.8.3. Instrumentasi FTIR
Menurut Supratman (2010), spektrometer inframerah umumnya
merupakan spektrometer double-beam (berkas ganda) dan terdiri dari lima bagian
utama: sumber radiasi, daerah cuplikan, fotometer, kisi difraksi (monokromator),
dan detektor.
1. Sumber radiasi
Biasanya dihasilkan oleh pemijar Nerst dan Globar. Pemijar Nerst
merupakan batang cekungan dari Zirkonium dan Ytrium oksida yang dipanasi
hingga 1500oC dengan arus listrik. Pemijar Globar merupakan batang silikon
karbida yang dipanasi hingga 1200oC, sehingga memancarkan radiasi kontinu
pada daerah 1-40 µm.
37
2. Monokromator
Terdiri dari celah masuk dan celah keluar, alat pendespresi yang berupa
kisi difraksi atau prisma, dan cermin untuk memantulkan dan memfokuskan sinar.
Bahan prisma adalah natrium klorida, kalium bromida, sesium bromida dan litium
fluorida. Prisma natrium klorida paling banyak digunakan, karena dispersinya
tinggi untuk daerah 5,0-16 µm, tetapi kurang baik untuk daerah antara 1,0-5,0 µm.
3. Detektor
Sebagian besar alat modern menggunakan detektor panas. Detektor
fotolistrik tidak dapat digunakan untuk mendeteksi sinar inframerah, karena
energi foton inframerah tidak cukup besar untuk membebaskan elektron dari
permukaan katoda.
38
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Penelitian ini dilaksanakan di Pusat Laboratorium Terpadu Universitas
Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, dimulai pada bulan Maret 2013
sampai bulan Februari 2014.
3.2. Bahan dan Alat
3.2.1. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan
tumbuhan dan bahan kimia.
a. Bahan tumbuhan
Bahan tumbuhan yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian ini
adalah biji honje (E. elatior) yang diperoleh dari Desa Cintaratu, Kecamatan
Parigi, Kabupaten Pangandaran, Jawa Barat. Biji honje diambil pada musim hujan
bulan Oktober 2012. Sampel telah dilakukan determinasi tumbuhan di Herbarium
Bogoriense, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor.
b. Bahan kimia
Bahan kimia yang digunakan adalah n-heksan, dietil eter, etanol (teknis
dan p.a), kloroform, Vitamin E (Alpha-Tocopherol) (CLR Fostpach), Vitamin C
(Ascorbic Acid) (Merck), DMSO, Asam Linoleat 75% (CLR Fostpach), TBA
(Thiobarbituric Acid) (Merck), larutan buffer pH 7, dan pereaksi fitokimia.
39
3.2.2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari alat-alat gelas,
timbangan analitik, ekstraktor soklet, rotary evaporator Heidolph Laborota 4000-
Efficient, inkubator Memmert, Centrifuge Hettich EBA 20, plat aluminium TLC
(Thin Layer Chromatography), GC-MS Shimadzu QP-2010, Spektrofotometer
UV Perkin Elmer Lambda 25, Spektrofotometer FTIR (Fourier Transform Infra
Red) Spectrum One Perkin Elmer.
3.3. Prosedur Kerja
3.3.1. Ekstraksi Sokletasi
Biji honje yang telah dikeringkan dan dihaluskan ditimbang, lalu dibungkus
dengan kertas saring dan diikat dengan tali dan dimasukkan dalam tabung
(ekstraktor) soklet. Kemudian dituangkan pelarut ke dalam labu soklet dan
dilakukan ekstraksi sampai warna pelarut di dalam tabung ekstraktor kembali
menjadi jernih. Pelarut yang digunakan adalah n-heksan dan dietil eter.
Temperatur disesuaikan dengan titik didih pelarut. Setelah selesai, sampel diambil
dari tabung soklet dengan pinset. Hasil sokletasi dipisahkan dari pelarut dengan
cara diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator. Setelah diperoleh minyak,
kemudian dicari massa jenis dan dihitung rendemennya.
% Rendemen = x 100%
3.3.2. Penentuan Massa Jenis (Densitas)
Penentuanmassa jenis dilakukan menggunakan alat piknometer.
Piknometer yang akan digunakan dicuci dengan akuades, dibilas dengan etanol
Massa minyak
Massa sampel
40
dan dietil eter serta dikeringkan bagian dalam piknometer. Setelah kering,
piknometer ditimbang dan dicatat nilainya. Selanjutnya piknometer diisi dengan
akuades hingga penuh kemudian piknometer berisi akuades tersebut dicelupkan
dalam penangas air pada suhu 25oC ± 0,2oC dan ditimbang. Piknometer yang
sudah berisi akuades dibilas kembali dengan etanol dan dietil eter, dan
dikeringkan. Piknometer yang sudah kering diisi dengan minyak biji honje hingga
penuh kemudian piknometer berisi minyak tersebut dicelupkan dalam penangas
air pada suhu 25oC ± 0,2oC dan ditimbang.Dihitung nilai massa jenisnya.
3.3.3. Uji Fitokimia
a. Identifikasi Alkaloid dengan metode Culvenor-Fitzgerald (Harborne, 1987)
Sampel dicampur dengan 5 mL kloroform dan 5 mL amoniak kemudian
dipanaskan, dikocok dan disaring. Ditambahkan 5 tetes asam sulfat 2 N pada
masing-masing filtrat, kemudian kocok dan didiamkan. Bagian atas dari masing-
masing filtrat diambil dan diuji dengan pereaksi Mayer, bourchardat, dan
Dragendorf. Terbentuknya endapan jingga, cokelat, dan putih menunjukkan
adanya alkaloid.
b. Identifikasi Flavonoid (Harborne, 1987)
Sampel dicampur dengan 5 mL etanol, dikocok, dipanaskan, dan dikocok
lagi kemudian disaring. Kemudian ditambahkan Mg 0,2 g dan 3 tetes HCl pekat
pada masing-masing filtrat. Terbentuknya warna merah pada lapisan etanol
menunjukkan adanya flavonoid.
41
c. Identifikasi Saponin (Harborne, 1987)
Sampel dididihkan dengan 20 mL air dalam penangas air. Filtrat dikocokdan
didiamkan selama 15 menit. Terbentuknya busa yang stabil berarti positif terdapat
saponin.
d. Identifikasi Steroid (Harborne, 1987)
Sampel diekstrak dengan etanol dan ditambah 2 mL asam sulfat pekat dan 2
mL asam asetat anhidrat. Perubahan warna dari ungu ke biru atau hijau
menunjukkan adanya steroid.
e. Identifikasi Terpenoid (Harborne, 1987)
Sampel dicampur dengan 2 mL kloroform dan 3 mL asam sulfat pekat.
Terbentuknya warna merah kecoklatan pada antar permukaan menunjukkan
adanya terpenoid.
f. Identifikasi Tanin (Edeoga, et al., 2005)
Sampel didihkan dengan 20 mL air lalu disaring. Ditambahkan beberapa
tetes feriklorida 1% dan terbentuknya warna coklat kehijauan atau biru kehitaman
menunjukkan adanya tanin.
3.3.4. Uji Aktivitas Antioksidan (Bakr, et al., 2013)
Sebanyak 10 mg sampel ditimbang kemudian dilarutkan dalam 10 mL
etanol p.a. dan beberapa tetes DMSO. Dari larutan ini kemudian dibuat larutan
dengan konsentrasi 10, 25, 50, 75, dan 100 ppm. Larutan sampel diambil
sebanyak 4 mL dan dimasukkan dalam tabung tertutup. Kemudian ditambahkan
asam linoleat 2,31% (dalam etanol) sebanyak 4,1 mL, larutan buffer fosfat pH 7
sebanyak 8 mL dan akuades sebanyak 3,9 mL. Tabung berisi campuran larutan
42
tersebut diinkubasi pada suhu 40oC selama 8 hari. Pada hari ke-4 sampai hari ke-8
dilakukan pengukuran absorbansi terhadap kontrol negatif untuk menentukan
waktu setimbang.
Pengujian aktivitas antioksidan metode Thiobarbituric Acid (TBA)
dilakukan pada saat waktu setimbang, yaitu ketika absorbansi kontrol negatif
mencapai titik optimum. Pengukuran dilakukan dengan cara diambil 1 mL larutan
sampel yang telah diinkubasi, ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 20% dan 2
mL larutan TBA 0.67%. Campuran dididihkan dalam penangas air selama 10
menit, kemudian didinginkan dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 menit.
