From Gene to Protein 2

Preface

Biologi molekuler merupakan disiplin ilmu yang perkembangannya sangat cepat. Hampir

semua sisi kehidupan manusia kini bersinggungan dengan biologi molekuler dari pangan,

energi, sampai dunia pengobatan. Obat-obat yang ada sekarang utamanya memiliki

target tertentu yang bertangung jawab pada perkembangan suatu penyakit. Target obat

umumnya adalah reseptor, juga enzim, kanal ion, dan transporter.

Mempelajari transkripsi dan translasi merupakan bagian dasar dari proses pemahaman

ekspresi gen. Bagaimana gen-gen yang ada tubuh kita terekspresi, sistem regulasi yang

superketat akan dipelajari di kuliah kali ini. Banyak obat yang bekerja pada reseptor

tertentu seperti antibiotik, oncology pipeline, dan masih banyak lagi. Sehingga

mahasiswa farmasi setelah mengikuti kuliah ini bisa banyak bicara tentang mekanisme

aksi obat sampai level molekuler.

Pada bagian terakhir akan disinggung tentang perkembangan bioinformatika yang

ledakannya juga luar biasa. Segala informasi biologis setelah selesainya Human Genome

Project memicu munculnya databased dan analyzer yang jumlahnya kian banyak. Dengan

kemampuan konsep “from gene to protein” diharapkan kita bisa menganalisis ekspresi

gen dengan memanfaatkan informasi yang banyak tersedia di internet.

Yogyakarta, 28 Maret 2011

Sarmoko

Biologi Molekuler 2011

1

FARMASI UNSOED

FROM GENE TO PROTEIN: TRANSKRIPSI DAN TRANSLASI

Oleh: Sarmoko

OVERVIEW

Biologi molekuler merupakan suatu ilmu yang mempelajari fenomena biologis

pada aras molekuler. Sejak ditemukannya struktur DNA oleh Watson dan Crick

(Gambar 1), ilmu ini berkembang dengan sangat pesat. Hal ini terjadi karena hampir

semua peristiwa fenomena biologis saat ini, dituntut untuk bisa dijelaskan sampai level

molekuler. Ketika mendengar kata level molekuler berati sampai level DNA, RNA,

protein dan sebagainya. Sebagai contoh, mekanisme kerja obat sekarang tidak cukup

jika hanya dijelaskan sampai level seluler namun sudah bisa dijelaskan sampai level

DNA. Pada masa kini, seorang apoteker dituntut untuk bisa menjelaskan mekanisme

obat sampai level molekuler. Bahkan, ilmu-ilmu yang ada sekarang makin menyempit

ke arah molekuler, misal Farmakologi Molekuler, Toksikologi Molekuler, dan

Farmakoepidemiologi Molekuler. Empat ilmu di atas, memerlukan landasan ilmu

Biologi Molekuler yang kuat.

Gambar 1. Struktur double helix DNA. Struktur DNA dikemukakan oleh Watson dan Crick pada tahun 1965, mereka menyatakan bahwa model struktur DNA adalah untai ganda, dengan orientasi yang berlawanan (antiparalel), rantai 1 membentuk arah 5’ � 3’, berpasangan dengan rantai dengan arah 3’ � 5’. Kedua rantai berikatan dengan ikatan hidrogen antara basa A=T (2 ikatan H), dan G=C (3 ikatan H). ©Visionlearning, Inc.


2

FARMASI UNSOED

Dogma Sentral Biologi Molekuler

Salah satu hallmark (penanda/karakteristik) dari suatu kehidupan yaitu

reproduksi. Informasi genetik dari suatu sel dengan segala keunikannya tentunya

harus dapat diturunkan ke anakannya. Informasi gentik (genom) disimpan

menggunakan asam nukleat, yaitu DNA. Asam nukleat ini mampu menyimpan

sejumlah besar informasi secara stabil hanya melalui 4 macam yakni adenin (A),

sitosin (C), guanin (G) dan timin (T), yang tersusun menjadi rantai DNA. Informasi

yang disimpan DNA tersebut akan diduplikasikan saat terjadi pembelahan sel

(REPLIKASI) dan akan disalin menjadi mRNA (TRANSKRIPSI), yang selanjutnya RNA

yang terjadi tersebut akan ditranslasikan menjadi urutan asam amino dari protein

(TRANSLASI). Proses tersebut dinyatakan sebagi Dogma Sentral dari biologi

molekuler (Gambar 2).

Gambar 2. Dogma sentral biologi molekuler. (1) DNA ditranskripsi oleh enzim RNA polymerase menjadi mRNA, (2) mRNA yang terbentuk mengalami proses pasca-transkripsi berupa pembuangan intron sehingga menjadi RNA mature, (3) mRNA ditranslasi menjadi urutan asam amino/protein yang terjadi di sitosol, (4) DNA diperbanyak melalui proses replikasi melibatkan ezim DNA polymerase.


3

FARMASI UNSOED

Gen memberi perintah untuk membuat protein tertentu. Tetapi gen tidak

membangun protein secara langsung. Jembatan antara DNA dan sintesis protein

adalah RNA. Kita ketahui bahwa RNA secara kimiawi serupa dengan DNA, kecuali

RNA mengandung ribosa, bukan deoksiribosa sebagai gulanya. Sedangkan untuk

basa nitrogen pada RNA adalah urasil (U), bukan timin (T). Dengan demikian, setiap

nukleotida di sepanjang untai DNA memiliki deoksiribosa sebagai gulanya dan A, G, C,

T sebagai basanya. Sedangkan pada RNA memiliki gula ribose dan A, G, C, U

sebagai basanya.

Aliran informasi genetik mirip dengan urutan-urutan huruf tertentu yang

menyampaikan informasi dalam bahasa tulisan. Pada DNA atau RNA, monomernya

merupakan keempat jenis nukleotida yang berbeda dalam basa nitrogennya. Gen

biasanya panjangnya mencapai ratusan atau ribuan nukleotida, masing-masing

memiliki urutan basa yang spesifik. Setiap polipeptida dari suatu protein juga memiliki

monomer yang tersusun pada struktur primer, tetapi monomernya adalah ke-20 asam

amino tersebut. Dengan demikian, asam nukleat dan protein berisi informasi yang

ditulis dalam dua bahasa kimia yang berbeda (Gambar 3). Untuk beralih dari DNA,

yang ditulis dalam satu bahasa, ke protein, yang ditulis dalam bahasa lain,

membutuhkan dua tahapan utama yaitu transkripsi dan translasi.

Gambar 3. Ilustrasi aliran informasi genetik yang ditulis dalam dua bahasa kimia yang berbeda

Transkripsi merupakan sintesis RNA berdasarkan template DNA. Kedua asam

nukleat menggunakan bahasa yang sama dan informasinya tinggal ditranskripsi

(disalin) dari satu molekul ke molekul yang lain. Persis sebagai mana saat proses

replikasi, untai DNA menyediakan suatu cetakan (template) untuk sintesis untai

komplemen terbaru, pada transkripsi juga disediakan template untuk menyusun RNA.

FARMASI UNSOED

Molekul RNA yang dihasilkan

protein dari gen tersebut. Jenis

Translasi merupakan

berdasarkan arahan mRNA.

menerjemahkan (mentranslasi) urutan

amino polipeptida. Tempat

Walaupun mekanisme

dan eukariot, namun ter

dalam sel. Karena bakteri

ribosom dan perlengkapan

dipasangkan dengan ribosom

transkripsi masih terus

nukleus memisahkan transkripsi

terjadi di nukleus dan mRNA dikirim

4). Tetapi sebelum mRNA meninggalkan nuk

berbagai cara untuk menghasilkan mRNA yang fungsional. Dengan

proses 2 langkah ini, transkrip gen eukariotik

pemrosesan RNA menghasilkan mRNA akhir.

Gambar 4. Lokasi terjadinya transkripsi dan translasi pada eukariotnukleus dan mRNA dikirim ke sitoplasma di mana terjadi translasi.protein melalui pesan genetik dalam bentuk mRNA. Dengan kata lain, sel diatur oleh rantai perintah molekuler: DNA �


FARMASI UNSOED

Molekul RNA yang dihasilkan merupakan transkrip penuh dari perintah

protein dari gen tersebut. Jenis molekul RNA ini disebut RNA messenger (mRNA).

merupakan sintesis polipeptida yang sesungguhnya, yang terjadi

arahan mRNA. Selama tahapan ini terjadi perubahan

menerjemahkan (mentranslasi) urutan basa molekul mRNA ke dalam

Tempat translasi adalah ribosom yang terletak di sitoplasma.

mekanisme dasar transkripsi dan translasi serupa

terdapat perbedaan penting dalam aliran informasi genetik

bakteri tidak memiliki nukleus, DNA-nya tidak

perlengkapan pensintesis-protein lainnya. Transkripsi

ribosom menempel pada ujung depan molekul mRNA sewaktu

terus berlangsung. Sebaliknya, dalam sel eukariotik, selubung

transkripsi dan translasi dalam ruang dan

leus dan mRNA dikirim ke sitoplasma di mana terjadi

sebelum mRNA meninggalkan nukleus, transkrip RNA dimodifikasi

menghasilkan mRNA yang fungsional. Dengan

ini, transkrip gen eukariotik menghasilkan pre

pemrosesan RNA menghasilkan mRNA akhir.

Gambar 4. Lokasi terjadinya transkripsi dan translasi pada eukariot. Transkripsi terjadi di nukleus dan mRNA dikirim ke sitoplasma di mana terjadi translasi. Gen memprogram sintesis protein melalui pesan genetik dalam bentuk mRNA. Dengan kata lain, sel diatur oleh rantai

� RNA � protein.


4

perintah pembangun

disebut RNA messenger (mRNA).

polipeptida yang sesungguhnya, yang terjadi

perubahan bahasa, sel

dalam urutan asam

ribosom yang terletak di sitoplasma.

serupa untuk prokariot

informasi genetik di

tidak tersegregasi dari

Transkripsi dan translasi

molekul mRNA sewaktu

eukariotik, selubung

waktu. Transkripsi

translasi (Gambar

leus, transkrip RNA dimodifikasi dengan

menghasilkan mRNA yang fungsional. Dengan demikian, pada

menghasilkan pre-mRNA, dan

. Transkripsi terjadi di Gen memprogram sintesis

protein melalui pesan genetik dalam bentuk mRNA. Dengan kata lain, sel diatur oleh rantai


5

FARMASI UNSOED

TRANSKRIPSI

Transkripsi adalah proses penyalinan kode-kode genetik yang ada pada urutan DNA

menjadi molekul RNA.

Mekanisme dasar sintesis RNA

Transkripsi (sintesis RNA) dilakukan melalui beberapa tahapan yaitu:

1. Faktor-faktor pengendali transkripsi menempel di bagian promoter, misalnya

RNA polimerase (Inisiasi).

2. Pembentukan kompleks promotor terbuka (open promoter complex). Tidak

seperti replikasi di mana DNA benar-benar dibuka, pada transkripsi pilinan

DNA dibuka namun masih tetap di dalam RNA polimerase.

3. RNA polimerase membaca DNA cetakan (template) dan mulai melakukan

pengikatan nukleotida yang komplementer (Elongasi).

4. Setelah pemanjangan untaian RNA, diikuti dengan terminasi yang ditandai

dengan lepasnya RNA polimerase dari DNA yang ditranskripsi (Terminasi).

Walaupun tahapan-tahapan yang terjadi sama antara eukariot maupun

prokariot, namun ada perbedaan fundamental dalam hal struktur gen, faktor-faktor

pengendali, mekanisme serta regulasi. Meskipun ada perbedaan, namun secara

umum pola mekanisme sintesis RNA serupa. Baik pada eukariot maupun prokariot,

PRINSIP yang harus di pegang adalah:

1. Prekursor untuk sintesis RNA ada 4 macam ribonukleotida: 5′-trifosfat ATP,

GTP, CTP, dan UTP (tidak ada timin pada RNA).

2. Reaksi polimerisasi atau pemanjangan RNA sama dengan replikasi DNA yaitu

dengan arah 5′ ��3′ (5’-PO4 ke 3’-OH).

3. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template

(Gambar 5).

4. Untai DNA yang berperan sebagai cetakan hanya salah satu untai.

5. Hasil transkripsi berupa molekul RNA untai tunggal.


6

FARMASI UNSOED

Gambar 5. Urutan nukleotida RNA hasil sintesis ditentukan oleh urutan DNA template. RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah 3′ → 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’.

Faktor-faktor pengendali transkripsi, salah satunya adalah Faktor Transkripsi.

Terdapat lebih dari 50 protein berbeda dari faktor transkripsi berikatan pada situs

promoter, umumnya pada sisi 5’ dari gen yang akan ditranskrip. Kemudian, enzim

RNA polimerase berikatan ke kompleks dari Faktor Transkripsi, bekerja sama untuk

membuka DNA. RNA polimerase bekerja dengan membaca template dengan arah 3′

→ 5′, namun sintesis mRNA adalah dari 5′ → 3’ . RNA polimerase berjalan sepanjang

template DNA, membangun ribonukleotida yang disuplai dari bentuk trifosfat dengan

prinsip pasangan basa. Ketika bertemu G, maka pada RNA dimasukkan C, G-C, T-A,

A-U (U, dari uridine triphosphate, UTP). Tidak ada T pada RNA. Ketika transkripsi

selesai, transkrip (mRNA) dilepaskan dari polimerase dan polimerae lepas dari DNA.

Transkripsi pada Prokariot

Salah satu ciri dari prokariot adalah adanya struktur operon. Operon adalah

organisasi dari beberapa gen yang ekspresinya dikendalikan oleh satu promotor. Misal

operon lac, pada metabolisme laktosa pada bakteri E.coli. Masing-masiang gen

structural mempunyai kodon inisasi dan kodon terminasi, tetapi ekspresinya

dikendalikan oleh satu promoter yang sama (Gambar 6). Pada waktu ditranskripsi,

operon lac akan menghasilkan satu mRNA yang membawa kode genetik untuk 3

polipeptida berbeda, disebut dengan mRNA polisistronik. Masing-masing polipeptida

akan ditranslasi secara independen dari satu untaian mRNA yang sama.

DNA template


7

FARMASI UNSOED

Gambar 6. Organisasi operan lac pada E. coli. Operon lac punya 3 gen struktural yaitu lac Z (mengkode β-galaktosidase), lac Y (mengkode permease) dan lac A (mengkode trans-asetilase). Masing-masing dari gen mempunyai start codon dan stop codon sendiri-sendiri, namun ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter (p) yang sama. Operator (o) adalah bagian dari promoter tempet penempelan protein repressor yang dikode oleh gen I. Catabolite activator protein (CAP). AUG adalah start kodon (materi ini akan dijelaskan lebih dalam setelah mid semester.

Struktur Gen Prokariot

Gen prokariot secara tersusun atas promoter, gen struktural, dan terminator

(Gambar 7).