Supernatan diukur pada panjang gelombang 532 nm. Sebagai kontrol adalah
perlakuan tanpa penambahan sampel dan sebagai pambanding terhadap sampel
digunakan Vitamin E dan Vitamin C.
Nilai serapan yang diperoleh dihitung sebagai % inhibisi dengan rumus
sebagai berikut:
% inhibisi =
3.3.5. Analisis GC-MS
Analisis GC-MS dilakukan untuk mengetahui komponen minyak biji honje
hasil sokletasimenggunakan pelarut n-heksan.Minyak biji honje dilarutkan dengan
n-heksan kemudian dimasukkan ke dalam vial, lalu sebanyak 1µL sampel
diinjeksikan ke dalam kolom RTx-MS Restech Polymethyl xyloxan, menggunakan
helium sebagai gas pembawa dan split rasio 1 : 200. Temperatur oven diatur pada
suhu 70°C selama 3 menit, perlahan-lahan temperatur ditingkatkan rata-rata 5°C
Akontrol – Asampel
Akontrol
43
permenit sampai 280°C dan suhu 280°C dipertahankan selama 5 menit.
Temperatur saat sampel diinjeksi pada suhu 230°C. Senyawa yang terdapat dalam
sampel diidentifikasi dengan membandingkan spektrum tersebut dengan senyawa
yang terdapat di dalam library. Cairan sampel yang dibawa dari GC diteruskan
sebagai sampel inlet MS, sumber ion pada suhu 250°C, fragmentasi ion yang
terbentuk dideteksi oleh analyzer berdasarkan rasio massa.
3.3.6. Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Plat KLT yang akan digunakan terlebih dulu diberi tanda batas atas dan
bawah, kemudian dimasukkan ke dalam oven selama 30 menit untuk mengurangi
kadar air pada plat KLT. Setelah selesai minyak ditotolkan pada garis dasar plat
KLT, lalu ditempatkan dalam chamber yang berisi eluen berupa campuran n-
heksan dan kloroform dengan perbandingan 5 : 2. Ketika pelarut mulai
membasahi plat KLT, pelarut akan melarutkan senyawa dalam bercak yang telah
ditempatkan pada dasar. Bila bercak-bercak pada plat KLT tidak tampak, dapat
digunakan penyinaran di bawah sinar UV. Selanjutnya dimasukkan lagi ke dalam
oven selama 30 menit. Bercak-bercak senyawa pada plat KLT yang telah terpisah
namun tidak terlihat jelas dapat dibantu dengan menyemprotkan pelarut H2SO4
1M. Selanjutnya dimasukkan ke dalam oven selama 30 menit dan hasilnya
diamati.
44
3.3.7. Analisis Spektrofotometri UV
Isolat pada KLT dikerik kemudian dilarutkan dengan 5 mL n-heksan,
kemudian divortex dan disaring. Setelah itu larutan dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV pada panjang gelombang 200-400 nm. N-heksan digunakan
sebagai blanko.
3.3.8. Analisis FTIR
Isolat pada KLT dikerik dan dilarutkan dengan 5 mL n-heksan. Kemudian
diteteskan pada permukaan sel KBr, ditutup dengan sel KBr yang lain sehingga
membentuk lapisan film kapiler. Sel diletakkan pada cell holder,kemudian analisis
menggunakan spektrofotometer FTIR pada bilangan gelombang 4000-450 cm-1.
45
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Determinasi
Determinasi sampel dilakukan Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian
Biologi LIPI, Bogor, Jawa Barat. Hasil determinasi ini menunjukkan bahwa
sampel merupakan spesies Etlingera elatior. Sertifikat hasil determinasi dapat
dilihat pada Lampiran 1.
4.2. Hasil Ekstraksi Sampel
Proses ekstraksi biji honje (Etlingera elatior) dilakukan menggunakan
metode sokletasi dengan pelarut n-heksan dan dietil eter. Penggunaan pelarut
nonpolar yaitu, n-heksan dan dietil eter pada proses ekstraksi bertujuan untuk
mendapatkan minyak biji honje. Menurut Munawaroh dan Handayani (2010)
untuk mendapatkan minyak dari bahan alam dapat dilakukan dengan
menggunakan metode sokletasi dengan pelarut nonpolar. Penggunaan metode
sokletasi mempunyai beberapa kelebihan, yakni sampel dapat terekstraksi dengan
sempurna, karena dalam metode ini penyarian dilakukan beberapa kali atau secara
kontinu dan dalam keadaan panas, proses ekstraksi dapat diteruskan sesuai
keperluan tanpa perlu menambah volume pelarut, sehingga pelarut yang
digunakan lebih sedikit (Heinrich, et al., 2012).
Minyak biji honje yang dihasilkan melalui proses sokletasi menggunakan
pelarut n-heksan menghasilkan rendemen yang lebih tinggi yaitu sebesar 2,75%
dibandingkan menggunakan pelarut dietil eter yaitu sebesar 1,94% (lampiran 3).
46
Hal ini kemungkinan besar terkait dengan sifat minyak biji honjeyang bersifat
nonpolar, sehingga minyak cenderung lebih larut ke pelarut n-heksan yang
kepolarannya lebih rendah dibandingkan dietil eter (Susanti, et al., 2012).
4.3. Hasil Uji Fitokimia
Uji fitokimia digunakan untuk mendeteksi senyawa tumbuhan berdasarkan
golongannya dan sebagai informasi awal dalam mengetahui senyawa kimia yang
mempunyai aktivitas biologi dari suatu tanaman (Tyler, et al., 1988). Sampel biji
honje diperkirakan mengandung metabolit sekunder yang memiliki aktivitas
antioksidan. Menurut Nurain, et al., (2012) dan Sivasothy (2008), honje
mengandung alkaloid, flavonoid, terpenoid, tannin dan betalain. Identifikasi pada
sampel perlu dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa metabolit sekunder
tersebut. Uji fitokimia yang dilakukan terdiri dari uji terpenoid, flavonoid,
saponin, tanin dan alkaloid.
Adapun hasil identifikasi golongan senyawa yang terdapat dalam ekstak
biji honje ditunjukkan pada Tabel 3.
Tabel 3. Hasil Uji Fitokimia
Uji Minyak Hasil Sokletasi N-heksan Dietil eter
Terpenoid Flavonoid Saponin Tanin
Alkaloid
+ ‒ ‒ ‒ +
+ ‒ ‒ ‒ +
Keterangan: (+) Menunjukkan hasil positif pada uji fitokimia (‒) Menunjukkan hasil negatif pada uji fitokimia
Berdasarkan hasil uji yang ditunjukkan tabel 3, minyak biji honje hasil
ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan dan dietil eter, keduanya mengandung
47
terpenoid dan alkaloid. Adanya terpenoid pada kedua sampel tersebut ditandai
dengan terbentuknya warna merah kecoklatan. Reaksi yang terjadi antara senyawa
terpenoid dengan H2SO4 menghasilkan endapan berwarna merah kecoklatan.
Hasil ini diperkuat oleh hasil penelitian Jaafar, et al., (2007), yang menyatakan
bahwa terdapat kandungan terpenoid baik dalam daun, batang, bunga, dan akar
tumbuhan honje. Reaksi yang terjadi pada uji Mayer ditunjukkan pada Gambar 13.
HO
Ac2O [H+]
-HOAc
- [H+]
O
O
H
[H+]-HOAc
+
+
H+
H
- [H+]
+
Endapan merah kecoklatan
Gambar 13. Reaksi Uji Terpenoid (Siadi, 2012)
Alkaloid diidentifikasi dengan menggunakan tiga pereaksi, yaitu pereaksi
Mayer, Bourchardat, dan Dragendorff. Berdasarkan hasil uji dengan ketiga
pereaksi tersebut, uji dengan pereaksi Mayer dan Dragendorff menunjukkan hasil
positif, sedangkan dengan menggunakan pereaksi Bourchardat menunjukkan hasil
negatif. Dengan hasil ini dapat disimpulkan bahwa sampel mengandung senyawa
48
alkaloid.Uji alkaloid dengan pereaksi mayer menunjukkan hasil positif dengan
terbentuknya endapan warna putih. Diperkirakan endapan tersebut adalah
kompleks kalium-alkaloid. (Svehla, 1990). Reaksi yang terjadi pada uji Mayer
ditunjukkan pada Gambar 14.