Gambar 7. Struktur gen prokariot

Promoter adalah urutan DNA spesifik yang berperan dalam mengendalaikan

transkripsi gen struktural dan terletak di daerah upstream (hulu) dari bagian struktural

gen. Fungsi promoter adalah sebagai tempat awal pelekatan enzim RNA polimerase

yang nantinya melakukan transkripsi pada bagian gen struktural. Salah satu bagian

penting promoter disebut sebagai Pribnow box pada urutan nukleotida -10 dan -35.

Oleh karena urutan consensus pada Pribnow box adalah TATAAT, maka seringkali

disebut juga TATA box. Pribnow box berperanan dalam mengarahkan enzim RNA

polymerase sehingga arah transkripsinya adalah dari ujung 5’ � 3’. Selain itu, daerah

ini merupakan tempat pembukaan heliks DNA untuk membentuk kompleks promoter

yang yang terbuka.


8

FARMASI UNSOED

Operator, merupakan urutan nukelotida yang terletak di antara promoter dan

bagian struktural dan merupakan tempat pelekatan protein represor (penekan atau

penghambat ekspresi gen). Jika ada represor yang melekat di operator maka RNA

polimerase tidak bisa jalan dan ekspresi gen tidak bisa berlangsung. Selain adanya

supresor ada juga enhancer. Jika supresor untuk menghambat, kebalikannya

enhancer berfungsi meningkatkan transkripsi dengan meningkatkan jumlah RNA

polimerase. Namun letaknya tidak pada lokasi yang spesifik, ada yg jauh di upstream

atau bahkan downstream dari titik awal transkripsi.

Coding Region (gen structural) merupakan bagian yang mengkode urutan

nukleotida RNA. Transkripsi dimulai dari sekuens inisiasi transkripsi (ATG) sampai

kodon stop (TAA / TGA / TAG). Pada prokariot tidak ada sekuens penyisip (intervening

sequences atau intron, yang tidak dapat diekspresikan) sehingga semuanya berupa

ekson (urutan nukleotida yang mengkode asam amino). Tidak semua gen mengkode

urutan asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau protein. Gen dibagi menjadi

3 kelompok yaitu gen yang mengkode protein, gen yang mengkode RNA ribosom

(rRNA) dan gen yang mengkode transfer-RNA (tRNA). Gen yang mengkode rRNA dan

tRNA hanya akan ditranskripsi dan tidak pernah ditranslasi karena yang diperlukan

dalam proses ekspresi genetic adalah molekul RNA-nya. rRNA digunakan untuk

menyusun ribosom (tempat sintesis protein) sedangkan tRNA berfungsi membawa

molekul asam amino spesifik yang akan dirangkaikan menjadi polipeptida dalam

proses sintesis protein.

Terminator, adalah bagian gen yang terletak di sebelah hilir dari gen structural.

Fungsinya adalah memeberikan signal pada enzim RNA polymerase agar

menghentikan proses transkripsi. Signal terminasi dicirikan oleh struktur jepit

rambut/hairpin dan lengkungan yang kaya yang akan urutan GC yang terbentuk pada

molekul RNA hasil transkripsi.

RNA Polimerase, merupakan enzim yang mengkatalisis proses transkripsi.

Susunan lengkap adalah α2ββ’σ disebut holoenzim, jika σ tidak ada dan hanya

ada α2ββ’ disebut core-enzyme. Fungsi subunit-subunit tersebut adalah: α = diduga

berfungsi dalam penyusunan enzim, β = berfungsi dalam pengikatan nukleotida, β’ =

berfungsi dalam penempelan DNA, σ = berfungsi untuk mengarahkan agar RNA

polimerase menempel pada promoter.


9

FARMASI UNSOED

MEKANISME TRANSKRIPSI PADA PROKARIOT

Tahapan transkripsi terdiri dari inisiasi, elongasi, dan terminasi.

Inisiasi. Transkripsi dimulai dengan penempelan RNA polimerase holoenzim

pada bagian promoter. RNA polimerase menuju ke promoter atas bantuan faktor σ

yang mampu menemukan bagian promoter suatu gen. Bisa diibaratkan RNA

polymerase adalah pesawat, faktor sigma adalah antenanya, promoter adalah

bandaranya. Pada prokariot, RNA polymerase menempel secara langsung pada DNA

di daerah promoter tanpa melalui ikatan dengan protein lain (pada eukariot protein

pembantu dibutuhkan sangat banyak !!).

Kemudian, bagian DNA yang berikatan dengan RNA polimerase membentuk

struktur gelembung transkripsi (transcription bubble) yang stabil. Selanjutnya adalah

penggabungan beberapa nukleotida awal sekitar 10 nukleotida. Basa-basa RNA yang

digabung membentuk ikatan hidrogen dengan basa DNA cetakan. Selanjutnya adalah

pelepasan subunit σ setelah terbentuk molekul RNA sepanjang 8-9 nukleotida. Terjadi

perubahan konformasi holoenzim jadi core enzyme (tanpa faktor σ). Faktor σ

selanjutnya dapat digunakan lagi dalam proses inisiasi transkripsi selanjutnya (dapat

digunakan oleh enzim inti RNA polimerase lain) (Gambar 8).

Gambar 8. Proses inisiasi transkripsi pada prokariot. Faktor sigma membantu mengenali promoter suatu gen.

Pada elongasi, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3′ molekul

RNA yang baru terbentuk dengan arah 5′ � 3′ pada ikatan fosfodiester (Gambar 9).

Nukleotida RNA yg ditambahkan bersifat komplementer dengan nukleotida untai DNA

cetakan.


10

FARMASI UNSOED

Gambar 9. Proses pembentukan ikatan fosfodiester. Gugus OH pada posisi 3’ menyerang posphat pada posisi 5’ melepas 2P dan molekul H2O membentuk ikatan fosfodiester yang stabil.

Penghentian transkripsi (terminasi) ada 2 macam yaitu:

1. Rho-independent yaitu terminasi yang dilakukan tanpa harus melibatkan

protein khusus, namun ditentukan oleh adanya urutan nukleotida tertentu pada

bagian terminator. Ciri urutan adalah adanya struktur jepit rambut/hairpin yang

kaya akan basa GC. Akibat struktur itu, RNA polimerase berhenti dan

membuka bagian dari sambungan (hibrid) DNA-RNA. Sisa hibrid merupakan

urutan oligo U (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan A (dA) �

ikatan hidrogen hanya 2 buah, akibatnya ikatan lemah terlepas dan RNA hasil

transkripsi lepas.

2. Rho-dependent yaitu terminasi memerlukan protein rho. Faktor rho terikat pada

RNA transkrip kemudian mengikuti RNA polimerase sampai ke daerah

terminator. Faktor rho membentuk destabilisasi ikatan RNA-DNA hingga

akhirnya RNA terlepas.


11

FARMASI UNSOED

TRANSKRIPSI PADA EUKARIOT

Struktur gen

Gen-gen pada eukariot bersifat monosistronik, artinya satu transkrip yang

dihasilkan hanya mengkode satu macam produk ekspresi. Pada eukariot tidak dikenal

namanya operon karena satu gen structural dikendalikan oleh satu promoter. Secara

umum hampir sama sama prokariot yaitu adanya promotor, bagian struktural dan

terminator. Bagian yang membedakan adalah pada bagian struktural gen. Bagian

struktural/coding region pada eukariot ada bagian intron dan ekson (Gambar 10).

Intron (intervening sequences) merupakan sekuens yang tidak mengkode asam

amino. Bagian ini akan dibuang saat RNA processing. Ekson merupakan sekuen yang

dikode menjadi asam amino (Gambar 10).

Gambar 10. Bagian struktural gen eukariot

Mekanisme Transkripsi Pada Eukariot

RNA polimerase pada eukariot bermacam-macam yaitu RNA polimerase I

(mentranskrip gen kelas I yaitu gen rRNA kecuali 5S rRNA), RNA Polimerase II

(mensintesis mRNA dan small nulear RNA/snRNA yang diperlukan pada saat RNA

splicing) dan RNA polymerase III (mentranskrip gen kelas III yaitu tRNA, 5S rRNA).

Pada bab ini hanya dijelaskan RNA polimerase II karena terlibat pada transkripsi

semua gen.


12

FARMASI UNSOED

Berbeda dengan prokariot, RNA polymerase eukariot tidak menempel secara

langsung pada DNA di daerah promoter namun melalui perantaraan protein-protein

lain disebut faktor transkripsi/transcription factor (TF). TF ada 2 macam yaitu ada

yang umum dan ada yang khusus. TF umum berfungsi mengarahkan RNA polymerase

ke promoter. TF umum meiputi TFIIA, B, D, E, F, H, J (transcription factors regulating

RNA pol II). Penempelan RNA polymerase [ada promoter oleh daktor transkripsi umum

hanya menghasilkan transkripsi pada aras dasar (basal level). Pengaturan yang lebih

spesifik dilakukan oleh FT yang khusus untuk suatu gen.

Promoter eukariot sangat beragam dan sulit untuk dikarakterisasi. Basal

promoter elements dikenal dengan TATA-box dan CCAAT-box, dinamakan

berdasarkan sekuen motifnya (Gambar 11). TATA-box berada pada 20 sampai 30

basa upstream dari transcriptional start site dan ini sama dengan sekuen pada

prokariot atau Pribnow-box (sekuen konsensusnya adalah TATAAA, TATAT/AAT/A,

dimana T/A menandakan basa yang mungkin ditemukan pada posisi tersebut). TFIID

adalah faktor transkripsi pertama yang secara langsung berikatan dengan TATA box

dan penempelan ini mengarahkan faktor transkripsi lainnya dan RNA polymerase II

untuk mengenali promoter. TFIID sebenarnya merupakan kompleks protein yang terdiri

dari protein pengikat kotak TATA (TATA-box binding protein, TBP) dan TAF (TBP-

associated factors). CCAAT-box terdapat pada posisi -100. CCAAT-box diketahui

mengikat protein FT CCAAT-binding transcription factor (CTF) dan CCAAT-enhancer-

binding protein (C/EBP).

Gambar 11. Struktur umum dari gen eukariot

Ada banyak regulator lain pada urutan gen, yaitu tempat berikatannya berbagai

faktor transkripsi (Gambar 12). Urutan regulator ini sebagian besar adalah terletak hulu

(5') dari situs inisiasi transkripsi, meskipun beberapa elemen terjadi hilir (3') atau

bahkan di dalam gen itu sendiri. Jumlah dan jenis elemen regulator ditemukan

bervariasi tiap masing-masing gen. Kombinasi yang berbeda dari faktor transkripsi ini


13

FARMASI UNSOED

memberikan efek yang berbeda. Berbagai jenis sel mengekspresikan kombinasi

karakteristik dari faktor transkripsi, dan ini menghasilkan mekanisme utama untuk

kekhususan tipe sel dalam regulasi ekspresi gen.

Gambar 11. Struktur bagian upstream gen eukariot. Dihipotesiskan terdiri dari 2 ekson dan 1 intron. Diagaram menunjukkan adanya TATA-box dan CCAAT box basal element masing-masing pada posisi -25 dan -100. FTIID terlihat berikatan dengan TATA-box binding protein, TBP. [CREB = cAMP response element binding protein] [C/EBP = CCAAT-box/enhancer binding protein]. Lingkaran besar hijau menggambarkan RNA polymerase II. Source: http://themedicalbiochemistrypage.org/gene-regulation.html

Tabel 1. Eukaryotic promoter elements

Kebanyakan walau tidak semua, CAAT dan GC-box berlokasi antara -200 dan -70. N = any (A, T, C, atau G), Py (pirimidin = C atau T). Penghilangan atau mutasi pada GC box dapat menghilangkan aktivitas promoter. Selain sekuen di atas, GC box juga mempunyai sekuen CCGCCC.

Table 2. Daftar Beberapa Faktor Transkripsi

Faktor transkripsi

Sequence Motif Komentar

MYC and MAX CACGTG MYC pertama kali diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; MAX secara khusus bergabung dengan MYC di sel

FOS and JUN TGAC/GT

C/AA Keduanya pertama kali ditemukan sebagai

onkogen retrovirus; bergabung di sel, dikenal juga sebagai faktor transkripsi AP-1

CREB TGACGC/T

C/A

G/A Terikat pada cAMP response element

(CRE); family minimal ada 10 factor transkripsi hasil dari gen yang berbeda


14

FARMASI UNSOED

atau alternative splicing; dapat membentuk dimer dengan JUN

ERBA; also TR (thyroid hormone receptor)

GTGTCAAAGGTCA Pertama diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; member of the steroid/thyroid hormone receptor superfamily; binds thyroid hormone

ETS G/C

A/CGGA

A/TG

T/C Pertama diidentifikasi sebagai onkogen

retrovirus; mendominasi pada sel B dan T

GATA T/AGATA Family dari erythroid cell-specific factors,

GATA-1 sampai -6

MYB T/CAAC

G/TG Pertama diidentifikasi sebagai onkogen

retrovirus; hematopoietic cell-specific factor

MYOD CAACTGAC

master kontrol diferensiasi sel otot

NFκB and REL GGGAA/CTN

T/CCC

(1) kedua faktor diidentifikasi secara independen; REL pertama kali diidentifikasi sebagai onkogen retrovirus; mendominasi dalam sel B-dan -T

RAR (retinoic acid receptor)

ACGTCATGACCT

mengikat pada elements disebut RAREs (retinoic acid response elements) juga mengikat situs JUN/FOS

SRF (serum response factor)

GGATGTCCATATTAGGACATCT Terdapat banyak dalam gen yang diinduksi oleh faktor-faktor pertumbuhan yang ada pada serum

Daftar ini hanya mewakili ribuan dari faktor transkripsi yang telah diidentifikasi. N menandakan segala macam basa dapat menduduki posisi ini.

Proses pemanjangan transkrip berlangsung sama seperti pada prokariot.

Proses ini akan berlangsung sampai RNA polymerase II mencapai daerah terminator.

Terminasi transkripsi dapat terjadi karena adanya aktivitas fosfatase yang spesifik

untuk CTD sehingga mengembalikan RNA polymerase II menjadi bentuk yang tidak

terfosforilasi. Pada keadaan ini, RNA polymerase dapat digunakan secara berulang-

ulang.

Proses pasca-transkripsi

Pre-mRNA yg dihasilkan dari proses transkipsi tidak bisa langsung dikeluarkan ke

sitoplasma untuk ditranslasi namun harus dimodifikasi dahulu.

1. Pemberian topi (capping) dan ekor (poliadenilasi)

Setiap ujung molekul pre-mRNA dimodifikasi dengan cara tertentu. Ujung 5’ yaitu

ujung depan, pertama kali dibuat saat transkripsi segera ditutup dengan mukleotida

guanin (G) yang termodifikasi. Pemerian topi ini mempunyai setidaknya 2 fungsi.

a. Ujung ini melindungi mRNA dari degradasi enzim hidrolisis.

b. Setelah mRNA sampai di sitoplasma, ujung 5’ berfungsi sebagai bagian dari

tanda “lekatkan di sini” untuk ribosom.