N NK+
+ K2[HGI4] + K[HGI4]-
Kalium-Alkaloid endapan
putih
Gambar 14. Reaksi Uji Mayer (Marliana, et al., 2005)
Hasil positif uji alkaloid juga ditunjukkan pada uji Dragendorff, hal ini
ditandai dengan terbentuknya endapan coklat muda. Endapan tersebut adalah
kalium-alkaloid(Svehla, 1990). Reaksi yang terjadi pada uji Mayer ditunjukkan
pada Gambar 15.
N NK+
+ K[BiI4] + [BiI4]-
Kalium-Alkaloid endapan
Coklat muda
Gambar 15. Reaksi Uji Dragendorff (Marliana, et al., 2005)
Hasil uji identifikasi flavonoid, saponin, dan tanin, menunjukkan hasil
negatif pada kedua sampel. Keduanya tidak menunjukkan adanya perubahan yang
menandakan adanya flavonoid, saponin, dan tanin. Uji flavonoid menunjukkan
hasil positif bilaterbentuk endapan warna merah atau jingga. Uji saponin
menunjukkan hasil positif apabila timbul busa atau buih. Sedangkan uji tanin
menunjukkan hasil positif bila ditandai dengan terbentuknya warna hitam atau
hijau (Harborne, 1987).
49
4.4. Hasil Uji Antioksidan
Uji antioksidan minyak biji honje dilakukan dengan menggunakan metode
TBA (Thiobarbituric Acid). Metode ini digunakan untuk mengukur peroksidasi
lipid dari asam lemak tak jenuh yaitu asam linoleat. Pada proses oksidasi lipid,
atom H dihilangkan dan atom karbon membentuk diena terkonjugasi sehingga
menghasilkan kompleks TBA-MDA yang berwarna merah (Naphade, et al., 2009).
Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan pada waktu setimbang yaitu
saat nilai absorbansi mencapai titik optimum. Waktu setimbang mengindikasikan
bahwa reaksi antara pereaksi TBA dengan produk sekunder oksidasi asam linoleat
telah mencapai kesetimbangan, ditandai dengan menurunnya absorbansi pada hari
berikutnya.Waktu setimbang ditentukan dengan mengukur absorbansi pada
rentang waktu tertentu. Pada pengukuran ini waktu setimbang diperoleh pada hari
ke 7 (Gambar 16).
Gambar 16. Penentuan Waktu Setimbang
Hasil pengamatan dapat dilihat pada Gambar 16 menunjukkan bahwa nilai
absorbansi cenderung meningkat dari hari ke hari karena semakin lama waktu
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
4 5 6 7 8
Abs
orba
nsi
Hari Ke-
50
penyimpanan, proses oksidasi semakin meningkat. Hal ini menyebabkan semakin
banyaknya kompleks TBA-MDA yang terbentuk yang mengakibatkan warna
semakin pekat, sehingga nilai absorbansi meningkat.
Hasil uji aktivitas antioksidan minyak biji honje, vitamin C, dan Vitamin E
tertera pada Tabel 4.
Tabel 4. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan
Sampel konsentrasi (ppm) Absorbansi %
inhibisiPersamaan
Regresi IC50
(ppm) Blanko 0,303
Vitamin C
10 0,193 36,25
y = 0,4309x + 33,641 37,96
25 0,169 44,31 50 0,121 59,97 75 0,113 62,81 100 0,070 76,89
Vitamin E
10 0,198 34,72
y = 0,4639x + 30,737 41,52
25 0,182 39,85 50 0,126 58,39 75 0,102 66,43 100 0,076 74,91
Minyak hasil Ekstraksi n-heksan
10 0,250 17,54
y = 0,4018x + 12,99 92,11
25 0,237 21,78 50 0,205 32,47 75 0,163 46,21 100 0,147 51,43
Minyak hasil Ekstraksi dietil eter
10 0,265 12,56
y = 0,3311x + 9,4561 122,45
25 0,245 19,27 50 0,227 24,93 75 0,204 32,58 100 0,170 44,02
Hasil uji aktivitas antioksidan pada Tabel 4 menunjukkan bahwa
peningkatan % inhibisi berkaitan dengan penurunan absorbansi. Semakian kecil
absorbansi yang dihasilkan maka semakin besar % inhibisi. Penurunan absorbansi
terjadi akibat pengurangan intensitas warna merah muda dari kompleks TBA-
MDA yang berinterksi dengan senyawa antioksidan.
51
Penentuan nilai IC50 digunakan untuk mengetahui kemampuan sampel
dalam menghambat 50% aktivitas radikal bebas. Hasil pengukuran aktivitas
antioksidan pada minyak biji honje hasil ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan
menunjukkan aktivitas antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 92,11 ppm,
sedangkan aktivitas antioksidan pada minyak biji honje hasil ekstraksi
menggunakan pelarut dietil eter sebesar 122,45 ppm. Aktivitas antioksidan yang
dimiliki kedua minyak biji honje hasil ekstraksi inilebih rendah dari aktivitas yang
ditunjukkan oleh vitamin C dengan nilai IC50 sebesar 37,96 ppm dan vitamin E
sebesar 41,52%.
Antioksidan hanya berfungsi menghambat reaksi oksidasi dan tidak dapat
menghentikan sama sekali proses autooksidasi pada lemak sehingga pada akhir
proses ketengikkan akan terjadi. Hal ini sesuai dengan pendapat (Rastuti dan
Purwati, 2010) bahwa penambahan senyawa antioksidan pada minyak akan
menyebabkan terhambatnya pembentukkan produk sekunder terutama
malondialdehid.
4.5. Hasil Analisis GC-MS
Analisis menggunakan GCMS (Gas Chromatography Mass Spectroscopy)
dilakukan untuk mengidentifikasi rumus molekul serta kemungkinan struktur
senyawa yang terdapat pada minyak biji honje hasil ekstraksi menggunakan
pelarut n-heksan. Berdasarkan identifikasi tersebut diketahui bahwa sedikitnya
terdapat sekitar 60 puncak spketrum kromatografi. Adapun Spektrum hasil
analisis GC terdapat pada Gambar 17.
52
Gambar 17. Spektrum Hasil Analisis GC Minyak Biji Honje Hasil Ekstraksi
n-heksan
Spektrum hasil analisis GC (Gambar 17) menunjukkan ada enam puluh
komponen senyawa yang terdapat dalam minyak biji honje hasil ekstraksi
menggunakan pelarut n-heksan. Keenampuluh komponen senyawa yang
teridentifikasi ini dapat dilihat pada Lampiran 6.
Berdasarkan data hasil analisis GC, terdapat tiga komponen senyawa yang
mempunyai persen area tinggi dan diperkirakan berkaitan dengan aktivitas
antioksidan minyak biji honje, yaitu eukaliptol (22), oktadek-9-asam enoat (23),
dan asam askorbat-2,6-diheksadekanoat (24) (Gambar 18).
53
O
CH3
CH3
CH3
(22) (23)
OH
O
CH3
(24)
Gambar 18. Struktur Senyawa eukaliptol (22), oktadek-9-asam enoat (23) dan asam askorbat-2,6-diheksadekanoat (24)
Senyawa pertama yaitu, senyawa dengan puncak nomor 7 yang memiliki
luas area 4,46% pada waktu retensi 4,716 mempunyai kemiripan dengan senyawa
eukaliptol (22) (Library Wiley7). Senyawa ini mempunyai rumus molekul
C10H18O3 dan massa molekul relatif (Mr) 154. Spektrum hasil analisis MS untuk
senyawa eukaliptol (22) dapat dilihat pada Gambar 19.
Gambar 19. Hasil Analisis MS Senyawa Eukaliptol
O
OOH
O
(CH2)14OCH3
O(CH2)14
O
OH
CH3
54
Prakiraan pola fragmentasi senyawa yang memiliki kemiripan dengan
eukaliptol ini dapat dilihat pada Gambar 20.
O
CH3
CH3
CH3O
CH3
CH3
CH3
OC
+
CH3
CH3- e CH3-
m/z : 15
m/z : 154 m/z : 139
C+
m/z : 58
CH2 O(CH3)2-
m/z : 81
C+
H
H
H
H
HH
CH3
CH3 CH2+
m/z : 43 m/z : 38
C3H2
Gambar 20. Prakiraan Pola Fragmentasi Senyawa Eukaliptol
Menurut Miguel, et al., (2004) eukaliptol merupakan salah satu komponen
utama dalam minyak dari tanaman Thymus mastichina dan Thymus camphoratus.