15

FARMASI UNSOED

Pada ujung 3’ suatu enzim menambahkan ekor polia(A) yang terdiri dari 30-200

nukleotida adenin. Ekor poli(A) berfungsi mempermudah ekspor mRNA dari nukleus.

Gambar 12. Capping dan pemberian ekor pada mRNA

Poliadenilasi merupakan proses penambahan poliA (rantai AMP) pada ujung 3′

nukleotida mRNA. Fungsinya untuk meningkatkan stabilitas mRNA dan meningkatkan

efisiensi translasi.

2. Splicing

Saat proses transkripsi, RNA polimerase mentranskripsi intron maupun ekson dari

DNA. Splicing merupakan proses pembuangan intron dan penyambungan ekson.

Intron adalah bagian penyela, merupakan segmen asam nukleat bukan pengkode dan

terletak diantara daerah pengkode. Sedangkan ekson adalah daerah yang yang

diekspresikan atau ditranslasi menjadi asam amino. Dalam penyambungan RNA,

intron dikeluarkan dan ekson bergabung. Penyambungan RNA dikatalis oleh

ribonukleoprotein nucleus kecil (snRNP), yang beroperasi de dalam susunan yang

lebih besar disebut spliosom. Setelah dilakukan berbagai modifikasi di atas, jadilah

mRNA matang (mature mRNA) (Gambar 13).


16

FARMASI UNSOED

Gambar 13. Proses splicing


17

FARMASI UNSOED

Alternatif splicing

Gambar 14. Alternative splicing memberikan hasil protein yang berbeda

NOTE:

Proses pembentukan RNA dari DNA dinamakan transkripsi, dilakukan oleh RNA

polymerase.

Pada kebanyakan virus, materi genetik berupa RNA sehingga ketikan menginfeksi

host, materi genetik di retro-transkripsi dari RNA menjadi cDNA (complement DNA)

oleh ennzim Reverse trancriptase.


18 FARMASI UNSOED

TRANSLASI

Translasi adalah proses penerjemahan urutan nukleotida yang ada pada

molekul mRNA menjadi rangkaian asam amino yang menyusun suatu polipeptida atau

protein. RNA yang ditranslasi adalah mRNA, sedangkan tRNA dan rRNA tidak

ditranslasi. Molekul rRNA adalah salah atau molekul penyusun ribosom yaitu organel

tempat berlangsungnya sintesisi protein, sedangkan tRNA adalah pembawa asam-

asam amino yang akan disambungkan menjadi rantai polipeptida.

Beberapa tipe RNA yang disintesis di nukleus pada sel eukariot, yang menarik

sebagai berikut:

1. messenger RNA (mRNA). mRNA kemudian bisa ditranslasi menjadi

polipeptida.

2. ribosomal RNA (rRNA). rRNA digunakan untuk membangun ribosom, yaitu

mesin untuk mensintesis protein pada saat translasi mRNA.

3. transfer RNA (tRNA), yaitu molekul RNA yang membawa asam amino selama

pembentukan polipeptida.

4. small nuclear RNA (snRNA). Transkripsi DNA dari gen menjadi mRNA, rRNA,

dan tRNA menghasilkan molekul prekursor dengan struktur yang besar disebut

"primary transcripts". Molekul ini harus diproses dalam nukleus untuk

menghasilkan molekul fungsional untuk diekspor ke sitosol. Beberapa tahapan

proses ini banyak melibatkan snRNA.

5. microRNA (miRNA). Molekul RNA yang sangat kecil (~22 nukleotida) yang

terlihat pada regulasi ekspresi mRNA.

Molekul mRNA merupakan transkrip urutan DNA yang menysusun suatu gen

dalam bentuk ORF (open reading frame, kerangka baca terbuka). Ciri-ciri ORF:

1. Kodon inisasi translasi, yaitu ATG (pada DNA) atau AUG (pada mRNA)

2. Serangkaian urutan nukleotida yang mneyusn banyak kodon

3. Kodon terminasi translasi yaitu TAA, TAG, TGA (pada DNA) atau UAA, UAG,

UGA (pada RNA).

Kodon (kode genetik) adalah urutan nukloetida yang terdiri dari 3 nukloetida

berurutan sehingga sering disebut sebagai triplet codon yang menyandi suatu asam

amino tertentu. Kodon inisiasi translasi merupakan kodon untuk asam amino metionin


19 FARMASI UNSOED

yang mengawali struktur suatu polipeptida (protein). Pada prokariot, asam amino awal

tidak berupa metionin tetapi formil metionin (fMet). Dalam proses translasi, rangkaian

nukleotida pada mRNA akan dibaca tiap tiga nukleotida sebagai satu kodon untuk satu

asam amino, dan pembacaan dimulai dari urutan kodon metionin (Gambar 15).

Gambar 15. Ilustrasi translasi kodon

Translasi berlangsung di dalam ribosom, ribosom disusun oleh molekul-molekul

rRNA dan beberapa macam protein. Ribosom tersusun atas dua subunit yaitu subunit

kecil dan subunit besar. Pada eukariot, subunit kecil mempunyai koefisien sedimentasi

sebasar 30S (unit Svedberg) dan subunit besar 50S, pada eukariot yaitu 50S dan 70S.

Pada prokariot, riosom tersebar di seluruh bagian sel, sedangkan pada eukariot

ribosom terletak di sitoplsma kususnya pada bagian permukaan membran retikulum

endoplasma.


20 FARMASI UNSOED

Gambar 16. Penentuan unit sedimentasi pada komponen ribosom

Pada eukariot, translasi sudah dimulai sebelum proses transkripsi (sintesis

mRNA) selesai dilakukan. Dengan demikian proses transkripsi dan translasi

berlangsung hampir serempak. Sebaliknya, pada eukariot proses translasi baru dapat

berlangsung jika proses transkripsi (sintesis mRNA yang matang) sudah selesai

dilakukan. Proses transkripsi pada eukariot berlangsung di dalam inti sel, sedangkan

translasi berlangsung dalam ribosom yang ada di dalam sitoplasma. Setelah sintesis

mRNA selesai, selanjuttnya mRNA keluar dari inti sel menuju sitoplasma untuk

bergabung dengan ribosom.

Proses Translasi

Proses translasi berlangsung melalaui 3 tahapan utama:

1. Inisiasi (initiation)

2. Pemanjangan (elongation) poli-asam amino

3. Pengakhiran (termination).

Perangkat translasi yaitu molekul tRNA (aminoasil tRNA) yang berfungsi

membawa asam amino spesifik. Terdapat sekitar 20 macam tRNA yang masing-

masing membawa asam amino spesifik karena di alam ada sekitar 20 asam amino

yang menyusun protein alami. Enzim yang mengikatkan antar-asam amino adalah

aminoasil tRNA sintetase.


21 FARMASI UNSOED

Gambar 17. Struktur tRNA aminoasil

Inisiasi

Ada beberapa perbedaan dalam hal proses inisiasi translasi antara prokariot

dengan eukariot. Pada eukariot kodon inisiasi adalah metionin, sedangkan pada

prokariot adalah formil-metionin/fMet. Molekul tRNA inisiator disebut tRNAiMet.

Ribosom bersama-sama dengan tRNAiMet dapat menemukan kodon awal dengan

cara berikatan dengan ujung 5’ (tudung) kemudian melakukan scanning transkrip ke

arah 3’ (arah 5’ 3’) sampai menemukan start kodon (AUG). selama scanning,

ribosom memulai translasi pada waktu menjumpai sekuen konsensus CCRCCCAUGG

(R adalah purin: A/G).

Gambar 18. Perbedaan translasi pada prokariot dan eukariot


22 FARMASI UNSOED

Elongasi

Proses elongasi terjadi dalam 3 tahapan:

1. Pengikatan aminoasil-tRNA pada sisi A (aminoasil) yang ada di ribosom

2. Pemindahan rantai polipeptida yang tumbuh dari tRNA yang ada pada sisi P

(peptidil) ke arah sisi A dengan membentuk ikatan peptida

3. Translokasi ribosom sepanjang mRNA ke posisi kodon selanjutnya yang ada di

sisi A.

Gambar 19. Proses elongasi translasi

Proses pemanjangan polipeptida berlangsung sangat cepat. Pada E. coli

sintesis polipeptida yang terdiri dari atas 300 asam amino hanya memelrukan waktu

selama 15 detik. Ribosom membaca kodon-kodon pada mRNA dari ujung 5’ 3’.

Hasil proses translasi adlah molekul poliptida yang mempunyai ujung amino dan ujung

karboksil. Ujung amino adalaah ujung uang pertama kali disntesis dan merupakan

hasil penerjemahan kodon yang terletak pada ujung 5’ pada mRNA, sedangkan ujung

yang terakhir disitesis adlah gugus karboksil, hasil terjemahan kodn yang terletak pada

ujung 3’ pada mRNA.

Terminasi

Translasi akan berakhir pada waktu salah satu dari ketiga kodon terminasi

(UAA, UGA, UAG) yang ada pada mRNA mencapai posisi A pada ribosom. Dalam

keadaan normal, tidak ada aminoasil-tRNA yang membawa asam amino sesuai


23 FARMASI UNSOED

dengan ketiga kodon tersebut. Oleh karena itu, jika ribosom mencapai salah satu dari

ketiga kodon terminasi tersebut, maka proses translasi berakhir.

Proses Pasca-Translasi

Selama proses translasi dan sesudahnya, rantai polipeptida yang terbentuk

mulai menggulung dan melipat secara spontan membentuk protein fungsional dengan

konformasi yang spesifik. Konformasi ini berupa suatu molekul tiga dimensi dengan

struktur skunder dan tersier. Pelipatan protein dibantu oleh suatu protein chaperon.

Langkah tambahan yang dilakukan sebelum dikirim ke target adalah

memberikan modifikasi secara kimiawi. Pada asam amino tertentu dilakukan

penambahan gula, lipid, gugus fosfat atau penambahan-penambahan lain. Pada

beebrapa kasus, rantai polipetida tunggal dapat membelah secara enzimatik menjadi

dua atau lebih potongan, missal insulin. Protein insulin pertama kali disintesis sebagai

rantai polipeptida tunggal tetapi menjadi aktif hanya setelah suatu enzim

menghilangkan bagian tengah dari rantai tersebut, membentuk protein yang terdiri dari

2 rantai peptida yang terhubung dengan jembatan sulfida.

Polipeptida sinyal mengarahkan beberapa polipeptida eukariotik ke tujuan

spesifik di dalam sel. Protein yang akan tetap berada dalam sitosol dibuat pada

ribosom bebas. Protein yang ditujukan untuk membrane atau untuk diekspor dari sel ,

disintesis pada ribosom yang terikat RE. Partikel pengenlan-sinyal mengikatkan diri

pada urutan sinyal pada ujung leading dari polipeptida yang sedang tumbuh, yang

membuat ribosom dapat mengingkatkan diri pada RE.

Obat Yang Bertarget Pada Translasi

Banyak obat yang bertarget pada proses translasi terutama obat golongan

antibiotik.

1. Puromisin. Proses pemanjangan polipeptida dihambat oleh puromisin,

mempunyai struktur yang mirip dengan suatu aminoasil-tRNA sehingga dapat

melekat pada sisi A ribosom. Jika puromisin melekat pada sisi A, maka

selanjutnya dapat membantuk ikatan peptida dengan peptida yang ada pada

sisi P dan menhasilkan peptidil puromisin. Peptidil puromisin tidak dapat

melekat kuat pada ribosom sehingga akhirnya terlepas. Hal ini menyebabkan

terjadinya terminasi translasi secara prematur. Mekanisme inilah yang


24 FARMASI UNSOED

menyebabkan puromisin dapat membunuh bakteri dan sel lainnya. Antibiotik

lain yang dapat menghambat translasi dengan cara berikatan pada ribosom

adlaah strptomisin, kloramfenikol, tetrasiklin, eritromisin, dan sikloheksimid.

2. Streptomisin.

Kode Genetik

OPEN READING FRAME

Tidak semua bagian DNA merupakan kode genetik, pada manusia sejumlah

98% adalah junk DNA, hanya 2% yang berupa gen yang mengkodekan protein.

Namun, dari persentase yang sedikit tersebut bagaimana membentuk protein yang

jumlahnya ribuan?

ATGTATTCTTACGGAATCCCTGAT

Sel membaca kalimat di atas sebagai kata-kata 3 huruf:

ATG TAT TCT TAC GGA ATC CCT GAT (DNA)

M Y S Y G I P D (Asam amino)

Reading Frame


25 FARMASI UNSOED

Bisa juga kita melakukan alternatif pembacaan berikut:

A TGT ATT CTT ACG GAA TCC CTG AT

Atau seperti ini:

AT GTA TTC TTA CGG AAT CCC TGA T

Dan kalau diterjemahkan hasilnya pun akan berbeda:

A TGT ATT CTT ACG GAA TCC CTG AT

C I L T E S L

AT GTA TTC TTA CGG AAT CCC TGA T

V F L R N P *

Jadi ada 3 alternatif pembacaan dari satu untai DNA, dan karena DNA itu adalah

pasangan 2 untai yang saling berkomplemen, berarti kalimat inipun bisa dibaca pada

untai pasangannya, artinya total ada 6 cara pembacaan DNA, atau disebut Reading

Frame. Dari 6 reading frame, biasanya hanya salah satu frame saja yang merupakan

kalimat bermakna alias disebut gen.

Contoh pembahasan ORF di bagian bioinformatika berikut.


26 FARMASI UNSOED

PEMANFAATAN BIOINFORMATIKA UNTUK ANALISIS EKSPRESI GEN

Sarmoko

Perkembangan bioinformatika berkembang sangat pesat. Penggunaan internet

dan komputer untuk melakukan analisis semakin sering digunakan, dan kita pun

dituntut untuk dapat menguasainya. Seiring dengan itu, telah banyak diciptakan

software maupun database yang menunjang dan mempermudah kita untuk dapat

melakukan analisis tentang berbagai disiplin ilmu.

Demikian halnya dengan biologi molekular yang mempelajari makhluk hidup

dalam tingkat molekuler, seperti gen, DNA, ataupun RNA yang berperan dalam proses

sintesis berbagai jenis asam amino dan protein. Saat ini telah ada banyak situs

database tentang gen (gen bank) yang dapat diakses secara mudah melalui internet

yang memungkinkan kita untuk melakukan analisis seputar gen. Gen bank ini

disediakan antara lain oleh situs NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Melalui situs tersebut kita bisa melakukan analisis serta mencari informasi

biologi dan referensi selengkap-lengkapnya terhadap gen tertentu yang kita inginkan,

misalnya dari makhluk hidup jenis gen tersebut berasal, letak domain, gen se-

homologi, asam amino yang dihasilkan, open reading frame, struktur 3 dimensi dari

protein yang mungkin dihasilkan, transuksi signal, dan lain-lain.

TOUR BEGIN

Masuklah ke situs: HGNC (http://www.genenames.org).