Senyawa ini diketahui mempunyai aktivitas antioksidan. Menurut penelitian
Aazza, et al., (2011), dengan menggunakan TBA sebagai metode uji antioksidan,
diketahui bahwa eukaliptol yang merupakan komponen utama tumbuhan
Eucalyptus, khususnya Eucalyptus globulus mempunyai aktivitas antioksidan.
Selain itu, berdasarkan penelitian (Cho, 2012), diketahui mempunyai aktivitas
antioksidan dalam metabolisme lipoprotein. Dengan kata lain eukaliptol dapat
melindungi lipoprotein dari modifikasi atau perubahan akibat oksidasi.
Senyawa kedua dengan puncak nomor 40, memiliki luas area 12,55% pada
waktu retensi 21,372, mempunyai kemiripan dengan asam askorbat-2,6-
diheksadekanoat (23) (Library NIST147). Senyawa ini mempunyai rumus
molekul C38H68O8 dan massa molekul relatif (Mr) 652. Massa molekul pada m/z =
625 tidak tampak pada spektrum disebabkan nilai m/z nya yang terlalu tinggi.
55
Senyawa asam askorbat-2,6-diheksadekanoat merupakan komponen utama
minyak daun Alstonia boonei De Wild yang mempunyai sifat antioksidan dan
antiinflamasi (Okwu dan Ighodaro, 2010). Senyawa ini juga terdapat dalam
beberapa ekstrak tanaman lain, seperti menurut Igwe dan Abii (2013), senyawa
askorbat-2,6-diheksadekanoat merupakan komponen terbanyak kedua dalam
ekstrak daun Psidium guajava Linn. dan diduga penggunaan ekstrak P guajava
sebagai obat herbal dalam pengobatan penyakit kencing manis dan infeksi pada
mulut atau sariawan merupakan hasil dari adanya senyawa askorbat-2,6-
diheksadekanoat.
Spektrum analisis MS untuk senyawa asam askorbat-2,6-diheksadekanoat
dapat dilihat pada Gambar 21.
Gambar 21. Hasil Analisis MS Senyawa Asam Askorbat-2,6-diheksadekanoat
56
Adapun prakiraan pola fragmentasi senyawa yang diperkirakan memiliki
kemiripan dengan pola fragmentasi asam askorbat-2,6-diheksadekanoat dapat
dilihat pada Gambar 22.
O
OOH
O
(CH2)14
O
CH3
O (CH2)14
O
OH CH3O
OOH
O
(CH2)14
O
CH3
O (CH2)14
O
OH CH3
HO
OOH
O
O
C+
CH2
OH
(H2C)11
CH3
-1e
+ 2e
O
OH
(CH2)14
CH3
m/z : 169
m/z : 652m/z : 396
C12H25
O
OOH
O
O
CH2
OH
CH2+
m/z : 227
CH2O
OOH
O
O
CH2
OH
CH2+
O
OOH
O
O
CH2
OH
CH2+
O
OO
+
O CH2
OH
H
CH2
m/z : 213m/z : 199
m/z : 157
C2H2O
OO
O+
C3H4O2
m/z : 85
COC
+
OO
m/z : 57
m/z : 256
m/z : 14m/z : 14m/z : 42
m/z : 72
m/z : 28
Gambar 22. Prakiraan Pola Fragmentasi Senyawa Asam Askorbat-2,6-
diheksadekanoat
Senyawa ketiga dengan puncak nomor 44 yang memiliki luas area 31,25%
pada waktu retensi 23,741 mempunyai kemiripan dengan senyawa oktadek-9-
Asam enoat (23) (Library Wiley7). Senyawa ini mempunyai rumus molekul
C18H34O2 dan massa molekul relatif (Mr) 282. Menurut Quaney, et al., (2010)
senyawa oktadek-9-asam enoat juga bersifat antikanker, antioksidan, dan
antiinflamasi. Senyawa oktadek-9-asam enoat juga terdapat pada ekstrak daun
Psidium guajava Linn (Igwe dan Abii, 2013). Spektrum analisis MS untuk
senyawa oktadek-9-asam enoat (23) dapat dilihat pada Gambar 23.
57
Gambar 23. Hasil Analisis MS Senyawa Oktadek-9-Asam Enoat
Adapun perkiraan pola fragmentasi dari senyawa yang memiliki
kemiripan dengan oktadek-9-asam enoatdapat dilihat pada Gambar 24.
OH
O
CH3
O
CH3
CH3CH2
CH2CH3
CH2CH3 CHCH3
CH2CH3
CH3CH2
m/z : 282
m/z : 264
m/z : 222
m/z : 180 m/z : 138
m/z : 112m/z : 98
m/z : 55
-H2O
-C2H2O
-C3H6
-C3H6
-C2H2
-CH 2
-C3H7
m/z : 18
m/z : 46
m/z : 48m/z : 48
m/z : 30m/z : 16
m/z : 49
Gambar 24. Prakiraan Pola Fragmentasi Senyawa Oktadek-9-Asam Enoat
58
Selain tiga senyawa yang sudah disebutkan sebelumnya, yaitu eukaliptol
(22), asam askorbat-2,6-diheksadekanoat (23), dan oktadek-9-asam enoat (24),
ada beberapa senyawa lain yang memiliki aktivitas antioksidan. Senyawa tersebut
dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5. Senyawa-senyawa yang Memiliki Aktivitas Antioksidan
Peak# R. Time Name Area% Similiaritas
7 4.716 Eukaliptol 4.46 94 16 6.529 p-Cimene 2.01 96 20 7.874 Terpinen-4-ol 0.25 83 22 8.189 Alfa. Terpineol 1.27 93 31 14.024 Alfa.-selinen 0.14 84 40 21.372 Asam Askorbat-2,6-
diheksadekanoat 12.55 89
44 23.741 Oktadek-9-Asam Enoat 31.25 92
Senyawa-senyawa kimia yang bersifat antioksidan yang teridentifikasi
oleh GCMS antara lain terpinen-4-ol (25) (Dandlen, et al., 2010), p-cimen (26)
(Sonboli, et al., 2005), alfa terpineol (27) dan alfa selinen (28) (Koudou, 2009)
(Gambar 25).
OH
OH (25) (26) (27)
(28)
Gambar 25. Struktur Senyawa terpinen-4-ol (25), p-cimen (26), alfa terpineol (27), dan alfa selinen (28)
59
4.6. Hasil Uji KLT
Kromatografi lapis tipis (KLT) digunakan untuk pemisahan golongan
senyawa dari minyak biji honje hasil ekstraksi menggunakan pelarut n-heksan. Uji
KLT dilakukan untuk mendapatkan hasil pemisahan senyawa-senyawa yang
terdapat pada minyak tersebut sehingga dapat dianalisis lebih lanjut menggunakan
sepktrofotometer UV dan FTIR. Proses pemisahan komponen penyusun suatu
senyawa pada KLT berdasarkan distribusinya pada fase diam dan fase gerak.
Komponen yang memiliki interaksi lebih besar terhadap fase diam akan tertahan
lebih lama. Sebaliknya, komponen yang memiliki interaksi lebih besar terhadap
fase gerak akan bergerak lebih cepat (Gholib dan Rohman, 2007).
Uji KLT yang dilakukan terhadap minyak biji honje menggunakan fase
diam silika gel dan fase gerak campuran n-heksan dan kloroform (5:2)
menunjukkan tiga spot dengan nilai Rf 0,31; 0,45; dan 0,78 (Gambar 26).
Gambar 26. Spot Minyak Biji Honje Ekstrak n-heksan pada KLT dengan Eluen n-heksan : kloroform (5:2)
Ketiga spot pada uji KLT diisolasi dan dilakukan pengukuran antioksidan.
Adapun hasil uji antioksidan isolat tersebut ditunjukkan pada Tabel 6.