Misal kita ingin menganalisis tumor supressor gene p53.

Dari halaman TP53 diperoleh link yang lengkap, dan bisa membawa kita ke NCBI.

Berikut hasil analisis yang dilakukan: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/35213?

Tentang p53 p53 plays a major role in preventing tumour development. It responds to a range of potentially

oncogenic stresses by activating protective mechanisms, most notably cell cycle arrest and

apoptosis. Its importance as a tumour suppressor is reflected by its high rate of mutation in

human cancer, with >50% of adult human tumours bearing inactivating mutations or deletions in

the TP53 gene. In many cancers where p53 is wild-type, the p53 pathway may be altered by

other oncogenic events. This means that the p53 response is probably defective in most

cancers.


27 FARMASI UNSOED

This gene encodes tumor protein p53, which responds to diverse cellular stresses to regulate

target genes that induce cell cycle arrest, apoptosis, senescence, DNA repair, or changes in

metabolism. p53 protein is expressed at low level in normal cells and at a high level in a variety

of transformed cell lines, where it's believed to contribute to transformation and malignancy. p53

is a DNA-binding protein containing transcription activation, DNA-binding, and oligomerization

domains. It is postulated to bind to a p53-binding site and activate expression of downstream

genes that inhibit growth and/or invasion, and thus function as a tumor suppressor. Mutants of

p53 that frequently occur in a number of different human cancers fail to bind the consensus

DNA binding site, and hence cause the loss of tumor suppressor activity. Alterations of this

gene occur not only as somatic mutations in human malignancies, but also as germline

mutations in some cancer-prone families with Li-Fraumeni syndrome. Multiple p53 variants due

to alternative promoters and multiple alternative splicing have been found. These variants

encode distinct isoforms, which can regulate p53 transcriptional activity. [provided by RefSeq]

DNA Sequence

Gen p53 berlokasi pada kromosom 17 (17p13).

Panjang origin: 1..20303 Namun gen terletak pada: 843..19876 mRNA adalah dari : join(843..949,11689..11790,11906..11927,12021..12299, 13055..13238,13320..13432,14000..14109,14452..14588, 14681..14754,17572..17678,18599..19876)

Kita hitung joinan di atas, ternyata terdapat 11 exons. There is a very large intron between

exons 1 and 2 (jarak nukleotida sangat panjang bukan? Dari 950-11688). Exon 1 is non-coding


28 FARMASI UNSOED

in the human p53 and it has been demonstrated that this region could form a stable stem-loop

structure which binds tightly to wild type p53 but not to mutant p53.

Note: The exon are numbered in the diagram above. The pink region denotes the UTR, the blue

region denotes the coding region and the grey region denotes the internal exons within the

introns.

Kita bisa melihat persebaran 11 exon dan panjangnya dari informasi berikut:

prim_transcript 843..19876 /gene="p53" exon 843..949 /gene="p53" /number=1 intron 950..11688 /gene="p53" /number=1 repeat_region 2581..2587 /gene="p53" /note="5'-ALU flanking" Repeat region banyak sekali di sini repeat_region 11374..11378 /gene="p53" /note="3' ALU-flanking" exon 11689..11790 /gene="p53" CDS join(11717..11790,11906..11927,12021..12299,13055..13238, 13320..13432,14000..14109,14452..14588,14681..14754, 17572..17678,18599..18680)


29 FARMASI UNSOED

/gene="p53" /codon_start=1 /product="protein p53" /protein_id="CAA38095.1" /db_xref="GI:35214" /db_xref="GDB:120445" /db_xref="GOA:P04637" /db_xref="HGNC:11998" /db_xref="InterPro:IPR002117" /db_xref="InterPro:IPR008967" /db_xref="InterPro:IPR010991" /db_xref="InterPro:IPR011615" /db_xref="InterPro:IPR012346" /db_xref="InterPro:IPR013872" /db_xref="InterPro:IPR015551" /db_xref="PDB:1A1U" /db_xref="PDB:1AIE" /db_xref="PDB:1C26" Kode pDB juga banyak di sini. Artinya adalah sudah banyak struktur Kristal protein yang sudah diidentifikasi. Klik tiap PDB ID akan membawa kita ke protein data bank dan didapat informasi tentang kompleks protein. /db_xref="PDB:3LW1" /db_xref="PDB:3SAK" /db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P04637" Hasil translasi adalah:

/translation="MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLM LSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKT YQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAM AIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVV PYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCA CPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRG RERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDS D" intron 11791..11905 /gene="p53" /number=2

Analisis promoter Pada keterangan di atas, dikatakan bahwa CDS (coding sequence) dimulai pada urutan 843..19876. Exon 1 adalah 843-949 Start codon adalah ATG. Coba cek, ada banyak ATG sebelum nomor 843 bukan?? Hal ini sesuai dengan teori bahwa bukah ATG pertama lah yang bakal jadi stop codon, bisa kedua ketiga dst, sampai ATG yang paling dekat dengan CDS (coding sequence = warna merah): yaitu 801-803 (warna biru) 1 ttcccatcaa gccctagggc tcctcgtggc tgctgggagt tgtagtctga acgcttctat


30 FARMASI UNSOED

61 cttggcgaga agcgcctacg ctccccctac cgagtcccgc ggtaattctt aaagcacctg 121 caccgccccc ccgccgcctg cagagggcgc agcaggtctt gcacctcttc tgcatctcat 181 tctccaggct tcagacctgt ctccctcatt caaaaaatat ttattatcga gctcttactt 241 gctacccagc actgatatag gcactcagga atacaacaat gaataagata gtagaaaaat 301 tctatatcct cataaggctt acgtttccat gtactgaaag caatgaacaa ataaatctta 361 tcagagtgat aagggttgtg aaggagatta aataagatgg tgtgatataa agtatctggg 421 agaaaacgtt agggtgtgga tattacggaa agccttccta aaaaatgaca tttaactgat 481 gagaagaaag gatccagctg agagcaaacg caaaagcttt cttccttcca cccttcatat 541 ttgacacaat gcaggattcc tccaaaatga tttccaccaa ttctgccctc acagctctgg 601 cttgcagaat tttccacccc aaaatgttag tatctacggc accaggtcgg cgagaatcct 661 gactctgcac cctcctcccc aactccattt cctttgcttc ctccggcagg cggattactt 721 gcccttactt gtcatggcga ctgtccagct ttgtgccagg agcctcgcag gggttgatgg 781 gattggggtt ttcccctccc atgtgctcaa gactggcgct aaaagttttg agcttctcaa 841 aagtctagag ccaccgtcca gggagcaggt agctgctggg ctccggggac actttgcgtt 901 cgggctggga gcgtgctttc cacgacggtg acacgcttcc ctggattggg taagctcctg Dst ……

Sekuen berikutnya adalah intron yang ternyata berupa repeat sekuen

yang sangat panjang sampai ketemu exon kedua yaitu pada sekuen:

11689..11790

Dst sampai exon 12.

Stop kodon berhenti pada urutan setelah exon terakhir.

exon 18599..19876 /gene="p53" /number=11 repeat_region 19424..19431 /gene="p53" /note="3' ALU-flanking"

Berarti pada 19887-19889 yaitu:

19861 taaaactttg ctgccacctg tgtgtctgag gggtgaacgc cagtgcaggc tactggggtc


31 FARMASI UNSOED

OPEN READING FRAME

Dari hasil 6 pembacaan diperoleh hasil:

Masih banyak lagi yang bisa ditelusur dari gen, bisa diklik di sebelah kanan sbb:


32 FARMASI UNSOED

Hasil translasi adalah:

/translation="MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLM LSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPRVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKT YQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAM AIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVV PYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCA CPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRG RERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDS

M adalah metionin (hasil translasi dari AUG)

Protein sequence:

The human p53 protein comprises of several domains:

1. The amino-terminus part (1-44) contains the transactivation domain, which is

responsible for activating downstream target genes.