Rf 0,31
Rf 0,45
Rf 0,78
60
Tabel 6. Hasil Uji Antioksidan Isolat Hasil KLT Sampel Absorbansi % Inhibisi Blanko Isolat 1 Isolat 2 Isolat 3
0,298 0,224 0,197 0,265
24,83 33,89 11,07
Berdasarkan Tabel 6, isolat 2 hasil KLT dengan Rf 0,45 mempunyai %
inhibisi paling tinggi yaitu 33,89% yang menunjukkan bahwa isolat 2 mempunyai
aktivitas antioksidan paling tinggi dibandingkan dengan isolat 1 dan 3 dengan Rf
0,31 dan 0,78. Pemisahan dengan KLT menyebabkan senyawa-senyawa terpisah
dan terdistribusi pada isolat yang berbeda.
4.7. Hasil Analisis Spektrofotometri UV
Isolat 2 dari hasil KLT dengan Rf 0,45 dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV dan FTIR. Isolat 2 dipilih karena mempunyai persen inhibisi
paling tinggi. Berdasarkan hasil analisis spektrofotometri UV pada rentang
panjang gelombang 200-400 nm menunjukkan adanya serapan pada panjang
gelombang maksimum (λmaks) 203,87 nm dan 272,73 nm (Gambar 27). Serapan
pada panjang gelombang 203,87 nm menandakan adanya pelarut n-heksan.
Sedangkan serapan pada panjang gelombang 272,73 nm diduga karena adanya
transisi elektron dari π- π* pada ikatan C=O (Sastrohamidjojo, 2001).
61
4.8. Hasil Analisis FTIR
Analisis spektrofotometri inframerah dilakukan dengan tujuan untuk
menentukan gugus fungsional senyawa yang terdapat pada sampel hasil uji KLT.
Hasil analisis spektrofotometer inframerah dapat dilihat pada Gambar 28.
4000.0 3000 2000 1500 1000 450.0
0.0 2 4 6 8
10 12 14 16 18 20 22 24 26
28.6
Bilangan Gelombang (cm-1)
%T
2924.22 2856.23
2359.062019.74
1746.67
1715.891459.64
1377.53
1239.96
1163.46
1119.39
966.61 722.61
584.51 470.13
3650.143853.95 3371.07
3005.12
2681.51
honje.Sample Name Description
200 400 250 300 350
2.4
-0.0 0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
Panjang gelombang (nm)
Abs
orba
ns
203.87nm, 2.14A
272.73 nm, 0.27034 A
Gambar 27. Spektrum UV Isolat 2 Minyak Biji Honje
Gambar 28. Spektrum FTIR Isolat 2 Minyak Biji Honje
62
Spektrum IR menunjukkan bahwa senyawa yang dianalisis memiliki gugus
fungsi dengan puncak serapan pada bilangan gelombang 2924,22 dan 2856,23 cm-1
dengan intensitas puncak serapan kuat, serapan ini diduga dihasilkan oleh serapan
uluran C–H dari gugus metilen (–CH2–). Uluran tak simetrik gugus –CH2–
terletak di daerah bilangan gelombang 2926 cm-1 sedangkan uluran simetrik gugus
–CH2– terletak di daerah bilangan gelombang 2853 cm-1. Adanya gugus metilen
diperkuat oleh adanya serapan pada bilangan gelombang 722,62 cm-1 yang diduga
dihasilkan oleh tekukan goyangan dari gugus –CH2– yang terletak di dekat
bilangan gelombang 720 cm-1 (Silverstain, et al., 1986).
Puncak serapan dengan intensitas kuat dan tajam pada bilangan gelombang
1746,67 dan 1715,89 cm-1 diduga dihasilkan oleh uluran C=O (1750-1350 cm-1).
Dugaan tersebut diperkuat dari hasil analisis spektrofotometri UV yang
menunjukkan adanya serapan pada panjang gelombang maksimum 272,73 nm
yang diduga berasal dari suatu kromofor ikatan C=O (Sastrohamidjojo, 2001).
Sedangkan serapan pada bilangan gelombang 1239,96; 1163,46; dan 1119,39 cm-1
diduga dihasilkan oleh uluran C–O alkohol (1260-1000 cm-1) (Silverstain, et al.,
1986).
Serapan pada bilangan gelombang 1459,64 cm-1 dan 1377,53 cm-1
menunjukkan tekukan C–H menggunting dari gugus metil (–CH3) alifatik.
Tekukan C–H tak simetrik terletak di dekat bilangan gelombang 1450 cm-1
sedangkan tekukan C–H simetrik terletak di dekat bilangan gelombang 1375 cm-1
(Silverstain, et al., 1986).
63
Gugus fungsi C=O dan C–O yang muncul pada spektrum FTIR
diperkirakan berasal dari senyawa asam askorbat-2,6-diheksadekanoat, ini
diperkuat dengan hasil analisis spektrofotometri UV yang menunjukkan adanya
ikatan gugus kromofor ikatan C=O. Namun, gugus fungsi –OH yang terdapat
pada senyawa asam askorbat-2,6-diheksadekanoat muncul dengan serapan yang
sangat rendah pada bilangan gelombang 3650 cm-1. Hal ini dapat disebabkan
gugus –OH pada senyawa tersebut telah terdegradasi.
Hasil identifikasi gugus fungsi menggunakan spektrofotometri inframerah
ditunjukkan pada tabel 7 sebagai berikut:
Tabel 7. Hasil Analisis Spektrometer Inframerah
Bilangan Gelombang (cm-1) Rentang Bilangan Gelombang (cm-1)
Prakiraan Gugus Fungsi
2924,22 dan 2856,23 3000-2840 Uluran C–H (–CH2–)
1746,67 dan 1715,89 1750-1350 Uluran C=O
1459,64 dan 1377,53 1465-1355 Tekukan C–H (–CH3) 1239,96; 1163,46; dan
1119,39 1260-1000 Uluran C–O
722,62 720 Tekukan C–H (–CH2–)
4.9. Mekanisme Reaksi Antioksidan
Senyawa yang diperoleh pada penelitian ini belum murni, sehingga
aktivitas antioksidan yang diperoleh merupakan sinergi antara beberapa senyawa
yang memiliki aktivitas antioksidan. Namun demikain, pada Gambar 29
ditunjukkan mekanisme reaksi antioksidan dari salah satu senyawa yang diperoleh,
yaitu asam askorbat-2,6-diheksadekanoat.
64
RR
Rantai panjang asam lemak tak jenuh (LH)X
Radikal bebasXH
LOO . Radikal peroksil
RR
OO•
O2
RR
OOH
RR
OO•
R CH•
R
RCH• R
Penataan ulang
L
L
+
H+
CH3
O
O
O
O
(CH2)14O
CH3
O
(CH2)14O
OH
+
CH3
O
O
OH
O
(CH2)14O
CH3
O
(CH2)14O
OH
Gambar 29. Mekanisme Reaksi Antioksidan
65
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang dilakukan terhadap minyak biji honje, maka
dapat disimpulkan bahwa:
1. Minyak biji honje (E. elatior) hasil ekstraksi menggunakan metode sokletasi
dengan pelarut n-heksan diperoleh rendemen sebesar 2,75% lebih besar
daripada ekstraksi menggunakan metode yang sama dengan pelarut dietil eter
sebesar 1,94%.
2. Nilai aktivitas antioksidan IC50 yang ditunjukkan oleh minyak biji honje hasil
ekstraksi pelarut n-heksan adalah 92,11 ppm, lebih baik dari aktivitas minyak
biji honje hasil ekstraksi dengan dietil eter adalah 122,45 ppm. Namun
aktivitas keduanya lebih rendah jika dibandingkan dengan vitamin C 37,96
ppm dan vitamin E 41,52 ppm.
4. Hasil analisis GCMS minyak biji honje hasil ekstraksi pelarut n-heksan
menunjukkan komponen dengan luas area tinggi yangdi duga memiliki
aktivitas antioksidan yaitu eukaliptol (4,46%), oktadek-9-asam enoat
(31,25%) dan asam askorbat-2,6-diheksadekanoat (12,55%).
5. Karakterisasi menggunakan spektrofotometer UV-Vis menunjukkan adanya
gugus kromofor C=O pada 272,73 nm. Sedangkan analisis FTIR
menunjukkan adanya gugus –CH2– alifatik (2924,22 dan 2856,23 cm-1),
gugus fungsi C=O (1746,67 dan 1715,89 cm-1), –CH3 alifatik (1459,64 dan
66
1377,53 cm-1), C–O alkohol (1239,96; 1163,46; dan 1119,39 cm-1), dan
–CH2– (722,62 cm-1).
5.2. Saran
1. Perlu dilakukan proses pemurnian komponen kimia dalam minyak biji honje
dan karakterisasi lebih lanjut dengan NMR.
2. Perlu dilakukan analisis GCMS terhadap minyak biji honje hasil ekstraksi
pelarut dietil eter untuk mengetahui senyawa yang terkandung di dalamnya.
3. Perlu dilakukan pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode yang
lain seperti DPPH, ABTS, dan reducing power.
4. Perlu dilakukan pengkajian mengenaipotensi minyak biji honje sebagai
emulsifier atau emollien.
67
DAFTAR PUSTAKA
Aazza, S., Badia Lyoussi, dan Maria G. Miguel. 2011. Antioxidant and Antiacetylcholinesterase Activities of Some Commercial Essential Oils and Their Major Compounds. Molecules, 16, 7672-7690.
Adnan, M. 1997. Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta: Andi.
Antoro, E. D. 1995. Skrining Fitokimia Rimpang Nicolaia speciosa Horan Secara Mikrokimiawi Kromatografi Lapis Tipis dan Spektrofotmetri UV. FF-UGM.
Arief, S. 2006. Radikal Bebas. Surabaya: SMF Ilmu Kesehatan Anak. Fakultas Kesehatan UNAIR.
Arora, D. S. dan Chandra, P. 2011. Antioxidant Activity of Aspergillus fumigates. ISRN Pharmacology.
Bakr, Riham O., El-Sayed A.Omer, Khaled A. Abd El-Razik, Azza S. M. Abu Elnaga, Enas N. Danial, Abd El-Naser G. Elgindy. 2013. Antioxidant and anti-listerial activities of selected Egyptian medicinal plants. African Journal of Microbiology Research, 7 (37), 4590-4595.
Błaszczyk, Alina, Aleksandra Augustyniak, and Janusz Skolimowski. 2013. Ethoxyquin: An Antioxidant Used in Animal Feed. International Journal of Food Science. Volume 2013.
Buck, D. F. 1991. Antioxidants in Food Additive User’s Handbook. Glasgow-UK: Blakie Academic dan Profesional.
Cho, K. H., 2012. 1,8-cineole Protected Human Lipoproteins from Modification by Oxidation and Glycation and Exhibited Serum Lipid-lowering and Anti-inflammatory Activity in Zebrafish. Biochemistry and Molecular Biology Reports, 565-570.
Dandlen, S. Anahi,A. Sofia Lima, Marta D. Mendes, M. GracaMiguel, M. Leonor Faleiro, M. Joao Sousa, Luis G. Pedro, Jose G. Barosso,A. Cristina Figueiredo. 2010. Antioxidant Activity of Six Portuguese Thyme Species Essential Oils. Flavour And Fragrance Journal, 25 (3), 150-155.
Deman, J. M. 1997. Kimia Makanan. Bandung: ITB.
Ditjen POM. 1997. Teknologi Ekstrak. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
68
Droge, W. 2002. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol, 82, 47-95.
Edeoga, H. O., D. E. Okwu, dan B. O. Mbaebie. 2005. Phytochemical Constituents of Some Nigerian Medicinal Plants. African Journal of Biotechnology, 4 (7), 685-688.
Emonocot. 2010. Etlingera elatior (Jack) R.M.Sm. http://e-monocot.org/taxon/ urn:kew.org:wcs:taxon:244696 Diakses pada tanggal 20 Februari 2014 pukul 14.05 WIB.
Estiasih, T. danD. A. Kurniawan. 2006. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Umbi Akar Ginseng Jawa (Talinum triangulare Willd.). Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 17 (3), 166 – 175.
Gholib, I. G. dan Rohman A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Gordon, M. H. 1990. The Mechanism of Antioxidant Action in Vitro. B.J.F. Hudson (ed). Food Oxidant., Elsevier Applied Science.
Gritter, R. J., Bobbit, J. M. Dan Schwarting, A. E. 1991. Pengantar Kromatografi. Ed ke-2. Penerjemah: Kosasih Padmawinata. Bandung: ITB
Gutteridge, J. M. dan Halliwell, B. 2000. Free Radicals and Antioxidants. New York: Annals New York Academy of Sciences.
Habsah, M., Lajis, N. H., Sukari, M. A., Yap, Y. H., Kikuzaki, H., Nakataani, N., Ali, A M. 2005. Antitumor-Promoting and Cytotoxic Constituents of Etlingera elatior. Malaysian Journal of Medical Sciences, 12, 6-12.
Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: ITB.
Heinrich, M., J. Barnes, S. Gibbons, danE. M. Williamson, 2012. Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotheraphy. London: Churchill Livingstone.
Hermanto, S. 2008. Mengenal Lebih Jauh Teknik Analisa Kromatografi dan Spektrofotometri. Jakarta: Pusat Laboratorium Terpadu UIN Syarif Hidayatullah.
Hernani dan Rahardjo, M. 2006. Tanaman Berkhasiat Antioksidan. Jakarta: Penebar Swadaya.
Hidayat, S. S. dan Hutapea, J. R. 1991. Inventaris Tanaman Obat Indonesia. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
69
Ibrahim, H. dan Setyowati, F. M. 1999. Alphabatical Treatment of Species. In C. de Guzmna and J. S. Siemonsma (Eds): Plant Resources of South-East Asia. Spices, 13, 123-126.
Igwe, O. I. dan Abii, T., 2013. Characterization of Bioactive Sesquiterpenes, Organic Acids and Their Derivatives from the Leaves of Psidium guajava Linn. International Research Journal of Pure dan Applied Chemistry, 4 (4), 456-467.
Jaafar, F. M., Osman, C. P., Ismail, N. H. dan Awang, K. 2007. Analysis of Essential Oils of Leaves, Stems, Flowers and Rhizomes of Etlingera elatior (Jack) R. M. Smith. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 11 (1), 269-273.
Jiun, L. T. 2007. Kajian Perbandingan Aktiviti Pengoksidaan Lipid Secara In-Vitro bagi Ekstrak Mimosa pigra dan Aplikasi Esktrak Sebagai Antioksidan dalam Pemakanan Tilapia. Pulau Pinang: Universitas Sains Malaysia.
Kawana, S. dan Miyagawa, H. 2011. Development of Green Technologies in GCMS-QP2010 Ultra Shimadzu Brochure, No. C146-E159. https://www.shimadzu.eu/sites/default/files/Development-of-Green-Technologies-in-GCMS-QP2010-Ultra.pdfDiakses pada tanggal 20 Maret 2014 pukul 11.35 WIB.
Khopkar. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.
Koudou, J. 2009. Volatile constituents and antioxidant activity of Aucoumea klaineana Pierre essential oil. African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 3 (6), 323-326.
Lingga, N. 2004. Laporan Kegiatan Training Instrumen GCMS Shimadzu QP 2010.
Marliana, S. D., Suryanti, V. dan Suyono. 2005. he Phytochemical Screenings an Thin Layer Chromatography Analysis of Chemical Compounds in Ethanol Extract of Labu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.). Jurnal Biofarmasi, 3 (1), 26-31.
Miguel, G., Simoes, M., Figueiredo, A. C., Barroso, J G., Pedro, L G., Carvalho, L. 2004. Composition and Antioxidant Activities of The Essential Oils of Thymus caespititius, Thymus camphoratus and Thymus mastichina. Elsevier Food Chemistry, 86, 183-188.
Munawaroh, S., dan Handayani, P. A. 2010. Ekstraksi Minyak Daun Jeruk Purut (Citrus hystrix D.C.) Dengan Pelarut Etanol dan N-Heksana. Jurnal Kompetensi Teknik, 2 (1), 73-78.
70
Naphade, S. S., Khadabadi, S., Deore, S. L., Jagtap, N. S., Hadka, S. P. 2009. Antioxidant Activity of Different Extract of Plant Tricholepis GaberrimaDC (Ateraceae). International Journal of Pharmatech Research, 1 (3).
Naufalin, R. B., Jenie, S. L., Kusnandar, F., Sudarwanto, M., Rukmini, H. 2005. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Bunga Kecombrang Terhadap Bakteri Patogen dan Perusak Pangan. Jurnal Teknol dan Industri Pangan, 16 (2).
Nurain, Aziman., Noriham, Abdullah., Zainon, Mohd Noor., Khairusy, Syakirah Zulkifli., Wan, Saidatul Syida. 2012. Phytochemical Constituents and In Vitro Bioactivity of Ethanolic Aromatic Herb Extracts. Sains Malaysiana, 41 (11), 1437-1444.