2. A proline-rich domain (58-101) mediates p53 response to DNA damage through

apoptosis.

3. The DNA-binding domain (102-292) is a core domain which consists of a variety of

structural motifs. It is the target of 90% of p53 mutations found in human cancers as a

single mutation within this domain can cause a major conformational change.

4. The oligomerization domain (325-356) consists of a β-strand, which interacts with

another p53 monomer to form a dimer, followed by an α-helix which mediates the

dimerization of two p53 dimers to form a tetramer.

5. Three putative nuclear localization signals (NLS) have been identified in the C-

terminus, through sequence similarity and mutagenesis. The most N-terminal NLS

(NLSI), which consists of 3 consecutive Lysine residues to a basic core, is the most

active and conserved domain.

6. Two putative nuclear export signals (NES) have been identified. The leucine-rich C-

terminal NES, found within the oligomerization domain, is highly conserved and it has

been suggested that oligomerization can result in masking of the NES, resulting in p53

nuclear retention.


33 FARMASI UNSOED

Mutations

Inactivation of the p53 gene is essentially due to small mutations (missense and nonsense

mutations or insertions/deletions of several nucleotides), which lead to either expression of a

mutant protein (90% of cases) or absence of a protein (10% of cases. Mutations of p53 have

been found in nearly all tumor types and are estimated to contribute to around 50% of all

cancers.

Polymorphisme

The role of natural p53 variants (polymorphisms) or variants in the p53 signalling pathway is an

area that is less well explored. Several polymorphisms have been identified in the p53 gene. A

well known SNP occurs on Codon 72 (Arg/Pro).

Transcription Factors

p53 transcription under different conditions is related to vast number of biological events in

response to various cellular stresses. Human p53 consists of two promoters:

• P1 responsible for the transcription of the major p53 mRNA species and located

upstream of first exon,

• P2 involved in transcription of other rarer species and located within the first intron

region.

Recent studies have suggested that there is another "P2" located within intron 4 and

responsible generating the p53 isoforms.

Regulatory elements are found in both p53 upstream and downstream of start sites including

exons and introns. So far, there are more than 15 transcription factors binding sites are

experimentally and computationally identified within the P1 and first exon regions.

A binding site for members of the PAX family of transcription factors was identified in the first

non-coding exon of the human p53 gene. c-Myc/Max heterodimers have been shown to bind to

and transactivate the human promoter through a CATGTG motif. NF-kB Jun/Fos and homeobox

factor Hoxa5 are shown to regulate p53 expression transcriptionally. These transcription factors

function under different biological conditions such as apoptosis, cell-cycle arrest and etc, in

terms of time, space and quantity.


34 FARMASI UNSOED

Protein Interactions

Post-translational modifications and activation of p53 by genotoxic stresses

Appella, E. and Anderson, C.W.

Eur. J. Biochem. 268, 27644-72 (2001)

Monoclonal Antibodies

The p53 protein is a potent antigen that has the ability to raise antibodies when injected into a

foreign host. Currently, the p53 knowledgebase contains more than 50 distinct antibodies

recognizing the different domains of p53. Most of the antibodies recognize epitopes localized in

the N-terminal of p53. Some of the antibodies are able to bind to p53 in its native conformation,

while other antibodies, like pAb240, DO12 and HO3.5, can only bind to mutant p53 whose

structural conformation has been altered.

Regulatory pathway, klik berikut: http://p53.bii.a-star.edu.sg/aboutp53/pathway/index.php


35 FARMASI UNSOED

Daftar Istilah

Istilah Definisi Hipotesis one gene-one polypeptide

Beadle and Tatum's idea that genes do not always form an enzyme or protein, they instead form one polypeptide

transkripsi synthesis of RNA under the direction of DNA

messenger RNA, mRNA the RNA molecule that carries the genetic message from the nucleus to the ribosomes

translasi synthesis of a polypeptide

ribosom particles that facilitate the linking of amino acids in the polypeptide chain

RNA processing pre-mRNA undergoes this in order to acheive the finished RNA primary transcript the initial RNA transcript that is not translated into protein

triplet code genetic instructions for a polypeptide chain are written in the DNA as a series of three-nucleotide words

template strand the strand of DNA that is transcribed (the other strand will be duplicated, in a sense, on the mRNA)

kodon triplet dari basa mRNA

reading frame Cara pembacaan spesifik dari gugusan kata (uua ccg gca uaa bisa juga di baca uac cgg cau aa...)

RNA polimerase pries the two strands of DNA apart and hooks together RNA nucleotides as they base-pair

promoter Urutan DNA dimana RNA polimerase menempel dan menginisiasi transkripsi

terminator sequence that signals the end of transcription transcription unit stretch of DNA that is transcribed into an RNA molecule

Faktor transkripsi mediate the binding of RNA polymerase and the initiation of transcription

transcription initiation complex

the completed assembly of transcription factor and RNA polymerase II bound to the promoter

TATA box promoter DNA sequence in eukaryotes

5' cap (tudung 5) a modified form of guanine that facilitates the export of mRNA from the nucleus and protects it from degradation

poly-A tail (ekor poli-A) on the 3' end, many adenines are added for protection from degradation and to help it exit the nucleus

RNA splicing Proses pemotongan pembuangan intron intron non coding sequences of nucleic acid exon Sekuen pengkode pada RNA spliceosome a type of snRNP that assists in RNA splicing snRNP small nuclear ribonucleoproteins located in the cell nucleus and is the signal molecule for splicing

ribozymes RNA molecules that function as enzymes; can splice itself

alternative RNA splicing genes that can give rise to two or more different polypeptides depending on which segments are treated as exons


36 FARMASI UNSOED

domains discrete functional and structural regions of proteins that make up the modular architecture

transfer RNA brings amino acids to the ribosome for making the polypeptide chain; clover shaped with anticodon end and recieving end

anticodon a nucleotide triplet that will base pair with the complimentary codon on the mRNA

aminoacyl-tRNA synthetase enzyme that joins the correct amino acid to tRNA

wobble relaxation of base-pairing rules; allows for the third base to be different and still yield the same amino acid

ribosomal RNA composes the two ribosomal subunits P site "peptidyl-tRNA site" holds the tRNA carrying the growing polypeptide chain

A site "aminoacyl-tRNA site"

holds the tRNA carrying the next amino acid to be added to the chain

E site "exit site" discharged tRNAs leave the ribosome from here polyribosomes or polysomes

multiple ribosomes can synthesize polypeptides from the same mRNA strand at the same time

signal peptide marks the polypeptides that are destined for the endomembrane system or secretion

signal-recognition particle (SRP)

this particl is that adapter that brings the ribosome to a receptor protein in the ER so polypeptide synthesis can continue and be on its way to the endomembrane system/ secretion

Daftar Pustaka

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff., M., Roberts, K., Walter, P., 2008, Molecular Biology of The Cell, 5th Edition, Garland Science, Taylor&Francis Group

Campbell, N.A., Reece, J.B., dan Mitchell, L.G., 2002, Biologi, Edisi 5, Jilid 1, Erlangga, Jakarta

Lodish, H., 2003, Molecular Cell Biology, 5th Ed., Freeman

Yuwono, T., 2005, Biologi Molekular, Erlangga, Jakarta

From Gene to Protein 2

Documents

Transcript of From Gene to Protein 2