Okwu, D. E. dan Ighodaro, B. U., 2010. GC-MS Evaluation of Bioactive Compounds and Antibacterial Activity of the Oil Fraction from the Leaves of Alstonia boonei De Wild. Der Pharma Chemica, 2 (1), 261-272.
Owen, T. 2000. Fundamentals of UV-Visible Spectroscopy. Germany: Agilent Technologies.
Panji, T. 2011. Teknik Spektroskopi Untuk Elusidasi Struktur Molekul. Bogor: Graha Ilmu.
Petani Muda Bogor. Honje Merah, Kecombrang, Etlingera elatior. http://www.petanimudabogor.com/product/42/527/Honje-Merah-Kecombrang-Etlingera-elatior#/image-product/img1545-1363241580.jpg. Diakses pada tanggal 17 Agustus 2014 pukul 20.30 WIB
Poedjiadi, A. 2007. Dasar – Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press.
Prangdimurti, E., Muchtadi, D., Astawan, M. dan Zakaria, F. R. 2006. Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Suji (Pleomele angustifolia N. E. Brown). Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, 17 (2), 79-85.
Pratt, D. E. dan Hudson, B. J. 1990. Natural Antioxidants not Exploited Commercially. Applied Food Science Series, 171-191.
Quaney, R., Megan, R. dan James, M. C. 2010. The Characterization of the Chemical Constituents of Vernonia altissima “Tall Ironweed” Root and the Correlation to Purported Medicinal Activities.
Rastuti, U. dan Purwati. 2010. Uji Aktivitas Antioksidan Hasil Degradasi Lignin dar Serbuk Gergaji Kayu Kalba (Albizia falcataria) dengan Metode TBA (Thio Barbituric Acid). Molekul, 5 (2), 98-104.
71
Riley, C. M., Rosanske, T. W. Dan Riley, S. R. R. 2014. Specification of Drug Substances and Products. Development and Validation of Analytical Methods. Oxford: Elsevier Ltd.
Sarastani, D., Soekarto, S T., Muchtadi, T R., Fardiaz, D., Supriyantono, A. 2002. Aktivitas Antioksidan Ekstrak dan Fraksi Ekstrak Biji Atung. Teknologi dan Industri pangan, 13 (2), 149-156.
Sastrohamidjojo, H. 2001. Spektroskopi. Yogyakarta: Liberty.
Siadi, K. 2012. Ekstrak Bungkil Biji Jarak Pagar (Jatropha Curcas) Sebagai Biopestisida yang Efektif dengan Penambahan Larutan NaCl. Jurnal MIPA UNNES. 35 (1).
Silverstain, R., Bassler, G. C. dan Morrill, T. C. 1986. Penyidikan Spektrofotometrik Senyawa Organik. 4 penyunt. Jakarta: Erlangga.
Singh, R., Leuratti, C., Josyula, S., Sipowicz, M. A., Diwan, B. A., Kasprzak, K. S., Schut, H. A., Marnett, L. J., Anderson, L. M., Shuker, D E. 2001. Lobe-specific increases in malondialdehyde DNA adduct formation in the livers of mice following infection with Helicobacter hepaticus. Carcinogenesis, 8, 1281-1287.
Sivasothy, Y. 2008. Phytochemical Investigation on Some Species from The Genera Elettariopsis and Etlingera. Pulau Penang: University Sains Malaysia.
Skoog, D. A., Holler, P. J., & Nieman, T. A. (2004). Principles of Instrumental Analysis Fifth Edition. Philadelphia: Hartcaurt Brace.
Soeatmaji, D. W. 1998. Peran Stress Oksidatif dalam Patogenesis Angiopati Mikro dan Makro DM. Medica, 5 (24), 318-325.
Sonboli, A., Salehi, P., Kanani, M. R. dan Ebrahimi, S. N. 2005. Antibacterial and Antioxidant Activity and Essential Oil Composition of Grammosciadium scabridum Boiss. from Iran. Journal of Biosciences, 60 (7), 534-538.
Sudjadi, 1986. MetodePemisahan. Yogyakarta: Kanisius.
Sugiman, 2000. Pengaruh Sari Jahe (Zingiber officinale Roscoe) dalam Menghambat Oksidasi LDL Plasma Darah pada Mahasiswa, Bogor: IPB.
Sukandar, D., Radiastuti, N., Jayanegara I., dan Hudaya A. 2010. Karakterisasi Senyawa Aktif Antibakteri Ekstrak Air Bunga Kecombrang (Etlingera elatior) Sebagai Bahan Pangan Fungsional. Valensi, 2 (1), 333-339
Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Bandung: Widya Padjajaran.
72
Susanti, Ari Diana, Dwi Ardiana, Gita Gumelar P.,Yosephin Bening G. 2012. Polaritas Pelarut Sebagai Pertimbangan dalam Pemilihan Pelarut untuk Ekstraksi Minyak Bekatul dari Bekatul Varietas Ketan (Oriza Sativa Glatinosa). Simposium Nasional RAPI XIFT UMS
Svehla, G. 1990. Buku Teks Analisis Anorganik Kualitatif Makro dan Semimikro. 5 penyunt. Jakarta: PT Kalman Media Pusaka.
Syamsuhidayat, S. S. 1991. Inventarisasi Tanaman Obat Indonesia. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan, Departemen Kesehatan RI.
Tahir, I. 2008. Arti Penting kalibrasi Pada Proses Pengukuran Analitik: Aplikasi Pada Penggunaan PH Meter dan Spektrofotometer UV Vis. Yogyakarta: UGM.
Tampubolon, O. T., Suhatsyah, S. dan Sastrapradja, S. 1983. Penelitian Pendahuluan Kandungan Kimia Kecombrang (Nicolaia speciosa Horan) dalam Risalah Simposium Penelitian Tumbuhan Obat III. Yogyakarta: UGM.
Taufiq, M. 2007. Pemurnian Minyak Goreng (Jelantah) menggunakan Biji Kelor (Moringa Oleifera Lamk), Malang: UIN-Press.
Tokur, B., Koray, K. dan Deniz, A. 2006. Comparison of Two Thiobarbituric Acid (TBA) Method for Monitoring Lipid Oxidation in Fish. Journal of Fisheriesand Aquatic Sciences, 23(3-4), 331-334.
Tyler, V. E., Lynn, B. L. dan James, R. E. 1988. Pharmacognosy. Philadelphia: Lea and Febiger.
Underwood, A. L. dan Day, R. A. 2002. Analisis Kimia Kuantitatif. 6 penyunt. Jakarta: Erlangga.
Vimala, S., Adenan, M. I., Ahmad, A. R. dan Shahdan, R. 2003. Nature’s Choice to Wellness: Antioxidant Vegetables/Ulam. Kuala Lumpur: Forest Research Institute Malaysia.
Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Yogyakarta: Kanisius.
Winefordner, J. D. 2003. Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry. New Jersey: John Wiley and Sons Inc.
LAMPIRAN
74
Lampiran 1. Hasil Determinasi Tanaman Honje (Etlingera elatior)
75
Lampiran 2. Bagan Kerja Penelitian
Serbuk biji honje
Sokletasi menggunakan pelarut n-heksan
Sokletasi menggunakan pelarut dietil eter
Analisis spektro UV
dan FTIR
Minyak biji honje (Rendemen terbanyak)
Uji Fitokimia Analisis GCMS Uji Antioksidan Uji KLT
76
Lampiran 3. Hasil Sokletasi Biji Honje
3.1. Penentuan Massa Jenis
Ulangan ke-
Massa (gr)
Piknometer Kosong
Piknometer + Aquades
Piknometer + Minyak Biji
Honje
Densitas (g/mL)
1 12,1174 17,6926 16,9832 0,8566 2 12,1175 17,6937 16,9845 0,8606
Rata-rata 0,8586
Cara Perhitungan
1. Volume aquades =
= = 5,5752mL
Volume aquades = volume minyak = 5,5752 mL
Massa jenis Minyak Biji Honje =
=
= 0,8566 g/mL
2. Volume aquades =
= = 5,5762 mL
Volume aquades = volume minyak = 5,5762 mL
Massa jenis Minyak Biji Honje =
=
= 0,8606 g/mL
Massa aquades
Massa jenis aquades
17,6926 g -12,1174 g
1 g/mL
Massa minyak
Volume minyak
16,9832 g -12,1174 g
5,5752 mL
Massa aquades
Massa jenis aquades
17,6937 g -12,1175 g
1 g/mL
Massa minyak
Volume minyak
16,9845 g -12,1175 g
5,5762 mL
77
3.2. Perhitungan Rendemen
No. Pelarut Bobot
sampel Biji Honje (g)
Volume Minyak Biji Honje (mL)
Massa Minyak Biji
Honje (g)
Rendemen (%)
1 n-heksan 640 20,50 17,60 2,75 2 dietil eter 640 13,29 12,43 1,94
Cara perhitungan
Massa Minyak Biji Honje = Volume Minyak x Massa Jenis Minyak
= 20,50 mL x 0,8586 g/mL
= 17,60 g
1. % Rendemen = x 100%
= x 100%
= 2,75%
2. % Rendemen = x 100%
= x 100%
= 1,94%
17,60 g
640 g
Massa minyak
Massa sampel
12,43 g
640 g
Massa minyak
Massa sampel
78
Lampiran 4. Hasi Uji Antioksidan 4.1. Penentuan Waktu Setimbang
Hari Ke- Absorbansi 4 0,199 5 0,225 6 0,299 7 0,403 8 0,356
4.2. Grafik Persamaan Regresi Linier Uji Aktivitas Antioksidan: a) Minyak
Ekstrak n-heksan, b) Minyak Ekstrak Dietil Eter, c) Vitamin E, d) Vitamin C
(a)
(b)
y = 0,401x + 12,99R² = 0,983
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100 120
% In
hibi
si
Konsentrasi (ppm)
y = 0,331x + 9,456R² = 0,985
05
101520253035404550
0 20 40 60 80 100 120
% In
hibi
si
Konsentrasi (ppm)
79
(c)
(d)
y = 0,463x + 30,73R² = 0,972
0102030405060708090
0 20 40 60 80 100 120
% In
hibi
si
Konsentrasi (ppm)
y = 0,430x + 33,64R² = 0,965
0102030405060708090
0 20 40 60 80 100 120
% In
hibi
si
Konsentrasi (ppm)
80
4.3. Perhitungan Aktivitas Antioksidan (IC50)
a. Standar Vitamin C
Persamaan garis regresi : y = ax + b
IC50 → y = 50; substitusi ke persamaan garis regresi:
y = ax + b
50 = 0,4309x + 33,641
x =
x = 37,96
b. Standar Vitamin E
Persamaan garis regresi : y = ax + b
IC50 → y = 50; substitusi ke persamaan garis regresi:
y = ax + b
50 = 0,4639x + 30,737
x =
x = 41,52
c. Minyak biji honje hasilekstraksi menggunakan n-heksan
Persamaan garis regresi : y = ax + b
IC50 → y = 50; substitusi ke persamaan garis regresi:
y = ax + b
50 = 0,4299x + 17,956
x =
x = 82,32
50 – 33,641
0,4309
50 – 30,737
0,4639
50 – 17,956
0,4299
81
d. Minyak biji honje hasilekstraksi menggunakan dietil eter
Persamaan garis regresi : y = ax + b
IC50 → y = 50; substitusi ke persamaan garis regresi:
y = ax + b
50 = 0,3311x + 9,4561
x =
x = 122,45
50 – 9,4561
0,3311
82
Lampiran 5. Optimasi GCMS
Model/type : RTx-MS Restech Polymethyl xyloxan
Diameter : 6,25 mm
Length : 30 m
Thickness : 0,25 µm
Column Oven Temp. : 70oC
Injection Temp. : 230oC
Injection Mode : Split
Flow Control Mode : Linear Velocity
Pressure : 54.0 kPa
Total Flow : 186.2 mL/min
Column Flow : 0.91 mL/min
Linear Velocity : 35.0 cm/sec
Purge Flow : 3.0 mL/min
Split Ratio : 200.0
Gas type : Helium
83
Lampiran 6. Komponen Senyawa Minyak Biji Honje Hasil Ekstraksi n-heksan
Peak# R. Time Name %Area Similiaritas1 2.047 Etilbenzena 2.14 98 2 2.127 p-Xilena 2.16 98 3 2.363 p-Dimetilbenzena 0.83 97 4 3.943 m-Etilmetilbenzena 1.37 96 5 4.043 n-Dekana 0.66 95 6 4.467 1-etil-4-metil-Benzena 1.20 94 7 4.716 Eukaliptol 4.46 94 8 5.206 2-Etil-1,4-dimetilbenzena 0.90 93 9 5.370 (1,3,3-
Trimetilnonil)benzena 0.33 74
10 5.592 2-Etil-1,4-dimetilbenzena 0.40 96 11 5.647 1-metil-3-(1-metiletil)-
Benzena 0.51 95
12 5.779 2-Etil-1,4-dimetilbenzena 1.04 96 13 5.927 2-Metil-2-fenilbutana 0.55 92 14 6.143 Undekana 1.12 91 15 6.456 1,2,3,4-tetrametilBenzena 1.23 95 16 6.529 p-Cimen 2.01 96 17 7.188 4-Isopropil-toluena 0.49 93 18 7.537 5-butil-Nonana 0.21 82 19 7.657 1-P-Menten-8-
YLFenilkarbamat 0.36 70
20 7.874 Terpinen-4-ol 0.25 83 21 7.924 Azulen 0.46 95 22 8.189 Alfa. Terpineol 1.27 93 23 8.310 Dodekana 0.56 96 24 8.575 2,6-Dimetilundekana 0.18 88 25 10.380 Tridekana 0.40 96 26 12.170 1-Tridekena 0.21 91 27 12.324 Tetradekana 0.26 95 28 13.152 1-(2,4-Dimetilfenil)-1-
Propanon 0.36 87
29 13.754 Germacren-D 0.14 87 30 13.895 Naftalen, 1,2,3,4,4a,5,6,8a-
oktahidro-4a,8-dimetil-2-(1-metiletena)
0.31 79
31 14.024 alfa.-selinen 0.14 84 32 14.150 Pentadekana 0.23 86 33 14.334 1-Isopropil-4-metil-7-
metilena-1,2,3,4,4a,5,6,7-oktahidronaftalena
0.49 82
34 15.739 1-Heptadekena 0.33 93
84
35 15.867 Heksadekana 0.17 88 36 18.935 1-Oktadekena 0.48 94 37 19.864 Diisobutil ftalat 8.16 96 38 20.861 Asam Palmitat 1.17 94 39 21.223 Di-N-Butilftalat 0.76 96 40 21.372 Asam Askorbat 2,6-
diheksadekanoat 12.55 89
41 21.823 1-Nonadekena 0.61 92 42 23.226 Metil 9-oktadekenoat 2.34 93 43 23.625 Asam Linoleat 1.56 91 44 23.741 Oktadek-9-Asam Enoat 31.25 92 45 24.034 Asam Oktadekanoat 0.88 89 46 24.091 Etil Oleat 0.55 76 47 24.490 1,2-Asam
Benzenadikarboksilat, butil 8-metilnonil ester
1.36 90
48 25.092 Butil-2-Etilheksil Ftalat 0.60 91 49 25.772 Tetrakosan 0.35 92 50 26.894 1-Eikosanol 0.37 88 51 26.955 n-Tetrakosan 0.27 90 52 28.094 n-Heksatriakontan 0.52 95 53 28.374 Asam Ftalat, mono-(2-
etilheksil) ester 3.73 96
54 29.144 17-Pentatriakontena 0.31 76 55 29.191 n-Heksakosan 0.43 90 56 30.252 n-Heksatriakontan 0.58 94 57 31.272 Tetrakosan 0.81 91 58 31.348 Squalena 0.35 80 59 32.260 n-Heksatriakontan 0.76 92 60 33.223 n-Tritriakontana65 1.49 88
85
Lampiran 7. Foto Hasil Pemisahan KLT
Hasil pemisahan KLT dengan eluen n-heksan: kloroform (5 : 2)
Rf 1 = = 0,31
Rf 2 = = 0,45
Rf 3 = = 0,78
Rf 3
Rf 2 Rf 1
1,7 cm
5,5 cm
2,5 cm
5,5 cm
4,3 cm
5,5 cm
86
Lampiran 8. Dokumentasi Penelitian
Soklet
Rotary Evaporator Uji Antioksidan
Spektrofotometer U FTIR
GCMS
Minyak hasil ekstraksi menggunakan pelarut
n-heksan